Разработка и испытание селективных питательных сред для культивирования Actinobacillus pleuropneumoniae тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат ветеринарных наук Карабанова, Ольга Владимировна

• Карабанова, Ольга Владимировна
• кандидат ветеринарных наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Карабанова, Ольга Владимировна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Роль A.pleuropneumoniae в инфекционной патологии свиней.

1.2. Классификация актинобацилл.

1.3. Актинобациллезная пневмония свиней.

1.3.1. Эпизоотологические данные. Клинические признаки и патологоанатомические изменения.

1.3.2. Краткая характеристика биологических свойств A.pleuropneumoniae.

1.4. Бактериологическая диагностика актинобациллезной пневмонии свиней.

1.5. Серологическая диагностика актинобациллезной пневмонии свиней.

2. Собственные исследования.

2.1. Материалы и методы исследования.

2.2. Результаты собственных исследований.

2.2.1. Сравнительная оценка ростовых свойств общеупотребительных коммерческих жидких и плотных питательных сред.

2.2.2. Конструирование оптимальной жидкой питательной среды для A.pleuropneumoniae.

2.2.2.1. Влияние дрожжевого экстракта на рост A.pleuropneumoniae в жидкой питательной среде.

2.2.2.2. Влияние сыворотки крови на рост A.pleuropneumoniae в жидкой питательной среде.

2.2.2.3. Влияние глюкозы на рост A.pleuropneumoniae в жидкой питательной среде.

2.2.2.4. Влияние рН на рост A.pleuropneumoniae в жидкой питательной среде.

2.2.2.5. Оптимизация состава жидкой питательной среды.

2.2.3. Конструирование жидкой накопительной питательной среды для A.pleuropneumoniae.

2.2.3.1. Чувствительность A.pleuropneumoniae к антибиотикам и некоторым красителям.

2.2.3.2. Оптимизация количества селективных факторов в жидкой накопительной питательной среде.

2.2.3.3. Сравнительная оценка ростовых свойств оптимальной жидкой и накопительной питательных сред.

2.2.4. Конструирование оптимальной плотной питательной среды для A.pleuropneumoniae. 2.2.5. Конструирование плотной селективной питательной среды.

2.2.5.1. Оптимизация количества антибактериальных веществ в плотной селективной питательной среде.

2.2.5.2. Сравнительная оценка ростовых свойств оптимальной и селективной плотных питательных сред.

2.2.6. Конструирование плотной дифференциально-диагностической питательной среды с селективными свойствами.

2.2.7. Изучение селективных свойств сконструированных жидкой и плотной питательных сред.

2.2.7.1. Ингибирующее действие жидкой накопительной питательной среды на рост гетерологичных видов микроорганизмов.

2.2.7.2. Ингибирующее действие плотной селективной питательной среды на рост гетерологичных видов f микроорганизмов.

2.2.7.3. Влияние различных видов бактерий на рост A.pleuropneumoniae в смешанных культурах в жидких питательных средах.

2.2.8. Результаты испытания сконструированных селективных питательных сред для выделения A.pleuropneumoniae из животных тканей.

2.2.8.1. Результаты бактериологического исследования миндалин клинически здоровых убойных свиней.

2.2.8.2. Влияние микрофлоры миндалин свиней на рост A.pleuropneumoniae.

2.2.8.3. Результаты бактериологического исследования * материалов от свиней, больных пневмонией с использованием селективных питательных сред.

3. Обсуждение результатов.

Выводы.

Практические предложения.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и испытание селективных питательных сред для культивирования Actinobacillus pleuropneumoniae»

Актуальность темы. Среди респираторных инфекций свиней широко распространены болезни, вызываемые представителями семейства Pasteurellaceae. В пределах данного семейства, наряду с P.multocida, значительную роль в инфекционной патологии свиней играет Actinobacillus pleuropneumoniae - возбудитель актинобациллезной пневмонии свиней (М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, 1986; Л.Я. Романова, В.Ф. Финенко, 1987; М.А. Сидоров, Ш.М. Мицаев Д.И. Скородумов, 1989; F. Touil, R. Higgins, 1988; J. Hommer, E.M. Kamp, W.L.A. Lioeffen et.al., 1999).

В основе борьбы с любой инфекционной болезнью лежит эффективная диагностика. Методы серодиагностики актинобациллезной пневмонии свиней (РСК, РА, иммуноферментный метод) большинство авторов рассматривают как групповые, полезные преимущественно при оценке эпизоотической ситуации в хозяйстве. Основным методом лабораторной диагностики актинобациллезной пневмонии свиней остается бактериологическое исследование (М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, Н.И. Лаврентьев, 1981; Л.Я. Романова, В.Ф. Финенко, 1987; A. Gunnarson, 1979; K.R. Mittal, R. Higgins, 1984; R. Nielsen, 1988).

При острых вспышках болезни и исследовании свежих легочных поражений изоляция культуры возбудителя не представляет особой сложности. Труднее выделить A. pleuropneumoniae из старых пневмонических очагов и особенно из миндалин, носовой и трахеобронхиальной слизи из-за сильного загрязнения материала сопутствующей микрофлорой. Многие аспекты экологии А. pleuropneumoniae недостаточно ясны, их изучение требует исследования материалов, содержащих значительное количество бактериальных контаминантов (М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, 1978; М.Ф. Мильков 1987; F. Castryck, 1984; Т. Gram, 1996; U. Hinrichs, V.F. Ohlinder, S. Pesh et. al., 1999). Таким образом, для повышения эффективности бактериологической диагностики актинобациллезной пневмонии свиней и изучения экологии возбудителя необходимо применение питательных сред с селективными свойствами. В зарубежной литературе имеются единичные сообщения о попытках конструирования и использования питательных сред подобного типа (К.A. Gilbride, 1983; M.J. Jacobsen, 1995).

Отечественные бактериологи целенаправленных исследований в данном направлении не проводили. В связи с изложенным, мы поставили перед собой задачу по конструированию и испытанию селективных питательных сред для культивирования A.pleuropneumoniae.

Цель и задачи исследовании. Разработать жидкую среду обогащения (накопительную) и плотную селективную среду для диагностического культивирования A. pleuropneumoniae.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

- оптимизировать состав жидкой и плотной питательных сред для диагностического культивирования A. pleuropneumoniae, с использованием в качестве основы доступных отечественных коммерческих питательных сред;

- определить качественный состав и оптимальное количественное соотношение противомикробных веществ в селективных питательных средах для культивирования A. pleuropneumoniae;

- провести оценку разработанных селективных питательных сред по основным параметрам, характеризующим рост A. pleuropneumoniae, и селективным свойствам;

- испытать сконструированные селективные питательные среды для выявления A. pleuropneumoniae в животных тканях.

Научная новизна. Научно обоснованы:

- оптимальный состав жидкой и плотной питательных сред для диагностического культивирования A. pleuropneumoniae с использованием в качестве основы доступных отечественных коммерческих микробиологических сред;

- качественный состав и оптимальное количественное соотношение противомикробных веществ в селективных жидких и плотных питательных средах для A. pleuropneumoniae;

- использование жидкой накопительной и плотной селективной питательных сред в схеме бактериологического исследования на актинобациллезную пневмонию свиней.

