Разработка и совершенствование средств и методов оценки эффективности вакцин против бешенства тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат ветеринарных наук Недосеков, Виталий Владимирович

• Недосеков, Виталий Владимирович
• кандидат ветеринарных наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Недосеков, Виталий Владимирович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Современная молекулярная биология вируса бешенства

2.2. Антирабические вакцины

2.3. Контроль антираби ческих вакцин

2.3.1. Общие положения

2.3.2. Методы оценки антирабических инакгивированных вакцин

2.3.2.1. Метод Национальных Институтов Здоровья (NIH)

2.3.2.2. Методы определения антигенной активности инактивированных вакцин in vitro <

2.3.3. Методы определения уровня в и ру с н е йтра л изу ют и х антител

2.3.3.1. Реакция нейтрализации in vivo

2.3.3.2. Методы определения вируснейтрализующих антител in vitro

2.4. Моноклональиые антитела

2.4.1. Теоретические аспекты получения моноклональных антител

2.4.2. Использование моноклональных антител для изучения бешенства

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и совершенствование средств и методов оценки эффективности вакцин против бешенства»

1.1. Актуальность проблемы

По данным ВОЗ (25) в мире ежегодно регистрируют более 30 тысяч случаев гибели людей от бешенства. Сложная эпидемическая и эпизоотическая ситуации по бешенству в последние годы наблюдается более чем в 80 странах мира, что в значительной мере связывают с качеством вакцин и эффективностью вакцинации против бешенства. (267,273).

Несмотря на более чем столетний период применения антирабических вакцин, до сих пор остается нерешенным ряд вопросов, касающихся оценки эффективности антирабических вакцин, что является предметом постоянных исследований, дискуссий и публикаций (77).

Для определения иммуногенной активности инактивированных антирабических вакцин используют рекомендованный ВОЗ метод United States National Institutes of Health - NIH (168). Данный метод является основным тестом и широко применяется в различных странах. Однако, по мнению многих исследователей, он имеет ряд существенных недостатков: интрацеребральное заражение не повторяет естественный путь трансмиссии вируса бешенства; наличие низкой корреляции между тестом NIH и уровнем вируснейтрализующих антител у иммунизированных животных, а также при сравнении результатов тестирования, полученных на целевых животных (65,101). Кроме того использование двух инъекций вакцины при традиционном методе NIH ведет к искусственному завышению активности препаратов; требуется большое количество животных, времени (28 дней), применение инфекционного вируса; наблюдается низкая воспроизводимость метода и значительная вариабельность результатов; (53,65,74,77,280).

Инфекционную активность живых антирабических вакцин определяют методом титрования вируса бешенства на мышах (165), что требует большого количества животных, временных и экономических затрат.

Одним из критериев оценки иммуногенной активности антирабических вакцин является определение вируснейтрализующих антител в сыворотках крови (111).

Для этого используют реакцию нейтрализации на мышах. Но, несмотря на доказанные временем и практикой преимущества данного метода, он трудоемкий, дорогостоящий, требует много времени и предполагает использование инфекционного вируса.

Всё вышеперечисленное свидетельствует об актуальности поиска новых подходов к оценке эффективности антирабических вакцин.

На основании данных молекулярной структуры вируса бешенства установлено, что основным протективным белком является гликопротеин (gp 66), содержание которого коррелирует с иммуногенностью антирабических вакцин. Поэтому перспективным является разработка теста in vitro, основанного на определении содержания протективного антигена - гликопротеина (gp 66) в антирабических вакцинах, коррелирующего с иммуногенностью (92,258); кроме этого, необходим подбор чувствительной культуры клеток для определения инфекционной активности вируса бешенства, а также разработка методов оценки поствакцинального иммунитета, оцениваемого по уровню вируснейтрализующих антирабических антител.

Указанные выше проблемы послужили основной предпосылкой для разработки и усовершенствования средств и методов контроля антирабических культу-ральных вакцин.

1.2 Цель и задачи исследования

Целью работы была разработка и совершенствование средств и методов определения антигенных и иммуногенных свойств антирабических кулыуральных вакцин и оценки напряженности поствакцинального иммунитета. Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать метод определения инфекционной активности вакцинного вируса бешенства, штамм ТС-80, в культуре клеток;

- модифицировать метод NIH определения иммуногенной активности инак-тивированных антирабических вакцин;

- получить МКА к гликопротеину вируса бешенства, штамм ТС-80, и на их основе сконструировать набор препаратов для определения антигенной активности инактивированных вакцин методом иммуноферментного анализа;

- разработать экспрессные методы оценки поствакцинального иммунитета у животных, привитых против бешенства;

- определить степень корреляции результатов, полученных разработанными методами и тестами, рекомендованными ВОЗ;

- изучить иммунобиологические свойства инактивированной культуральной антирабической вакцины, изготовленной из штамма ТС-80, выращиваемого в перевиваемой культуре клеток ПС.

