Разработка критериев вирусологической безопасности для клинического использования свиных гепатоцитов в аппарате "Вспомогательная печень" тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Питкина, Зорина Шмуровна

• Питкина, Зорина Шмуровна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Питкина, Зорина Шмуровна

Сокращения и обозначения.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность.

Острая печеночная недостаточность, современные методы лечения.

Характеристика системы "Вспомогательная печень".

Контроль качества при ксенотрансплантации с использованием поросят в качестве доноров гепатоцитов

Цель исследования.

Задачи исследования.

Научная новизна и значение для практики.

Оценка риска и безопасности системы "Вспомогательная печень".

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Причины возникновения и современные методы лечения острой печеночной недостаточности у человека.

Этиология острой печеночной недостаточности.

Вирусные инфекции.

Применение ацетаминофена.

Применение различных лекарственных препаратов (кроме ацетаминофена).

Современное состояние проблемы лечения больных с острой печеночной недостаточностью.

Аппараты "Вспомогательная печень".

Необходимость применения альтернативного лечения.

Биоискусственные системы по поддержанию функции печени и их сравнительный анализ.

Использование свиных клеток и тканей для лечения острой печеночной недостаточности.

Применение свиных гепатоцитов в экстракорпоральных системах с использованием мембран.

Риск вирусного инфицирования больных при ксенотрансплантации с использованием свиных гепатоцитов.

Этическая проблема ксенозоонозов.

Характеристика и методы определения свиных вирусов, представляющих опасность для ксенотрансплантации.

Характеристика и методы диагностики свиных экзогенных вирусов.

Характеристика и инфекционные свойства свиных эндогенных ретровирусов.

Методы диагностики свиных эндогенных ретровирусов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Определение вирусных агентов при кокультивировании свиных тканей и клеток.

Среды и оборудование для контроля вирусов.

Изучение цитопатического действия вирусов.

Диагностика гемадсорбируюгцих вирусов.

Реакция торможения гемагглютинации.

Иммунофлуоресцентный метод.

Полимеразная цепная реакция.

Методы серологического обследования свиней.

Изоляция и криоконсервация гепатоцитов.

Диагностика свиных эндогенных ретровирусов.

Определение активности обратной транскриптазы.

Применение полимеразной цепной реакции для диагностики свиных эндогенных ретровирусов при кокультивировании свиных гепатоцитов с линией клеток человека 293.

Определение потенциальной инфекционности свиных эндогенных ретровирусов в биореакторе.

Определение свиных эндогенных ретровирусов у леченых пациентов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Программа гарантии и контроля качества терапии с применением ксеногенных клеток.

Модель контроля качества.

Оценка контроля качества.

Программа контроля качества терапии с использованием аппарата "Вспомогательная печень".

Оценка программы контроля качества аппарата "Вспомогательная печень".

Комплексная программа вирусологического контроля при использовании аппарата "Вспомогательная печень".

Вирусологический контроль животных племенного стада свиней.

Вирусологический контроль поросят - доноров гепатоцитов

Вирусологический контроль при исследовании лимфатических узлов отдельных животных.

Вирусологический контроль гепатоцитов, используемых в апппарате "Вспомогательная печень".

Оценка снижения риска заражения свиными эндогенными ретровирусами в результате применения мембраны в аппарате "Вспомогательная печень".

Определение свиных эндогенных ретровирусов в криоконсервированных гепатоцитах по активности обратной транскриптазы.

Определение свиных эндогенных ретровирусов в криоконсервированных гепатоцитах при кокультивировании гепатоцитов и линии клеток человека 293.

Контроль свиных эндогенных ретровирусов в биореакторе аппарата "Вспомогательная печень".

Оценка вирусного контроля больных с острой печеночной недостаточностью при применении системы "Вспомогательная печень".

Обсуждение проблемы безопасности применения свиных гепатоцитов.

Сертификация свиных гепатоцитов для обеспечения инфекционной безопасности при их применении в аппарате "Вспомогательная печень".

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка критериев вирусологической безопасности для клинического использования свиных гепатоцитов в аппарате "Вспомогательная печень"»