Практическая ценность работы. Разработаны жидкая накопительная и плотная селективная питательные среды для культивирования А. pleuropneumoniae.

Определена целесообразность использования сконструированных селективных питательных сред для выделения A. pleuropneumoniae из материала, контаминированного сопутствующей микрофлорой.

Предложена схема бактериологического исследования на актинобациллезную пневмонию свиней, предусматривающая применение жидкой и плотной селективных питательных сред.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: межкафедральном заседании сотрудников ветеринарно-санитарного факультета МГУПБ (2003) и Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, (2003).

Публикации. Материалы диссертации отражены в четырех опубликованных печатных работах.

Основные положения, выносимые на защиту:

Состав оптимизированных жидкой и плотной питательных сред для диагностического культивирования A. pleuropneumoniae.

Состав жидкой накопительной и плотной селективной питательных сред для A. pleuropneumoniae.

Схема бактериологического исследования на актинобациллезную пневмонию свиней с использованием жидкой и плотной селективных питательных сред.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Карабанова, Ольга Владимировна

ВЫВОДОВ

Для выделения A.pleuropneumoniae из контаминированного посторонней микрофлорой материала рекомендуем применять разработанные накопительную и плотную селективные питательные среды.

Заключение

При остром и сверхостром течении актинобациллезиой пневмонии ifr свиней выделение возбудителя не представляет особой сложности.

Типичные клинические симптомы могут служить диагностическим ориентиром, патологоанатомические и гистологические изменения достаточно специфичны и также могут служить основанием для постановки предварительного диагноза на актинобациллезную пневмонию свиней. Окончательный диагноз ставится на основании результатов бактериологического исследования.

Затруднения возможны при диагностике подострых, и особенно хронических случаев, а также при изучении бактерионосительства.

В случае хронического течения типичные признаки болезни ^ практически отсутствуют. Исследуемый материал, направляемый в лабораторию, может быть контаминирован сопутствующей микрофлорой, а количество возбудителя в нем может быть невелико.

Как следует из данных литературы, сведения о носительстве возбудителя, биологических свойствах A.pleuropneumoniae, выделенных от свиней из благополучных стад, крайне скудны. Исследование указанных

32 вопросов безусловно требует использования селективных питательных сред.

Поэтому одним из существенных направлений совершенствования бактериологической диагностики актинобациллезной пневмонии свиней, по нашему мнению, является разработка соответствующих жидкой накопительной и плотной селективной питательных сред для культивирования возбудителя.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследования

Работа выполнена в период с 2000 по 2003 гг. на кафедре микробиологии и иммунологии Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

Материал для бактериологического исследования брали от убойных свиней на Таганском мясокомбинате и ЗАО «Кузнецовский свинокомплекс», а также от павших и убитых с диагностической целью животных из хозяйств, неблагополучных по респираторным болезням свиней (АОЗТ «Комплекс» Череповецкого района Вологодской области; СПК «Кущевский» Краснодарского края). Всего бактериологическому исследованию подвергнут материал от 42 свиней, в том числе от 19 клинически здоровых и 23 с явлениями пневмонии.

В опытах использовали референтные штаммы Actinobacillus pleuropneumoniae ССМ 5869, ССМ 5870, ССМ 5871, М62, К 17, К 98; штаммы из музеев бактериальных культур кафедр микробиопогии и иммунологии МГУПБ и МГАВМиБ: B.subtilis, S. aureus NCTC 8530, S. epidermidis AFCC 14990, S. typhimurium № 415, E. coli 02, P. multocida P19 (серовар D), а также С. albicans.

Перед использованием культуры типовых штаммов A.pleuropneumoniae подвергали селекции по признаку диссоциации. С этой целью лиофильно высушенные культуры A. pleuropneumoniae после регидратации высевали на сывороточно-дрожжевой бульон с добавлением 5 % сыворотки крови крупного рогатого скота и 5 % стерильного дрожжевого экстракта.

После 18-20 ч культивирования при 37 °С культуры рассевали на чашки Петри с сывороточно-дрожжевым агаром. Через 20 ч культивирования колонии изучали при помощи стереоскопического микроскопа МБС-10 в косопроходящем пучке света (Н.С. Акатова, 1966) и отбирали для последующей работы колонии S-формы, характеризующиеся следующими признаками: 6-18-часовые культуры в пучке косопроходящего света флуоресцируют, имеют зеленоватый цвет с красным отливом, мелкозернистую структуру, иногда легкую концентрическую исчерченность.

При конструировании питательных сред применяли: питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой (НПО «Питательные среды», г. Махачкала); агар для культивирования микроорганизмов, сухой (ГРМ-агар, МНПЦ ГИП, г. Оболенск); питательный агар сухой АСД (Ставропольский НИИ вакцин и сывороток, г. Ставрополь); МПА; «шоколадный агар»; питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), бульон на переваре Хоттингера с содержанием 120 мг/% аминного азота; МПБ.

В качестве добавочных ростовых и антитоксических компонентов питательных сред использовали дрожжевой экстракт, глюкозу в виде 40%-ного стерильного раствора, стерильную сыворотку крови крупного рогатого скота (ООО «Биолот», Санкт-Петербург).

Дрожжевой экстракт готовили из прессованных хлебных дрожжей по следующей методике: в 1 л дистиллированной воды суспендировали 250 г дрожжей, кипятили 4-5 мин; суспензию центрифугировали при 5000 об/мин 15-20 мин; надосадочную жидкость стерилизовали путем фильтрации через стерилизующие пластины фильтра Зейтца. Стерильный дрожжевой экстракт хранили при температуре 4-8 °С - не более 7 суток.

В качестве селективных факторов при разработке питательных сред использовали следующие антибиотики и красители: кристалвиолет (Фабрика химреактивов, г. Львов); раствор бриллиантовой зелени 1%-й (ОАО «Московская фармацевтическая фабрика»); Амфотерицин В (АКО «Синтез», г. Курган); Bacitracin, В - 5150; Tylosin, РА 9503; Cloxacillin sodium 106Н0826; Nistatin, - (Sigma chemical CO). Для определения чувствительности A. pleuropneumoniae к антибиотикам использовали стандартные бумажные диски (объединение «Мосмедпром» им. Л.Я. Карпова) с оксациллином, бензилпенициллином, ристомицином, линкомицином, эритромицином, олеандомицином, фузидином, тетрациклином, метациклином, левомицетином, неомицином, мономицином, канамицином, гентамицином, ампициллином, полимиксином, рифампицином, стрептомицином, карбенициллином, амфотерицином, нистатином, доксациклином, ципрофлоксацином, клотримазолом, бацитрацином, тилозином, клоксациллином.

Чувствительность A. pleuropneumoniae к антибиотикам определяли методом диффузии в агар с применением стандартных бумажных дисков и методом серийных разведений в жидких питательных средах (М.Д. Биргер, 1973). Ингибирующее действие красителей устанавливали методом предельных разведений.

