Разработка и испытание живой сухой вакцины против эпизоотической диареи свиней (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) в экспериментальных и производственных условиях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.02, кандидат наук Сергеев, Олег Витальевич

• Сергеев, Олег Витальевич
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Сергеев, Олег Витальевич

1.2.2. Систематика вируса ЭДС...................................................10

1.2.3. Структура вириона............................................................10

1.2.4. Физико-химические свойства..............................................10

1.2.5. Структурные белки...........................................................10

1.2.6. Неструктурный белок ORF3................................................13

1.2.7. Структура генома.............................................................13

1.2.8. Антигенное родство.........................................................14

1.3. Культивирование...................................................................16

1.4. Эпизоотологические данные......................................................17

1.5. Патогенез..............................................................................18

1.6. Клинические признаки.............................................................21

1.7. Диагностика..........................................................................22

1.8. Предупреждение и контроль......................................................25

1.8.1. Общие меры...................................................................25

1.8.2. Специфическая иммунопрофилактика...................................25

1.9. Заключение по обзору литературы..............................................29

1.10. Цель и задачи исследования.....................................................33

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы................................................................34

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Культуральные свойства и аттенуация полевого изолята

вируса ЭДС с целью получения вакцинного штамма..................49

2.2.1.1. Серийное пассирование вируса в культуре клеток Vero

и оценка его аттенуации..............................................49

2.2.1.2. Антигенность штамма ИС в зависимости

от длительности аттенуации вируса...................................52

2.2.1.3. Изменения в геноме штамма ИС вируса ЭДС как результат адаптации к культуре клеток Vero....................................54

2.2.2. Оптимизация условий массового культивирования вируса...........56

2.2.2.1. Состояние культуры клеток...........................................56

2.2.2.2. Зависимость накопления вируса от дозы заражения.............58

2.2.2.3. Культивирование вируса ЭДС в роллерных

и статических условиях...............................................59

2.2.2.4. Размножение штамма ИС в других линях клеток

и в су б линиях клеток Vero............................................59

2.2.3. Разработка технологии изготовления и контроля живой

сухой вакцины в экспериментальных условиях.....................62

2.2.3.1. Изготовление сухой вакцины...........................................63

2.2.3.2. Контроль вакцины на безопасность и реактогенность..........70

2.2.4. Разработка способа применения живой вакцины против ЭДС......71

2.2.4.1. Способ введения вакцины.............................................71

2.2.4.2. Антигенность штамма ИС в зависимости

от прививочной дозы.................................................74

2.2.4.3. Антигенность штамма ИС в зависимости

от кратности введения и дозы вакцины...........................75

2.2.4.4. Применение экспериментальной серии сухой вакцины

в неблагополучном по ЭДС хозяйстве............................78

2.2.5. Изготовление и применение живой сухой вакцины ИС-ЭДС

в хозяйствах, неблагополучных по ЭДС................................81

2.2.5.1. Изготовление и контроль живой сухой вакцины

в производственных условиях.......................................81

2.2.5.2. Распространение ЭДС в крупных свиноводческих

хозяйствах России......................................................82

2.2.5.3. Вакцинопрофилактика ЭДС в производственных условиях....83

2.2.5.4. Сравнительная эффективность двух вариантов

живой вакцины против ЭДС...........................................90

2.2.6. Одновременная и последовательная вакцинация свиней

против ЭДСиТГС.................................................,.....92

2.2.6.1. Антигенность моновалентных живых вакцин.....................94

2.2.6.2. Антигенность бивалентной живой вакцины (ЭДС+ТГС)......94

2.2.6.3. Одновременное введение вакцин ИС-ЭДС и ТР-1...............95

2.2.6.4. Последовательная вакцинация супоросных свиноматок

против ТГС и ЭДС....................................................96

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 98

4. ВЫВОДЫ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ............118

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 121

6. ПРИЛОЖЕНИЯ..................................................................138

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ЭПИЗООТИЧЕСКАЯ ДИАРЕЯ СВИНЕЙ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и испытание живой сухой вакцины против эпизоотической диареи свиней (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) в экспериментальных и производственных условиях»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И РАСПРОСТРАНЁННОСТЬ

Эпизоотическая диарея свиней (ЭДС) является высококонтагиозным вирусным заболеванием свиней, характеризующимся изнурительной диареей и дегидратацией организма. Заболеванию подвержены свиньи всех возрастов, но наиболее восприимчивыми являются новорождённые поросята до двухнедельного возраста, смертность среди которых колеблется в пределах 30 - 100%. ЭДС по клиническим признакам очень сходна с трансмиссивным гастроэнтеритом свиней (ТГС). Главными отличиями ЭДС являются отсутствие рвоты и более низкая смертность новорождённых поросят, более тяжёлое течение болезни у свиней в период откорма, а также более медленное распространение.

ЭДС впервые была обнаружена в Англии в 1971 г. среди свиней в период откорма [116]. Заболевание проявлялось спорадическими вспышками энтерита в зимнее время. Основной характеристикой болезни была водянистая диарея. Данное заболевание было названо «эпизоотическая диарея типа 1». В 1976 г. наблюдали острую диарею среди свиней всех возрастов, включая подсосных поросят. Это заболевание по клиническим проявлениям напоминало ТГС и было названо «эпизоотическая диарея типа 2» [178, 179]. Этиологическим агентом обоих типов диареи являлся коронавирус, впервые выделенный и названный «вирус эпизоотической диареи свиней» в 1978 г. [106].

В течение 1980-х и 1990-х гг. ЭДС была широко распространена в странах Европы: Англии, Бельгии, Германии, Франции, Нидерландах, и Швейцарии, была зарегистрирована в Японии. В период 1995 - 2011 гг. ЭДС была зарегистрирована в Южной Корее, Китае и Таиланде. В 2013 г. заболевание было выявлено в США [39, 158].

Таблица 1. Первичные вспышки ЭДС в различных странах _согласно публикациям _

Год публикации Страна Описание Источник

1978 Англия Диарея свиней типа 2, экспериментально воспроизведена на свиньях разного возраста. В фекалиях и кишечном эпителии инфицированных животных наблюдали коронавирусные частицы 35

1978 Бельгия Диарея свиней типа 2, экспериментально воспроизведена на свиньях. Выделен новый коронавирус, обозначенный СУ777, который отличался от коронавирусов ТГС и энцефаломиелита свиней. 124

1983 Япония Вспышка острой диареи у почти 2500 свиней одной фермы. Смертность поросят 20%. 164

1993 Чехия ЭДС выявлена в двух хозяйствах. Вирус ЭДС идентифицирован с помощью электронной микроскопии 133

1994 Бельгия Свиньи с тяжёлой диареей оказались серопозитивными к вирусу ЭДС 172

1996 Венгрия На 19 фермах обнаружена диарея у поросят подсосного возраста, выделен вирус ЭДС 111

2000 Южная Корея В 304 из 639 свиноводческих хозяйств (47,6%) обнаружен вирус ЭДС 33

2005 Китай Выделен вирус ЭДС от поросят с тяжёлой диареей 79

2008 Италия Вспышка острой диареи среди свиней всех возрастов. В 63 хозяйствах установлена ЭДС на основании данных иммунной ЭМ, серологических исследований и ПЦР 104

2010 Китай Повторные вспышки ЭДС среди свиней, ранее иммунизированных против данного заболевания 37

2010 Таиланд Несколько вспышек ЭДС в период 2007-2010 гг. Диагноз поставлен на основе клинических наблюдений, гистологии и ПЦР 115,128

2011 Китай Показано, что ЭДС в Китае впервые обнаружена в 1986 г. Использовали прямую ИФ (срезы кишечника), иммунную ЭМ и сероконверсию (РН) 38

2013 США 679 свиней разных возрастных и технологических групп в 17 штатах 39, 158

Данные об основных первичных вспышках ЭДС в различных странах приведены в таблице 1. В России ЭДС впервые обнаружена в крупных свиноводческих хозяйствах в 2006 г. (НПО НАРВАК).

В Европе вспышки ЭДС регистрировали реже, чем в Азии. В странах Азии массовые вспышки ЭДС сопровождаются высокой смертностью новорождённых поросят, которая в среднем составляет 50%, но в отдельных случаях достигает 100%. По массовости, остроте и тяжести их нельзя клинически отличить от острых вспышек ТГС. Различные особенности возникновения и течения ЭДС отмечали в разных странах. Например, в Нидерландах заболевание остро протекало у откормочных свиней и супоросных свиноматок, хотя проявлялось в лёгкой форме или даже при отсутствии клинических признаков у подсосных поросят и поросят вскоре после отъёма. В Англии ЭДС клинически проявлялась у свиней в возрасте 815 недель [178, 179]. В Венгрии наиболее существенный ущерб заболевание причиняло в послеотъёмный период [111]. В Японии вспышки ЭДС сопровождались высокой смертностью поросят-сосунов (30-100%), тогда как взрослые животные имели лишь незначительные признаки болезни [160, 164]. В Южной Корее заболеваемость поросят до 10-дневного возраста достигала 90% [33]. В Азии в целом ситуация по ЭДС характеризуется выраженной стационарностью, связанной с персистенцией вируса ЭДС в популяциях частично иммунных свиноматок.

1.2. ЭТИОЛОГИЯ 1.2.1. Вирусные гастроэнтериты свиней

Патологию желудочно-кишечного тракта свиней вызывают вирусы пяти семейств: Coronaviridae, Reoviridae, Caliciviridae, Astroviridae и Adenoviridae. Однако, несмотря на это многообразие, ведущая роль в этиологии массовых острых гастроэнтеритов свиней и особенно поросят в

неонатальный период развития принадлежит коронавирусам. По экономическому ущербу, причиняемому промышленному свиноводству, особое значение имеют коронавирусные гастроэнтериты: трансмиссивный гастроэнтерит свиней (ТГС) и эпизоотическая диарея свиней (ЭДС) [3, 10, 11, 19]. ТГС и ЭДС - два массовых вирусных диарейных заболевания свиней, очень сходные по характеру течения, клиническим проявлениям, патологоанатомической картине и патоморфологическим изменениям. Много общего имеет их эпизоотология. Фактически ТГС и ЭДС - заболевания-двойники, вызываемые двумя кишечными коронавирусами свиней, не имеющими антигенного родства. Оба заболевания характеризуются высокой заболеваемостью и смертностью новорожденных поросят. Поскольку поросята заболевают и гибнут в первые дни жизни, возможность их активной иммунизации исключается.

Вирус ТГС является более патогенным по сравнению с вирусом ЭДС. Он вызывает гибель 80-100% поросят до 10-дневного возраста. Более выраженная патогенность вируса ТГС обусловлена более масштабным разрушением энтероцитов от основания до вершины ворсинок тонкого кишечника (рис. 1А). Инфицированные энтероциты разрушаются и слущиваются в просвет кишечника, ворсинки быстро атрофируются. В первые сутки после заражения резко нарушается пищеварение и всасывание и развивается диарея, следствием которой является тяжелая дегидратация. Потеря воды с фекалиями у поросят в первые дни после рождения достигает 150 мл в сутки. У поросят 3-недельного возраста энтероциты поражаются только в отдельных участках тощей и подвздошной кишок [10].

