Разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антигенов Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma hominis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Шершнёва, Наталья Николаевна

• Шершнёва, Наталья Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шершнёва, Наталья Николаевна

Список сокращений

Введение

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О ПРЕДСТАВИТЕЛЯХ

КЛАССА MOLLICUTES.

1.1 .Характеристика семейства Mycoplasmataceae.

1.2.Биологические особенности микоплазм.

1.3 .Патогенные свойства микоплазм.

Глава II. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ МИКОПЛАЗМАМИ.

2.1. Методы лабораторной диагностики микоплазменных инфекций.

2.2.Современное представление об иммуноферментном анализе.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Глава IV. КОНСТРУИРОВАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ МИКОПЛАЗМЕННЫХ АНТИГЕНОВ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ.

4.1.Разработка модельной тест-системы для определения антигенов M.pneumoniae.

4.2.Разработка модельной тест-системы для определения антигенов M.hominis.

Глава V. АПРОБАЦИЯ РАЗРАБОТАННЫХ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ НА КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

5.1. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы в сравнении с другими методами, используемыми для выявления антигенов M.pneumoniae.

5.2. Характеристика белкового профиля в ЭПАГ мембранных и растворимых антигенов M.pneumoniae (FH).

5.3. Иммуноблоттинг сывороток больных с респираторной микоплазменной инфекцией.

5.4. Иммуноблоттинг ЦИК, выделенных из проб сыворотки крови больных с респираторной инфекцией.

5.5. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы в сравнении с другими методами, используемыми для выявления антигенов M.hominis.

5.6. Характеристика белкового профиля в ЭПАГ мембранных белков и целых клеток M.hominis.

5.7.Иммуноблоттинг проб сыворотки крови больных урогенитальной инфекцией.

5.8. Иммуноблоттинг ЦИК, выделенных из проб сыворотки крови больных урогенитальными инфекциями.

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антигенов Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma hominis»

Актуальность работы:

В последнее время внимание многих исследователей направлено на изучение микоплазм, часто являющихся причиной развития патологических процессов в органах мочеполовой и респираторной системы. Основным возбудителем респираторного микоплазмоза является Mycoplasma pneumoniae. Среди всех респираторных инфекций доля респираторного микоплазмоза, вызванного M.pneumoniae, составляет 10-20%, пневмонии микоплазменной природы регистрируются в 10-16,3% случаев от общего числа пневмоний в различных возрастных группах (11,22,101). Ureaplasma urealyticuM, Mycoplasma hominis и Mycoplasma genitalium заселяют урогенитальный тракт и вызывают воспалительные, чаще всего хронические заболевания мочеполового тракта человека и могут служить причиной повторных спонтанных абортов, мужского и женского бесплодия (123,126). Распространенность M.hominis среди населения по данным разных авторов варьирует от 10 до 50%. Внутриутробные заболевания среди новорожденных, обусловленные M.hominis, составляют 34,4% среди всех внутриутробных инфекций (39; 23).

Микоплазмы являются мембранными паразитами, при этом тесное взаимодействие с мембраной клетки хозяина способствует обмену антигенными комплексами, что позволяет им "ускользать" от иммунологического надзора со стороны иммунной системы хозяина, а повторное инфицирование, или затяжное, хроническое течение болезни может способствовать возникновению аутоиммунного синдрома (101).

Факторы патогенности возбудителя генетически детерминированы. Их принято подразделять на 4 группы: (1) определяющие взаимодействие возбудителя с эпителием соответствующих экологических ниш и колонизацию зоны первичного инфицирования; (2) обеспечивающие устойчивость микробов к факторам защиты макроорганизма и способность к размножению in vivo; (3) индуцирующие синтез цитокинов и медиаторов воспаления, ассоциированных с иммунопатологией; (4) токсины, и токсические продукты, вызывающие патологические изменения в органах и тканях макроорганизма (Бондаренко В.М., 1999). Патогенное действие микоплазм может проявляться как токсическими биомолекулами (токсины, ферменты, метаболиты), так и факторами патогенности, обеспечивающими адгезию, колонизацию и персистенцию возбудителя в организме хозяина. Микоплазменные инфекции не имеют патогномонических особенностей, что чрезвычайно затрудняет клиническую диагностику заболеваний и это обстоятельство выделяет раздел лабораторной диагностики в один из наиболее важных.