Общее количество бактериальных клеток устанавливали при помощи стандарта мутности ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича и нефелометрически, используя калибровочную кривую. Количество жизнеспособных бактериальных клеток определяли методом посева серийных десятикратных разведений исследуемой взвеси бактерий на поверхность плотной питательной среды, а также методом предельных разведений в жидкой питательной среде с вычислением концентрации микробных клеток методом наиболее вероятных чисел с использованием таблицы Мак-Креди (Н.С. Егоров, 1986).

Выбор оптимального соотношения исследуемых компонентов в составе базовых и селективных питательных сред осуществляли согласно методу ортогональных латинских прямоугольников (В.В. Бирюков, 1968).

Оценку качества сконструированных питательных сред проводили по следующим показателям:

- чувствительность питательной среды;

- скорость роста, период генерации;

- выход бактериальных клеток на 1 мл среды;

- селективные свойства среды;

- сохранение стабильности биологических свойств культивируемого микроорганизма (Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям 1980; Г. Шлегель 1987; Э. Джавец 1982).

Длительность лаг-фазы — Ti определяли как промежуток времени между моментом tr, в который культура достигла определенной плотности хг и моментом времени tj , в который она могла бы достичь такой же плотности, если бы сразу же после инокуляции начался экспоненциальный рост

Ti = tr-ti = tr- 'е*г-'8*о.

Скорость экспоненциального роста вычисляют из начальной и конечной плотности бактерий х0 и xt в моменты времени t0 и t по формуле: м lgxt-lgxQ Ц lge(t-t0)

Время генерации вычисляли по формуле

Явление диссоциации изучали по методу Н.С. Акатовой (1966), с использованием стереоскопического микроскопа МБС-10. При этом определяли наличие в популяции и процентное содержание колоний с измененными морфологическими и оптическими характеристиками.

Материалом для бактериологического исследования служили миндалины, пораженные ткани легких, бронхиальная слизь. Всего исследовано 76 материалов от 19 клинически здоровых и 23 больных пневмонией свиней. Выделено и идентифицировано на уровне рода или вида 156 культур бактерий.

При бактериологическом исследовании материал высевали на сывороточно-дрожжевой агар и бульон, сывороточный и кровяной агар с «баккормилкой», а также на сконструированные питательные среды. У выделенных культур бактерий определяли форму клеток, отношение к окраске по Граму. Окраску бактерий по методу Грама проводили в модификации Хукера (P. Gerhard et al, 1983). В сомнительных случаях результаты окраски по Граму контролировали в тесте с гидроксидом калия (Т. Gregesen, 1978). Капсулы выявляли окраской по методу Гинса (М.О. Биргер, 1973); жгутики - посевом в 0,3%-й ПЖА и микроскопией препарата «раздавленная капля». На первоначальном этапе идентификации, после установления формы клетки и окраски по Граму, использовали идентификационные схемы P.J. Quinn и соавт. (1994). У грамположительных палочковидных бактерий и кокков в этом случае определяли в тесте Хью-Ляйфсона тип метаболизма углеводов (глюкоза, сахароза, мальтоза, маннит); каталазную и оксидазную активность. У выделенных грамотрицательных палочковидных бактерий и кокков исследовали способность к росту на агаре Мак-Конки, тип метаболизма углеводов, каталазную и оксидазную активность. В случае необходимости у бактерий, отнесенных к определенному роду или группе родов, изучали дополнительные ферментативные характеристики с использованием рутинных тестов, а также пластин биохимических для дифференциации энтеробактерий (ПБДЭ) производства Нижегородского НИИЭМ.

Ферментативную активность бактерий по отношению к углеводам исследовали в полужидких средах Гисса, при изучении НАД-зависимых бактерий в среды добавляли НАД (10 мкг/мл).

Оксидационно-ферментативный тест Хью-Ляйфсона проводили на одноименной питательной среде с глюкозой, сахарозой, мальтозой и маннитом. Для этого исследуемую культуру засевали в пробирки со средой Хью-Ляйфсона. Перед посевом для удаления кислорода пробирки со средой, углеводом и индикатором кипятили 15-20 мин, охлаждали и

38 засевали уколом испытуемой культурой. В одну из пробирок после посева наливали стерильное вазелиновое масло слоем толщиной 1 см (анаэробная пробирка). Результаты учитывали после инкубирования по следующей схеме: если кислота не образуется в обеих пробирках — микроорганизм не утилизирует данный углевод. Образование кислоты только в аэробной пробирке (без вазелинового масла) указывает на расщепление углеводов путем окисления. Если кислота образовалась в обеих пробирках, то микроорганизм способен расщеплять углевод также путем брожения.

Образование каталазы тестировали с применением 3%-й перекиси водорода: бактериальную массу снимали с поверхности агаровой среды бактериологической петлей или тонким стеклянным шпателем и суспендировали в капле 3%-й перекиси водорода на предметном стекле. Результат учитывали невооруженным глазом или под малым увеличением микроскопа сразу или через 5 мин. Оценивали по наличию пузырьков газа ^ (положительный результат) или по их отсутствию (отрицательный результат).

Образование оксидазы определяли по методу Ковач с использованием в качестве субстрата 1%-го диметилпарафенилендиамина. Испытуемую культуру выращивали 18-20 ч на агаровой среде в чашке Петри. Поверхность среды заливали приготовленным перед употреблением 1%-ным раствором диметилпарафенилендиамина. Чашку наклоняли, чтобы раствор стек, и через 20-30 с учитывали результат. Колонии бактерий, образующих оксидазу, приобретали пурпурный цвет.

Редукцию нитратов определяли, используя жидкую питательную ^ среду с добавлением 0,1% KNO3 (С.A. Neyra et. al. 1977). Посевы инкубировали при 37 °С, результаты учитывали через 1, 2, 4 и 7 дней. В указанные сроки в пробирку отбирали 0,1 мл культуры, добавляли 2 мл реактива, затем дистиллированную воду до 4 мл. Через 15 мин учитывали результат: положительный результат - среда окрашена в красный цвет.

Щелочную фосфатазу выявляли с помощью раствора динатрий-п-нитрофенилфосфата на глициновом буфере (Burger, 1967). Испытуемую культуру выращивали на питательном агаре, смывали бактериальную массу небольшим количеством изотонического раствора натрия хлорида с таким расчетом, чтобы бактериальная суспензия по оптической плотности приближалась к молоку. Затем в стерильную пробирку наливали 0,3 мл суспензии бактерий и 0,3 мл 0,1 М глицинового буфера (рН 4,8), с растворенным 0,01 М динатрий-п-нитрофенилфосфатом. Компоненты перемешивали и выдерживали при 37 °С 6 ч. При наличии щелочной фосфатазы суспензия окрашивалась в желтый цвет. Контролем служила пробирка с физиологическим раствором и остальными компонентами, но без бактерий.

Утилизация натрия цитрата. Для данной цели использовали цитратный агар Кристенсена (Christensen, 1949).