Вирус ЭДС размножается в энтероцитах нижней части ворсинок и крипт (рис. 1 Б). По-видимому, по этой причине вирус ЭДС вызывает менее интенсивную диарею и меньшую смертность по сравнению с вирусом ТГС, но по той же причине может длительно персистировать в кишечнике животных [122, 126].

ТвЕУ ТСЕУ РЕОУ

А

Рисунок 1. Эпителиальные клетки тонкого кишечника свиней, поражённые энтеропатогенными коронавирусами свиней. А: Обнаружение антигенов вируса ТГС методом иммуногистохимии.

В: Части кишечных ворсинок, в которых обнаруживают антигены вируса ТГС (слева) и ЭДС (справа), показаны тёмным оттенком. [146].

-о

1.2.2. Систематика вируса ЭДС

Возбудителем ЭДС является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Согопаутёае (порядок №ёоУ1га1ез). На основе антигенных и генетических критериев вирус ЭДС вместе с коронавирусами человека N1.63 и 229 Е и несколькими коронавирусами летучих мышей принадлежат роду А1рЬасогопаУ1гиз (до недавнего времени антигенная группа 1) [67, 142]. В данный род также входит недавно установленный вид альфакоронавирус 1, который включает вирусы, недавно считавшиеся самостоятельными видами: вирус ТГС, коронавирус собак, коронавирусы кошек типов I, II и вирус инфекционного перитонита кошек [49].

1.2.3. Структура вириона

Вирионы вируса ЭДС обладают всеми характеристиками семейства Согопаутёае [35, 124]. Они представляют собой плеоморфные частицы диаметром 95-190 (в среднем 130) нм (Рис. 2 А). Они состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются характерные радиальные булавовидные пепломеры (выступы) длиной 18-23 нм, формирующие «корону» [55, 160].

1.2.4. Физико-химические свойства

Плавучая плотность вирионов вируса ЭДС в градиенте сахарозы равна 1,18 г/см3.

Адаптированный к культуре клеток вирус ЭДС теряет инфекционность при >60°С в течение 30 мин, но сохраняет стабильность при 50°С. При 4°С вирус стабилен при рН 4,0 - 9,0, при 37 С он стабилен при рН 6,5-7,5 [28, 98].

Вирус ЭДС является чувствительным к эфиру, хлороформу и другим жирорастворителям, детергентам и ультрафиолетовым лучам, быстро инактивируется формалином (0,03%).

1.2.5. Структурные белки

В вирионах вируса ЭДС обнаружено 4 белка. В состав липопротеидной оболочки вирионов входят поверхностный (пепломерный) гликопротеин S, формирующий выступы, большой мембранный гликопротеин М и негликозилированный белок оболочки Е. С вирусной РБК ассоциирован негликозилированный белок N, вместе они формируют спиральный нуклеокапсид (рис. 2 Б) [110, 131].

Белок S является гликопротеином типа I. Он состоит из 1 383 аминокислотных остатков (штамм CV777) и имеет молекулярную массу 150220 кД (различных штаммах вируса). Гликопротеин S отвечает за адсорбцию вирионов на энтероцитах кишечника посредством связывания вириона с клеточными рецепторами и за слияние липопротеидной оболочки вируса с плазматической мембраной клетки [51, 135, 162]. Для вируса ЭДС выявлена связь между белком S, адаптацией вируса к размножению в культуре клеток и вирулентностью [118, 144]. Гликопротеин S также обусловливает гемагглютинирующую активность вируса ТГС, однако вирус ЭДС гемагглютинирующей активностью не обладает [28]. Гликопротеин S индуцирует синтез вируснейтрализующих антител (ВНА), в его составе идентифицированы четыре вируснейтрализующих эпитопа [34, 42, 65, 78, 161].

Белок М (20-30 кД) является наиболее многокопийным компонентом вирионной оболочки. Он представляет собой структурный мембранный гликопротеин, трижды пронизывающий мембрану, с коротким N-концевым доменом на поверхности вириона и долгим С-концевым доменом внутри [79, 168]. Показано, что гликопротеин М играет важную роль в процессе сборки вирионов [113, 134], в чём не исключено также участие белка Е (7 кД) [22]. Гликопротеин М индуцирует синтез антител, способных нейтрализовать вирус в присутствии комплемента [135], и, возможно, альфа интерферона [97].

и

Рисунок. 2. Вирион вируса ЭДС.

А: Электронный микрофотоснимок вирионов вируса ЭДС [156]; Б: Структура вириона вируса ЭДС [156].

Белок N (57-58 кД) представляет собой щелочной фосфопротеин, ассоциированный с вирусным геномом [23, 43, 58, 110]. Предполагается его роль в индукции клеточно-опосредованного иммунитета [135].

1.2.6. Неструктурный белок ORF3

Для многих коронавирусов характерны неструктурные вспомогательные белки, функции которых известны мало [43, 145, 183, 184]. Единственным вспомогательным белком (и геном) вируса ЭДС является ORF3, который, как показано, формирует ионные каналы в мембранах инфицированных клеток-хозяев [173], что может быть одним из механизмов регуляции продукции вируса. В ходе адаптации и размножения вируса ЭДС в перевиваемой культуре клеток ген ORF3 мутирует, что коррелирует с аттенуацией вируса для новорождённых поросят [40, 119, 152]. Аналогичным образом в ходе адаптации к культуре клеток изменяются последовательности гомологичного гена вируса ТГС [108, 111, 168] и других коронавирусов [50, 52, 70,71, 102].

Помимо изменений в гене ORF3 в основе тканевого тропизма и вирулентности вируса ЭДС (а также других коронавирусов) лежат изменения в генах гликопротеинов S и М [36, 118, 135, 140, 141, 144].

1.2.7. Структура генома

Геном вируса ЭДС представлен единой односпиральной линейной инфекционной (позитивной) РНК длиной 28033 нуклеотидов (штамм CV777) [26, 67, 89, 169]. На 5'- конце РНК имеются лидирующая последовательность (около 90 нуклеотидов) и нетранслируемый участок (5'-UTR, примерно 200 нуклеотидов). На 3'-конце имеются нетранслируемый участок (З'-UTR, примерно 200 нуклеотидов) и поли (А)-

последовательность. В геномной РНК идентифицированы 7 открытых рамок считывания, которые кодируют структурные и неструктурные белки. Гены,

кодирующие структурные белки (8, Е, М и К) расположены в 3'-концевой части РНК и составляют примерно 30% генома. Гены, кодирующие неструктурные белки, находятся в 5'-концевой половине РНК (гены полимеразы (репликазы) 1а и 1Ь), а также между структурными генами 8 и Е (ген СЖРЗ); они составляют около 70% генома (рис. 3) [23, 26, 27,54, 58, 89,112, 157].

В клетках, инфицированных вирусом ЭДС, обнаружены шесть видов вирусспецифических РНК различного размера. Один вид соответствует по длине вирионной РНК, а остальные виды являются субгеномными РНК. Все виды РНК содержат лидирующую последовательность на 5'-конце и идентичные последовательности нуклеотидов на 3'-конце. Каждая субгеномная РНК является информационной РНК (иРНК) и обеспечивает синтез одного белка, размер которого соответствует кодирующему потенциалу 5'-концевой последовательности, отсутствующей в более короткой субгеномной иРНК. Субгеномные иРНК 2, 4, 5 и 6 кодируют соответственно структурные белки 8, Е, М и Ы, иРНК 3 кодирует белок ОКРЗ, полноразмерная иРНК 1 кодирует вирусную полимеразу (Рис. 3) [89, 110, 112].

1.2.8. Антигенное родство

Все штаммы вируса ЭДС, выделенные в различных странах мира, практически идентичны по антигенной структуре и представляют один серотип вируса. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов N и 8 и аминокислотных последовательностей их продуктов у прототипного штамма СУ777 и корейского штамма СЫгуи99, а также нескольких корейских и японских изолятов обнаружило высокую (96,7%) гомологию [91, 93, 99, 182].

5' У

О 5 10 15 20 V 25 30 кЬ

|-!-!-1-4-1-1

ЛиА(А/С)АС

Рисунок 3. Схема генома вируса ЭДС и иРНК - продуктов его транскрипции [156].. 6 м

О!

1. 3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

В начале вирус ЭДС размножали пероральной инокуляцией новорожденных поросят кишечным материалом от больных поросят [46]. Адаптация вируса к размножению в культуре клеток оказалась трудной задачей. Многие типы клеток были безуспешно использованы для культивирования вируса ЭДС. Невозможность накопления вируса ЭДС в культуре клеток затрудняла разработку средств диагностики и специфической профилактики заболевания. Впоследствии было найдено, что культура клеток Vero (почка зелёной мартышки) поддерживает серийное размножение вируса ЭДС. В культуре клеток Vero вирус был выделен из тонкого кишечника как естественно больных, так и экспериментально инфицированных поросят. Полевые изоляты вируса проходили свыше 100 серийных пассажей в клетках Vero. Поддерживающая среда в период размножения вируса содержала трипсин в концентрации 1-2 мкг/мл. Размножение вируса сопровождается выраженным цитопатическим эффектом (ЦПЭ), который выражается в вакуолизации клеток и формировании синцития (симпласты), содержащие до 100 ядер (Рис. 6). Титр вируса достигал пика (около Ю5'5БОЕ / мл) через 15 часов после инокуляции [72, 73, 98]. При выделении вируса из фекалий больных поросят требовалось провести несколько «слепых» пассажей перед появлением ЦПЭ в клетках Vero [92, 94, 98, 148, 152].

При серийном пассировании вирус (Ю5'° ТЦД50/мл) вносили в культуру клеток через 48 часов после посева клеток, когда монослой ещё полностью не сформировался. После развития выраженного ЦПЭ, вирус выделяли из клеток путём повторного замораживания-оттаивания [72, 81]. Инфекционная активность изолята KPEDV-9 на 90 пассаже достигла титра 106'5 ТЦДзо/мл [94], а изолят DR13 на 55 пассаже достиг уровня активности Ю6'0 ТЦД50/мл и до 100 пассажа накапливался в пределах 106'5 - Ю7'0 ТЦД50/мл [152].

Важным достижением в области культивирования вируса ЭДС явилось то, что некоторые штаммы вируса ЭДС, адаптированные к клетакм Vero, успешно размножались в культурах клеток как свиного, так и несвиного происхождения: МА 104, СРК и ESK [92]. В линиях клеток свиньи KSEK-6 и IB-RS2 штамм P-5V серийно размножался даже без добавления трипсина [81], хотя роль трипсина в повышении уровня репродукции вируса ЭДС была показана экспериментально [41].

Имеются сведения о выделении вируса ЭДС в культурах клеток мочевого пузыря и почки свиньи, выращенных в плашках, покрытых коллагеном. Присутствие трипсина в поддерживающей среде было необходимо [148].

Один штамм вируса ЭДС, МК, адаптированный к росту в культуре клеток Vero [92], оказался способным реплицироваться в нейронах новорождённых мышей после интрацеребрального заражения [150] и после 10 пассажей (МК-plO) проявлял высокую нейровирулентность. Продуктивность МК-plO по сравнению с таковой исходного штамма МК возросла [90].

Установлено, что серийное пассирование полевых вирулентных штаммов вируса ЭДС в культуре клеток приводит к потере вирулентности и получению антигенно активных аттенуированных штаммов (глава 1.2.6). Случаи реверсии патогенности при пассировании аттенуированных штаммов на поросятах неизвестны.