Представляемая работа посвящена разработке технологии и методов обеспечения вирусологической безопасности терапевтической системы "Вспомогательная печень" с использованием свиных гепатоцитов, взаимодействующих с плазмой больного исключительно через поры диализных мембран.Разработанные автором технология и методология были применены в системе "Вспомогательная печень" с использованием мембран производства компании Circe Biomedical (Лексингтон, США). Применение системы "Вспомогательная печень" для лечения больных с острой печеночной недостаточностью (ОПН) было осуществлено в 19 медицинских центрах США и Европы (общее количество пациентов - 171 человек). Результаты клинико-лабораторных исследований показали отсутствие вирусных или бактериальных контаминации, связанных с биологическим компонентом в аппарате "Вспомогательная печень". Исследования in vitro и in vivo, проведенные для оценки потенциальной инфекционности свиных эндогенных ретровирусов (СЭРВ), свидетельствовали об отсутствии данной инфекции у больных, в лечении которых применяли систему "Вспомогательная печень".Таким образом, разработанная методология доказала свою эффективность в обеспечении безопасности применения аппарата "Вспомогательная печень" с использованием свиных гепатоцитов. Это позволяет предположить, что разработанные технологии и методология могут применяться в различных ксеногенных системах как для планового лечения, так и для проведения интенсивной терапии.1.1. Актуальность В последнее десятилетие в связи с распространением гепатитов и наркомании отмечен рост смертности от острой и хронической печеночной недостаточности. Однако ни один из современных методов лечения не способствует восстановлению функциональной способности или регенерации печени. В связи с этим показатели смертности больных с ОПН в настоящее время остаются очень высокими (Hoofiiagle J.H. et al., 1995/ Особенно это относится к фульминантным гепатитам и ОПН у наркоманов.Недостаток донорского материала для проведения трансплнтации печени, наиболее эффективного в настоящее время метода лечения больных с ОПН, является существенным препятствием для ее применения в клинической практике. В связи с этим ксенотрансплантация как метод лечения, при котором для трансплантации используются живые клетки, ткани и органы, источником которых служат животные, имеет явное преимущество благодаря неограниченному количеству и доступности донорского материала. Ксенотрансплантаты могут применяться в экстракорпоральных перфузионных системах. Поэтому разрабатываемые искусственные органы биологического происхождения, в состав которых входят селективные мембраны и свиные гепатоциты (Maki Т. et al., 1996; Watanabe F.D. et a l , 1997; Samuel D . et al., 2002), также следует отнести к ксенотрансплантации.Данный метод лечения больных с ОПН приобретает особую актуальность, так как мембраны осуществляют барьерную функцию и, следовательно, ксеногенные клетки не находятся в прямом контакте с плазмой крови реципиента. Однако, несмотря на сообщения о достоверной эффективности этих систем, при использовании которых происходит трансмембранный контакт крови больных со свиными клетками, на первый план выступает проблема обеспечения безопасности больных.Два основных фактора определяют важность обеспечения безопасности при ксенотрансплантации для лечения больных с ОПН. Во-первых, у больных с ОПН из-за нарушенной функциональной способности печени отсутствует сопротивляемость к любым инфекционным агентам, которые могут быть занесены в организм при использовании биологической системы. Во-вторых, отсутствует достаточно полный контроль вирусологической безопасности биологического продукта, производимого из тканей животных, и поэтому такой продукт может служить источником многих известных и неизвестных инфекционных болезней. Следовательно, разработка критериев оценки инфекционной безопасности предлагаемого биологического продукта для лечения больных с ОПН является крайне необходимой.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Питкина, Зорина Шмуровна

110 выводы

1. Разработана и апробирована впервые в медицинской практике комплексная программа вирусологической безопасности применения гепатоцитов свиней в аппарате "Вспомогательная печень", используемом для ксенотрансплантации у больных с ОПН. Контроль ксенотрансплантата (гепатоцитов печени) включает в себя данные по инфекционной безопасности и стерильности клеток, данные по содержанию эндотоксина и побочных примесей, оценку жизнеспособности и функциональной активности клеток. Комплексная программа обеспечивает безопасность применения системы «Вспомогательная печень» и воспроизводимость паспортных характеристик ксеногенного терапевтического продукта (свиных гепатоцитов).

2. На основе анализа инфекционных агентов у свиней-доноров, гепатоциты которых подлежат использованию в аппаратах «Вспомогательная печень», установлена общая этиологическая структура заболеваемости и вирусоносительства у этих животных, разработаны рекомендации для отбора свиней-доноров по вирусологическим тестам, выявляющим 22 вирусных агента.

3. Отобрано 4 вируса - цирковирусы, герпесвирусы, вирус гепатита Е и эндогенные ретровирусы, которые представляют наибольшую опасность при клиническом применении гепатоцитов свиного происхождения для ксенотрансплантации.

4. Разработаны требования к выявлению, идентификации и мониторингу вирусных агентов эндогенного и экзогенного происхождения: у свиней - доноров гепатоцитов; в биологическом продукте, полученном из указанных гепатоцитов; у пациентов, участвовавших в клинических испытаниях.

5. Представлены предложения по сертификации инфекционной безопасности свиных гепатоцитов, включающей выявление и

Ill идентификацию эндогенных ретровирусов, цирковирусов, герпесвирусов, вируса гепатита Е.

112

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Снижение риска инфицирования ретровирусами при ксенотрансплантации может быть достигнуто благодаря использованию в биоискусственных органах селективных мембран.

В данном исследовании представлены результаты изучения потенциальной инфекционности СЭРВ при применении аппарата "Вспомогательная печень". Данная система представляет собой экстракорпоральную биоискусственную печень, предназначенную для временного замещения функции этого органа у больных с печеночной недостаточностью. Механизм действия данной системы заключается в том, что плазма крови больного циркулирует в полом волоконном картридже (биореактор), в котором содержатся свиные гепатоциты (рис.1). Гепатоциты в этом устройстве изолируются пористыми полыми волоконными мембранами и осуществляют многочисленные метаболические функции здоровой печени. Каждую лечебную процедуру длительностью шесть часов назначают 1 раз в день.

Первая фаза клинических исследований по оценке безопасности и переносимости лечения с использованием аппарата "Вспомогательная печень" была проведена в соответствии с официальным разрешением на проведение клинических испытаний, выданным FDA, в трех центрах (два в США, один во Франции). Протокол испытаний - открытое неконтролируемое мультицентровое исследование у больных с ОПН и печёночной энцефалопатией III-IV стадии (Watanabe F.D. et al., 1997; Samuel D.et al., 2002).