В настоящее время диагностика микоплазменных инфекций основывается на микробиологических, иммунологических, иммунохимических и генетических методах. Если раньше основной упор делали на микробиологические тесты, то внедрение новых лабораторных технологий, таких как иммуноферментный анализ (ИФА), реакция прямой и непрямой иммунофлуоресценции (РИФ), полимеразная цепная реакция (ПЦР) создали принципиально новую возможность для диагностики, инфекций, обусловленных микоплазмами (23, 52, 100). Сейчас перед специалистами стоят задачи по повышению надежности и репрезентативности методов диагностики, что во многом зависит от уровня информативности лабораторных методов исследования и расширения диагностических возможностей. Решение этих проблем позволит применить комплексный подход к лабораторной диагностике, контролю лечения, прогнозированию течения инфекций и внедрению масштабного тестирования отдельных групп населения на ряд инфекций микоплазменной природы.

Большой популярностью в лабораторной практике пользуется иммуноферментный анализ, в основе которого лежит образование комплекса "антиген-антитело" на твердой фазе полистироловых планшет и дальнейшая регистрация ферментной метки (13, 20). Основными преимуществами метода являются: высокая чувствительность и специфичность, возможность одновременного исследования большого количества проб, объективная оценка результатов, простота постановки. ИФА является универсальным методом и позволяет выявлять в сыворотке крови и в других биосубстратах специфические антитела различных классов и субклассов (чаще всего определяют антитела классов IgM и IgG). В последние годы появились тест-системы, предназначенные для определения антигенов различных видов микроорганизмов. По чувствительности ИФА уступает лишь ПЦР, широкое использование которой ограничивает необходимость иметь специальное оборудование.

На сегодняшний день в России нет зарегистрированных диагностикумов на основе ИФА для выявления микоплазменных антигенов в клиническом материале. Для дифференциальной диагностики инфекций респираторного тракта фирма "SERION" (Германия) предлагает иммуноферментную тест-систему "ELISA antigen Quadrogen", построенную по принципу сэндвича, для выявления антигенов M.pneumoniae, вирусов гриппа А и В и респираторного синтициального вируса в клиническом материале. В 1991 г. Hirschberg L. et. al. применили в своих исследованиях систему "Semimonoclonal Double-Sandwich Test" (Швеция) для выявления антигенов М. pneumoniae с использованием моноклональных антител. Публикации о диагностике инфекций, обусловленных M.hominis, методом ИФА отсутствуют как в зарубежных, так и в отечественных литературных источниках.

Представленные данные свидетельствуют о необходимости разработки отечественных тест-систем на основе иммуноферментного анализа для выявления антигенов микоплазм у больных с респираторными и урогенитальными инфекциями с целью верификации этиологического диагноза.

Цель исследования: разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антигенов микоплазм в клиническом материале от больных с респираторными и урогенитальными заболеваниями человека.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Получить высокоактивные иммунные сыворотки к цитоплазматическим мембранам клеток М. pneumoniae и М. hominis.

2) Разработать иммуноферментные тест-системы для выявления антигенов М. pneumoniae и М. hominis в ИФА и дать оценку их специфичности и чувствительности.

3) Апробировать тест-системы на клиническом материале, полученном от больных с респираторными и урогенитальными микоплазменными инфекциями.

4) Определить условия выявления в ИФА антигенов М. pneumoniae и М. hominis в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в пробах сыворотки крови.

5) Дать электрофоретическую характеристику антигенов М. pneumoniae и М. hominis с помощью «Вестерн-блот» анализа.

6) Провести иммуноблоттинг в пробах сыворотки крови для подтверждения специфичности обнаружения в ИФА антигенов М. pneumoniae и М. hominis в свободном состоянии и в составе ЦИК.

Научная новизна:

Получены высокоактивные гипериммунные сыворотки к М. pneumoniae и М. hominis путем иммунизации кроликов фракциями цитоплазматических мембран клеток микоплазм. Антитела, выделенные из иммунных сывороток, были использованы для создания диагностических тест-систем на основе ИФА для определения антигенов М. pneumoniae и М. hominis в свободном состоянии и в составе ЦИК в сыворотках крови больных с заболеваниями респираторного и урогенитального тракта.

Специфичность, чувствительность и диагностическая значимость разработанных вариантов ИФА была показана на примере анализа проб сыворотки крови больных с респираторными и урогенитальными микоплазменными инфекциями и подтверждена результатами дополнительных исследований этих образцов на присутствие антигенов М. pneumoniae и М. hominis и антител к ним в ИФА, РАГА и иммуноблоттинге.

Научно-практическая значимость работы.

Разработаны варианты ИФА для обнаружения антигенов М. pneumoniae и М. hominis в клиническом материале, полученном от больных с респираторной и урогенитальной патологией, и показана их диагностическая значимость. Предложен метод выявления микоплазменных антигенов в составе циркулирующих иммунных комплексов, который дает возможность увеличить специфичность и чувствительность разработанных тест-систем и проследить длительность персистенции микоплазм в организме больного. С целью повышения эффективности диагностики микоплазменных инфекций рекомендуется применять ИФА в комплексе с РАГА, РИФ или ПЦР в практике клинических и экспериментальных лабораторий, занимающихся диагностикой микоплазменных инфекций.

