Разработка количественного анализа серологических маркеров рака предстательной железы на гидрогелевых микрочипах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Коновалова, Елизавета Владимировна

• Коновалова, Елизавета Владимировна
• кандидат физико-математических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Коновалова, Елизавета Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Молекулярно-генетические онкомаркеры и методы их определения.

1. 2. Иммунохимические опухолевые маркеры и методы их определения.

1. 3. Простата - специфический антиген.

1. 4. Белковые микрочипы.

1. 4.1 Двумерные белковые микрочипы для анализа онкомаркеров.

1. 4.2 Белковые микрочипы на основе гидрогелей.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Белковые микрочипы.

2. 1.2. Регистрация сигналов с гелевых ячеек микрочипа.

2. 1.3. Подбор условий иммобилизации белков.

2.1.4 Выбор состава геля на примере прямого анализа ПСА.

2.1.5. Сравнение двумерных и трехмерных микрочииов.

2.1.6. Определение констант ассоциации (Kass) бинарного комплекса флуоресцентно меченного ПСА с иммобилизованными на микрочипе моноклональпыми антителами.

2.2. Белковый гидрогелевый микрочип для количественного анализа двух форм ПСА.

2.2.1. Характеристики количественного иммуноанализа ПСА на биочипах.

2.2.2. Внутренняя калибровочная кривая.

2.2.3. Определение значений «эффективных» концентраций для внутренней калибровочной кривой.

2.2.4. Получение результатов иммуноанализа.

2.2.5. Определение содержания двух форм ПСА в сыворотках крови.

2.2.6. Стабильность микрочипов с иммобилизованными антителами и ПСА.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Приборы и реактивы.

3.2. Изготовление белковых микрочипов.

3.3. Окрашивание белков флуоресцентным красителем Су5.

3.4. Флуоресцентные и хемшпоминесцентные измерения.

3.5. Определение степени иммобилизации белков в геле.

3.6. Определение ферментативной активности белков в растворе.

3.7. Регистрация ферментативной активности белков на микрочипе.

3.8. Определение процента сохранения ферментативной активности пероксидазы после иммобилизации на чипе.

3.9. Прямой анализ пероксидазы на микрочипе с иммобилизованными антителами.

3.9.1 Сэндвич-иммуноанализ ПСА.

3.9.2. Кинетические измерения на микрочипах.

3.10. Определение констант ассоциации (Kass) бинарного комплекса флуоресцентно меченного ПСА с иммобилизованными на микрочипе моноклональными антителами.

3.11. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) на 96-луночном планшете.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка количественного анализа серологических маркеров рака предстательной железы на гидрогелевых микрочипах»

Злокачественные опухоли являются одними из самых распространенных заболеваний с летальным исходом. Рак предстательной железы (РПЖ) занимает второе место по смертности от онкологических заболеваний у мужчин. Своевременное распознавание злокачественного процесса является ключевым этапом при лечении рака, поскольку именно этот фактор именно определяет прогноз заболевания и терапию. Поэтому разработка и внедрение в практику быстрых, чувствительных и недорогих методов анализа приобретает все большее значение.

Для диагностики злокачественных новообразований и контроля за лечением в настоящее время широко используются опухолеассоциированные антигены (онкомаркеры), определяемые в сыворотке крови с помощью специфических моноклональных антител. Их уровень в крови, как правило, коррелирует с размером опухоли или стадией заболевания.

Простатический специфический антиген (ПСА) относится к наиболее эффективным маркерам рака предстательной железы, получившим широкое внедрение в клиническую практику в целях диагностики и мониторинга РПЖ. Однако использование ПСА в ранней диагностике и скрининге РПЖ ограничено в связи с его низкой специфичностью, обусловленной повышением концентрации маркера у больных с незлокачественными заболеваниями ПЖ, а также у здоровых мужчин пожилого возраста. Остро стоящая перед клиницистами проблема дифференциальной диагностики РПЖ и доброкачественных заболеваний ПЖ требует повышения специфичности ПСА как опухолевого маркера. Использование для диагностики двух форм ПСА (общей и свободной) позволяет ближе подойти к решению этой проблемы: использование соотношения свободного и общего ПСА способствует значительному увеличению специфичности ПСА как опухолевого маркера в дифференциальной диагностике злокачественных и доброкачественных заболеваний ПЖ.