1.3. Научная новизна

Научная новизна работы состоит в том, что в результате проведенных исследований:

- модифицирован традиционный метод оценки иммуногенной активности инакгивированных антирабических вакцин (тест КПП), заключающийся в однократной иммунизации мышей, что ведет к сокращению времени проведения и стоимости анализа;

- впервые получены МКА, специфичные к трем эпи гонам гликоиротеина ^р 66) вируса бешенства. штамм ТС-80, индуцирующим образование вируснейтрализующих антител;

- разработан новый метод (сэндвич-вариант ТФ И ФА) оценки качества инакгивированных антирабических вакцин на основе использования моноклональных антител к антигенным детерминантам гликопротеина ^ 66) вируса бешенства;

- впервые показана возможность определения инфекционной активности вируса бешенства, штамм ТС-80, в культуре клеток ПС;

- разработаны метод двухфазного ингибирования ТФ ИФА и тест ингибиции фокусов флуоресценции (ТИФФ), являющиеся высокоэффективными методами при определении антирабических вируснейтрализующих антител в сыворотках крови животных. Получено положительное решение ФИПС о выдаче патента "Способ определения антирабических вируснейтрализующих антител" № 97116427/13 (017362) с приоритетом от 1.10.97 г.

1.4. Практическая ценность

Разработаны и рекомендованы для контроля эффективности антирабических вакцин чувствительные, производительные и экспрессные методы ТФ ИФА на основе моноклональных антител.

Разработан проект нормативных документов на "Набор препаратов для определения активности инакгивированных антирабических вакцин иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител". (Временные инструкции по изготовлению и контролю "Набора.", Технические условия, Наставления по применению "Набора." и Методические указания по постановке иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител).

Разработаны ТИФФ и ТФ ИФА, на основе МКА, для оценки напряженности поствакцинального антирабического иммунитета у вакцинированных животных.

Разработанные методы внедрены во ВНИИВВиМ при определении активности вируса на различных стадиях производства антирабических вакцин, их имму-ногенной активности, вируснейтрализующих антирабических антител в сыворотках крови привитых животных.

1.5 Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту

1. Результаты модификации метода определения иммуногенности инакти-вированных антирабических вакцин.

2. Результаты исследований по получению вируснейтрализующих моно-клональных антител к гликопротеину вируса бешенства для выявления протектив-ного антигена в антирабических вакцинах сэндвич-вариантом ТФ ИФА и обнаружения вируснейтрализующих антител в сыворотках крови привитых животных с помощью метода двухфазного ингибирования ТФ ИФА.

3. Результаты разработки теста ингибиции фокусов флуоресценции и метода определения инфекционной активности вируса бешенства (штамм ТС-80) с использованием перевиваемой культуре клеток ПС.

4. Результаты изучения иммунобиологических свойств инактивированной ан-тирабической вакцины, изготовленной из штамма ТС-80.

1.6. Апробация результатов работы.

Материалы диссертации были доложены на научных конференциях в Донском государственном аграрном университете (г. Новочеркасск, 1998), ВИЭВ (г. Москва, 1998), на заседаниях Ученого Совета ВНИИВВиМ и совещаниях научных сотрудников лаборатории "Диагностика" ВНИИВВиМ (1996-1998).

1.7. Публикация результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ.

1.8 Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 172 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (290 источников, в том числе 51 отечественные). Работа иллюстрирована 32 таблицами, 7 рисунками и дополнена приложениями.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Недосеков, Виталий Владимирович

5. ВЫВОДЫ.

1. Модифицированный метод N111, заключающийся в однократной иммунизации мышей, позволяет определять иммуногенную активность антираби-ческих вакцин при высоком уровне корреляции с традиционным тестом (г=0,99).

2. Получены МКА клонов 4Б2.2, 8Б12.4, 14Б18.2, 17Б5.3, 19Б8.1, специфичные к вируснейтрализующим эпитопам гликопротеина вакцинного вируса бешенства, штамм ТС-80, пригодные для изготовления тест-систем на основе ИФА для тестирования инактивированных антирабических вакцин.

3. Для определения антигенной активности инактивированных антирабических вакцин разработан высокочувствительный (0,0031-0,0063 МЕ) сэндвич-вариант ТФ ИФА, на основе МКА, специфичных к протекгавным эпитопам гликопротеина вируса бешенства. Метод позволяет сократить время тестирования вакцин с 28 дней до 3 часов. Коэффициент корреляции результатов, полученных при тестировании вакцин разработанным методом и тестом №Н, составляет 0,95

4. На основе МКА к вируснейтрализующим эпитопам гликопротеина вируса бешенства разработан метод двухфазного ингибирования ИФА, который обеспечивает определение вируснейтрализующих антител в сыворотках крови вакцинированных животных. Коэффициент корреляции результатов метода двухфазного ингибирования ТФ ИФА с РН составляет 0,87. Метод позволяет определять активность вируснейтрализующих антител в течение 3 часов.