Внедрение результатов работы.

Составлены Методические рекомендации «Изготовление и контроль тест-системы диагностической для определения антигенов Mycoplasma pneumoniae в иммуноферментном анализе» и «Изготовление и контроль тест-системы диагностической для определения антигенов Mycoplasma hominis в иммуноферментном анализе», предназначенные для микробиологов, иммунологов и других специалистов, занимающихся разработкой и производством диагностических препаратов. Методические рекомендации одобрены на Совете по внедрению научных достижений в практику в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН (протокол № 8 от 19 марта 2009 г.).

Положения, выносимые на защиту: - на основе ИФА разработаны высокочувствительные методы обнаружения антигенов M.pneumoniae и M.hominis в клиническом материале, полученном от больных с респираторной и урогенитальной патологией. Исследование сывороток крови на присутствие микоплазменных антигенов в РАГА, иммуноблоте и антител к ним в ИФА подтвердило специфичность данных тест-систем.

- способ определения антигенов M.pneumoniae и M.hominis в составе ЦИК увеличивает чувствительность ИФА, а совместная диагностика, как свободных, так и связанных в ЦИК антигенов позволяет установить длительность персистенции антигенов в макроорганизме.

- протестированные в иммуноблоте антигены M.pneumoniae и M.hominis, обнаруженные в ИФА, имеют широкий протеиновый спектр (от 30 до 170 кДа и от 25 до 120 кДа соответственно) и содержат как специфические, так и патогенетически значимые антигены.

Апробация работы.

Апробация состоялась на совместной научной конференции отдела медицинской микробиологии и лаборатории микоплазм и L-форм бактерий ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 18 февраля 2009 года.

Материалы диссертации были обсуждены и доложены на:

- X Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2006 год, Санкт-Петербург.

- Российской - научно-практической конференции «Инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами», 2007 год, Москва.

- Конференции «Современные технологии в диагностике инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами», 2009 год, Краснодар.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Глава 1. Современное представление о представителях класса Mollicutes.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Шершнёва, Наталья Николаевна

выводы.

1. Впервые на основе поликлональных антител к M.pneumoniae и M.hominis разработаны варианты ИФА для выявления микоплазменных антигенов у больных с респираторными и урогенитальными заболеваниями. Чувствительность модельных тест-систем составила 2 нг/мл (по белку).

2. Показано, что с помощью разработанных вариантов ИФА у больных с респираторной и урогенитальной инфекцией в 48 % и 82% случаев обнаружены антигены M.pneumoniae и M.hominis соответственно. Полученные результаты подтверждены выявлением микоплазменных антигенов в РАГА и иммуноблоттинге, специфических антител в ИФА.

3. Спектр выявляемых в иммуноблотинге антигенов M.pneumoniae и М. hominis в сыворотках крови больных с респираторной и урогенитальной микоплазменными инфекциями находился в пределах от 30 до 170 кДа и от 25 до 120 кДа соответственно и содержал основные специфические антигены.

4. Разработана методика определения в ИФА антигенов M.pneumoniae и M.hominis в составе ЦИК в пробах сыворотки крови больных с респираторными и урогенитальными инфекциями.

5. Установлено, что использование метода диссоциации ЦИК повышает чувствительность выявления антигенов M.pneumoniae и M.hominis при респираторных и урогенитальных заболеваниях.

6. Иммуноэлектрофоретическая характеристика специфических антигенов в составе ЦИК, выявляемых в ИФА, показала, что антигенный спектр M.pneumoniae и М. hominis находился в диапазоне от 50 до 170 кДа и от 55 до 120 кДа соответственно.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шершнёва, Наталья Николаевна, 2009 год

1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы микробиологических исследований. — Л.:Изд-во Медгиз, 1962.С. 178.

2. Биргер М.О. «Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования» Москва, Медицина, 1982, с.464.

3. Бондаренко В.М., «Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса» //Журн. Микробиол. 1999; 5; 34-39.

4. Вонский М.С., Аствацатурянц Г. В., Борхсениус С. Н. Экспрессия белков теплового шока у микоплазм//ДАН. 1993. Т. 331. С. 112-115.

5. Голубева Т.Н. «Факторы патогенности микоплазм урогенитального тракта и чувствительность к антимикробным препаратам». http://www.laborama.ru/articles.

6. Горина Л.Г., Вульфович Ю.В., Зильфян А.В. и др. «Микоплазменные артриты человека и некоторые механизмы их патогенеза» Вестник академии наук 1989 г., №6, с. 84-87.