Количественный анализ онкомаркеров проводится иммунохимическими методами (ИФА) в основном на плашках (стрипах). Традиционные иммунологические методы позволяют выявлять содержание только одного маркера в одном клиническом образце, в то время как для постановки точного диагноза требуется анализ на содержание в крови нескольких онкомаркеров.

Эта проблема решается при помощи метода, представленного в данной диссертационной работе, позволяющего одновременное количественное определение общей и свободной форм ПСА с использованием трехмерных гидрогелевых микрочипов.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Коновалова, Елизавета Владимировна

выводы

1. Подобраны оптимальные условия иммобилизации белков в гелевых элементах микрочипов с максимальным сохранением исходной активности белков.

2. Разработан биологический микрочип для количественного анализа общей и свободной формы простата-специфического антигена. Подобраны условия для проведения одновременного иммуноанализа двух форм ПСА на микрочипе.

3. Показана возможность проведения количественного анализа двух форм ПСА на биологическом микрочипе, содержащем иммобилизованные антитела и внутреннюю калибровочную кривую, иммобилизованный антиген. Разработанный метод позволяет значительно упростить процедуру анализа, проводя его в формате один микрочип - один анализ.

4. Получены основные аналитические характеристики разработанного метода: проведена оценка воспроизводимости и чувствительности иммуноанализа двух форм ПСА на микрочипе. Результаты полностью удовлетворяют требованиям, предъявляемым к иммунологическим аналитическим системам.

5. Показано, что результаты измерений содержания в сыворотках крови ПСАобщ и ПСАсв на биочипах коррелируют с результатами, полученными в стандартных тест-системах.

БЛАГОДАРНОСТИ

Приношу глубокую благодарность моему научному руководителю Рубиной Алле Юрьевне за доброжелательное руководство, всестороннюю помощь и внимание к работе. Я искренне признательна Екатерине Игоревне Дементьевой и Марии Вадимовне Цыбульской за ценные замечания при обсуждении результатов и рукописи диссертации, Елене Савватеевой, Марине Филлиповой и Сергею Иванову за помощь в работе и дружеское участие. Также выражаю признательность Татьяне Владимировне Осиповой и Татьяне Павловне Рябых за сотрудничество; Сергею Панькову, Кириллу Евсееву, Валентине Владимировне Чупеевой и Эдуарду Яковлевичу Крейндлину за подготовку микрочипов для проведения экспериментов; Александру Сергеевичу Заседателеву за помощь и поддержку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Коновалова, Елизавета Владимировна, 2006 год

1. Абелев Г.И. Механизмы дифференцировки и опухолевый рост. //Биохимия.- 2000.- вып. 1.- С.127-138.

2. Карпищенко А.И., Антонов В.Г., Бутенко А.Б., Белохвостое А.С. и др. Онкомаркеры и их диагностическое значение. //Изд. Военно-медицинской академии. Санкт-Петербург: -1999.-48 С.

3. Белохвостов А.С., Новик А.А. Роль молекулярно-генетических маркеров в диагностике солидных опухолей. //Вопр. онкологии-1999.-Т.45, №6, С.599-606.

4. Chen X.Q. et al., Microsatellite alterations in plasma DNA of small sell lung cancer patiens.//Nat.med. 1996 2, 10033-1035.

5. Nawroz H. et al., Microsatellite alterations in serum DNA of head and neck cancer patients.//Nat.Med. 1996 2, 1035-1037.