Одним из важных результатов настоящей работы по выявлению риска межвидовой инфекции при ксенотрансплантации явилось создание комплексной программы определения известных вирусных агентов и эндогенных вирусов. Свиней, используемых для ксенотрансплантации приобретали на фермах, где поголовье животных свободно от патогенной

105 флоры. С целью контроля безопасности животных был предложен и соблюдался определённый режим оценки наличия вирусов как у всего стада, так и у отдельных особей, входящих в него. Мы исходили из того факта, что опасность представляют те вирусы, которые: 1) являются зоонозами; 2) могут реплицироваться в клетках человека in vitro; 3) не реплицируются в клетках человека in vitro, но могут инфицировать людей; 4) обладают онкогенными свойствами. В последнее время обнаружены ещё 4 вируса, которые, возможно, являются зоонозными агентами и обладают способностью инфицировать человека. К этим вирусам относятся свиной вирус гепатита Е, свиной цирковирус, свиной цитомегаловирус и СЭРВ.

В результате проведенных исследований было идентифицировано более 40 свиных вирусов и составлен перечень из 22 вирусов, представляющих наибольшую опасность для ксенотрансплантации. Идентификация этих вирусов позволила нам определить стратегию по обеспечению вирусологической безопасности применения продукта свиного происхождения.

Кроме рутинного исследования каждой партии криоконсервированных гепатоцитов перед непосредственным применением у больных, ретроспективно оценивали наличие и потенциальную инфекционность СЭРВ методом кокультивирования гепатоцитов в среде, собранной из аппарата биоискусственной печени, при условиях, близких к условиям клинического использования гепатоцитов. Мы считаем, что применение системы "Вспомогательная печень", представляющий собой аппарат биоискусственной печени с использованием мембраны способно снизить степень риска заражения ксенозоонозами, включая СЭРВ. Кроме этого, конструкция данного аппарата обеспечивает изоляцию свиных печеночных клеток, тем самым предотвращая их прямой контакт с тканями больного.

106

Настоящее исследование является первым сообщением по оценке потенциальной инфекционности СЭРВ при использовании биоискусственных органов.

В ходе проведенного исследования не было получено никаких доказательств в пользу присутствия специфических последовательностей ДНК СЭРВ в линии клеток человека 293, кокультивируемых со свиными гепатоцитами. Отрицательные результаты тестирования также были выявлены в надосадочных жидкостях при определении активности ОТ после 10 пассажей при кокультивировании. В 20 сериях гепатоцитов, изолированных от 30 поросят, не было отмечено активности ОТ при предельно допустимом количестве мононуклеарных клеток периферической крови человека, в 2,2 раза превышающем количество этих клеток, используемых в данном исследовании в качестве отрицательного контроля.

По данным ПЦР при исследовании in vitro в биореакторе с применением свиных гепатоцитов было показано отсутствие инфицирования СЭРВ линии клеток человека 293, в которую инокулировали надосадочную жидкость или концентрированную циркулирующую среду. Из этого следует, что в аппарате "Вспомогательная печень", загруженном тем же количеством гепатоцитов, которое используется в клинических условиях, не происходит активная репродукция СЭРВ, на что указывали результаты исследования линии клеток человека 293. Однако, учитывая то, что при кокультивировании не происходило инфицирования линии клеток 293 от гепатоцитов, эти результаты были ожидаемы. Целью контрольного исследования в биореакторе с применением линии клеток РК-15 была оценка барьерной функции, которую обеспечивает мембрана аппарата "Вспомогательная печень". Качественная оценка инфицированности (дорожки 8 и 9 в сравнении с дорожками 18 и 19) показывает, что содержание ДНК СЭРВ в концентрированной циркулирующей среде составило менее 1 клетки на

107

100 ООО или менее 10" клеток на 100 ООО с учётом фактора концентрации (рис.13). Напротив, уровень инфицированности надосадочной жидкости (дорожки 10 и 11 в сравнении с дорожками 18 и 19) был, вероятно, выше 100 клеток на 100 000.

Таким образом, протективный эффект мембраны заключался в снижении проникновения в биореактор, по крайней мере, 100 000 ДНК СЭРВ.

Интересным фактором является отсутствие СЭРВ по данным ОТ-ПЦР в линии клеток 293, инкубированной с 1000-кратным концентратом циркулирующей среды (рис.14, дорожки 10,11) по сравнению с сильным сигналом от линии клеток 293, совместно инкубированных с надосадочной жидкостью линии клеток РК-15 (рис.14, дорожки 12,13).

Таким образом, данное исследование позволяет оценить способность мембраны в биоискусственном органе снижать риск передачи СЭРВ, тем самым повышая безопасность продукта, по сравнению с используемыми клетками или органами без применения мембраны в качестве барьера. Полученные данные свидетельствуют о достаточно высокой безопасности свиных гепатоцитов и процедуры в целом.

Кроме того, использованная в аппарате "Вспомогательная печень" мембрана, размер пор которой составляет 0.15 (im, является непроницаемой для свиных клеток, что снижает риск микрохимеризма свиных клеток у больных при применении для лечения данной системы.