1.4. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ

ЭДС в хозяйствах протекает в эпизоотической (острой) и энзоотической (хронической) формах.

Эпизоотическая форма ЭДС наблюдается при заносе вируса в хозяйство, где все или большинство животных чувствительны к нему. Заболевание характеризуется внезапно появляющейся диареей у животных

всех возрастов и гибелью 30 - 100% поросят до 2-недельного возраста. Обычно вспышка болезни в хозяйстве продолжается 3-4 недели и затем прекращается после формирования иммунитета примерно у 80% животных. Эпизоотическую форму ТГС чаще регистрируют в холодное время года. Эта форма болезни нередко переходит в энзоотическую форму [10, 139].

Энзоотическая форма ЭДС обычно встречается в крупных свиноводческих хозяйствах, и она связана с персистенцией вируса и наличием чувствительных к вирусу поросят при непрерывных опоросах. Латентное инфицирование свиней вирусом ЭДС регистрируют чаще, чем вирусом ТГС. Персистенция вируса ЭДС в организме свиней обусловлена, по-видимому, тем, что он поражает энтероциты крипт тонкого кишечника. Это явление также обусловливает более частый переход острой инфекции в хроническую при ЭДС по сравнению с ТГС (глава 1.2.1).

При хроническом течении ЭДС аналогично ТГС условия содержания, кормления и различные стрессовые воздействия оказывают значительное влияние на тяжесть болезни. При пониженной температуре внешней среды заболевание протекает тяжелее и более длительно [10, 106].

1.5. ПАТОГЕНЕЗ

Патогенез при ЭДС изучали на безмолозивных поросятах. 3-дневные поросята, заражённые орально изолятом СУ777, заболевали через 22-36 часов после инокуляции [48]. Вирус размножается в цитоплазме эпителиальных клеток ворсинок всего тонкого кишечника (тощей и подвздошной кишок), а также ободочной кишки, что было показано иммунофлуоресценцией и электронной микроскопией. Признаки инфицирования эпителиальных клеток обнаруживают уже через 12-18 часов после заражения поросят, максимум развития цитопатологии наступает через 24-36 часов. Репликация вируса в тонком кишечнике приводит к разрушению

энтероцитов и укорочению ворсинок. Отношение высоты ворсинок к глубине крипт уменьшается до 3:1 по сравнению с нормой 7:1. Дегенерацию инфицированных эпителиальных клеток ободочной кишки не наблюдали.

Патогенетические изменения в тонком кишечнике поросят при ЭДС подобны таковым при ТГС. Однако, так как репликация вируса и развитие инфекционного процесса при ЭДС протекают медленнее, инкубационный период при ЭДС длится дольше [125].

Репликация вируса ЭДС у поросят обнаружена только в клетках кишечного тракта. 8ЫЬа1а е1 а1. [148] показали, что безмикрофлорные свиньи-гнотобиоты, инокулированные полевым вирусом ЭДС в возрасте от 2 дней до 12 недель, вырабатывали иммунитет, напряжённость которого зависела от возраста, а погибали только 2-7-дневные поросята.

Патогенез ЭДС у взрослых свиней детально не изучен, но с помощью иммунофлуоресценции в эпителиальных клетках ворсинок тощей, подвздошной и ободочной кишок у откормочных свиней выявляли вирусный антиген как после экспериментальной, так и после естественной инфекции [46]. Неясно, насколько инфекция ободочной кишки усиливает клинические признаки болезни. Неясно также, какой патогенный механизм обусловливает внезапную смерть с острым некрозом мышц спины, наблюдаемую иногда у взрослых свиней и свиней в период доращивания [125].

Особенности патогенеза ЭДС, описанные в Корее и Японии, идентичны тем, которые наблюдали в Европе, за исключением того, что репликация азиатских штаммов вируса в ободочной кишке не обнаружена и не было случаев внезапной смерти откормочных животных [76, 87, 160].

Как у экспериментально, так и у естественно инфицированных поросят наблюдаются сходные патологоанатомические изменения [56, 57, 76, 126, 160] (рис. 4). Повреждается только тонкий кишечник, стенки которого обволакиваются жидкостью жёлтого цвета. Вакуолизация и

Рисунок 4. Патогенез при эпизоотической диарее свиней.

А Помёт поросят, инфицированных вирусом ЭДС. В. Типичный инфицированный поросёнок с водянистой диареей. С. Рвотные массы инфицированного поросёнка. Э. Кишечник с утончённой стенкой и водянистым содержимым. Е. Стенка тонкого кишечника с ворсинками и опущенными эпителиальными клетками ворсинок (увеличение *100). Б. Сгустки слизи в просвете кишечника с некрозом и слущиванием ^ эпителиальных клеток ворсинок (увеличение х400) [101].

слущивание энтероцитов ворсинок тонкого кишечника начинаются через 24 часа после инокуляции и совпадает с началом диареи. Начиная с этого момента, ворсинки быстро укорачиваются и энзиматическая активность кишечника резко снижается. Данные наблюдения были подтверждены сканирующей электронной микроскопией [55]. Эта патология очень сходная с патологией при ТГС. Гистопатологические изменения в ободочной кишке не наблюдают.

Ультраструктурные изменения наблюдают сначала в цитоплазме энтероцитов, в которых органеллы уменьшаются, образуя электронно-прозрачные пятна. Позже микроворсинки и терминальная мембрана исчезают, а цитоплазма частично вытекает в просвет кишечника. Клетки становятся плоскими, теряют тесное соединение друг с другом и высвобождаются в просвет кишечника. Видно формирование вируса внутри клеток путём почкования через мембраны эндоплазматического ретикулума [55, 75, 126]. В ободочной кишке наблюдают незначительные изменения в энтероцитах, содержащих вирусные частицы, но не подвергающиеся слущиванию.

1.6. КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ

Инкубационный период ЭДС составляет приблизительно 48 часов, клинические признаки заболевания проявляются в течение 7-14 дней. Главным и часто единственным видимым клиническим признаком ЭДС является водянистая диарея. Вспышки в восприимчивых репродукторных стадах могут значительно варьировать по заболеваемости, длительности и летальности. На некоторых фермах заболевают свиньи всех возрастов, а заболеваемость приближается к 100%. ЭДС очень сходна с ТГС за исключением более медленного распространения и несколько более низкой смертности новорождённых поросят. Поросята в возрасте до 1 недели могут погибнуть от дегидратации после 3-4-дневной диареи. Смертность поросят в

среднем составляет 50%, но может достигать 100%. Более старшие поросята выздоравливают примерно через 1 неделю. После острой вспышки диарея у них может наблюдаться 2-3 недели после отъёма [125]. В последние два десятилетия типичные острые вспышки с высокой смертностью новорождённых поросят в Европе наблюдают редко, но они часто происходят в Японии [160], Корее [33], Китае [37, 38, 40, 101] и других странах Азии [115, 128]. В 2013 г. ЭДС, характеризующаяся острыми вспышками, охватила 27 штатов США [39, 158].

При острой вспышке ЭДС в хозяйстве все откормочные свиньи заболевают с развивитием диареи в течение недели. Животные аноректичны, угнетены, и их фекалии водянистые. К концу периода откорма клинические признаки ЭДС могут быть суровее, чем при ТГС. В частности, животные проявляют большую болезненность в области живота. Как правило, животные выздоравливают через 7-10 дней. Смертность среди откормочных свиней составляет 1 - 3%, гибель наступает на ранней стадии диареи или даже до её появления. При некропсии у таких животных обнаруживают острый некроз спинной мускулы. Наиболее высокая смертность наблюдается среди пород, чувствительных к стрессу. По сравнению с ТГС ЭДС распространяется медленнее. Распространение вируса из одного свинарника в другой может занять 4-6 недель, некоторые свинарники могут оставаться свободными от инфекции [125].

1.7. ДИАГНОСТИКА

Диагноз на ЭДС нельзя поставить только по клиническим признакам. Клинически острые вспышки диареи у свиней всех возрастов нельзя отличить от проявления ТГС. В ряде случаев вспышки ЭДС могут проявляться в виде быстро распространяющейся водянистой диареи у послеотъёмных поросят и более взрослых животных на репродукторных фермах, но без клинических признаков у новорождённых поросят.

Этиологический диагноз можно установить прямым обнаружением вируса ЭДС и / или его антигена, или специфических антител. Наиболее демонстративными методами являются электронная микроскопия (ЭМ), иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ), прямая иммунофлуоресценция (ИФ) и иммуногистохимия ультратонких срезов тонкого кишечника новорождённых поросят.

Частицы вируса ЭДС можно видеть в фекалиях в прямой ЭМ, хотя их нелегко обнаружить, если шипы вириона потеряны или неясно видны. Наивысший результат обнаружения вируса в фекальных образцах составил 73% и получен при исследовании экспериментально зараженных поросят в первый день после начала диареи. Следует отметить, что для дифференциации вирусов ЭДС и ТГС, требуется ИЭМ, так как оба вируса имеют одинаковую морфологию [125].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Сергеев, Олег Витальевич, 2014 год

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алипер, Т. И. Инактивированная вакцина при ТГС / Т. И. Алипер, В.А. Сергеев, Е.А. Непоклонов // Ветеринария. - 2002. - т.8. - С. 18-21

2. Беляков, И.М. Иммунная система слизистых / И.М. Беляков // Иммунология. - 1997.-т.4. - С.7-13

3. Вишняков, И.Ф. Результаты исследований по изучению особо опасных болезней животных и разработке мер борьбы с ними /И.Ф. Вишняков // Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России. М., 1999, С. 67-74

4. Лозина-Лозинский, Л.К. //Криобиология и криомедицина. - 1980. - №7. - С. 3-6

5. Орлянкин, Б.Г. Особенности функционирования иммунной системы слизистых оболочек и стратегия специфической профилактики вирусных гастроэнтеритов поросят / Б.Г. Орлянкин, Т.И. Алипер // Сельхоз. Биология. -2001.-№2.-С. 10-19

6. Орлянкин, Б.Г. Основы противовирусного иммунитета / Б.Г. Орлянкин, Е.А. Непоклонов, Т.И. Алипер // Орбис Пиктус, Москва, 2011. 231с.

7. Сергеев, В.А. Иммунная система слизистых: концепция общности и механизм функционирования / В.А. Сергеев, Т.И. Алипер, Г.Г. Рухадзе, В.И. Бахуташвили // Вопр. Вирусол. - 1988. - №4. - С. 393-402

8. Сергеев, В.А. Респираторный коронавирус свиней / В.А. Сергеев, Г.Г. Рухадзе, Т.И. Алипер // Вест. с.-х. науки. - 1989. - №8. - С. 96-100

9. Сергеев, В.А. Вирусы и вирусные вакцины / В.А. Сергеев, Е.А. Непоклонов, Т.И. Алипер // Библионика, Москва, 2007. 523с.

10. Собко, А.И. Вирусные диареи свиней / А.И. Собко, Е.В. Краснобаев // ВНИИТЭИ Агропром, Москва, 1987. 56с.