7. Горина Л.Г., Гончарова С.А., Ланге А., Каган Г.Я. Определение свободного и связанного в имунные комплексы антигена Mycoplasma pneumoniae у больных острыми респираторными заболеваниями.// Лаб. Дело. — 1983-№11-с. 8-10.

8. Горина Л.Г., Вульфович Ю.В. Дифференциация антигенов в составе циркулирующих иммунных комплексов. // Журнал микробиология. — 1996-№1-с. 47-50.

9. Горина Л.Г., Каган Г.Я, Гаврилова и др. Свободный и связанный антиген L-форм стрептококка группы А и уровень циркулирущих иммунных комплексов у больных рожей. // Журнал микробиология. — 1983-№9-с. 106109.

10. Горина Л.Г., Гончарова С.А., Раковская И.В., Машканцева И.В.Частота обнаружения микоплазм при заболеваниях органов дыхания. // Журнал лабор. мед. 2005-№9-с.57-58.

11. Гриппи М. А. Патофизиология легких. Москва. СПб, изд-во БИНОМ -Невский диалект, 2001, с. 19-43.

12. Егоров A.M., Осипов А.П. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. Москва: Высш. шк., 1991. стр. 114.

13. Жевержеева И.В., Коптелова Е.И., Неустроева В.В., Вульфович Ю.В. и др. Индикация микоплазм в синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом. // ЖМЭИ. 1983. -№9 - стр.63-66.

14. Зильфян A.B. Патогенез и нммуноморфологическая характеристика экспериментальных артритов, индуцированных микоплазмами arthritidis и fermentans. : Дис. докт. мед. наук. М., 1986.

15. Кац JI.H. Мембранный аппарат L-форм бактерий. // Биомембраны. Рига.: Изд-во Знание. 1977. стр.105.

16. Кац JI.H. Субмикроскопическая структура микроорганизмов с дефектом клеточной стенки. // Успехи микробиол. АН СССР. — 1980. №15. — стр. 180-196.

17. Каган Г .Я. Mycoplasma pneumoniae и респираторные микоплазмозы. Микоплазмы в патологии человека. 1981. М. С. 3-24.

18. Немченко О.И., Уварова Е.В. ФГУ НЦ АГиП "Росмедтехнологий" Журнал: Consilium medicum. Том 09/N1. 2007. http://www.consilium-medicum.com.

19. Нго Т.Г., Ленхофф Г. Иммуноферментный анализ. -1988.- Москва-Мир. -с.256.

20. Покровский В.И. «Медицинская микробиология», ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1998, 183.

21. Прозоровский С.В., Раковская И.В., Вульфович. «Медицинская микоплазмология». Москва. Медицина. 1995, с. 42-43. , стр.262, стр. 187188.

22. Раковская И.В., Горина Л.Г. Лабораторная диагностика микоплазмозов человека. Клин лаб. диагностика 1999; 11:6 7.

23. Раковская И.В. Микоплазмы и патологии человека. — М.: Мзд-во ВНИИМИ, 1981. с.70-82.

24. Руденко А.В. Роль hominis в этиологии и патогенезе нефрологических и урологических заболеваний: Дисс. . докт. мед. наук. Киев, 1986.

25. Синопальников А.И. Атипичная пневмония: диагностика и лчение.// Российские медицинские вести. 2000.-№1.

26. Теплов С.А., Назарова Л.С., Елисеева И.П. Уретриты, циститы, кольпиты, вульвовагиниты. М.: КРОН-Пресс, 2000.

27. Токарев М. «Что такое масс-спектроскопия?» htpp//www.textronica.com.

28. Фримель X. Иммунологические методы. Издательство «Мир», Москва, 1979, стр. 31 и 264-273.

29. Andersen Н., Birkelund S., Christiansen G et.al. Electrophoretic analysis of proteins from M.hominis strains detected by SDS-Page, two-dimensional gel electrophorezis and immunoblotting. // J.Gen.Mycrobiol. 1987.-Vol.133. -p.181-191.

30. Bartholomew L.E: Isolation and characterization of mycoplasmas (PPLO) from patients with rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus and Reiter's Syndrome. Arthritis Rheum 1965, 8:376-388.

31. Baseman В., Banai.M., Kahane J. Sialic and residues mediate M.pneumoniae attachment to human and sheep erythrocytes. Infection and Immunity. 1982. Vol.38. P.389-391.

32. Baseman J.B., D.L. Drouillard,D.K. Leith, and Tully J.G. Absence of Mycoplasma pneumoniae cytoadsorbtion protein PI in Mycoplasma genitalium and Mycoplasma gallisepticum. Infect. Immun. 43:1103-1105.

33. Bendjennat M., Blanchard A., et. al. Role of Mycoplasma penetrans Endonuclease P40 as a potential pathogenic determinant. Infect. Immun. 1999. Vol.67, No 9, p. 4456-4462.