Указанная низкая степень риска подтверждается данными клинических наблюдений, полученными в рамках ретроспективного и проспективного исследований по выявлению СЭРВ. У 103 больных с ОПН, в лечении которых применяли систему "Вспомогательная печень", было проведено обследование на наличие инфицированности СЭРВ. Больные проходили лечение в трех центрах США и Европы в период 1994-1997 гг. (29 больных) и 19 центрах (включая вышеупомянутые 3 центра) в период 1998-2001 гг. (74 больных). Более половины больных (62 из 103),

108 включенных в исследование, получали иммунодепрессантную терапию в течение от 1 года до 5 лет с целью предотвращения отторжения ОТП. У всех 103 больных получены отрицательные показатели инфицированности СЭРВ по данным ПЦР-анализа ДНК мононуклеарных клеток периферической крови. Таким образом, впервые в мировой клинической практике в результате обследования значительного контингента больных представлены данные оценки передачи СЭРВ при использовании биоискусственного органа.

Чёткие различия между методом имплантации ксеногенных органов или клеток и применением ксеногенных клеток в экстракорпоральной системе с использованием мембран заключаются в степени риска передачи патогенных агентов.

За годы работы нами получен и опубликован ряд аргументированных доказательств в пользу того, что применение ксеногенных клеток в экстракорпоральной системе с использованием мембран создает дополнительные барьеры, обеспечивающие значительный уровень безопасности, в отличие от других видов ксенотрансплантации.

Решение вопроса о повышении уровня безопасности разработанной экстракорпоральной терапии с применением мембран заключалось в следующем:

1) В дополнение ко всем традиционным мерам, направленным на снижение уровня потенциальных ксенозоонозов, например, соответствующее обследование доноров-животных, соблюдение правил хранения коллекции органов и обеспечения урожайности клеток в соответствии с нормативными документами (GMP), был разработан метод криоконсервации клеток, который предоставляет время для сбора всей необходимой информации о доноре-животном, включая данные исследования трупного материала и контрольное исследование качества клеток, до клинического применения последних. Таким образом, криоконсервация является следующим шагом к повышению уровня

109 безопасности препарата по сравнению с применением для ксенотрансплантации непосредственно взятых от доноров-животных тканей, микробиологическое или вирусологическое исследование которых возможно только у доноров-животных до получения тканевого материала.

2) В экстракорпоральных системах с применением мембран ксеногенные клетки не вступают в прямой контакт с тканями/клетками человека в процессе всего периода лечения, что является результатом основных свойств мембраны, используемой в экстракорпоральной системе. Более того, способность мембраны служить преградой для потенциальных патогенов является ключевым моментом в предотвращении проникновения этих агентов в систему кровообращения больного. Мы показали, что в биореакторе не происходит передачи СЭРВ от криоконсервированных первичных свиных гепатоцитов к линиям чувствителных клеток человека.

3) Риск передачи инфекционного агента ещё больше снижается за счёт кратковременности экспозиции больного с ксеногенными клетками, используемыми в аппарате "Вспомогательная печень", в противоположность продолжительной хронической имплантации ксеногенных тканей и органов, предлагаемых для ксенотрансплантации.

На основании вышеизложенного мы считаем, что указанный метод экстракорпоральной терапии с использованием криоконсервированных гепатоцитов, мембран с иммуноизолирующими свойствами и кратковременной экспозицией обеспечивает существенное повышение уровня безопасности для больных, так как при данном способе лечения по сравнению с другими видами ксенотрансплантации отмечается значительная разница в характере риска экспозиции с патогеном и вероятности последующего заражения организма.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Питкина, Зорина Шмуровна, 2002 год

1. Киселев О.И., Виноградская Г.Р., Стукова М.А., Руденко В.И. Герпесвирусные инфекции: лекарственные препараты и ПЦР-мониторинг терапии. СПб.: Роза мира, 1999. - С.9-16.

2. Киселев О.И., Бендзко П.Г., Школьникова Л.Л., Хансон К.П., Киселев В.И. Вирусные и опухолевые антигены в конструировании противораковых вакцин // Мед. акад. журн. 2002. - T.2,N 1. - С.19-32.

3. Хахалин Л. Н., Соловьева Е. В. Герпесвирусные заболевания человека // Клин, фармакология и терапия. 1998. - T.7,N1. - С.72-76.

4. Шумаков В.И., Арзуманов B.C., Онищенко Н.А., и др. Лечение тяжелой печеночной недостаточности перфузией крови больного через взвесь криоконсервированных гепатоцитов // Хирургия. 1990. - N2. - С.113-116.

5. Шумаков В.И., Тоневицкий А.Г. Иммунологические и физиологические проблемы ксенотрансплантации. М.: Наука, 2000. - 144 с.

6. Aaronson S.A., Stephenson J.R. Endogenous type-C RNA viruses of mammalian cells // Biochim.Biophys.Acta. 1976. - Vol.458,N4. - P.323-354.

7. Akiyoshi D.E, Denaro M., Zhu H. et al. Identification of a full-length cDNA for an endogenous retrovirus of miniature swine // J.Virol. 1998. -Vol.72,N5. - P.4503-4507.

8. Albina E. Epidemiology of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS): an overview // Vet. Microbiol. 1997. - Vol.55. - P.309-316.