11. Сюрин, В.Н. Инфекционный гастроэнтерит свиней / В.Н. Сюрин, А .Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина // В кн.: Вирусные болезни животных. М., 1998, С. 165-183

12. Федоров, Ю.Н. Иммунопрофилактика болезней новорожденных животных

/ Ю.Н. Федоров // С.-х. биология. - 1988. - №2. - С. 133-136

13. Федоров, Ю.Н. Лактогениый иммунитет у поросят против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной инфекции и колибактериоза свиней / Ю.Н. Федоров, О.А. Верховский, М. Аноятбеков, Б.Г. Орлянкин, Н.А. Соколова, Э.А. Шегидевич // Ветеринария. - 1997. -№12. - 20-23

14. Хаитов, P.M. Иммунная система желудочно-кишечного тракта: особенности строения и функционирования в норме и патологии / P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин // Иммунология. - 1997. - №5. - С.4-7

15. Харрис, Р. Применение замораживания-высушивания в биологии / Р. Харрис // В кн. Консервирование вирусов, под ред. Р. Харриса. М., ИЛ., 1956. С. 273-291

16. Холод, В.М. Иммуноглобулины молозива и пассивный иммунитет новорожденных животных / В.М. Холод // С.-х. биология. -1983. - №6. - С.127-132

17. Al-Ahdal, M.N. Variation in herpes simplex virus type 1 glycoproteins produced in kidney cells from different species / M.N. Al-Ahdal, F.A. Al-Khodairy, T.J. McGarry // Microbios. - 1989. - v.58. - P.7-15

18. Atkinson, W.L.General immunization practices / W.L. Atkinson, A.L. Kruger, L.K. Pickering // In: Vaccines, Eds S.Plotkin et al., 2008; P. 83-109

19. Bachmann, P.A. Comparative aspects of pathogenesis and immunity of viral diarrhoeas in animals / P.A. Bachmann, R.G. Hess // In: Virus infections of gastrointestinal tract, New York, 1982; P.361-397

20. Bae, J.L. Induction of antigen-specific systemic and mucosal immune responses by feeding animals transgenic plants expressing the antigen / J.L. Bae, J.G. Lee, T.J. Kang, H.S. Jang, Y.S. Jang, M.S. Yang // Vaccine. - 2003. - v.21. - P.4052-4058

21. Bachrach, H.L. Large-scale cultivation of animal cells in roller bottles for production of decigram amounts of pure foot-and-mouth disease virus / H.L. Bachrach // Natl. Cancer Inst. Monogr. - 1968. - v.29. - P.73-79

22. Baudoux, P. Coronavirus pseudoparticles formed with recombinant M and E proteins induce alpha interferon synthesis by leukocytes / P. Baudoux, C. Carrat, L. Besnardeau, B. Charley, H. Laude // J. Virol. - 1998. - v.72. - P.8636-8643

23. Bernasconi, C. Experimental infection of gnotobiotic piglets with a cell culture adapted porcine epidemic diarrhoea virus: Clinical histopathological and immunohistochemical findings / C. Bernasconi, F. Guscetti, A. Utiger, K. Van Reeth, M. Ackermann, A. Pospischil // Proc. 3rd Congr. ESVV, 1995. P.542-546

24. Bohl, E.H. Secretory antibodies in milk of swine against transmissible gastroenteritis virus / E.H. Bohl, L.J. Saif, R.K. Gupta, G.T. Frederick //Adv. Exp. Med. Biol. - 1974. - - v.45. - P.337-342

25. Bohl, E.H. Antibody responses in serum, colostrum, and milk of swine after infection or vaccination with transmissible gastroenteritis virus / E.H. Bohl, R.K. Gupta, M.V. Olquin, LJ. Saif// Infect. Immun. - 1972.- v.6. - P.289-301

26. Bridgen, A. Sequence determination of the nucleocapsid protein gene of the porcine epidemic diarrhoea virus confirms that this virus is a coronavirus related to human coronavirus 229E and porcine transmissible gastroenteritis virus / A. Bridgen, M. Duarte, K. Tobler, H. Laude, M. Ackermann // J.Gen.Virol. - 1993. - v.74. - P.1795-1804

27. Bridgen, A. Further analysis of the genome of porcine epidemic diarrhoea virus / A. Bridgen, R. Kocherhans, K. Tobler, A. Carvajal, M. Ackermann // Adv. Exp. Med. Biol. - 1998. - v.440. - P.781-786

28. Callebaut, P. Some characteristics of a new porcine coronavirus and detection of antigen and antibody by ELISA / P. Callebaut, P. DeBouck // In Proc. 5th Int. Congr. Virol., Strasbourg, 1981, P.420

29. Callebaut, P. Enzyme-linked im-munosorbent assay for the detection of the coronavirus-like agent and its antibodies in pigs with porcine epidemic diarrhea / Callebaut P, DeBouck P, Pensaert M. // Vet. Microbiol. - 1982. - v.7. - P.295-306

30. Callebaut, P. Induction of milk IgA antibodies by porcine respiratory coronavirus infection / P. Callebaut, E. Cox, M. Pensaert, K. Van Deun // Adv. Exp. Med. Biol. - 1990. - v. 276. - P.421-428

31. Carvajal, A. Evaluation of an ELISA for the detection of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in feces of naturally infected pigs / A. Carvajal, R. Diego, I. Lanza, P. Rubio, P. Carmenes, M. Schwyzer // Proc. 3rd Congr. ESW; 1995a. P. 516-519

32. Carvajal, A. Evaluation of a blocking ELISA using monoclonal antibodies for the detection of porcine epidemic diarrhea virus and its antibodies / A. Carvajal, I. Lanza, R. Diego, P. Rubio, P. Carmenes // J. Vet. Diagn. Invest. - 1995b. - v.7.

- P.60-64

33. Chae, C. Prevalence of porcine epidemic diarrhoea virus and transmissible gastroenteritis virus infection in Korean pigs / Chae C, Kim O, Choi C, Min K, Cho WS, Kim J, Tai JH. // Vet Rec. 2000. 147:606-608.

34. Chang, S.H. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus / Chang S.H., Bae J.L., Kang T.J., Kim J., Chung G.H., Lim C.W, Laude H, Yang M.S., Jang Y.S. // Mol. Cells. - 2002. - v. 14. - P.295-299

35. Chasey, D. Virus-like particles associated with porcine epidemic diarrhoea / Chasey D, Cartwright S.F. // Res. Vet. Sci. - 1978. - v.25. - P.255-256

36. Chen, J.F. Molecular characterization and phylogenetic analysis of membrane protein genes of porcine epidemic diarrhea virus isolates in China / Chen J.F., Sun D.B., Wang C.B, Shi H.Y., Cui X.C., Liu S.W., Qiu H.J., Feng L. // Virus Genes. - 2008. - v.36. - P.355-364

37. Chen, J. Molecular epidemiology of porcine epidemic diarrhea virus in China / Chen J., Wang C., Shi H., Qiu H., Liu S., Chen X., Zhang Z., Feng L. // Arch. Virol. - 2010. - v.15. - P.1471-1476

38. Chen, J. Complete genome sequence of a Chinese virulent porcine epidemic diarrhea virus strain / Chen J., Wang C., Shi H, Qiu H, Liu S, Shi D., X., Feng L. // J. Virol. - 2011. - v.85. - P. 11538-11539

39. Chen, Q. Isolation and Characterization of Porcine Epidemic Diarrhea Viruses Associated with the 2013 Disease Outbreak among Swine in the United States / Chen Q., Li G., Stasko J., Thomas J.T., Stensland W.R., Pillatzki A.E., Gauger P.C., Schwartz K.J., Madson D., Yoon K.-J., Stevenson G. W., Burrough E.R., Harmon K.M., Main R.G., Zhang J. // J. Clin. Microbiol. - 2014. - v.52. - P.234-243

40. Chen, X. Sequence heterogeneity of the ORF3 gene of porcine epidemic diarrhea viruses field samples in Fujian, China, 2010-2012 / Chen X., Zeng L., Yang J., YuF., GeJ., GuoQ., Gao X., Song T.//Viruses. - 2013.-v.5.-P.2375-2383

41. Chen, X. Trypsin-dependent cleavage of the spike protein increases infectivity of porcine epidemic diarrhea virus in Vero cells / Cruz M. D. J., Shin H. J. // Proceedings, 88 Ann. Meet., Chicago, 2007.

42. Cruz, D.J. The GPRLQPY motif located at the carboxy-terminal of the spike protein induces antibodies that neutralize porcine epidemic diarrhea virus / Cruz

DJ., Kim C.J., Shin HJ. // Virus Res. - 2008. - v.132. - P.192-196

43. Curtis, K.M. Heterologous gene expression from transmissible gastroenteritis virus replicon particles / Curtis K.M., Yount B., Baric R.S. // J. Virol. - 2002. -v.76.-P. 1422-34

44. Davis, D. Triple plaque purified strains of duck hepatitis virus and their potential as vaccines / Davis D. // Res. Vet. Sei. - 1987. - v.43. - P.44-48

45. De Arriba, M.L. Development of an ELISA for the detection of antibody isotypes against porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV) in sow's milk / De Arriba ML, Carvajal A, Lanza I, Rubio P, Carmenes P. // Proc 3rd Congr. ESVV, 1995, P.222-225

46. DeBouck, P. Experimental infection of pigs with a new porcine enteric Coronavirus CV777 / DeBouck P., Pensaert M. // Am. J. Vet. Res. - 1980. - v.41. -P.219-223

47. DeBouck, P. The diagnosis of coronavirus-like agent (CVLA) diarrhea in suckling pigs / DeBouck P, Callebaut P, Pensaert M. // Curr. Top. Vet. Med. Anim. Sei. - 1981a. - v.13.-P.59-61

48. DeBouck, P. The pathogenesis of an enteric infection in pigs experimentally induced by the coronavirus-like agent CV777 / DeBouck P., Pensaert M., Coussement W. //Vet. Microbiol. - 1981b.-v.6.-P.157-165

49. De Groot, R.J. Coronaviridae / De Groot R.J., Baker S.C., Baric R., Enjuanes L., Gorbalenya A.E., Holmes K.V., Perlman S., Poon L., Rottier P.J.M., Talbot P.J., Woo P.C.Y., Ziebuhr J. // In King A.M.Q., Adams M.J., Carstens E.B., Lefkowitz E.J. (ed), Virus taxonomy: 9th report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier Academic Press, Inc, San Diego, CA. 2012. P.774 -796

50. De Haan, C.A. The group-specific murine Coronavirus genes are not essential, but their deletion, by reverse genetics, is attenuating in the natural host / De Haan C.A., Masters P.S., Shen X., Weiss S., Rottier P.J. // Virology. - 2002. - v.296. -P.177-189

51. Delmas, B. Assembly of Coronavirus spike protein into trimers and its role in epitope expression / Delmas B., Laude H. // J.Virol. - 1990. - v.64. - P.5367-5375

52. Dijkman, R. Human Coronavirus 229E encodes a single ORF4 protein between the spike and the envelope genes / Dijkman R., Jebbink M.F., Wilbrink B., Pyre

K., Zaaijer H.L., Minor P.D., Franklin S., Berkhout B., Thiel V., van der Hoek L. // Virol J. - 2006. - v.3. - P. 106.