34. Bernet C., Garret M., de Barbeyrac В., et al. Detection of Mycoplasma pneumoniae by using the polymerase chain reaction. // Journal of clinical microbiology. 1989-Vol.27-p.2492-2496.

35. Biberfeld G., Norberg. Circulating immune complex in Mycoplasma pneumoniae infection. //J. immunol. 1974. 112. 413-415.

36. Birkelund S., Christiansen G., et.al. Cloning sequencing and variability analysis of a non-ouspensable 75 kD membrane protein from Mycoplasma hominis. 13 IOM. Japan. 2000, p. 133.

37. Blanchard A. Ureaplasma urealyticum urease genes; use of a UGA tryptophan codon. Mol Microbiol 1990; 4 (4): 669-76.

38. Blanchard A. and Bebear,C.M. Mycoplasmas of humans. In Razin S. and Herrmann R., et. al. Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas. Kluwer Academic/Plenum Publishers, London, 2002, pp. 45-71.

39. Boesen Т., Christiansen G. et al. // Mol. Microbiol. 1998. V. 29. P. 97-110.

40. Boesen Т., Emmerson L.T., Jensen S.A., et.al. The Mycoplasma hominis vaa gene displays a mosaic gene structure. Mol. Microbiol. 1998. V. 29. P. 97-110.

41. Busolo Franco, Tonin Enrico and Conventi Luciano. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. // J. of Clin. Mycrobiol. 1980 - July - p.69-73.

42. Catrein I., Pizkl E., Herrmann R. Genetic variation and adherence in Mycoplasma pneumoniae. 14 IOM. Austria. 2002. p. 138.

43. Christiansen G., Methiesen S., Ladenfogel S. Abstr. X Congr. IOM. 1990, Turkey, p. 111.

44. Cimolai N., Bryan.L.E., To M., and Woods D.E. Immunological Cross-Reactivity of a Mycoplasma pneumoniae Membrane-Associated Protein Antigen with Mycoplasma genitalium and Acholeaplasma laidlawii, Clinical Mycrobiology, Nov. 1987, p. 2136-2139.

45. Clark H.W., Coker-Vann M.R., Bailey J.S., Brown T. Detection of mycoplasmal antigen in immune complexes from reumathoid arthritidis synovial fluids. // Annals, of allergy. 1988. 60. p. 394-398.

46. Clark H., Bauley J., Brown T. Medium-dependent properties of mycoplasmas. Diagn.Mycrobiol.Infect.Dis. 1985. Vol.3. №4. p.283-294.

47. De Silva N.S., QuinnP.A. J.Clin.Microbiol. 1986. Vol.135, p. 683-691.

48. Deguchi Т., Gilroy C.B., Taylor-Robinson D. Failure to detect Mycoplasmafermentans or M.pirum in the uretra of patients with acute nongonococcal urethritis. J.Clin.Microbiol.Inf.Dis. 1996. Vol. 15. p.169-171.

49. Digeon M., Laner M., Risa I. Detection of circulation immune complex in human serum by simplified assays with polyethyleneglicol//l. Immunol. Meth.— 1977.— V. 16.—P. 165-172.

50. Dorigo-Zetsma L.W., Zaat S.A., Wertheim von Dillen P.M.E., et al. Comparison of PCR, culture and serological tests for diagnosis of Micoplasma pneumoniae respiratory tract infection in children. J Clin Microbiol 1999;37:14-7.

51. Duffy M.E., Whithear K.G., et al. Indirect enzyme linked immunosorbent assay for detection of immunoglobuline G reactive with a recombinant protein-expressed for the gene encoding the 116 KD protein of M.pneumoniae . J Clin Microbiol 1999;37:1024-9.

52. Ejsing Т., Birkelund S., Christiansen G. Establishment of colonial Mycoplasma hominis 7488 cell lines. 13 IOM. Japan.2000, p. 132.

53. Ekins R.P. Mycroarrays: their origins and applications. Tibtech. 1999, 17, p.217-218.

54. Feizi Т., Loveless R.W. 1996. Cerbohydratc recognition by Mycoplasma pneumoniae and pathologic consequences II Amer.J.Res.Crit.Care Med. Vol.l54.P.133-136.

55. Fernald G.W. Immunologic interactions between host cells and mycoplasmas: an introduction. Rev. Infect. Dis. 1982. Vol.4. Suppl. P. 201-204.

56. Fernald G.W., Clyde W. Protective effect of vaccines in experimental M.pneumoniae disease. // Infect. Immunity. 1970.-Vol.1.-p.559-565.

57. Fisselia M., Popham P., Birkhead K, Krause D. Exploring HMW1 and HMW2 function in Mycoplasma pneumoniae. 13 IOM. Japan. 2000, p. 167.