9. Atillasoy E., Berk P.D. Fulminant hepatic failure. Pathophysiology, treatment, and survival // Annu.Rev.Med. 1995. - Vol.46. - P. 181 -191.113

10. Bach F., Fineberg H.V. Call for moratorium on xenotransplants // Nature. -1998.-Vol.391.-P.326.

11. Baltimore D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses // Nature. 1970. - Vol.226. - P. 1209-1211.

12. Baquerizo A., Mhoyan A., Shirwan H. et al. Xenoantibody response of patients with severe acute liver failure exposed to porcine antigens following treatment with a bioartificial liver // Transplant.Proc. 1997. - Vol.29,Nl-2. - P.964-965.

13. Bascunana C.R., Bjornerot L., Ballagi-Pordany A. et al. Detection of pseudorabies virus genomic sequences in apparently uninfected "single reactor" pigs // Vet.Microbiol. 1997. - Vol.55,N1-4. - P.37-47.

14. Belak S., Ballagi-Pordany A. Application of the polymerase chain reaction (PCR) in veterinary diagnostic virology // Vet.Res.Commun. 1993. -Vol.17,N1. - P.55-72.

15. Benveniste R.E., Todaro G.J. Multiple divergent copies of endogenous C-type virogenes in mammalian cells // Nature. 1975. - Vol.252,N5479. -P.170-173.

16. Bloom E.T., Moulton A.D., McCoy J. et al. Xenotransplantation: the potential and the challenges // Crit.Care Nurse. 1999. - Vol.19. - P.76-83.

17. Bouillant A.M.P., Grieg A.S., Lieber M.M., Todaro G.J. Type С virus production by a continous line of pig oviduct cells (PFT) // J.Gen. Virol. -1975.-Vol.27.-P.173-180.

18. Butler D. Polls reveals backing for xenotransplants // Nature. 1998. -Vol.391.-P.327-328.114

19. Capocaccia L., Angelico M. Fulminant hepatic failure. Clinical features, etiology, epidemiology, and current management // Dig.Dis.Sci. 1991. -Vol.36.-P.775-779.

20. Carithers R.L.,Jr. Liver transplantation: American Association for the Study of Liver Diseases // Liver Transplant. 2000. - Vol.6,N1. - P.122-135.

21. Centers for Disease Control. Wonder Mortality Data Set. 1994.

22. Chapman L.E., Folks T.M., Salomon D.R. et al. Xenotransplantation and xenogeneic infections // N.Engl.J. Med. 1995. - Vol.333. - P. 1498-1501.

23. Chari R.S., Collins B.H., Magee J.C. et al. Treatment of hepatic failure with ex vivo pig-liver perfusion followed by liver transplantation // N.Engl.J.Med. -1994.-Vol.331.-P.234-237.

24. Christopher-Hennings J., Nelson E.A. PCR analysis for the identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in boar semen // Meth.Mol.Biol. 1998. - Vol.92. - P.81-88.

25. Christopher-Hennings J., Nelson E.A., Nelson J.K. et al. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in boar semen by PCR // J.Clin.Microbiol. 1995. - Vol.33,N7. - P.1730-1734.

26. Deacon Т., Schumacher J., Dinsmore J. et al. Histological evidence of fetal pig neural cell survival after transplantation into a patient with Parkinson's disease // Nature Med. 1997. -Vol.3. - P.350-353.

27. Denis J., Opolon P., Delorme M.L. et al. Long-term extracorporeal assistance by continuous haemofiltration during fulminant hepatic failure // Gastroenterol.Clin. Biol. 1979. - Vol.3 - P.337-348.

28. Denner J. Immunosuppression by retroviruses: implications for xenotransplantation // Ann. N.Y.Acad.Sci. 1998. - Vol.862. -P.75-86.

29. Dunnett C.W. A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control // J.Amer.Stat.Assoc. 1955. - Vol.50. - P. 10961121.

30. Dunnett C.W. New tables for multiple comparisons with a control // Biometrics. 1964. - Vol.20. - P.3.115

31. Ellis A.J., Hughes R.D., Wendon J.A. et al. Pilot controlled trial of extracorporeal liver assist device in acute liver failure // Hepatology. 1996. - Vol.24.-P.l446-1451.

32. Erdem H., Kocabalkan F., Mas M.R. et al. Fulminant hepatic failure as the initial manifestation of primary hepatocellular carcinoma // Europ.J.Gastroenterol. Hepatol. 2000. - Vol. 12,N5. - P.575-578.

33. Fishman J.A. Miniature swine as organ donors for man: strategies for prevention of xenotransplant-associated infections // Xenotransplantation. -1994. -Vol.1. -P.47-57.

34. Flint S.J., Enquist L.W., Krug R.M. et al. Principles of Virology: Molecular Biology, Pathogenesis, and Control. Washington, D.C.: ASM press, 2000.

35. Fox I.J, Langnas A.N., Ozaki C.F. et al. Successful application of extracorporeal liver perfusion for the treatment of fulminant hepatic failure: a technology whose time has come // Amer.Gastroenterol. 1993. - Vol.88. -P.1876-1881.

36. Gerlach J.C. Development of a hybrid liver support system: a review // Int.Artif. Organs. 1996. - Vol.19. - P.645-654.