53. Domingo, E. RNA virus mutations and fitness for survival / Review. Domingo E., Holland J.J. // Annu. Rev. Microbiol. - 1997. - v.51. - P. 151 -178

54. Duarte, M. Sequence of the spike protein of the por^cine epidemic diarrhoea virus Duarte M., Laude H. // J. Gen. Virol. - 1994. - v.75. - P.l 195-1200

55. Ducatelle, R. Three-dimensional sequential study of the intestinal surface in experimental porcine CV777 Coronavirus enteritis / Ducatelle R., Coussement W., Charlier G., DeBouck P., Hoorens J. // Zentralbl. Veterinarmed. B. - 1981. -v.28. -P.483-493

56. Ducatelle, R. Pathology of experimental CV777 Coronavirus enteritis in piglets. II. Electron microscopic study / Ducatelle R. // Vet. Pathol. - 1982a. - v. 19. -P.57-66

57. Ducatelle, R. Pathology of experimental CV777 Coronavirus enteritis in pig-'lets. I. Histological and histochemical study / Ducatelle R., Coussement W., DeBouck P., Hoorens J. // Vet. Pathol. - 1982b. - v. 19. - P.46-56

58. Egberink, H.F. Characterization of the structural proteins of porcine epizootic diarrhea virus, strain CV777 / Egberink H.F., Ederveen J., Callebaut P., Horzinek M.C. // Am. J. Vet. Res. - 1988. - v.49. - P.1320-1324

59. Eigen, M. The fifth Paul Ehrlich Lecture, Virus strains as models of molecular evolution / Eigen M. // Med. Res. Rev. - 1993a. - v.13. - P.385-398

60. Eigen, M. Viral quasispecies / Eigen M. // Sei. Am. - 1993b. - v.269. - P.42-49

61. Enders, J.F. Development of attenuated measles-virus vaccines. A summary of recent investigation / Enders J.F., Katz S.L., Holloway A. // Am. J. Dis. Child. -1962. - v.103. - P.335-340

62. Epstein, A.L. In vitro divergence of HSV-1 populations propagated in different cell lines / Epstein A.L., Lyon M., Michal Y., Jacquemont B. // Arch. Virol. -1990. - v.lll. - P. 133-140

63. Flint, S.J. Principles of virology. 2nd ed., 2004.

64. Gifford, G.E. Effect of proteolytic enzymes on vaccinia virus replication / Gifford G.E., Klapper D.G. // Arch. Gesamte Virusforsch. - 1969. - v.26. -P.321-333

65. Godet, M. Major receptor-binding and neutralization determinants are located within the same domain of the transmissible gastroenteritis virus (coronavirus) spike protein / Godet M., Grosclaude J., Delmas B., Laude H. // J. Virol. - 1994. - v.68. - P.8008-8016

66. Gomez, P.L. Vaccine manufacturing / Gomez P.L., Robinson J.M., Rogalewicz J.A. // In: Vaccines, Eds S.Plotkin et al., 2008, P.45-58

67. Gonzales, J.M. A comparative sequence analysis to revise the current taxonomy of the family Coronaviridae / Gonzales J.M., Gomez-Puertas P., Cavanagh D., Gorbalenya A.E., Enjuanes L. // Arch. Virol. - 2003. - v. 148. - P.2207-2235

68. Guscetti, F. Immunohistochemical detection of porcine epidemic diarrhea virus compared to other methods / Guscetti F, Bernasconi C, Tobler K, Van Reeth K, Pospischil A, Ackermann M. //Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998. 5:412-414.

69. Ha, G.W. Colostrum IgA concentration as a marker of protection from porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection / Ha G.W., Kang B.K., Park S.J., Lee C.S., Oh J.S., Chai Y.G., Park B.K., Moon H.J. // Korean J. Vet. Public Health. -2010. - v.34. -P.53-56

70. Haijema, B.J. Live, attenuated coronavirus vaccines through the directed deletion of group-specific genes provide protection against feline infectious peritonitis / Haijema B.J., Volders H., Rottier P.J. // J. Virol. - 2004. - v.78. -P.3863-3871

71. Herrewegh, A.A. The molecular genetics of feline coronaviruses: comparative sequence analysis of the ORF7a/7b transcription unit of different biotypes / Herrewegh A.A., Vennema H., Horzinek M.C., Rottier P.J., de Groot R.J. // Virology. - 1995. - v.212. -P.622-631

72. Hoffman, M. Propagation of the virus of porcine epidemic diarrhea in cell culture / Hoffman M., Wyler R. // J. Clin. Microbiol. - 1988. - v.26. -P.2235-2239

73. Hoffman, M. Quantitation, biological and physiocemical properties of cell culture-adapted porcine epidemic diarrhea coronavirus (PEDV) / Hoffman M., Wyler R. // Vet. Microbiol. - 1989. - v.20. -P. 131-142

74. Hoffman, M. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of porcine epidemic diarrhea coronavirus antibodies in swine sera / Hofmann M, Wyler R. // Vet. Microbiol. - 1990. - v.212. - P.63-73

75. Horvath, I. Ultrastructural changes in the small intestinal epithelium of suckling pigs affected with a trans^missible gastroenteritis (TGE)-like disease / Horvath I., Moscari E. // Arch. Virol. - 1981. - v.68 - P. 103-113

76. Hwang, E.K. Current occurrence of porcine epidemic diarrhea in Korea / Hwang E.K., Kim J.H., Jean Y.H., Bae Y.C., Yoon S.S., Park C.K., Kweon C.H., Yoon Y.D., Ackermann M. // RDA J. Agri. Sei. - 1994. - v.36. - P.587-596

77. Ishikawa, K. Direct and rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus by RT-PCR / Ishikawa K., Sekiguchi H., Ogino T., Suzuki S. // J. Virol. Methods. -1997. - v.69. - P.191-195

78. Jackwood, M.W. Spike glycoprotein cleavage recognition site analysis of infectious bronchitis virus / Jackwood M.W., Hilt D.A., Callison S.A., Lee C.W., Plaza H., Wade E. // Avian Dis. - 2001. - v.45. - P.366-372

79. Jinghui, F. Cloning and sequence analysis of the M gene of porcine epidemic diarrhea virus LJB/03 / Jinghui F., Yijing L. // Virus Genes. - 2005. - v.30. -P.69-73

80. Jung, K. Effects of epidermal growth factor on atrophic enteritis in piglets induced by experimental porcine epidemic diarrhoea virus / Jung K., Kang B.K., Kim J.Y., Shin K.S., Lee C.S., Song D.S. // Vet. J. - 2008. - v. 177. - P.231-235

81. Kadoi, K. The propagation of a porcine epidemic diarrhea virus in swine cell lines / Kadoi K., Sugioka H., Satoh T., Kadoi B.K. // New Microbiol. - 2002. -v.25. -P.285-290

82. Kang, T. J. Expression of the synthetic neutralizing epitope gene of porcine epidemic diarrhea virus in tobacco plants without nicotine / Kang T. J., Kim Y. S., Jang Y. S., Jang M.S. // Vaccine. - 2005. - v.23. - P.2294-2297

83. Kang, J.H. Development of a simple and rapid immunochromatographic strip test for diarrhea-causative porcine rotavirus in swine stool / Kang J.H., Kwon DH, Chung TW, Kim YD, Lee HG, Kim JW, Choe IS, Kim KW, Lim JS, Song EY, Kim CH. // J. Virol. Methods. - 2007. - v. 146. - P.74-79

84. Kim, O. In situ hybridization for the detection and localization of porcine epidemic diarrhea virus in the intestinal tissues from naturally infected piglets / Kim O., Chae C. // Vet. Pathol. - 2000. - v.37. - P.62-67

85. Kim, S.Y. Differential detection of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus by duplex RT-PCR / Kim S.Y., Song D.S., Park B.K. //J. Vet. Diagn. Invest. - 2001. - v.13. - P.516-520

86. Kim, O. Comparison of reverse transcription polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine epidemic diarrhea virus in pigs / Kim O., Chae C. // Can. J. Vet. Res. - 2002. -v.66. -P.112-116

87. Kim, O. Experimental infection of piglets with a Korean strain of porcine epidemic diarrhoea virus / Kim O., Chae C. // J. Comp. Path. - 2003. - v. 129. -P.55-60

88. Knuchel, M. An ELISA for detection of antibodies against porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV) based on the specific solubility of the viral surface glycoprotein / Knuchel M, Ackermann M, Miiller HK, Kihm U. // Vet. Microbiol. - 1992. - v.32. - P.l 17-134

89. Kocherhans, R. Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus (PEDV) genome sequence / Kocherhans R, Bridgen A, Ackermann M, Tobler K. // Virus Genes. - 2001. - v.23. - P. 137-144

90. Kotani, O. Neuropathogenesis of a mouse-adapted porcine epidemic diarrhea virus infection in suckling mice / Kotani O., Shirato K., Nagata N., Ikeda H., Takahashi K., Taguchi F. // J. Gen. Virol. - 2013. - v.94. -P.831-836

91. Kubota, S. Detection of porcine epidemic diarrhea virus using polymerase chain reaction and comparison of the nucleocapsid protein genes among strains of the virus / Kubota S., Sasaki O., Animoto K., Okada N., Kitazima T., Yasuhara H. // J. Vet. Med. Sci. - 1999. - v.61. - P.827-830

92. Kusanagi, K. Isolation and serial propagation of porcine epidemic diarrhea virus in cell cultures and partial characterization of the isolate / Kusanagi K., Kuwahara H., Katoh T., Nunoya T., Ishikawa Y., Samejima T., Tajima M. // J. Vet. Med. Sci. - 1992. - v.54. - P.313-318

93. Kweon, C.H. Isolation of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection in Korea / Kweon C.H., Kwon B.J., Jung T.S., Kee Y. J., Hur D.H., Hwang E.K., Rhee J.C., An S.H. // Korean J. Vet. Res. - 1993. - v.33 - P.249-254

94. Kweon, C.H. Cell adaptation of KPEDV-9 and serological survey on porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection in Korea / Kweon C.H., Kwon B.J., Kang Y.B., An S.H. // Korean J. Vet. Res. - 1994. - v.34 - P.321-326

95. Kweon, C.H. Derivation of attenuated porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) as vaccine candidate / Kweon C. H., Kwon B. J., Lee J. G., Kwon G.O., Kang Y.B. // Vaccine. - 1999. - v.17. - P.2546-2553

96. Kweon, C.H. Immunoprophylactic effect of chicken egg yolk immunoglobulin (IgY) against porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in piglets / Kweon C.H., Kwon B.J., Woo S.R., Kim J.M., Woo G.H., Son D.H., Hur W., Lee Y.S. // J. Vet. Med. Sci. - 2000. - v.62. - P.961-964

97. Laude, H. Single amino acid changes in the viral glycoprotein M affect induction of alpha interferon by the coronavirus transmissible gastroenteritis virus / Laude H., Gelfi J., Lavenant L., Charley B. // J. Virol. - 1992. - v.66. - P.743-749

98. Lee, H.K. Biological and physiochemical properties of porcine epidemic diarrhea virus Chinju99 strain isolated in Korea / Lee H.K., Yeo S.G. // J. Vet. Clin. - 2003a. - v.20. - P. 150-154

99. Lee, H.K. Cloning and sequencing analysis of the nucleocapsid gene of porcine epidemic diarrhea virus Chinju99 / Lee H.K., Yeo S.G. // Virus Genes. - 2003b. -v.26. -P.207-212