58. Freundt E.A. Methods in Mycoplasmology. Academic Press. New York. 1983. Vol. 1, p. 9-13.

59. Fu P.C., Vodian M., Balga M., et al., Perfomance characteristics of a competitive solid fase enzyme immunoassay for serum Digoxin. 1983. Clin. Chem., 29, 1012.

60. Gerlic M, Horowitz J, S Farkash, S Horowitz. The inhibitory effect of Mycoplasma fermentans on tumour necrosis factor (TNF)-alpha-induced apoptosis resides in the membrane lipoproteins. Cellular microbiology. 2007 Jan;9(l): 142-53.

61. Habermann V.E., Ein neus prinzip zur quantativen bestimmung hochmolekularer antigene, 1970. Z. Klin.Chem. u. Klin.Biochem., 8, 51055.

62. Hauge S., Ladefoged S., Birkelund S., et. al. Abst. 7-th Congr. IOM. Baden, Austria, 1988, p. 8.

63. Henrich B.A., Feldman, Hadding U. Cytoadhesins of Mycoplasma hominis. Infect. Immun. 61:2945-2951.

64. Hirschberg L., Holme T. «ELISA for detection of Mycoplasma pneumoniae antigens using monoclonal antibodies». APMIS. 1991. May. 99(5): 475-81.

65. Hollingdale M. The role of Mycoplasma membrane proteins in the adsorbtion of animal cells to M.hominis colonies. J. Gen.Mycrobiol. 1972. Vol.70. P.391-393.

66. Horowitz S., Yevirison В., Horowitz J. «Mycoplasma fermentans in Rheumatoid arthritis and other inflammatory arthritis», 12 IOM, 1998, p.96.

67. Horn Abele M., Busch U., Nitscheo, et al. Molecular approaches to diagnosis of pulmonary diseases due to M.pneumoniae. J Clin Microbiol 1998;36:548-51.

68. Ни P.C., Kenny G.E. Abstr. Ann. Meet. Amer. Soc. Microbiol. 1987. G.28. P.118.

69. Ishikawa et al., Major factors limiting sensitivity of sandwich enzyme immunoassay for ferritin, immunoglobulin E, and thyroid-stimulating hormone, 1982. Ann.Clin.Biochem., 19, 379-384. 1982.

70. Jacobs. E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical state in different populations of patients. // Clin. Infect. Dis. 1993-17-p.579-582.

71. Jansson E., Makisara P., Vianio K. et.al. An 8-year study on Mycoplasma in rheumatoid arthritidis // Scand. J. Rheum. 1971. - Vol. 30. - p. 506-508.

72. Kenny G. Serological cross-reaction between lipids of M.pneumoniae and M.neurolyticum.// Infect.Immunity. 1981. - Vol.4. - p. 149-152.

73. Kuppeveld F.J., Johansson K.E., et.al. 16S r RNA based polymerase chain reaction compared with culture and serological methods for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. // Eur.J.Clin.Microbiol. Infect. Dis. 1994. -Vol.13 -p.401-405.

74. Ladenfogen S. A., Christiansen G. //Microbiolgy. 1998.V. 144. P. 761-770.

75. Ladenfogen S. A. Molecular dissection of Mycoplasma hominis. Apmis. V 108. p.5-45.

76. Laemmli U.K, 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London), 227: 680-685.

77. Lin S.K., Lucier I.S., Huang C.H., Heitzman K., Hu S.C., P.C.Hu. Genetic and biologic characterization of transpose generated cytoadherence-deficient of Mycoplasma pneumoniae. 12 IOM, 1998, p.159.

78. Ling M.C. Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies. 1975. United States Patent No. 3, 867,517.

79. Lo S.-C. et al. // Clin. Infect. Dis. 2003. V. 36. P. 1246-1253.

80. Maeda H. Paradigm shift in microbial pathogenesis: an alternative to the Koch-Pasteur paradigm on the new millennium // 13th Intern. IOM Congress. 2000. Abstracts, p. 35. Fukuoka, Japan.

81. Maiolini R., Masseyeff R. A sandwich method of enzyme immunoassay. I. Aplication to rat and human alpha- fetoprotein. 1975. J. Immunol Methods, 58, 293-300. 25.

82. Michael F.Duffy. Endirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for detection immunoglobulin G Reactive with a recombinant protein expressed from the gene Encoding the 116-kD Protein of Mycoplasma pneumoniae. Journal of clinical Microbyology, 1999.

83. Miettinen A., Hakkaranen K., Jansson E. et.al. Abst. 7-th Congr. IOM.- Baden, Austria, 1988.- p.82.

84. Miettinen Ari., Hannu Turunen, Jorna Paavonen, Elli Janson, and Paul Leinikki. Detection of Mycoplasma hominis antigen in clinical specimens by Enzime Immunoassay (EIA). Journal of Immunological Methods. 69. 1984. 267-275.