Выявление уреазы. Бактериальную массу испытуемой культуры в количестве одной бактериологической петли вносили в пробирку с 1 мл среды Заксе. Результаты учитывали после 30-40 мин инкубирования при температуре 37-38 °С. За положительную реакцию принимали малиново-красное окрашивание среды.

Определение индола. Испытуемую культуру выращивали сутки в бульоне Хоттингера. Экстракцию образовавшегося индола из культуры производили эфиром, пробирку тщательно встряхивали, оставляли в покое до отстаивания на поверхности среды слоя эфира и затем осторожно добавляли 0,5 мл реактива Эрлиха. Реактив Эрлиха: пара-диметиламинобензоальдегид - 0,5 г, этанол 96% - 95 мл, НС1 - 20 мл.

Желатиназную активность определяли посевом чистой культуры бактерий уколом в столбик желатины. Засеянные пробирки, а также пробирки с незасеянной желатиной инкубировали при температуре 37 °С в течение 10 суток. Опытные и контрольные пробирки охлаждали в холодной воде (10-15° С), после чего учитывали результат по текучести столбика желатины.

Способность утилизировать аминокислоты (аргинин, орнитин, фенилаланин, лизин) и образовывать Р-галактозидазу тестировали на пластинах ПБДЭ. Пластины биохимические для идентификации энтеробактерий (ПБДЭ) использовали согласно прилагаемой инструкции.

Зависимость бактерий от НАД определяли в тесте "сателлитного" роста на сывороточном питательном агаре (5 % сыворотки крови крупного рогатого скота) с питающей культурой S. epidermidis.

Полученный цифровой материал обрабатывали, используя общепринятые методы математической статистики (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962, Ростова Н.С., 1977).

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Сравнительная оценка ростовых свойств общеупотребительных коммерческих жидких и плотных питательных сред

На первом этапе исследований провели сравнительную оценку доступных для диагностических лабораторий коммерческих общеупотребительных плотных и жидких питательных сред с целью выбора наиболее оптимальных, как основы для конструирования жидкой накопительной и плотной селективной питательных сред.

Общепринятые питательные среды не обеспечивают рост A.pleuropneumoniae, поэтому в каждую из тестируемых сред вносили равные объемы стерильного дрожжевого экстракта как источника НАД и стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота в количестве 5%.

Испытывали следующие жидкие питательные среды:

• Питательный бульон сухой для культивирования микроорганизмов (ННПЦ ГИП, г. Оболенск). Состав в г на 1 л воды: панкреатический гидролизат рыбной муки - 18,0; натрия хлорид — 2,0.

• Питательный бульон сухой для культивирования микроорганизмов (НПО «Питательные среды», г. Махачкала). Состав в г на 1 л воды: панкреатический гидролизат кильки - 10,05 г.; натрия хлорид-4,95 г.

• Питательный бульон на переваре Хоттингера с содержанием 20 мг/% аминного азота.

• Мясо-пептонный бульон.

Жидкие питательные среды после уравнивания рН (7,4-7,5) разливали в одинаковых объемах по однотипным культуральным сосудам (пробирки, колбы). После внесения дрожжевого экстракта и сыворотки крови, для контроля стерильности, среды выдерживали 20 ч при 37-38 °С, затем инокулировали равными посевными дозами бактериальных культур, выращенных в течение 20 ч на 5%-ном сывороточно-дрожжевом МПА. Посевная доза составляла 0,1 мл культуры концентрацией 0,5 х 109 микробных клеток в 1 мл. Производили параллельный посев трех штаммов A. pleuropneumoniae (ССМ 5869, ССМ 5870, М 62). Посевы инкубировали в термостате при 37 °С в стационарных условиях в течение 20 ч.

Затем нефелометрически, используя калибровочную кривую, устанавливали общее количество бактериальных клеток в 1 мл питательной среды. Полученные результаты в виде средних показателей по группе штаммов представлены в табл. 1. Как видно из приведенных данных, наибольшие и близкие показатели накопления бактериальных клеток в 1 мл среды получены в бульоне Хоттингера и питательном бульоне НПО «Питательные среды» (г. Махачкала). Поскольку различия выхода бактериальных клеток на этих средах были несущественными, для дальнейших исследований мы выбрали, как наиболее доступный, питательный бульон производства НПО «Питательные среды» (г. Махачкала).

Сравнительная оценка ростовых свойств различных общеупотребительных жидких питательных сред (Р> 0,01)

Питательная среда Общее количество бактериальных клеток (log)

Питательный бульон сухой для культивирования микроорганизмов (НПО «Питательные среды», г. Махачкала) 8,99 ± 0,08

Питательный бульон сухой для культивирования микроорганизмов (ННПЦ ГИП, г. Оболенск) 8,89 ± 0,27

Бульон Хоттингера с содержанием 120 мг/% аминного азота 9,0 ±0,16

МПБ 8,86 ± 0,27

Из плотных общеупотребительных коммерческих питательных сред испытывали:

• Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ - агар), производство ННПЦ ГИП, г. Оболенск. Состав в г на 1 л воды: панкреатический гидролизат рыбной муки — 24,0; натрий хлористый - 4,0; агар микробиологический — 12,0 ± 2,0.

• Питательный агар сухой для культивирования микроорганизмов (АСД), производство Ставропольского НИИ вакцин и сывороток. Состав в г на 1 л воды: очищенный гидролизат кормовых дрожжей — 16,0-18,0; агар в/с - 8,0-13,0; натрий хлорид - 6,0.

• Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой производства НПО «Питательные среды», г. Махачкала. Состав в г на 1 л воды: панкреатический гидролизат панциря криля мороженого - 23,1; агар микробиологический - 11,2±1,2; натрия хлорид — 7,7±0,3.

• Мясо-пептонный агар (НИИЭМ им. Гамалеи Н.Ф.)

Питательные среды готовили согласно рекомендациям производителя. Устанавливали рН 7,4-7,5. После автоклавирования среды охлаждали до 45 °С и добавляли по 5 % (объем/объем) стерильного дрожжевого экстракта и стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота. Среды разливали в стандартные чашки Петри строго по 20 мл в каждую чашку. Для посева применяли 20-часовые агаровые культуры А. pleuropneumoniae, выращенные на сывороточно-дрожжевом МПА. Посевная доза составляла 0,2 мл взвеси бактерий концентрацией 0,5 х 109 м.к./мл на одну чашку Петри. Культуру каждого штамма A.pleuropneumoniae (ССМ 5869, ССМ 5870, М 62) засевали на три параллельные чашки Петри.

Через 20 ч инкубирования при 37-38 °С бактериальную массу смывали изотоническим раствором натрия хлорида, измеряли объем бактериальной взвеси, устанавливали количество микробных клеток в 1 мл при помощи калибровочной кривой, затем умножали этот показатель на объем бактериальной взвеси. Таким образом, получали урожай бактериальной культуры для каждого штамма A.pleuropneumoniae. Общее количество выросших микробных клеток (урожай) делили на объем среды в мл в чашках Петри и получали выход бактериальных клеток на 1 мл испытуемой плотной питательной среды.