100. Li, X. In vivo interference by Newcastle disease virus in chickens, the natural host of the virus / Li X., Hanson R.P. // Arch. Virol. - 1989. - v.108. - P.229-245

101. Li, W. New Variants of Porcine Epidemic Diarrhea Virus, China, 2011 / Li W., Li H., Liu Y., Pan Y., Deng F., Song Y., Tang X., He Q. // Emerg. Inf. Dis. -2012. - v. 18. - P. 1350-1353

102. Lissenberg, A. Luxury at a cost? Recombinant mouse hepatitis viruses expressing the accessory hemagglutinin esterase protein display reduced fitness in vitro / Lissenberg A., Vrolijk M.M., van Vliet A.L., Langereis M.A., de Groot-Mijnes J.D., Rottier P.J., de Groot R.J. // J. Virol. - 2005. - v.19. - P. 1505415063

103. Lundstrom, M. Host cell-induced differences in O-glycosylation of herpes simplex virus gC-1. I. Structures of nonsialylated HP A- and PNA-binding carbohydrates / Lundstrom M, Olofsson S, Jeansson S, Lycke E, Datema R, Mansson JE. // Virology. - 1987. - v.161.-P.385-394

104. Martelli, P. Epidemic of diarrhoea caused by porcine epidemic diarrhoea virus in Italy / Martelli P., Lavazza A., Nigrelli A.D., Merialdi G., Alborali L.G., Pensaert M.B. // Vet. Rec. - 2008. - v. 162. -P.307-310

105. McMillan, B.C. The effects of the multiplicity of infection on viral subpopulations during passage of Newcastle disease viruses / McMillan B.C., Fellenz S.C., Hanson R.P. //Avian Dis. - 1986. - v.30. - P. 122-125

106. Morin, M. Neonatal diarrhea of pigs in Quebec: Infectious causes of significant outbreaks / Morin M., Turgeon D., Jolette J., Robinson Y., Phaneuf J.B., Sauvageau R., Beauregard M., Teuscher E., Higgins R., Larivere S. // Can. J. Comp. Med. - 1983.-V.47.-P.11-17

107. Moxley, R.A. Clinical evaluation of transmissible gastroenteritis virus vaccination procedures for inducing lactogenic immunity in sows / Moxley R.A., Olson L.D. //Am. J. Vet. Res. - 1989. - v.50. -P.lll-118

108. Moya, A. The evolution of RNA viruses: A population genetics view / Moya A., Elena S.F., Bracho A., Miralles R., Barrio E. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2000. - v.97. - P.6967-6973

109. Murphy, B.R. Immunization against viral diseases / Murphy B.R., Channock R.M. // In Fields Virology, eds D.M. Knipe et al., 4th ed., 2001. P.435-467

110. Murphy, F.A. / Murphy F.A., Gibbs E.P., Horzinek M.C., Studdert M.J. // In: Veterinary Virology, 3rd edn, (Academic Press, San Diego, 1999): P. 496-501

111. Nagy, B. Enterotoxigenic Escherichia coli, rotavirus, porcine epidemic diarrhoea virus, adenovirus and calici-like virus in porcine postweaning diarrhoea in Hungary / Nagy B, Nagy G, Meder M, Mocsari E. // Acta Vet. Hung. - 1996. v.44. - P.9-19

112. Narayanan, K. / Narayanan K., Makino S. // In Nidoviruses, by Perlman S., Snijder E.J.(eds) (ASM Press, Washington, DC, 2008), P.235-244

113. Nguyen, V.P. Protein interactions during coronavirus assembly / Nguyen V.P., Hogue B.G. // J. Virol. - 1997. - v.71. -P. 9278-9284

114. Offit, P.A. Protection against rotavirus-induced gastroenteritis in a murine model by passively acquired gastrointestinal but not circulating antibodies / Offit P.A., Clark H.F. // J. Virol. - 1985. - v.54. - P.58-64

115. Olanratmanee, E.O. Impact of porcine epidemic diarrhea virus infection at different periods of pregnancy on subsequent reproductive performance in gilts and sows / Olanratmanee EO, Kunavongkrit A, Tummaruk P. // Anim. Reprod. Sci.-2010.-V.122.-P.42-51

116. Oldham, J. Letter to the editor. //Pig Farming. - 1972. - October suppl. - P.72-73

117. Ortego, J. Transmissible gastroenteritis coronavirus gene 7 is not essential but influences in vivo virus replication and virulence / Ortego J., Sola I., Almazan F.,

Ceriani J.E., Riquelme C., Balasch M., Plana J., Enjuanes L. // Virology. - 2003. - v.308. -P.13-22

118. Park, S.J. Sequence analysis of the partial spike glycoprotein gene of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea / Park S.J., Moon HJ., Yang J.S., Lee C.S., Song D.S., Kang B.K., Park B.K. // Virus Genes. - 2007. - v.35. - P.321-332

119. Park, S.J. Cloning and further sequence analysis of the ORF3 gene of wild- and attenuated-type porcine epidemic diarrhea viruses / Park S.J., Moon H.J., Luo Y., Kim H.K., Kim E.M., Yang J.S., Song D.S., Kang B.K., Lee C.S., Park B.K. // Virus Genes. - 2008. - v.36. - P.95-104

120. Paul, P.S. Pathogenicity and sequence analysis studies suggest potential role of gene 3 in virulence of swine enteric and respiratory coronaviruses / Paul P.S, Vaughn E.M., Halbur P.G. // In: Paul P.S., Francis D.H., Benfield D.A. (eds). Mechanisms in the pathogenesis of enteric diseases. Plenum Press., New York, 1997. P.317-321

121. Pensaert, M.B. Transmissible gastroenteritis virus (respiratory variant) / Pensaert M.B. // In: M. B. Pensaert (Ed.) Virus Infections of Porcines. Amsterdam: Elsevier Science, 1989. P.154-165

122. Pensaert, M. Porcine epidemic diarrhea / Pensaert M. //In: B.E. Straw et al. (eds) Diseases of Swine, (8th Ed., Blackwell, Ames, 1999), P.179 -185

123. Pensaert, M.B. Porcine respiratory Coronavirus related to transmissible gastroenteritis virus / Pensaert M.B., Cox E. // Agri-Pract. - 1989. - v. 10. -P. 17-21

124. Pensaert, M. A new coronavirus-like particles associated with diarrhea in swine / Pensaert M., DeBouck P. // Arch. Virol. - 1978. - v.58. - P.243-247

125. Pensaert, M. Porcine epidemic diarrhea / Pensaert M. //In: B.E. Straw et al. (eds) Diseases of Swine, (9th Ed., Blackwell, Ames, 2006), P.367-372

126. Pospischil, A. Light microscopy and ultrahistology of intestinal changes in pigs infected with enzootic diarrhoea virus (EVD): Comparison with transmissible gastroenteritis (TGE) virus and porcine rotavirus infections / Pospischil A., Hess R.G., Bachmann P.A. //Zentralbl. Veterinarmed. B. - 1981. - v.28. - P.564-577

127. Prager, D. Die serologische Diagnose der Epizootischen Virusdiarrhoe (EVD) des Schweines mit Hilfe der indirekten Immunofluoreszenztechnik (UFT). II. Antikorper-Antwort nach experimenteller Infektion / Prager D, Witte K. //

Tierarztl. Umsch. - 1981. - v.36. -P.477-480

128. Puranaveja, S. Chinese-like Strain of Porcine Epidemic Diarrhea Virus, Thailand / Puranaveja S., Poolperm P., Lertwatcharasarakul P., Kesdaengsakonwut S., Boonsoongnern A., Urairong K., Kitikoon P., Choojai P., Kedkovid R., Teankum K., Thanawongnuwech R. // Emerg. Infect. Dis. - 2009. - v.15. - P.l 112-1115

129. Pyo, H.M. Escherichia coli expressing single-chain Fv on the cell surface as a potential prophylactic of porcine epidemic diarrhea virus / Pyo H.M., Kim I.J., Kim S.H, Kim H.S., Cho S.D., Cho I.S., Hyun B.H. // Vaccine. - 2009. - v.21. -P.2030-2036

130. Rasschaert, D. Porcine respiratory coronavirius differs from transmissible gastroenteritis virus by a few genomic deletions / Rasschaert D., Duarte M., Laude H. // J. Gen. Virol. - 1990. - v.71. - P.2599-2607

131. Risco, C. The transmissible gastroenteritis coronavirus contains a spherical core shell consisting of M and N proteins / Risco C., Anton I.M., Enjuanes L., Carrascosa J.L. //J.Virol. - 1996. - v.70. - P.4773-4777

132. Robertson, B.H. Altered hepatitis A VP1 protein resulting from cell culture propagation of virus / Robertson BH, Brown VK, Khanna B. // Virus Res. -1989. - v.13. - P.207-212

133. Rodak, L. Elisa detection of group A rotavirus, transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhoea virus in faeces of piglets / Rodak L, Smid B, Valicek L, Smitalova R, Nevorankova Z. // Proc. Congr. Int. Pig Vet. Soc. -2004. - v.l. -P.271-280.

134. Rottier, P.J.M. // In: Siddel S.G. (ed.) The Coronaviridae. Plenum Press, New York, 1995, P.l 15-139

135. Saif, L.J. Coronavirus immunogens / Saif L.J. //Vet. Microbiol. - 1993. - v.37. -P.285-297

136. Saif, L.J. Enteric viral infection of pigs and strategies for induction of mucosal immunity / Saif L.J. //In: Advances in veterinary medicine, 1999, 41, P.429-446

137. Saif, L.J. Animal coronavirus vaccines: lessons for SARS / Saif L.J. // Dev. Biol. (Basel). - 2004. - v. 119. - P. 129-140

138. Saif, L.J. Isolation of porcine immunoglobulins and determination of the immunoglobulin classes of transmissible gastroenteritis viral antibodies / Saif L.J., Bohl E.H., Gupta R.K. // Infect. Immun. - 1972. - v.6. - P.600-609

139. Saif, L.J. Transmissible gastroenteritis and porcine respiratory coronavirus / Saif L.J., Wesley R.D. // In: B.E. Straw et al. (eds) Diseases of Swine, Iowa State University Press, Ames, 1999, P.295-325

140. Sanchez, C.M. Genetic evolution and tropism of transmissible gastroenteritis coronaviruses / Sanchez C.M., Gebauer F., Sune C., Mendez A., Dopazo J., Enjuanes L. // Virology. - 1992. - v. 190. - P.92-105

141. Sanchez, C.M. Targeted recombination demonstrates that the spike gene of transmissible gastroenteritis coronavirus is a determinant of its enteric tropism and virulence / Sánchez C.M., Izeta A., Sánchez-Morgado J.M., Alonso S., Sola I., Balasch M., Plana-Durán J., Enjuanes L. // J. Virol. - 1999. - v.73. - P.7607-7618

142. Sanchez, C.M. Antigenic homology among coronaviruses related to transmissible gastroenteritis virus / Sanchez C.M., Jimenez G., Laviada M.D., Correa I., Sune C., Bullido M. J., Gebauer F., Srnerdou C., Callebaut P., Escribano J.M., Enjuanes L. //Virology. - 1990. - v. 174. - P.410-417

143. Santero, G.G. The "rotary column" method for growth of large-scale quantities of cell monolayers // Biotechnol. Bioeng. - 1972. - v. 14. - P.753-775