6. Horwich A. and Ross G. Circulating tumor markers// Principles of Molecular Oncology, Eds Brouchud M.H. et al. Humans Press, Totowa, New Jersey 2000, 111-124 pp.

7. Kawasaki E.S.,Clark S.S., Coyne M.Y. et al. Diagnosis of chronic myeloid andacute lymphocytic leukemias by detection of leukemia-specific mRNA sequences amplified in vitro. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988.- Vol.85.- P.5698-5702.

8. Sell S. Cancer markers of the 1990s. Comparison of the new generation of markers defined by monoclonal antibodies and oncogene probes to prototypic markers. //Clin. Lab. Med.- 1990.-Vol.10, № 1.- P. 1-37.

9. Anker Ph., Lefort F., Vasioukhin V., Lyatey J., Lederrey C., Chen X.Q., StrounM. Mulcahy M.E. K-ras mutations are found in DNA extracted from the plasma of patients with colorectal cancer. //Gasrtoenterology. 1997.-Vol.112,-P.l114-1120

10. Ward R., Hawkins N., O'Grady R. et al. Restriction endonuclease-mediated selective polymerase chain reaction. A novel assay for the detection of K-ras mutations in clinical samples. //Am. J. Pathol.-1998.-Vol.153, N 2.-P.373-379

11. Wong IH, Lo YM, Zhang J, Liew CT, Ng MH, Wong N, Lai PB, Lau WY, Hjelm NM, Johnson PJ. Detection of aberrant pi 6 methylation in the plasma and serum of liver cancer patients.//Cancer Res 1999 Jan l;59(l):71-3

12. Ligget W.H., Sidranski D. Role of the pi6 tumor suppressor gene in cancer.

13. J. Clin. Oncol. -1998.- N3.-P.1197-1206.

14. Raj С. V., Moreno J.G., Gomella L.G. Utilization of polymerase chain reaction technology in the detection of solid tumors.//Cancer.- 1998.-V.82. P.1419-1442.

15. Dong JT. Prevalent mutations in prostate cancer. //J Cell Biochem. 2006 Feb 15;97(3):433-47.

16. Schostak M, Krause H, Miller K, Schrader M, Weikert S, Christoph F, Kempkensteffen C, Kollermann J. Quantitative real-time RT-PCR of CD24 mRNA in the detection of prostate cancer. //BMC Urol. 2006 Mar 15;6:7.

17. Огнерубов H.A Маркеры злокачественных опухолей издательствою // «Инфа» Воронеж. 1996

18. Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. //Nature. 1975 Aug 7;256(5517):495-7.

19. А.М.Егоров, А.П.Осипов, Б.Б.Дзантиев, Е.М.Гаврилова. Теория и практика иммуноферментного анализа. //М.: Высш.шк., 1991.

20. Aybay С. Development of an enzyme-linked immunoassay for sensitive detection of native and recombinant human interferon-gamma using whole IgG fraction as polyclonal tracer. //J Immunoassay Immunochem. 2004;25(4):321-34.

21. Arai K, Kanikawa S, Isomura M, Takemori Y, Kanda Y, Ishii M. Enzyme immunoassay of CEA using monoclonal antibody. //Gan To Kagaku Ryoho.1982 Dec;9(12):2161-7

22. Carvalho, A., Sanz, L., Barettino, D., Romero, A., Calvete, J., Romao, M. Crystal Structure of a Prostate Kallikrein Isolated from Stallion Seminal Plasma: A Homologue of Human Psa. //J.Mol.Biol. 2002. v322 pp.325.

23. A.C. Белохвостое, А.Г. Румянцев. Онкомаркеры. Молекулярно-генетические, иммунохимические, биохимические анализы. //2-ое издание. Москва 2003.