37. Graves E.J., Gillum B.S. Detailed diagnoses and procedures, National Hospital Discharge Survey, 1995 // Vital Health Stat. 1997. - Vol.130. -P.127.

38. Groth C.G. et al. Transplantation of porcine fetal pancreas to diabetic patients //Lancet. 1994. - Vol.344. - P. 1402-1404.

39. Guscetti F., Bernasconi C., Tobler K. et al. Immunohistochemical detection of porcine epidemic diarrhea vims compared to other methods // Clin.Diagn.Lab.Immunol. 1998. - Vol.5,N3. - P.412-414.116

40. Hamel A.L., Lin L.L., Nayar G.P. Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs // J. Virol 1998. - Vol.72. - P.5262-5267.

41. Heneine W., Tibell A., Switzer W.M. et al. No evidence of infection with porcine endogenous retrovirus on recipients of porcine islet-cell xenografts // Lancet. 1998. - Vol.352. -P.695-699.

42. Hoofnagle J.H., Carithers R.L.,Jr., Shapiro C., Ascher N. Fulminant hepatic failure: Summary of a workshop // Hepatology. 1995. -Vol.21,N1. -P.240-252.

43. Howard E.B., Clarke W.J., Hackett P.L. Experimental myeloproliferative and lymphoproliferative diseases of swine // Bibl.Haematol. 1968. - Vol.30. -P255-262.

44. Hsien S.Y., Meng X.J., Wu Y.H. et al. Identity of a novel swine hepatitis E virus in Taiwan forming a monophyletic group with Taiwan isolate of human hepatitis E virus // J.Clin.Microbiol. 1999. - Vol.37,N12. - P.3828-3834.

45. Jestin A., Foulon Т., Pertuiset B. et al. Rapid detection of pseudorabies virus genomic sequences in biological samples from infected pigs using polymerase chain reaction DNA amplification // Vet.Microbiol. 1990. -Vol.23,Nl-4.-P.317-328.

46. Kiss I., Matiz K., Allard A. et al. Detection of homologous DNA sequences in animal adenoviruses by polymerase chain reaction // Acta Vet.Hung. -1996. Vol.44,N2. - 243-251.

47. Krawczynski K. Hepatitis E // Hepatology. 1993. - Vol.17,N5. - P.932-941.

48. Kweon C.H., Lee J.G., Han M.G., Kang Y.B. Rapid diagnosis of porcine epidemic diarrhea virus infection by polymerase chain reaction // J.Vet.Med.Sci. 1997. - Vol.59,N3. - P.231-232.

49. Larochelle R., Antaya M., Morin M., Magar R. Typing of porcine circovirus in clinical specimens by multiplex PCR // J.Virol.Methods. 1999. -Vol.80,N1. - P.69-75.117

50. Lee W.M. Acute liver failure // N.Engl.J.Med. 1993. - Vol.329. - P. 18621872.

51. Legeay O., Bounaix S., Denis M. et al. Development of a RT-PCR test coupled with a microplate colorimetric assay for the detection of a swine Arterivirus (PRRSV) in boar semen // J.Virol.Methods. 1997. - Vol.68,N1. - P.65-80.

52. Lepore M.J., Stutman L.J., Bonanno C.A. et al. Plasmapheresis with plasma exchange in hepatic coma // Arch.Intern.Med. 1972. - Vol.129. - P.900-907.

53. Le Tissier P., Stoye J.P., Takeuchi Y. et al. Two sets of human-tropic pig retrovirus // Nature. 1997. - Vol.389. - P.681-682.

54. Lidofsky S.D. Fulminant hepatic failure // Crit.Care Clin. 1995. -Vol.11,N2.-P.415-430.

55. Lieber M.M., Benveniste R.E., Livingston D.M., Todaro G.J. Mammalian cells in culture frequently release type С viruses // Science. 1973. -Vol.182. -P.56-59.

56. Lin F., Mackay D.K., Knowles N.Y. et al. Detection of swine vesicular disease virus RNA by reverse transcription-polymerase chain reaction // J.Virol.Methods. 1997.-Vol.65,N1.-P. 111-121.

57. Lin S.S., Saadi S. New development in solid organ xenotransplantation // Graft. 1998. - Vol.1,N2. - P.45-47.

58. Litovitz Т.О., Smilkstein M., Felberg L. et al. Annual report of American Association of Poison Control Centers, Toxic Surveillance System // Amer.J. Emerg.Med. 1996. - Vol.15,N5. - P.447-450.

59. Lokensgard J.R., Thawley D.G., Molitor T. Enzymatic amplification of latent pseudorabies virus nucleic acid sequences // J.Virol.Methods. 1991. -Vol.34,N1. - P.45-55.

60. Long Z., Li L.P., Grooms T. et al. Biosafety monitoring of patients receiving intracerebral injections of murine retroviral vector producer cells // Hum.Gene Ther. 1998. - Vol.9,N8. - P. 1165-1172.118

61. Maki Т., Otsu I., O'Neill J.J. et al. Treatment of diabetes by xenogeneic islets without immunosuppression: use of a vascularized bioartificial pancreas // Diabetes. 1996. - Vol.45. - P.342-347.

62. Martelli G.P., Mayo M.A., Summers M.D. Virus taxonomy classification and nomenclature of viruses: sixth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Vienna: Springer, 1995.