5. Разработан тест ингибиции фокусов флуоресценции для определения уровня вируснейтрализующих антител в сыворотках крови привитых животных, который позволяет сократить время тестирования сывороток с 21 до 3 суток. Коэффициент корреляции результатов, полученных тестом ингибиции фокусов флуоресценции и РН, равен 0,99.

6. Впервые для определения инфекционной активности вируса бешенства, штамм^ ТС-80, разработан метод титрования с использованием перевиваемой культуры клеток ПС и ФИТЦ-конъюгата поликлональных иммуноглобулинов. Метод позволяет сократить время анализа с 21 до 3 суток. Коэффициент корреляции результатов титрования, полученных на культуре клеток и мышах, составляет 0,92.

7. Изучены иммунобиологические свойства инактивированной антирабиче-ской вакцины из штамма ТС-80, выращенного в перевиваемой культуре клеток ПС. Иммуногенная активность препарата - 1,23-3,10 МЕ, титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови вакцинированного крупного рогатого скота - через один месяц 1:128, через шесть -1:70, через 12 месяцев -1:34, что соответствует требованиям ВОЗ, предъявляемым к инактивированным препаратам.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Рекомендованы для оценки эффективности антирабических вакцин экспресс-методы ТФ ИФА, на основе МКА, отличающиеся чувствительностью, специфичностью и высокой воспроизводимостью.

2. Предложен для применения в ветеринарной практике "Набор препаратов для определения активности инактивированных антирабических вакцин имму-ноферментным анализом на основе моноклональных антител". Разработана нормативно-техническая документация (Временные инструкции по изготовлению и контролю "Набора.", Технические условия, Наставления по применению "Набора." и Методические указания по постановке иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител), утвержденная директором института.

3 Разработанные и предложенные тест ингибиции фокусов флуоресценции и метод двухфазного ингибирования ТФ ИФА, на основе МКА могут применяться для оценки поствакцинального антирабического иммунитета, оцениваемого по уровню вируснейтрализующих антител.

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Недосеков, Виталий Владимирович, 1998 год

1. Аксенова Т.А., Хапчаев Ю.Х., Миронова Л.Л., Сошенко Ю.В., Селимов М.А., Хозинский В.В. Культивирование вакцинного вируса бешенства в линиях перевиваемых клеток зеленой мартышки // Вопросы вирусологии.-1991.-№ 5.- с. 432.

2. Ботвинкин А.Д. Обнаружение антител к вирусу бешенства с помощью ИФА в пробах крови собранных на бумажные диски // Лабораторное дело.- 1988.-№ 3.-с. 73-75.

3. Ботвинкин А.Д. Особенности эпидемиологии гидрофобии и экологии вируса бешенства в условиях преобладания очагов природного типа // Дисс. доктора мед. наук.- М.,1992.- с. 57.

4. Волкова A.B. Культивирование вируса бешенства штамма Внуково-32 в культуре перевивавемых клеток для производства антирабической вакцины // Дисс. к.б.н. М., 1997.-117 с.

5. Волкова Р. А., Рунова В.Ф., Романова JI,H., Храпова И.С., Эльберт Л.Б., Мальдов Д.Г. Применение ракетного иммуноэлектрофореза для определения гликопро-теина в концентрированных антирабических вакцинах // Вопросы вирусологии. -1994.- Т. 39, №2.-с. 68-71.

6. Вуннер В. Культивирование, очистка и титрование рабдовирусов // В кн.: Вирусологические "методы.-М.: Высшая школа, 1988,-с. 112-130.

7. Грибенча C.B. Изучение иммуногенных свойств липосомальной формы антирабической вакцины // Вопросы вирусологии.-1988.- т. 33, № 4.- с. 431-433.

8. Грибенча C.B. Современные аспекты биологии и профилактики лиссавирусных инфекций // Дисс. докт. мед.наук.-М.-1993.- 80 с.

9. Грибенча C.B., Баринский И.Ф. Разработка в эксперименте принципов построения оптимальной схемы прививок инактивированной культуральной антирабической вакциной // Вопросы вирусологии.- 1987.- т. 32, № 4,- с 487-492.

10. Грибенча C.B., Василенко О.В., Фуралев В.А Получение и характеристика гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к структурным белкам вируса бешенства штамма Внуково-32 // Вопросы вирусологии.-1991.-т.36, № 4.- с 318-321.

11. Дзантиев Б.Б., Осипов А.П. Классификация и характеристика методов иммуно7