Средние показатели выхода бактериальных клеток по группе штаммов A. pleuropneumoniae на разных плотных питательных средах представлены в табл. 2. Из этих данных видно, что накопление бактериальных клеток A. pleuropneumoniae на всех испытанных образцах питательных сред близки. Исходя из полученных результатов, в качестве базовой среды для конструирования селективного агара мы выбрали питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой производства НПО «Питательные среды», г. Махачкала, как достаточно доступный и широко используемый.

Сравнительная оценка ростовых свойств коммерческих плотных питательных сред (Р > 0,01)

Питательная среда Общее количество бактериальных клеток (log)

Питательный агар сухой для культивирования микроорганизмов (ННПЦ ГИП, г.Оболеиск) 9,23 ± 0,08

Питательный агар сухой для культивирования микроорганизмов (Ставропольский НИИ вакцин и сывороток) 9,27 ±0,08

Питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой (НПО «Питательные среды», г. Махачкала) 9,25 ± 0,28

МПА 9,17 ±0,31

2.2.2. Конструирование оптимальной жидкой питательной среды для A. pleuropneumoniae

Определяя оптимальный состав питательной среды для культивирования A. pleuropneumoniae, экспериментально устанавливали оптимальное соотношение добавочных компонентов, при которых урожай бактериальных клеток достигал максимального значения в стационарном режиме культивирования.

Исследовали влияние на рост A.pleuropneumoniae дрожжевого экстракта, сыворотки крови крупного рогатого скота, глюкозы и рН среды. В качестве показателя выхода процесса использовали накопление общего количества бактериальных клеток в 1 мл питательной среды через 20 ч инкубирования при 37-38 °С. Для каждого единичного перечисленного фактора определяли «лимитирующую», «стационарную» и «ингибирующую» области, путем варьирования его содержания в среде на фоне постоянного уровня остальных факторов.

2.2.2.1. Влияние дрожжевого экстракта на рост ~ A.pleuropneumoniae в жидкой питательной среде

Питательный бульон разливали по 5 мл в стандартные пробирки с ватно-марлевыми пробками, устанавливали рН 7,6-7,7, стерилизовали (рН среды после стерилизации составлял 7,4-7,5). Затем вносили 5% (объем/объем) стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота, 0,2% глюкозы в виде 40%-ного стерильного раствора и варьирующее количество дрожжевого экстракта (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10,0 %).

Посевная доза A. pleuropneumoniae составляла 0,1 мл бактериальной взвеси 20-часовой культуры, выращенной на сывороточно-дрожжевом МПА, концентрацей 0,5 х 109 м.к. Культивирование проводили в стационарных условиях при 37-38 °С в течение 20 ч. В опыте использовали 6 штаммов A. pleuropneumoniae (ССМ 5869, ССМ 5870, ССМ 5871, М 62, К 17, К 98).

Полученные результаты представлены в табл.3 и на рис. 1. Как видно, концентрации дрожжевого экстракта в диапазоне 0,5 - 3,5 % можно оценить как «лимитирующие», а в диапазоне 5,5-9,5 % - как «ингибирующие». По нашему мнению, при использовании данного питательного бульона (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), предметом дальнейших исследований при оптимизации питательной среды могут быть концентрации дрожжевого экстракта в интервале, близком к «стационарной» области.

Влияние содержания дрожжевого экстракта в питательной среде на рост Actinobacillus pleuropneumoniae ( n = 6 ; Р > 0,05)

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Карабанова, Ольга Владимировна, 2004 год

1. Акатова Н.С. Исследования бактериальных колоний при косом освещении: Автореф. дис.канд. биол. наук. М., 1966.

2. Ашмарин И.Н. Статистические методы в микробиологических исследованиях/И.Н. Ашмарин, А.А. Воробьев.— Л., 1962.

3. Бирюков В.В. Планирование экспериментов при оптимизации сложных процессов по схемам ортогональных латинских прямоугольников//Химико-фармацевтический журнал. 1968. №1. С.57-62.

4. Воронина Л.Г. Совершенствование лабораторной диагностики Haemophilus influenzae: Дис. канд. биол. наук. М., 1990.

5. Букин А.В. Этиология и клинико-морфологические проявления плевропневмонии свиней в хозяйствах Беларуси / А.В. Букин и др. // Вет. наука производству. - Минск, 1993. №31. С. 44-48.

6. Вакараш Н.А. Усовершенствование системы конструирования питательных сред/ Н.А. Вакараш, В.А. Смирнов и др. // Акт. вопр. разр. преп. мед. биотехнологии: Тез. конф. Махачкала, 1988. С. 164-165.

7. Виестур У.Э. Культивирование микроорганизмов. / У.Э. Виестур, М.Х. Кристапсонс, B.C. Былинкина. — М.: Пищевая пром-ть,1980.

8. Вишнякова Л.А. Питательная среда для выделения и культивирования пневмококков и гемофильных палочек / Л.А. Вишнякова, М.В. Герасимов, М.Е.Фаустова// Лаб. дело. 1981. №1. С.38-41.

9. Власов Н.А. Антибиотики и химиопрепараты для борьбы с инфекционными болезнями животных / Н.А. Власов, М.М. Зубаиров, Д.А. Васильев, А.И. Козин. Ульяновск, 1997.

10. Ю.Воронин И.Е. Совершенствование профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней: Дис.канд. вет. наук. М., 1996.

11. Временные методические указания по лабораторной диагностике гемофилезной плевропневмонии свиней. -М., 1987.

12. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам: Методические рекомендации // Клиническая микробиология и антимикробная терапия. 2000. №2. С. 93-109.

13. Горченина JI.B. Экспериментально-производственные разработки сухих дифференциально-диагностических сред для энтеробактерий: Дис. канд. биол. наук. -М., 1986.

14. Губер И.М. Разработка полунепрерывных процессов культивирования Haemophilus influenzae / И.М. Губер, А.А. Стрельникова //ЖМЭИ. 1995. №6. С. 3-4.

15. Джавец Э. Руководство по медицинской микробиологии. /Э. Джавец, Э.А. Эйдельберг, Дж.Л. Мельник. -М. Медицина, 1982. Т.1.

16. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. — М., 1986.

17. Змушко Л.С. Ускоренные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам / Л.С. Змушко, А.А. Адарченко // Лаб. дело. 1980. №8. С.451-454.

18. Зубков М.Н. Эпидемиологические аспекты антибиотикорезистен-тности клинических изолятов Haemophilus influenzae / М.Н. Зубков и др. // Пульмонология. № 3. С.89-91.

19. Иерусалимский Н.Д. Основы физиологии микробов. — М., 1963.

20. Исаева З.А. Изучение качества питательных сред по показателям процесса культивирования //ЖМЭИ. 1978. № 11. С.70-73.

21. Калинина Т.Э. Питательные среды для культивирования бифидобактерий: Дис. канд.биол.наук. -М., 1995.

22. Ковтун Ю.С. Разработка сухих питательных сред на основе из непищевого сырья для контроля микробной загрязненности нестерильных лекарственных препаратов: Дис. канд. биол. наук. -М., 1992.