24. Polascik TJ, Oesterling JE, Partin AW. Prostate specific antigen: a decade of discovery-what we have learned and where we are going. //J Urol. 1999 Aug; 162(2):293-306. Review

25. Young F., Li X, Ellet J., et al. Regions of prostate specific antigen (PSA) promoter confer androgen -independent expression of PSA in prostate cancer cell. //J Biol Chem 2000 Dec 29; 275(52): 40486-55.

26. Sadar M.D. Androgen-independent induction of prostate-specific antigengene expression viacross-talk between the androgen receptor and protein kinase a signal transduction pathways. //J Biol Chem -1999-Mar 19;-274 (12): 7777-83.

27. Zhu W., Young C.Y. Androgen-dependent transcriptional regulation of the prostate specific antigen by thyroid hormons 3,5,3-1-triiodthyrosinine. //J Androl 2001, Jan-Feb; 22(1): 136-41

28. Sadar M.D., Hussain M., Bruchowsky W. Prostate cancer: molecular bioliogy of early progression to androgen independence. //Endocr Relat Cancer. 1, 1999-Dec; 6(4):487-502

29. Xue W., Irvine R.A.,Yu M.C. et al. Susceptibility to prostate cancer: interaction between genotypes al the androgen receptor and prostate specificantigen loci. //Cancer Res 2000 Feb 15; 60(4):839-41.

30. Ablin RJ, Soanes WA, Bronson P, Witebsky E. Precipitating antigens of the normal human prostate. //J Reprod Fertil. 1970 Aug;22(3):573-4.

31. Wang MC, Valenzuela LA, Murphy GP, Chu TM. Purification of a human prostate specific antigen. //Invest Urol. 1979 Sep; 17(2): 159-63.

32. Papsidero LD, Wang MC, Valenzuela LA, Murphy GP, Chu TM. A prostate antigen in sera of prostatic cancer patients. //Cancer Res. 1980 Jul;40(7):2428-32.

33. Pollen JJ, Dreilinger A. Immunohistochemical identification of prostatic acid phosphatase and prostate specific antigen in female periurethral glands. //Urology. 1984 Mar;23(3):303-4.

34. Lilja H, Christensson A, Dahlen U, Matikainen MT, Nilsson 0, Pettersson K, Lovgren T. Prostate-specific antigen in serum occurs predominantly in complex with alpha 1-antichymotrypsin. //Clin Chem. 1991 Sep;37(9): 1618-25.

35. McCormack RT, Rittenhouse HG, Finlay JA, Sokoloff RL, Wang TJ, Wolfert RL, Lilja H, Oesterling JE. Molecular forms of prostate-specific antigen and the human kallikrein gene family: a new era. //Urology. 1995 May;45(5):729-44.

36. Lilja H. Structure, function, and regulation of the enzyme activity of prostate-specific antigen. //World J Urol. 1993; 11 (4): 188-91. Review.

37. Wang TJ, Hill TM, Sokoloff RL, Frankenne F, Rittenhouse HG, Wolfert RL. Dual monoclonal antibody immunoassay for free prostate-specific antigen. //Prostate. 1996 Jan;28(l):10-6.

38. Vessella RL, Lange PH. Issues in the assessment of prostate-specific antigen immunoassays. An update. //Urol Clin North Am. 1997 May;24(2):261-8.

39. Кушлинский H.E., Любимова H.B., Гориловский JI.M. ПСА при раке и доброкачественной гиперплазии предстательной железы. //Бюл.эксперим.биологии и медицины, 1997.-х. 124-№ 9-С. 327-330.

40. Carter НВ, Epstein JI, Chan DW, Fozard JL, Pearson JD. Recommended prostate-specific antigen testing intervals for the detection of curable prostate cancer.//JAMA. 1997 May 14;277(18):1456-60.

41. Pound CR, Partin AW, Epstein JI, Walsh PC. Prostate-specific antigen after anatomic radical retropubic prostatectomy. Patterns of recurrence and cancer control. //Urol Clin North Am. 1997 May;24(2):395-406.