63. Martignat L., Sai P., Jestin A. Detection of porcine endogenous retrovirus: possible involvment in pig islet transplantation // Diabetes and Metabolism. -1998.-Vol.24.-P.434-441.

64. Martin U., Kiessig V., Blusch J.H. et al. Expression of pig endogenous retrovirus by primary porcine endothelial cells and infection of human cells // Lancet. 1998. - Vol.352. - P.692-694.

65. Matsumura K.N., Guevara G.R., Huston H. et al. Hybrid bioartificial liver in hepatic failure: preliminary clinical report // Surgery. 1987. - Vol.101. -P.99-103.

66. McGoldrick A., Lowings J.P., Ibata G. et al. A novel approach to the detection of classical swine fever virus by RT-PCR with a fluorogenic probe (TaqMan) // J. Virol.Methods. 1998. - Vol.72,N2. - P. 125-135.

67. McLaughlin B.E., Tosone C.M., Custer L.M., Mullon C. Overview of extracorporeal liver support systems and clinical trials // Ann.N.Y.Acad.Sci. 1999. - Vol.875. - P.310-325.119

68. Meng X.J., Purcell R.H., Halbur P.G. et al. A novel virus in swine in closely related to the human hepatitis E vims // Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 1997. -Vol.94. -P.9860-9865.

69. Moennig V., Frank H., Hunsmann G. et al. C-type particles produced by a permanent cell line from a leukemic pig. II.Physical, chemical, and serological characterization of the particles // Virology. 1974. - Vol.57. -P.179-188.

70. Morsiani E, Rozga J, Scott H, et al. Automated liver cell processing facilitates large-scale isolation and purification of porcine hepatocytes // ASAIOJ. 1995.-Vol.41.-P155-161.

71. Morozov I., Sirinammitr Т., Sorden S.D. et al. Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome //J.Clin. Microbiol. 1998. - Vol.36, N9. - P.2535-2541.

72. Nunez J.I., Blanco E., Hernandez T. et al. RT-PCR in foot-and-mouth disease diagnosis // Vet. Quart. 1998. - Vol.20,suppl. 2. - P.34-36.

73. Paradis K, Langford G., Long Z. et al. // Science. 1999. - Vol.285. -P.1236-1241.

74. Patience C., Takeuchi Y., Weiss R. Infection of human cells by an endogenous vims of pigs // Nature Med. 1997. - Vol.3. - P.282-286.120

75. Patience С., Patton G.S., Takeuchi Y. et al. No evidence of pig DNA or retroviral infection in patients with short-term extracorporeal connection to pig kidneys // Lancet. 1998. - Vol.352. - P.699-701.

76. Pearson M.L., Jarvis W.R., Folks T.M., Chapman L.E. Xenotransplantation: is the future upon us? // Infect.Control Hosp.Epidemiol. 1999. - Vol. 19,N5. -P.305-307.

77. Platt J.L. Knocking out xenograft rejection // Nature Biotechnol. 2002. -Vol.20.-P.231-232.

78. Plevris J.N., Schina M., Hayes P.C. The management of acute liver failure: Review article // Aliment.Pharmacol. Ther. 1998. - Vol.12. - P.405-418.

79. Potts B.J. Quantitative Assays for Virus Detection: "Mini" Reverse Transcriptase Assay // Techniques in HIV Research/ Ed. by A. Aldovini, B. Walker. -N.Y.: Stockton Press, 1990. P. 103.

80. Potts B.J., Kivens W. J. Detecting and removing porcine viruses // Biopharm. -2000.-Vol.05.-P.26-31.

81. Riordan S.M., Williams R. Acute liver failure: targeted artificial and hepatocyte-based support of liver regeneration and reversal of multiorgan failure // J.Hepatol. 2000. - Vol.32,N1. - P.63-76.

82. Samuel D., Ichai P., Feray C. et al. Neurological improvement during bioartificial liver sessions in patients with acute liver failure awaiting transplantation // Transplantation 2002. - Vol.73,N2. - P257-264.121

83. Scherba G., Jin L., Schnitzlein W.M., Vodkin M.H. Differential polymerase chain reaction for detection of wild-type and a vaccine strain of Aujeszky's disease (pseudorabies) vims // J.Virol. Methods. 1992. - Vol.38,N1. -P.131-143.

84. Schiodt F.V., Atillasoy E., Shakil A.O. et al. Etiology and outcome for 295 patients with acute liver failure in the United States // Liver Transplant. Surg. 1999.-Vol.5.-P.29-34.

85. Schlauder G.G., Dawson G.J., Erker P.Y. et al. The sequence and phylogenetic analysis of a novel hepatitis E virus isolated from a patient with acute hepatitis reported in the United States // J.Gen.Virol. 1998. - Vol.79. P.447-456.

86. Sherr C.J., Fedele L.A., Benveniste R.E., Todaro G.J. Interspecies antigenic determinants of the reverse transcriptases and p30 proteins of mammalian type С viruses // J.Virol. 1975. - Vol. 15,N6. - P.1440-1448.

87. Shin J., Bautista E.M., Kang Y.B., Molitor T.W. Quantitation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus RNA in semen by single-tube reverse transcription-nested polymerase chain reaction // J.Virol.Methods. -1998. Vol.72,N1. - P.67-79.