85. Minion F., Coguen J. Diffusion of target cell membrane proteins allows recognition of cryptic binding sites by M.pulmonis hemagglutinin. Infection and Immunity. 1985. Vol.48. №2. P.579-580.

86. Mizutani Hiroko, Mizutani Hiromishi. Circulating immune complexes in patients with Mycoplasma pneumoniae. // Am. Rev. Resper. Dis. 1984. 130. p 627629.

87. Morrison-Plummer, J.A.Lazell, and J.B.Baseman. 1987. Shared epitopes between Mycoplasma pneumoniae major adhesion protein PI and a 140-kilodalton protein of Mycoplasma genitalium. Infect. Immun. 55:49-56.

88. Nishimura M., Saida Т., Kuroki S. et al. 1996. Post infections encephalitis with anti-aglactocerebroside antibody subsequent to Mycoplasma pneumoniae infection // J.Neurol.Sci.Vol.l40.P.91-95.

89. Nomura M., Imai M. et al. Three-site radioimmunoassay with monoclonals for a sensitive dtermination of human alpha-phetoprotein. 1983. J. Immunol. Methods, 58, 293-300.

90. Nyvold C, Birkelund S, Christiansen G. The Mycoplasma hominis P120 membrane protein contains a 216 amino acid hypervariable domain that is recognized by the human humoral immune response. Microbiology. 1997; 143: p. 675-688.

91. Olson L.D., Shane S.W., Karpas A.A., et.al. Monoclonal antibodies to surface antigens of pathogenic Mycoplasma hominis strain. Infect. Immun. 1991. 59:1683-1689.

92. Patten В., Whithear K., Rodwell A. Attachment of Mycoplasma synoviae to erythrocytes. IOM. Tokyo. 1982. P. 152.

93. Pletsch K., Ehlers S., Jacobs E. 1994. Cytokine gene expression in the lungs of BALB/C mice during primery end secondary intranasal infection with Mycoplasma pneumoniae II Microbiology Vol. 140. P. 2043-2048.

94. Portstmann В., Portstmann Т., et al., Comparision of direct and indirect tow-site binding enzyme immunoassay. 1982. Clin.Chim.Acta, 122, 1-9.

95. Rastawicki W, Kaluzewski S, Jagielski M, Gierczynski R. Evalution of commercial usefulness for microparticle agglutination Serodia-Myco II test forserodiagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections. Med Dosw Mikrobiol. 2002. 54 (l):67-73.

96. Razin S., Herrmann R., Barile M.F. Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas, 2002, Kluwer Academic/ Plenum Publisher, New York, p.495.

97. Razin S., Yogev D., Naot Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas // In: Microbiol. Molec. Biol. Rev. 1998, 64:1094-1156

98. Razin S. Membranes and transport. 1982. Vol.1, p. 283-288.

99. Razin S., Barile M.F. The Mycoplasmas. 1983. Academic press. INC. USA p. 404-406, 479, 477, 288.

100. Razin S. The Mycoplasmas. Microbiol.Rev.- 1978.-Vol 42, N2.-p.417-470.

101. Rivera Antonio, Yanez Antonio, Leon-Tello Gloria, Gil Constantino, Giono Silvia, et.al. Experimental arthritis induced by a clinical Mycoplasma fermentans Isolate. BMC Musculoskeletal Disorders 2002, 3:15.

102. Robertson J., Stemke G. Expended serotyping scheme for U.urealyticum strains isolated from humans. J.Clin.Microbiol. 1982. Vol.15, №5, p.873-878.

103. Ross R.F., Dale S.E., Duncan J. R. 1973. Experimentally indused Mycoplasma hyorhinis arthritis of swine immune responce to 26th postinoculation work. Amer. J. Vet. Res. Vol. 34. P. 367-372.

104. TULLY, «Methods in Mycoplasmology», Academic Press, INC, USA, 1983.

105. Schaeverbeke T.,Vernhes J.P.,Lequen L.,Banwarch В., et al: «Mycoplasmas and arthritis», Rev. Rhum, 1997,64:120-12.

106. Schiefer H.-G., Gerhardt U., Brunner H. Immunological stadies on the localization of phosphatidylglycerol in the membranes of M. hominis. Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 1975. (MAO). Bd. 356. p. 559-565.

107. Sheena Johnson, David Sidebottom at al «Journal of Clinical Microbiology», Jan., 2000, p. 90-93.

108. Shimizu Takashi, Yutaka Kida, and Koichi Kuwano. A dipalmitoylated lipoprotein from Mycoplasma pneumoniae Activates NF-kB through TLR1, TLR2, and TLR6. Journal of Immunology. 2007. Aug, 121 (4): p.473-83.