42. Carter HB, Partin AW, Luderer AA, Metter EJ, Landis P, Chan DW, Fozard JL, Pearson JD. Percentage of free prostate-specific antigen in sera predicts aggressiveness of prostate cancer a decade before diagnosis. //Urology. 1997 Mar;49(3):379-84.

43. Pearson JD, Landis P, Fozard JL and Carter HB. When is PSA testing no longer necessary?//J.Urol., part 2, 159: 178A, abstract 681, 1998.

44. Oesterling JE, Jacobsen SJ, Chute CG, Guess HA, Girman CJ, Panser LA, Lieber MM. Serum prostate-specific antigen in a community-based population of healthy men. Establishment of age-specific reference ranges. //JAMA. 1993 Aug 18;270(7):860-4.

45. Alison Abbot. Betting on tomorrow's chips. //Nature Vol 415 lOjanuary 2002 112-114.

46. Robert F.Service. Searching for Recipes for protein chips. //Science 294, (2001)2080-2082

47. Haab B.B., Duhman M.J., Brown P.O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific protein and antibodies in complex solutions. //Genom Biology 2001,2(2) research 0004.1-0004.13.

48. Philipp Angenendt, Jorn Glokler, Derek Murphy, Hans Lehrach, and Dolores J. Cahill. Toward optimized antibody microarrays: a comparison of current microarray support materials. //Analytical Biochemistry 309(2002) 253-260.

49. Nuzzo R.G., Allura D.L. //Adsorption of bifunctional organic disulfides on gold surface. //J. Amer. Chem. Soc. 1983, 105: 4481-4483.

50. Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques. //Acad. Press: San Diego, New York, Boston 1996.

51. Hengsakul M., Cass A.E.G. Protein patterning whis a photoactivatable derivative of biotin. //Bioconjugate Chem 1996, 7: 249-254.

52. Pirrung M.C., Huang, C.Y. A general method for the spatially defined immobilization of biomolecules on glass surfaces using "caged" biotin. //Bioconjug Chem. 1996 May-Jun;7(3):317-21.

53. Sean P.Lai, Richard I.Cristopherson and Sristobal G.dos Remedios. Antibody arrays: an embryonic but rapidly growing technology. //Drug Discovery Today Vol.7, No. 18 (Suppl.), 2002 143-149.

54. MacBeath G., Schreiber S. Priniting proteins as microarrays for high -throughput function determination. //Science. 2000 289, 1760-1763.

55. Sreekumar A., Nyati M., Varambally S., Barrette Т., Ghosh D., Lawrence Т., Chinnaiyan A. Profiling of Cancer Cells Using Protein Microarrays: Discovery of Novel Radiation-regulated Proteins. //Cancer. Res. 2001. 61, 7585-7593.

56. Schweitzer В., Roberts S., Grimwade В., Shao W., Wang W. Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification. //Nat. Biotechnol. 2002.20,359-365.

57. Zhu H, Bilgin M, Bangham R, Hall D, Casamayor A, Bertone P, Lan N, Jansen R, Bidlingmaier S, Houfek T, Mitchell T, Miller P, Dean RA, Gerstein M, Snyder M. Global Analysis of Protein Activities Using Proteome Chips. //Science. 2001.293,2101-2105.

58. Houseman В., Huh J., Kron S., Mrksich M. Peptide chips for the quantitative evaluation of protein kinase activity. //Nature Biotechnol. 2002. 20, 270-274.