88. Stallknecht D.E., Howerth E.W., Reeves C.L., Seal B.S. Potential for contact and mechanical vector transmission of vesicular stomatitis virus New Jersey in pigs // Amer.J.Vet.Res. 1999. - Vol.60. - P.43-48.

89. Stockmann H., Hiemstra C.A., Marquet R.L., Ijzermans J.N. Extracorporeal perfusion for the treatment of acute liver failure // Ann.Surg. 2000. -Vol.231,N4.-P.460-470.

90. Suarez P., Zardoya R., Prieto C. et al. Direct detection of the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus by reverse polymerase chain reaction (RT-PCR) // Arch.Virol. 1994. - Vol. 135,N1-2. - P.89-99.

91. Sur J.H., Doster A.R., Osorio F.A. Apoptosis induced in vivo during acute infection by porcine reproductive and respiratory syndrome virus // Vet.Pathol. 1998. - Vol.35,N6. - P.506-514.

92. Sussman N.L., Gislason G.T., Conlin C.A., Kelly J.H. The Hepatix extracorporeal liver assist device: initial clinical experience // Artif.Organs. -1994. Vol. 18,N5. - P.390-396.

93. Switzer W.M., Michler R.E., Shanmugam V. et al. Lack of cross-species transmission of porcine endogenous retrovirus infection to nonhuman primate recipients of porcine cells, tissues, or organs // Transplantation. -2001.- Vol.71,N7. -P.959-965.123

94. Takeuchi Y., Patience C., Magre S. et al. Host range and interference studies of three classes of pig endogenous retrovirus // J.Virol. 1998. -Vol.72,N12. - P.9986-9991 .

95. Tischer I., Mields W., Wolff D. et al. Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus // Arch.Virol. 1986. - Vol.91,N3-4. -P.271-276.

96. Tobler K., Ackermann M. Identification and characterization of new and unknown coronaviruses using RT-PCR and degenerate primers. // Schweiz.Arch. Tierheilkd. 1996. - Vol.138,N2. - P.80-86. (de.)

97. Todaro G.J., Benveniste R.E., Lieber M.M, Sherr C.J. Characterization of a type С virus released from the porcine cell line PK(15) // Virology. 1974. - Vol.58. -P.65-74.

98. UNOS (United Network for Organ Sharing Scientific Registry): Database Website. -2001. April 07.

99. Vanderhallen H., Koenen F. Rapid diagnosis of encephalomyocarditis virus infections in pigs using a reverse transcription-polymerase chain reaction // J.Virol. Methods. 1997. - Vol.66,N1. -P.83-89.

100. Van Woensel P., Van der Wouw J., Visser N. Detection of porcine reproductive respiratory syndrome virus by the polymerase chain reaction // J.Virol.Methods. 1994. - Vol.47,N3. - P.273-278.

101. Vogel G. No moratorium on clinical trials // Science. 1998. - Vol.279. -P.648.

102. Wang L., Sun J., Li L. et al. Comparison of porcine hepatocytes with human hepatoma (C3A) cells for use in a bioartificial liver support system // Cell Transplant. 1998. - Vol.7. - P.459-468.

103. Watanabe F.D., Mullon C., Hewitt W.R. et al. Clinical experience with a bioartificial liver in the treatment of severe liver failure. A phase I clinical trial // Ann. Surg. 1997. - Vol.225. - P.484-491.

104. Weiss R., Teich N., Varmus H., Coffin J. Molecular biology of tumor viruses. 2d ed. Cold Spring Harbor Laboratory., 1984.124

105. Weiss R.A. Transgenic pigs and vims adaptation // Nature. 1998. -Vol.391. -P.315.

106. White D.O., Fenner F.J. Herpesviridae // Medical Virology. 4th ed. /Ed. by D.O. White, F.J. Fenner. 1994. - Ch.20. - P.317-347.

107. Widen B.F., Lowings J.P., Belak S., Banks M. Development of a PCR system for porcine cytomegalovirus detection and determination of the putative partial sequence of its DNA polymerase gene // Epidemiol.Infect. -1999. Vol. 123,N1. - P. 177-180.

108. Willey R.L., Smith D.H., Lasky L.A. et al. In vitro mutagenesis identifies a region within the envelope gene of human immunodeficiency virus that is critical for infectivity // J.Virol. 1988. - Vol.62,N 1. - P.139-147.

109. Williams R. Classification, etiology, and considerations of outcome in acute liver failure // Semin.Liver Dis. 1996. - Vol.16. - P.343-348.

110. Wilson C., Wong S., Muller J. et al. Type С retrovirus released from porcine primary peripheral blood mononuclear cells infects human cells // J.Virol. 1998. - Vol.72,N12. -P.3082-3087.

111. Woods R.D. Development of PCR-based techniques to identify porcine transmissible gastroenteritis coronavirus isolates // Can.J.Vet.Res. 1997. -Vol. 61,N3. - P.167-172.

112. Woods W.A., Papas T.S., Hirumi H., Chirigos M.A. Antigenic and biochemical characterization of the C-type particle of the stable porcine kidney cell line PK-15 // J. Virol. 1973. - Vol.12. - P. 1184-1186.

113. World Health Organization (WHO). Report of a WHO Consultation on Xenotransplantation. -Geneva, 1997.125