109. Skakni Leila, Sardet Anne, Just Jocelyne et.al. Detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical samples from pediatric patients by polymerase chain reaction. // Journal of clinical microbiology. 1992-Oct.-p.2638-2643.

110. Smith P.F., Isr.J.med.Sci. 1987. Vol.23, p. 448-452.

111. Stanbridge E.J. Mycoplasma Lymphocyte Interaction and their possible role in immunopathologic manifestations of mycoplasmas diseas. Rev. Infect. Dis. 1982. Vol.4. P. 219-226.

112. Stanbridge E., Weiss E. Mycoplasma capping on lymphocytes. Nature. 1978. Vol. 276. №5688. P. 583-587.

113. Standefer J.C., Saunders G.C., Enzyme immunoassay for gentamicin,prolactin. 1978. Clin. Chem., 24, 1903-1907.

114. Swea M.V., Miles R.J., at. al. Potential virulence determinants of Mycoplasma fermentans strain. 14 IOM. Austria. 2002. p. 139.

115. Talkinyton D.F., Thacker W., Keller D.W., et al. Diagnosis of M.pneumoniae infection in autopsy and open-lung biopsy tissues by Nested PCR. J Clin Microbiol 1992;36:1151-3.

116. Taylor-Robinson D., Furr P.M. Geniturin. Med. 1985. Vol. 61. p. 404-408.

117. Taylor-Robinson, D., Tully J. G., and M. F. Barile. 1985. Urethral infection in male chimpanzees produced experimentally by Mycoplasma genitalium. Br. J. Exp. Pathol. 66:95-101.

118. Taylor-Robinson D., Furr P.M. Tully J. G. et.al. J. Med. Sci. 1987. Vol.23, p. 561-564.

119. Taylor-Robinson D., Furr P.M. 1997. Genital mycoplasma infections // Wien Kin. Wochenschr. Bd 109. S. 578-583.

120. Taylor R.B., Duffus W. P. H., Reff M. P., de Petris S. 1971. Redistribution and pinocytosis of lymphocyte surfase immunoglobulin molecules induced by antiimmunoglobulin antibody II Nature New Biol. Vol.223. P. 225-229.

121. Tjhie J.H.,Kuppeveld F.J. et.al. Direct PCR enables detection of Mycoplasma pneumoniae in patients with respiratory tract infections. // J. Clin Microbiol . 1994 - Vol.32-p.l 1-16.

122. Towbin H., Staehelin T. and Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 4350-4354.

123. Wang R.Y., Shih J. W., Weiss S. H. et al. 1993. Mycoplasma penetrans infection in male homosexuals with AIDS high seroprevalence and association with Kaposi's sarcoma. Cim. Infect. Dis. Vol.17. P. 724- 729.

124. Weber R., Osborn M., Proteins and sodium dodecyl sulfate: Molecular weight determinations on polyacrylamide gels and related procedures. In: The proteins, 3rd ed., H.Neurath and R.L.Hill, Academic prss, New York, 1975. v. 1, p. 179.

125. Wei-wing, Shi De-li, Chen Yang-kang Ye. Analysis of major proteins of Ureaplasma urealyticum standart serovars and local isolates. Australia, Sidney. 12 IOM. 1998, p.65/

126. Wise K., Cassel G., Acton R. Selective association of murine T lymphoblastoid cell surface alloantigens with M.hyorhinis. Proc. Natl.Acad.Sci. USA. 1978. Vol.75. P.4479-4483.

127. Wise K., Minion F., Cheung H. Translocation of thy-I antigen and a fluorescent lipide probe during lymphoblastoid cell interaction with M.hyorhinis. Rev.Infect.Dis. 1982. Vol.4. P. 210-218.

128. Wise K., Watson H. Antigenic mimicry of mammalian intermediate filaments by mycoplasmas. Infect.Immun. 1985. Vol.48. P.587-591.

129. Ye Yuan-kang, Lu De-yunn, Study of the common antigen between Ureaplasma urealyticum and human sperm. Abst. 12-th. Inter. Congr. IOM. 1998, p.66, Australia, Sidney.

130. Yorde D.E., Sasse E., Wang Т., Hussa R., Garancis J. Conjugatiive enzyme linked immunoassay with the use of soluble enzyme/antibody immune complex for labeling. I. Measurement of human choriogonatropin. 1976. Clin. Chem., 22 1372-1377.

131. You Xiao-xing, Zeng Yan-hia, WU Yi-mou. Interaction between mycoplasma lipid-associated membrane proteins and the host cells. J. of Zhejiang University SCIENCE B. 2006. 7(5): p. 342-350.