144. Sato, T. Mutations in the spike gene of porcine epidemic diarrhea virus associated with growth adaptation in vitro and attenuation of virulence in vivo / Sato T., Takeyama N., Katsumata A., Tuchiya K., Kodama T., Kusanagi K. // Virus Genes. - 2011. - v.43. - P.72-78

145. Schwarz, B. Murine coronavirus nonstructural protein ns2 is not essential for virus replication in transformed cells / Schwarz B., Routledge E., Siddell S.G. // J. Virol. - 1990. - v.64. - P.4784-4791

146. Sestak, K. Porcine coronaviruses / Sestak K., Saif L.J. //In: A. Morilla et al. (Eds) Trends In Emerging Viral Infections Of Swine, Iowa State Press, 2002. P.321-330

147. Shibata, I. Passive protection against porcine epidemic diarrhea (FED) virus in piglets by colostrum from immunized cows / Shibata I., Ono M, Mori M. // J. Vet. Med. Sci. - 2001. - v.63. - P.655-658

148. Shibata, I. Isolation of porcine epidemic diarrhea virus in porcine cell cultures and experimental infection of pigs of different ages / Shibata I., Tsuda T., Mori M., Ono M., Sueyoshi M., Uruno K. // Vet. Microbiol. - 2000. - v.72. - P. 173182

149. Shirai, J. Lactogenic immunity to transmissible gastroenteritis of swine induced by attenuated Nouzilly strain of TGE virus: Neutralizing antibody classes and protection / Shirai J., Lantier I., Bottreau E., Aynaud J.M., Bernard S. //Ann. Rech. Vet. - 1988. - v. 19. -P.267-272

150. Shirato, K. Enhanced cell fusion activity in porcine epidemic diarrhea virus adapted to suckling mice / Shirato K., Maejima M., Hirai A., Ami Y., Takeyama N., Tsuchiya K., Kusanagi, K., Nunoya, T. & Taguchi, F. // Arch. Virol. - 2010. -v.155. - P.1989-1995

151. Siegrist, C.A. Vaccine immunology / Siegrist C.A., Robinson J.M., Rogalewicz J.A. // In: S. Plotkin et al. (Eds) Vaccines, 2008, P. 17-36

152. Song, D.S. Differentiation of a Vero cell adapted porcine epidemic diarrhea virus from Korean field strains by restriction fragment length polymorphism analysis of ORF 3 / Song D.S., Yang J.S., Oh J.S., Han J.H., Park B.K. // Vaccine. - 2003. - v.21. -P.1833-1842

153. Song, D.S. Fecal shedding of a highly cell adapted porcine epidemic diarrhea virus after oral inoculation of pigs / Song D.S., Oh J.S., Kang B.K. Yang J.S., Song J.Y., Moon H.J., Kim T.Y., Yoo H.S., Jang Y.S., Park B.K. // J. Swine Health Prod. - 2005. - v. 13. - P.269 - 272

154. Song, D.S. Use of an internal control in a quantitative RT - PCR asssay for quantitation of porcine epidemic diarrhea shedding in pigs / Song D.S., Kang B.K., Lee S.S., Yang J.S., Moon H.J., Oh J.S., Ha G.W., Jang Y.S., Park B.K.// J. Virol. Meth. - 2006. - v. 133. - P. 27-33

155. Song, D.S. Oral efficacy of Vero cell attenuated porcine epidemic diarrhea virus DR13 strain / Song D.S., Oh J.S., Kang B.K., Yang J.S., Moon H.J., Yoo H.S., Jang Y.S., Park B.K. // Res. Vet. Sei. - 2007. - v.82. - P. 134—140

156. Song, D.S. Porcine epidemic diarrhea virus: a comprehensive review of molecular epidemiology, diagnosis and vaccines / Song D.S., Park B.K. // Virus Genes. - 2012. - v.44. - P.167-175

157. Spaan, W. Coronaviruses: structure and genome expression / Spaan W., Cavanagh D., Horzinek M.C. // J. Gen. Virol. 1988. 69: 2939-2952.

158. Stevenson, G.W. Emergence of Porcine epidemic diarrhea virus in the United States: clinical signs, lesions, and viral genomic sequences / Stevenson G.W., Hoang H., Schwartz K.J., Burrough E.R., Sun D., Madson D., Cooper V.L., Pillatzki A., Gauger P., Schmitt B.J., Koster L.G., Killian M.L., Yoon K.J. // J.

Vet. Diagn. Invest. - 2013. - v.25. - P.649-654

159. Stokes, C. Mucosal defence along the gastrointestinal tract of cats and dogs / Stokes C., Waly N. // Vet. Res. - 2006. - v.37. - P.281-293

160. Sueyoshi, M. An immunohistochemical investigation of porcine epidemic diarrhea / Sueyoshi M., Tsuda T., Yamazaki K., Yoshida K, Nakazawa M, Sato K, Minami T, Iwashita K, Watanabe M, Suzuki Y. // J. Clin. Pathol. - 1995. -v.113. - P.59-67

161. Sun, D. Identification of two novel B cell epitopes on porcine epidemic diarrhea virus spike protein / Sun D., Feng L., Shi H., Chen J., Cui X., Chen H., Liu S., Tong Y., Wang Y., Tong G. // Vet. Microbiol. - 2008. - v. 131. - P.73-81

162. Sune, C. Mechanisms of transmissible gastroenteritis coronavirus neutralization / Sune C., Jimenez G., Correa I., Bullido M.J., Gebauer F., Smerdou C., Enjuanes L. //Virology. - 1990. - v. 177. -P.559-569

163. Superti, F. HT-29 cells: a new substrate for rotavirus growth / Superti F., Tinari A., Baldassarri L., Donelli G. // Arch Virol. - 1991. - v. 116. - P. 159-173

164. Takahashi, K. An outbreak of swine diarrhea of a new-type associated with coronavirus-like particles in Japan / Takahashi K., Okada K., Ohshima K. // Jpn. J. Vet. Sci. - 1983. - v.45. -P.829-832

165. Tidke, R. Characterization of a double avirulent mutant of rabies virus and its potency as a vaccine, live or inactivated / Tidke R., Prehaud C., Coulon P., Blancou J., Flamand A. // Vaccine, - 1987. - v.5. - P.229-233

166. Truitt, R.L. The replication of bovine viral diarrhea-mucosal disease virus in bovine leukocytes in vitro / Truitt R.L., Schechmeister I.L. // Arch. Gesamte Virusforsch. - 1973. - v.42. - P.78-87

167. Usami, Y. Antibody response of pregnant sows to porcine epidemic diarrhea virus live vaccine and maternally derived antibodies of the piglets / Usami Y., Yamaguchi O., Kumanomido K., Matsumura Y. // J. Jpn. Vet. Med. Assoc. -1998.- v.51.-P.652-655

168. Utiger, A. Identification of the membrane protein of porcine epidemic diarrhea virus / Utiger A., Tobler K., Brigen A., Ackermann M. // Virus Genes. - 1995a. -v.10. - P.137-148

169. Utiger, A. Identification of proteins specified by porcine epidemic diarrhoea virus / Utiger A., Tobler K., Bridgen A., Suter M., Singh M., Ackermann M. //

Adv. Exp. Med. Biol. - 1995b. - v.380. -P.287-290

170. Van Cott, J.L. Contribution of antibody secreting cells induced in mucosal lymphoid tissues of pigs inoculated with respiratory or enteric strains of Coronavirus to immunity against enteric Coronavirus challenge / Van Cott J.L., Brim T.A., Lunney J.K., Saif L.J. // J. Immunol. - 1994. - v.152. - P.3980-3990

171. Van Nieuwstadt, A.P. Use of two enzyme-linked im-munosorbent assays to monitor antibody responses in swine with experimentally induced infection with porcine epidemic diarrhea virus / Van Nieuwstadt A.P., Zetstra T. // Am. J. Vet. Res. - 1991. - v.52. - P.1044-1050

172. VanReeth, K. Prevalence of infections with enzootic respiratory and enteric viruses in feeder pigs entering fattening herds / VanReeth K., Pensaert M. // Vet. Ree. - 1994. - v. 135. - P.594-597

173. Wang, K., PEDV ORF3 encodes an ion channel protein and regulates virus production / Wang K., Lu W., Chen J., Xie S., Shi H., Hsu H., Yu W., Xu K., Bian C., Fischer W.B., Schwarz W., Feng L., Sun B. // FEBS Lett. - 2012. -v.586. -P.384-391

174. Wege, H. Immunological aspects of Coronavirus infections // Springer Semin. Immunopathol. - 1995. - v. 17. - P. 133-148

175. Willcocks, M.M. Growth and characterisation of human faecal astrovirus in a continuous cell line / Willcocks M.M., Carter M.J., Laidler F.R., Madeley C.R. // Arch. Virol. - 1990. - v. 113. - P.73-81

176. Williams, R.A. Further studies on the development of a live attenuated vaccine against turkey rhinotracheitis / Williams R.A., Savage C.E., Worthington K.J., Jones R.C. // Avian Pathol. - 1991. - v.20. - P.585-596

177. Witte, K.H. Der Nachweis von Antikörpern gegen das Virus der Epizootischen Virusdiarrhoe (EVD) des Schweines mit dem Immunofluoreszenz-blockadetest (IFBT) / Witte K.H., Prager D. // Tierarztl. Umsch. - 1987. - v.42. - P.817-820

178. Wood, E.N. An apparently new syndrome of porcine epidemic diarrhoea // Vet. Ree. - 1977.-v. 100.-P.243-244

179. Wood, E.N. Transmissible gastroenteritis and epidemic diarrhoea of pigs // Br. Vet. J. - 1979. - v.135. - P.305-314

180. Woods, R.D. Efficacy of a transmissible gastroenteritis Coronavirus with an altered ORF-3 gene // Can. J. Vet. Res. - 2001. - v.65. - P.28-32

181. Woolcock, P.R. Duck virus hepatitis: serial passage of attenuated virus in ducklings / Woolcock P.R., Crighton GW. // Vet. Rec. - 1979. - v.105. - P.30-32

182. Yeo, S.G. Cloning and sequencing analysis of the spike gene of porcine epidemic diarrhea virus Chinju99 //Virus Genes. - 2003. - v.26. - P.239-246

183. Youn, S. In vitro assembled, recombinant infectious bronchitis viruses demonstrate that the 5a open reading frame is not essential for replication / Youn S., Leibowitz J.L., Collisson E.W. // Virology. - 2005. - v.332. - P.206-215

184. Yount, B. Severe acute respiratory syndrome coronavirus group-specific open reading frames encode nonessential functions for replication in cell cultures and mice / Yount B., Roberts R.S., Sims A.C., Deming D., Frieman M.B., Sparks J., Denison M.R., Davis N, Baric R.S. // J.Virol. - 2005. - v.79. - P. 14909-14922

ПРИЛОЖЕНИЯ

РТСШЙСЕЛШ ФЩЩ1РЛ1Щ1Ш

ж жжжжж

ж ж ж

ж

ж

ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж

ж ж ж ж ж ж

ож

ж ж ж ж ж ж ж ж ж

жжжжжж

■Ч^ л.