23. Ковалев В.Ф. Антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны в ветеринарии: Справочник / В.Ф. Ковалев, И.Б. Волков, Б.В. Виолин и др. -М. ВО «Агропром», 1988. С. 233.

24. Козлов Ю.А. Питательные среды для медицинской микробиологии. М.: Медиздат, 1950. 252 с.

25. Кибирев А.В. Изучение возможности применения основ питательных сред, выпускаемых ВНИИМП МО РФ для выделения культур актинобацилл при эпидемиологическом обследовании / А.В. Кибирев и др. -Покров, 1998. С.390-391.

26. Лаврентьев Н.И. Патологоанатомическая диагностика гемофилезной плевропневмонии // Тезисы НПС. Вологда, 1988. С.78.

27. Лаврентьев Н.И. Диагностика гемофилнзной плевропневмонии: Методические рекомендации / Н.И. Лаврентьев, Л.Я. Романова, М.Ф.Финенко. Свердловск., 1985. 15 с.

28. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина, 1978. 390 с.

29. Максименко И.Л Разработка и стандартизация бактериальных питательных сред / И.Л. Максименко, А.В. Бочкова, Н.М. Головина. М., 1980. С.64-68.

30. Машковский М.Д. Лекарственные средства. — М.: Медицина, 1977. 4.2.

31. Маянская И.В. Использование пишевого сырья в качастве основпитательных сред для культивирования микроорганизмов/ И.В. Маянская,113

32. JI.M. Зорина, Г.И. Рузоль // Разработка и стандартизация бактериологических питательных сред. М, 1980. С.43-45.

33. Мильков М.Ф. Плевропневмония (гемофилезная) свиней / М.Ф. Мильков, В.П. Расколов // Земля сибирская. 1985. Т.12. С.33-34.

34. Мильков М.Ф. Гемофилезная плевропневмония свиней в промышленном свиноводстве // Труды Свердловской н.-и. вет. станции. 1987. Вып. 9. С.37-39

35. Мицаев Ш.М. Биологические свойства Haemophilus pleuropneumoniae и его роль в патологии животных: Дис. канд. вет. н. — М., 1983.

36. Мицаев Ш.М. Культуральные и гемолитические свойства Haemophilus pleuropneumoniae // Бюл. ВИЭВ. 1982. Вып. 48. С. 20.

37. Мельникова В.А. Сравнение некоторых показателей микробной биомассы для оценки качества питательной среды / В.А. Мельникова, И.А. Баснакьян, Л.И. Ванева//Лаб. Дело. 1973. № 10. С. 627-628.

38. Метаболизм микроорганизмов: Практикум / Под ред. Н.С. Егорова. М.: МГУ, 1986.

39. Методические рекомендации к конструированию и оценке питательных сред по параметрам роста. М., 1980.

40. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. — М., 1980.

41. Налимов В.В. Статистические методы планирования экспериментов / В.В. Налимов, Н.А. Чернова. М., 1965.

42. Навашин С.М., Фомина И.П. Справочник по антибиотикам, — М.: Медицина, 1974. 415 с.

43. Орлова О.Е. Особенности состава синтетических питательных сред для культивирования Haemophilus influenzae / О.Е. Орлова, Н.Е. Ястребова, А.П. Елкина //ЖМЭИ. 2001. № 3. С. 111-117.

44. Орлова О.Е. Культивирование Haemophilus influenzae серотип 6 на полусинтетических питательных средах / О.Е. Орлова, Н.Е. Ястребова //ЖМЭИ. 2002. №3. С. 56-58.

45. Перрен Ж. Выделение и идентификация Haemophilus pleuropneumoniae в свиноводческих хозяйствах Бретани / Ж. Перен, Ж. Лоран, Ж. Брюн//Иссл. вет. мед. 1979. №6. С. 571-575.

46. Поляченко В.М. Конструирование питательных сред для бактерий рода Hatmophilus-продуцентов рестриктирующих эндонуклеаз /

47. B.М. Поляченко, В.А. Мельникова, И.М. Грубер и др. //ЖМЭИ. 1989. №3.1. C.3-8.

48. Раскин Б.М. Конструирование микробиологических питательных сред / Б.М. Раскин, С.В. Денисова // Сб. тр. НИИВ им. Мечникова АМН СССР.-М., 1992. С. 123-135.

49. Раскин Б.М. разработка новых отечественных питательных сред //Вакцинно-сывороточное дело. М., 1979. С.124-132.

50. Раскин Б.М. Конструирование микробиологических питательных сред / Б.М. Раскин, С.В. Денисова // Микробиологические аспекты иммунологии.-М., 1992. C.I23-135.

51. Раскин Б.М. Отечественные сухие питательные среды, их перспектива и разработка//ЖМЭИ. 1990. №3. С.25-31.

52. Равилов Л.З. Микробиологические среды / Л.З. Равилов, Р.Я. Гильмутдинов, М.Ш. Хусаинов. -Казань: Фэн, 1999. 398 с.

53. Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротесторных систем // Материалф междунар. научной конференции. К 70-летию НПО «Питательные среды». Махачкала, 1998. 213 с.

54. Санеблидзе С.В. Жидкая питательная среда и режимы культивирования Haemiphilus pleuropneumoniae — возбудителя гемофилезной плевропневмонии свиней: Дис.канд. биол. наук. М., 1988.

55. Сидоров М.А. Роль бактерий рода Haemophilus в инфекционной патологии животных / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, Ю.К. Гумбатов // Ветеринария. 1978. № 5. С.101-107.

56. Сидоров М.А. Свойства H.pleuropneumoniae, выделенных от больных пневмонией свиней / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов // Ветеринария. 1981. № 1.С.45-47.

57. Сидоров М.А. Диагностика гемофилезной плевропневмонии свиней / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, Н.И. Лаврентьев // Ветеринария. 1981. № 12. С.66-68.

58. Сидоров М.А. Гемофилезная плевропневмония свиней / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, Н.И. Лаврентьев // Свиноводство. 1984. № 4. С.14-15.

59. Сидоров М.А. Индикация Н. pleuropneumoniae в паталогоанатомическом материале / М.А. Сидоров, А.И. Юдин // Бюл.ВИЭВ, 1985. Вып.60. С.50-53.

60. Сидоров М.А. Иммунопрофилактика гемофилезной плевропневмонии свиней./ М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, И.А. Логинов, Н.И. Лаврентьев.// Ветеринария.- 1985.- 12.-С.37-43.

61. Сидоров М.А. Гемофилезы животных / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов. -М.: Агропромиздат, 1986.

62. Сидоров М.А. Гемофилезы животных. М.: Колос, 1986.

63. Сидоров М.А. Патогенность Н. pleuropneumoniae для животных / М.А. Сидоров, Ш.М. Мицаев, Д.И. Скородумов // Ветеринария. 1989. №11. С.39-41.

64. Сидоров М.А. Определитель зоопатогенных микроорганизмов / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, В.Б. Федотов. М.: Колос, 1995. 318 с.