59. Paweletz C., Charboneau L., Bichsel V., Simone N., Chen Т., Gillespie J., Emmert-Buck M., Poli M.A., Rivera V.R., Hevetson J.F., Merril G.A. Detection of ricin by colorimetric and chemiluminescence ELISA. //Toxicon. 1994. 32, 1371-1377

60. Knezevic V., Leethanakul C., Bichsel V., Worth J., Prabhu V., Gutkind J., Liotta L., Munson P., Petricoin E. Proteomic profiling of the cancer microenvironment by antibody arrays //Proteomics. 2001. 1, 1271-1278

61. Thomas Kodadek. Protein microarrays: prospects and problems. //Chemistry & Biology 8 (2001) 105-115.

62. Emili AQ, Cagney G. Large-scale functional analysis using peptide or protein arrays. //Nat Biotechnol. 2000 Apr;18(4):393-7

63. Pavel Arenkov, Alexander Kukhtin, Anne Gemmel, Sergey Voloshchuk, Valentina Chupeeva and Andrei Mirzabekov. Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reactions. //Analytical Biochemistry 278 (2000) 123131.

64. Ekins RP. Ligand assays: from electrophoresis to miniaturized microarrays. //Clin Chem. 1998 Sep;44(9):2015-30.

65. Sobek J, Bartscherer K, Jacob A, Hoheisel JD, Angenendt P. Microarray technology as a universal tool for high-throughput analysis of biological systems. //Comb Chem High Throughput Screen. 2006 Jun;9(5):365-80.

66. Phizicky EM, Fields S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. //Microbiol Rev. 1995 Mar;59(l):94-123.

67. Silzel JW, Cercek B, Dodson C, Tsay T, Obremski RJ. Mass-sensing, multianalyte microarray immunoassay with imaging detection. //Clin Chem. 1998 Sep;44(9):2036-43.

68. Peter Mitchell. A perspective on protein microarrays. //Nature Biotechnology Vol.20 march 2002 225-229

69. Carl A.K. Borrebaeck. Antibodies in diagnostics from immunoassays to protein chips. //Immunology today. Vol.21 No.8 (2000) 379-382

70. Cahill, D. Protein and antibody arrays and their medical applications. //J. Immunol. Methods (2001) 250, 81-91

71. Haab, В. B. Methods and applications of antibody microarrays in cancer research. //Proteomics (2003) 3, 2116-2122

72. Sreekumar, A., and Chinnaiyan, A. M. Using protein microarrays to study cancer. //BioTechniques suppl., (2002) 46-53

73. Nielsen, U. В., and Geierstanger, В. H. Multiplexed sandwich assays in microarray format. //J. Immunol. Methods (2004) 290, 107-120

74. Sun Z, Fu X, Zhang L, Yang X, Liu F, Hu G. A protein chip system for parallel analysis of multi-tumor markers and its application in cancer detection. //Anticancer Res. 2004 Mar-Apr;24(2C):l 159-65.

75. Petrilc J. Diagnostic applications of microarrays. //Transfus Med. 2006 Aug;16(4):233-47

76. Zhang S. Hydrogels: Wet or let die. //Nat Mater. 2004 Jan;3(l):7-8.

77. Kiyonaka S, Sada K, Yoshimura I, Shinkai S, Kato N, Hamachi I. Semi-wet peptide/protein array using supramolecular hydrogel. //Nat Mater. 2004 Jan;3(l):58-64. Epub 2003 Dec 7.

78. Mezzasoma L, Bacarese-Hamilton T, Di Cristina M, Rossi R, Bistoni F, Crisanti A. Antigen microarrays for serodiagnosis of infectious diseases. //Clin Chem. 2002 Jan;48(l):121-30.

79. Bacarese-Hamilton T, Mezzasoma L, Ingham C, Ardizzoni A, Rossi R, Bistoni F, Crisanti A. Detection of allergen-specific IgE on microarrays by use of signal amplification techniques. //Clin Chem. 2002 Aug;48(8): 1367-70.

80. Guschin, D., Yershov, G., Zaslavsky, A., Gemmell, A., Shick, V., Proudnikov, D., Arenkov, P. & Mirzabekov, A. Manual manufacturing of oligonucleotide, DNA and protein microchips. //Anal. Biochem. (1997) 250, 203-211.