НА ИЗОБРЕТЕНИЕ

№ 2440823

*V с л

< О *> Ч < -V А

4 ^ ^

шш

ЖИВЖ^СУЖШ ВАКПИНА 'ИС'' ПРОТИВ ЭЩЗШШ^|% ДИАРЕИ СВИНЕИ И СПОСОБ

щ

Л Ч <4 V >

Ч ч <>

¥ л .»V

~ > + Л* ! с

А V» «ь ч

N ^

СВИНЕИ

Патентообладатели) Сергеев Олег Витальевич (1Ш), Алипер Тарас Иванович (КII), Сергееве Вищалий Александрович (1Ш), Непокл оно вМвгсни и\А на тол ь ев и ч (ЯИ)

> » % <

^ та ^ ^ ^ 4

Автор(ы) см .Снацборотё^ к

> *

г-

ч4

Ч

4 4 Заявка №-2010131048

у ^

5 Приоритет изобретения 27 ИЮЛЯ 2010 г. Зарегистрировало в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27января 2012 г. ч£рок действия патента^истекает 27 июля 2030 г.

Руководитель Федеральной службы по интеллектуальной собственности

Б П Симонов

ж

ж ж ж

ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж

ж ж ж

ПАСПОРТ НА ШТАММ ВИРУСА

i

i,

í • р

i

l*

г

iK

№

i

f ¿ &

íD

vv

'tjí, Щ

!ÍÍ

1 Наименование штамма, таксономическое положение Штамм «ИС» вируса эпизоотической диареи свиней (ЭДС), сем. Coronaviridae, род Coronavirus

2 Каким путём получен данный штамм Оригинальный вакцинный штамм получен из полевого вирулентного изолята вруса ЭДС путём серийного пассирования в культуре клеток почки зелёной мартышки (линия Vero). Штамм прошёл 100 пассажей в культуре клеток Vero

3 Назначение штамма Штамм производственный, авирулентный, предназначен для изготовления живой вакцины

4 Рекомендуемый способ хранения штамма В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 40°С

5 Периодичность освежения 1 раз в 5 лет

6 Биологические свойства В культуре клеток Vero размножается с выраженным ЦПЭ (формированием синцитиев, симпластов)

7 Серологические свойства Активен в РН со специфической антисывороткой

8 Патогенность для животных Не патогенен для сельскохозяйственных и лабораторных животных

9 Активность штамма Вирус 80-100 пассажа имеет титр 10£о_106,ОТцц5о/смЗ

10 В каком виде передаётся штамм, количество и род упаковки В лиофилизированном виде в 3 мл стеклянных флаконах, 10 флаконов по 1,0 см3

11 Дополнительные сведения о штамме Штамм не контаминирован бактериальной микрофлорой, грибами, посторонними вирусами

iVíl

r¡f

•ж

•ш

jrl'í

Генеральный директ<

Т.И. Алипер

ООО «Ни> чно-произволс I веииое объел имение НАРВАК» (ООО «НПО НАРВАК»)

^иерайьлй йк« ректор РВАК»

\\ Г\\ л"""? ^

Ч Ч 'г, / ^ и'-^/У

_Т.И.Али пер

« "У"» ^ -Л- 2010 г.

стандарт ооо «нпо иарвак»

ШТАММ ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ИС ВИРУСА ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ ДИАРЕИ СВИНЕЙ (ЭДС)

СТО 42418073-0019-2010

ООО « II у ч и о- п р о 11 з во дел в е и н о е о б т> ед и н е н и е НАР В А К »

(ООО «НПО НАРВАК») AHO «liüyiно-пcc.rie,'iOBatejü>civifii институт диагностики и профилактики болезней человека и животных» (АНО «НИИ Д П

Л :

СОГЛАСОВАН О / i В Ш?жД АЮ

Замести гель Руко вод и геля Россел ьхоз надзо ра

/у У Н -А. В л асов

« 2010

¿S

СТАВДАРТ ООО «НПО НАРВАК» и AHO «НИИ ДПБ»

важщнна против эпизоотической диареи свине! живая КУЛЬТУРАЛЬНАЯ сухая «веррес-эдс»

СТО 76418883-0003-2010

Тех ни чески е уел о в и я

г.

ft

, ^ I (."енераЛыхЦй,Директор

v \00a'^il0^APBAK>>

4 '} У- 1/У Т.И.Ал инер

2010 r.

«

РЖДАГО

л?нт ЧНО «НИИ ДПБ»

» i. *'(

О.А.Всрховек'ий г.

СОГЛАСОВАНО Директор ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стендартизацин«дек;арственных средств для ж ив от ны х; и кормов», прёдс.рдйтёл-ь ТК 454

7 I ' А У

У " ' А.И. Панин

« ч- .» 2010 I

л

УШй'ЖДШ)

За меетт ггеть Р> ководш е ля

Polco илош i юра

_Н А Власов

« , » ¿f /nL^h > i

ИНСТРУКЦИЯ

iн' применению вакцины прошв um зоогическои диарей сиинси живои к\ ¡ыуральной сулои «ВЕРРЕС ЭДС» (организация-произво in гель - ООО «Вешиохнм»)

Г*

¥

lU

¡»tf3

ib 'Л ¡W

Гл и >

¿a

íbj.

н

»q

<1*

1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

1 Вакцина против знимотичсекон диареи свиней жива? к> шгуральаая сухая «ВЕРРЕС-ЭДС><

2 Вакцина представляет собой с\\ую ггорислую массу белою я m розового иве га, быстро растворяющуюся при добавлении физиологического раствора Вакцина нзготвтена из аттенуировапного штамма (ИС) вируса яш юотической диареи свиней {ЭДС} со средой высушивания и подвергнута лиофи шзации

3 Вакцину выпускают в стеклянных герме i ически ¡акры i ых флаконах вместимостью 3 0 см, содержащих 1,0 см1 вакцины Флаконы \к>корены резиновыми пробками, укрепленными алюминиевыми колпачками Флаконы с вакцинои упаковывают по 10-40 uir в карюнные (и i<acтиковые) коробки с разделительными перегородками, обеспечивающими и\ неподвижное i ь и целостность

Срок годности вакцины - 12 мес от га i ы ипотовления Запрещено использовать вакшшу по истечении срока годности

4 Вакцину хранят и транспортируют в сухом защищенном о г света месте при температуре от 2 до 8° С

5 Вакшшу необходимо хранить r местах, недоступных д ¡я детей

6 Флаконы с вакиинон. подвергшиеся замораживанию, без гнпкеток, с нарушенной укупоркой и целостностью, измененным цветом вакцины, содержавшие посторонние примеси или не разбивающийся при взбалтывании осадок, а также вакцину не испо ¡ьювапную в течение 2 ч нос ie растворения, выбраковывают и обезвреживаю! п\тем кипячения в течение 30 мин

ЧУ ф

ÍI. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

7 > вакцинированных свиней вакцина выбывает формирование иммунитета к )Д(_ коюрыи сочраняекя не менее mecí и месяцев Вакцина «В! PPÍ С-ЯДС » безопасна пя свиней всех возрасти, лечебными cbohci вамп не об ni taer

Ш. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ

X Вакцине применяю! 11Я профи икiики шнзоотческоп диареи спинеи Вакшшу применяют в комплексе с общими прошво тизоогическнми мероприятиями в соот вегс! мии с дейс iих нндеи «Пне грукцнен о меропрняшях по иред\прежлешпо и шквидацни трансмиссивною iастроэнтерига сиинень

9 Вакцин) ВЕРРГС-ЭДС применяют для вынужденной вакцинации супоросных свиноматок и хряков во все\ к.иеюрнях хозяжпз неблагополучных по ''-ЭДС Вакцинации подлежат ю тько к тнически здоровые животные

10 Содержимое флакона с сухой вакциной ВЕРРЕС-ЭДС расшорягот в стерильного фи зиолОгическом раиьоре из расчета 2 см' на о гну прививную дозу вакцины

Вакцину вводят внутримышечно в области нижней теги шеи или внутренней поверхиосш бедра в дозе 2 см\ используя для каждого жиногисио отдельную стерши ную иглу

При возникновении ЭДС в хозяйстве вакциной ВЕРРЕС-ЭДС прививают одновременно всех клинически здоровых супоросных свиноматок двукратно с шлервалпм 2 ^ недели В дальнейшем свипома/ок вакцинируют двукрашп на 75-80 и 90-95 день супоросносы! Вакцинацию свиломаток против ЭДС в ранее неблагополучном хозяйспзе зр прекращаю! через 6-8 месяцев после полного исчезновения заболевания & 11. Указанные режимы применения исключаю! возможность передозирования

Р" лекаре 1 венного средства

12 1 ¡обочные действия у препарата не выявлены.

13 Вакцину не применяю! в одном шприце с дрттми биопрепаратами и лекары венными среда вами

14. Свиней, привитых вакциной ВЕРРЕС-ЭДС, разрешается сдавать на

>¿1 мясоперераоагывагощие цреднриятия независимо от сроков вакцинации, а передавать

ВГЧ»

Д4

в другие хозяйства не ранее чем через 90 сут после полного прекращения ЭДС

IV. МЕРЫ ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ

15. Работа с лекарственным средством не ¡ребхел специальных мер предосторожности

^ 16 Подготовка к вакцинации и вакцинация проводится с использованием средсш

¡¡¡^ защиты при работе с лекарственными среда вами (хала 1 ы. кошачки. перчатки и др ) с соблюдением правил личной I игиены

17 При попадании вакцины на кожу или слизистые оболочки рекомендуется промывать эго место водопроводной водой. При случайном введении вакцины человеку ему следует обратиться в медицинское учреждение

гё",

а

Щ-

Ц50

ы

I1*

V

ы

Инструкция разработана ООО «Ветбиохим». Организация-производитель - ООО «Ветбиохим». Россия. Москва Лдрес производства' Россия. 123098, г. Москва, у л Гамалеи, д. 1 б

Рекомендовано к регистрации в Российской Федерации ФГУ ВГИКИ

Производственный регламент и технологическая инструкция по изготовлению и контролю вакцины против эпизоотической диареи свиней живой культуральной сухой (вакцины ЭДС)

Оглавление

1. Оригинальное название препарата

2. Компоненты, входящие в состав сухой вакцины ЭДС

3. Общие положения

3.1. Сухая вакцина против эпизоотической диареи свиней (ЭДС)

3.2. Производство вакцины против ЭДС

3.3. Производственный штамм ИС вируса ЭДС

3.4.

4. Характеристика готовой вакцины против ЭДС

5. Характеристика производственного штамма вируса

5.1. Требование к производственному штамму ИС вируса ЭДС и порядок работы с ним.

5.2. Порядок работы с вакцинным штаммом ИС вируса ЭДС в ООО «Ветбиохим»

6. Сырьё и материалы, применяемые в производстве сухой вакцины против эпизоотической диареи свиней

7. Спецификация лабораторного, технологического оборудования, приборов и

аппаратуры КИПиА

7.1. Аппаратурная схема и спецификация оборудования

8. Обработка стеклянной посуды, резиновых изделий и инструментов

8.1. Для изготовления вакцины и выращивания культуры клеток

8.2. Новые стеклянные 1,5 дм3 матрасы

8.3. Новые резиновые пробки

8.4. Визуальный контроль мойки

8.5. Физико-химический контроль

8.6. Обработка новых резиновых трубок и пробок

8.7. Обработка резиновых трубок и пробок, бывших в употребленн