65. Скворцов В.Н. Изучение in vitro чувствительности возбудителя пневмонии свиней к антибиотикам / В.Н. Скворцов, А.В. Голиков и др. // Труды ВИЭВ. 1991. Т. 69. С.101-102.

66. Скворцова В.Н. Изучение in vitro чувствительности возбудителя пневмонии свиней к антибиотикам / В.Н. Скворцова, А.В. Голиков и др. // Труды ВИЭВ. 1991. Т. 69. С.101-102.

67. Скородумов Д.И. Применение РА в диагностике гемофилезной плевропневмонии свиней / Д.И. Скородумов, Н.И. Лаврентьев // Сборн. научн. трудов. Новосибирск, 1983. С. 132-133.

68. Скородумов Д.И. Методы хранения культур Н. parasuis и А. pleuropneumoniae в лабораторных условиях.// Современные методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных бол. жив.- М.-1998.-С.6-8.

69. Скородумов Д.И. Характеристика гемолитических гемофилезных бактерий / Д.И. Скородумов, М.А. Сидоров // Труды ВИЭВ. 1980. Т.52. С.13-18.

70. Скородумов Д.И. Выделение возбудителя гемофилезной плевропневмонии / Д.И. Скородумов, Ю.К. Гумбатов // Бюл. ВИЭВ. 1977. Вып. 28. С.14-17.

71. Скородумов Д.И. Дифференциация культур Actinobacillus pleuropneumoniae второго биовара и сходных видов бактерий, выделяемых от убойных свиней / Д.И. Скородумов, О.В. Карабанова, К.П. Родионова, Т.С. Костенко // Все о мясе. 2003. № 2. С.37-39.

72. Скородумов Д.И., Родионова К.П., Карабанова О.В. Методы лабораторной диагностики пастереллеза и актинобациллезной пневмонии свиней: Методические указания к лабораторным занятиям для студентов специальности 310800-Ветеринария.- М.: МГУПБ, 2003.

73. Скородумов Д.И. Потребности некоторых видов бактерий рода Haemophilus в специфических ростовых факторах./ Д.И. Скородумов, Ю.К. Гумбатов // Бюл. ВИЭВ. 1982. Вып.45. С.6-9.

74. Субботин В.В. Токсигенность и иммуногенность различных фракций культуры Haemophilus pleuropneumoniae // Ветеринария. 1987. №4. С. 29.

75. Стрельникова Л.И. Динамика роста и биологические свойства Haemophilus influenzae в различных условиях культивирования / Л.И. Стрельникова и др.//ЖМЭИ. 1995. №6. С. 12-13 .

76. Толяронок Г.Е. Свойства гемофильных бактерий, выделенных от поросят, больных полисерозитом // Вет. наука производству. — Минск, 1993. Вып 31. С.41-44.

77. Фаустова М.Е. Элективная питательная среда для микробов рода Haemophilus //Лабораторное дело. 1980. № 1. С. 682-684.

78. Фаустова М.Е. Чувствительность к антибиотикам Н. Influencae, выделенных от больных / М.Е. Фаустова, Л.А. Вишнякова // ЖМЭИ. 1989. №1. С.27-30.

79. Хазан М.А. Конструирование плотной питательной среды для диагностики и накопления бактериальной массы чумы: Дис.канд. биол. наук. Саратов, 1987.

80. Чайковская С.М. Стандартизация методов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам / С.М. Чайковская и др. // Лаб.дело. 1984. № 5. С.299-302.

81. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987.

82. Шубин В.А. Гемофилезная плевропневмония поросят / В.А. Шубин, И.П.Татришвили//Ветеринария. 1983. № 12. С.37-39.

83. Шимко В.В. Антибиотикорезистентность условно патогенных бактерий / В.В. Шимко и др. // Вет. наука производству. 1998. Вып. 33. С.103-108.

84. Этлас P.M. Справочник по микробиологическим средам. — М.,1993.

85. Ярцев М.Я. Состав и некоторые свойства бактерий при пневмонии поросят / М.Я. Ярцев, М.С. Данилов, Ю.Н. Паутов // Вестник с-х н. Казахстан, 1979. № 12. С.57-60.

86. Aarestup F.M. Susceptibility testing of Actinobacilluspleuropneumoniae in Demmark. // Vet.Microbiol. -1999.- 64.- 4. P.299-305.118

87. Agerso H., Friis С., Nilsen J.P. Penetration of amoxycillin to the respiratory tract tissues and secretions in Actinobacillus pleuropneumoniae infected pigs.// Rec. in Veter. Sc. 1998. - 64.- 3.- P. 251-257.

88. Bachmann Ph. Beitrag zur epidemiologic der kontagiosen pleuropneumonie beim schwein.// Schweiz Arch. Tierheik.- 1972.- 114.- P.362-380.

89. Barigazzi G. at. al. Sansibilita in vitro dell Haemophilus.// Riv. Zootecn. Veter.- 1986.- P. 232.

90. Bhatnagar A., Sing N.B., Malic B.S. Bacterial flora from the respiratory tract of pigs.// Indian Veter. J.- 1972.- 49/ 3. -P.234-236.

91. Burnes J.M., Mayagoitlea A.L., Moncada M.M. Eliminacion bacteriana pulmonary. //Vet. Мех.- 1986.- 17.

92. Brandreth S.R., Smith I.M. Comparaitive virulence of some English strains of Haemophilus pleuropneumoniae serotypus 2 and 3 in the pig. //Res. Vet. Scien.- 1987.-42.- P. 187-193.

93. Bendixen P., Shewen P.E., Rosendal S. et. al. Toxicity of Haemophilus pleuropneumoniae for porcine lung macrophages peripheral blood monocytes and testicular cells.// Infect. Immun. 1981.- 37.- P. 637-676.

94. Caruso J. P., Soss R.F. Effecs of mycoplasma hyopneumoniae and Actiobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae infections on alveolar macrophage functions ons in swine.// J. Vet. Res.- 1990.- 51.-2. -P.227-231.

95. Chiers K., Haesebrouck F., Overbeke I. et.al. Early in vivo interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with tonsils of pigs// Vet.Med.-1999. -68.- 3\4.-P. 301-306.

96. Christensen G. Pleuropneumonie hos svin fremkaldt of Haemophilus pleuropneumoniae s. parahaemoliticus.//Nord.Vet.Med. -1981.- 33.- P.121-133.

97. Elazhary M., Dea S., Mittal K.R., Higgins R. Prevalence of antibodies to swine influenza virus, porcine adenovirus type 4 and Haemophilus pleuropneumoniae in Quebec pig farms with respiratory problems. //Can.Vet.J. -1985. 26. - P. 190 - 192.

98. Frank S.H., Ни H., Ro L.H. Pathogenesis of pleuropneumoniae in swine saused by Haemiphilus pleuropneumoniae pathologic, immunofluorescent and bacteriological atudies.// J. Pig. Vet. Congress.-Mexico.- 1982.- 78.