81. Mirzabekov, A.D., A.Yu. Rubina, S.V. Pan'kov, A.N. Perov, and V.V.

82. Chupeeva, Enhelhart Institute of Molecular Biology of RAS, Moscow, Russia.

83. Composition for polymerization immobilization of biological macromolecules in hydrogels on forming of biochips, method for preparation of the composition, biochip and method for carrying out PCR on a biochip. //PCT/RU 01/00445, priority of 25.07.2001.

84. V.A. Vasiliskov, E.N. Timofeev, S.A. Surzhikov, A.L. Drobyshev, V.V. Shick, and A.D. Mirzabekov. Fabrication of microarray of gel-ommobilized compounds on a chip by co-polymerization. //BioTechniques 1999 27:592-606.

85. Timofeev, E. & Mirzabekov, A. Binding specificity and stability of duplexes formed by modified oligonucleotides with a 4,096-hexanucleotide microarray. //Nucl. Acids Res. (2000) 29 (12) 2626-2634

86. Dubiley, S., Kirillov, Eu., & Mirzabekov, A. Polymorphism analysis and gene detection by minisequencing on an array of gel-immobilized primers. //Nucleic Acids Res. 1999 Sep 15;27(18):el9.

87. Zasedateleva O., Krylov A., Prokopenko D., Skabkin M., Ovchinnikov L.,

88. Kolchinsky A., Mirzabekov A. Specificity of mammalian Y-box binding proteinp50 in interaction with ss and ds DNA analyzed with generic oligonucleotide microchip. //J. Mol. Biol. (2002) 324 73-87.

89. Nasedkina, Т.; Domer, P.; Zharinov, V.; Hoberg, J.; Lysov, Yu.; Mirzabekov, A. Identification of chromosomal translocation in leukemias by hybridization with oligonucleotide microarrays. //Haematologica (2002) 87 (4) 363-372

90. АЛО. Рубина, C.B. Паньков, C.M. Иванов, Е.И. Дементьева, академик АД. Мирзабеков. Белковые микрочипы. //Доклады Академии Наук, 2001, том 381, №56 с.701-704

91. Stomakhin, V.Vasiliskov, Е. Timofeev, D.Schulga, R. Cotter, & A.

92. Mirzabekov. DNA sequence analysis by hybridization with oligonucleotidemicrochips: MALDI mass spectrometry identiofication of 5-mers contiguouslystacked to microchip oligonucleotides. //Nucl. Acids Res. 28 (5) (2000) 1193-1198

93. Gryadunov D., Mikhailovich V., Noskov A., Lapa S., Sobolev A., Pan'kov S., Rubina A., Zasedatelev A., & Mirzabekov A. Detection of Bacillus anthracis using multiplex PCR on the oligonucleotide biochip, //Dokl. Biochem. Biophys. (2001) 381 384-386

94. Дементьева Е.И., Рубина А.Ю., Дарий E.JI. и др. Применение белковых микрочипов для количественного определения опухолеассоциированных маркеров. //ДАН. 2004. 395, 542-547.

95. Rubina A.Yu., Dyukova V.I., Dementieva E.I. et al. Quantitative immunoassay of biotoxins on hydrogel-based protein microchips. //Anal. Biochem. 2005.340,317-329.

96. И.В. Березин, Н.Л. Клячко, А.В. Левашов и др. Иммобилизованные ферменты. //М.:Высш.шк. 1987 с.58-67

97. Zubtsov DA, Ivanov SM, Rubina AY, Dementieva EI, Chechetkin VR, Zasedatelev AS. Effect of mixing on reaction-diffusion kinetics for protein hydrogel-based microchips. //J Biotechnol. 2006 Mar 9; 122(1): 16-27. Epub 2005 Sep 22

98. Barsky V., Perov A., Tokalov A., Chudinov A., Kreindlin E., Sharonov A., Kotova E., Mirzabekov A Fluorescence data analysis on gel-based biochips. //J. Biomol. Screen. 2002. 7, 247-257