99. Fenwick B.W., Osburn I., Olander H.J. Isolation and biological characterization of two lipopolysaccharides and a capsular enriched polysaccharide preparation from Haemophilus pleuropneumoniae.// Am.J.Vet.Res. - 1986.- 47.- 7. - P. 1433-1441.

100. Gutierres C.B., et. al. In vitro susceptibility of Actinobacillus pleuropneumoniae strains to 42 antimicrobial agents. //Am. J. Vet. Res.- 1993.54.- 4.- P.546-550.

101. Gram T. Evaluation of a PCR for detection of Actinobacillus pleuropneumoniae in mixed bacterial all cultures from tonails.// Vet.Microbiol.-1996.-51.- P.95-104.

102. Goltstein F.W., Emirian M.F., Coutret A. et.al. Bacteriostatic and bactericidae activity of azithromycin against Haemophilus infection.// J. Antimicrob. Chemother. -1990. 25. (suppl A).- P.25-28.

103. Garcia-Delgado G.A., Litlle P.K. A comparison of various Haemophilus streins.// Canad.J.comp. Med. -1977. 41.-4. -P.380-388.

104. Gunnarsson A. Evaluation of different antigens in the complement-fixation test for diagnosis of Haemophilus pleuropniumoniae (parahaemolyticus) infections in swine. //Am.J.Vet.Res.- 1979. -40. -11.-P.1564-1567.

105. Gilbride K.A., Rosendal S. Antimicrobial susceptibility of 51 strains of Haemophilus pleuropneumoniae.// Canad.J.comp. Med.- 1984. 48.1. -P.47-50.

106. Gilbride K.A. Evaluation of a selective medium for isolation Haemophilua pleuropneumoniae.// Canad.J.comp. Med. -1983.- 47.- 4.- P.445-450.

107. Hommer J., Castryck F. Routine identification of porcine Actinobacilli and Pasteurellae.// Intern.Vet.soc.prac. -1984.- P. 139-140.

108. Hansel A., Ganter M., et,al. Prevalence of aerobic bacteria in bronhoalveolar lavage gluids from healthy pigs. //Am.J.Vet.Res.- 1994.- 55. -12.- P.1697-1701.

109. Hafner S., Latimer K. Cilia — associated respiratory bacillus infection and pneumonia in a pig.// J.Vet.diagnostic. Jnvestig.- 1998. -10.-4.-P.373-375.

110. Harris D.L., Ross R.F., Switzer W.P. Incidence of certain microorganisms in nasal cavities of swine in Iowa. //Am.J.Vet. Res.- 1969. -9 -P.30.

111. Idris U.E., Harmon B.G., Udere F.A. et.al. Pulmonary lesionsin mise inoculated with Actinobacillus pleuropneumoniae hamolysin and lpopoly sacharide.// Vet.Pathol.- 1993.- 30.-3. -P.234-241.

112. Inone A., Yamamoto K. Drug susceptibility of Haemophilus pleuropneumoniae strains isolated from swine.// Japan J.Vet.Res.- 1984,- 46. -2.- P. 179-180.

113. Ichikawa T. Serovars and antibiotic susceptibility of Actinobacillus pleuropneumoniae isolates from swine. //J. Japan Vet. Med.Assn.- 1994.- 47.5.- P.353-356.

114. Jacobsen M.J., et.al. Development and evaluation of a selective and indicatiwe medium for isolation of Actinobacillus pleuropneumoniae from tonsils.//Vet. Microbiol. -1995.- 47. V2 .-P.191-197.

115. Kich I.D., Piffer L.A. Comparacaode metodos de isolamento de bacterias NAD-dependentes trato respiratorio superior de suinos. //Arq.Brasil Med.Vet.Zootecn.- 2000.- 52.- 1. P. 1-6.

116. Kawahara K., Asano M., Nakai T. Antibiotic susceptibility of serotipe 2 and 5 strans of Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae isolated from swine from 1974 to 1986.// Jpn.J.Vet.Sci.- 1989. 51.- 2. -P. 359363.

117. Kume К., Nakai Т., Sawata A. Development of an experimental animal model for the protection test of Haemophilus pleuropneumoniae vaccine.// Jpp.J.Vet. Sci. -1985.- 47.-2.- P.269-273.

118. Kume K., Nakai Т., Sawata A. Isolation of Haemophilia from the nasal cavities of healthy pigs.//Jpn.J.Vet.Sci. 1984.- 46. - P. 641-647.

119. Kume K., Nakai T. Immunologic relationships among Haemophilus pleuropneumoniae strains scrovar 1 to 5 in guinea pigs. //Jap.J.Vet.Sci. 1986. -484.-P. 739-744.

120. Kamp E.M., Van Leengoen L.A. Serotype-Related differences in production and type of heat-labile haemolysin and heat-labile cytotoxin of Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae.//.!. Clinical Micr.- 1989.- 27. -6.- P.l 187-1191.

121. Kamp E.M., Lioeffen W.L.A. et.al. Survey of in agents involved in acute respiratory disease in finis pigs.//Vet.Rec.-1999.- 145.-5.-P.123-129.

122. Kilian M., Nicolet J. et.al. Biochemical and serological characterization of Haemophilus pleuropneumoniae (Mattihews and Pattison 1961) shope 1964 and propesae of a neotype strain. //J.jour.of Sist.Bact. -1978. -28.-1.- p. 20-26.

123. Kulsten P., Bocklisch H. Hammorragisch nebrotisierende pleuropneumonien beim schuren clurch Actinobacillen.// Arch.J.Expor.Vet.-1981.-95.-6.-P. 879-902.

124. Libal M.C. Antimicrobial sensitivity patterhs of Haemophilus pleuropneumoniae isolates from pigs with pneumonia. //J.Am.Vet.Med.- 1982. -180.-4.-P.399.

125. Lindecrona R.H., Frus C., Lensen N.E. The pharmacodynamic effect of anoxycillin and danifloxacin against Actinobacillus pleuropneumoniae in an in-vitro pharmacodynamic model. //Res. In Vet.Sc. -1999. 1.- P. 93-97.

126. Morgan J.H., Rhillips J.E. Isolation of Haemophilus parahaemoliticus from pigs in Scotland. // Vet. Rec. -1978. -103. P.139-140.

127. Mittal K.R., Higgins R., Laveriere S., et.al. A simple 2-mercaptoetahnos tobe agglutination test for the diagnosis of Haemophilus pleuropneumoniae.// Am.J.Res. 1984. - 45. - P.715-719.

128. Mitui Т., Onaga H., Magasawa J., Nomura J., Kuramasu S. Studies on haemophilus infection in swine. 1. Application of the latex agglutination test to the diagnosis of Haemophilus pleuropneumoniae infection.// Vet.Micr. — 1981. 6. - 4. - P.339-349.

129. Muller E., Koch K., Matschullat G. und Jimmermann H. Vorcommen vur antiborpern gegen Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae in schurinezuchtbestarden nordwestdeutschlands.// Tierarrtl.Umsch.- 1988. 4. - S. 252-258.

130. Martin J., Gunther H., Janetschhe P., Schonherr W., Kielstein P. Beitray zus experimentellen Haemophilus infechtion (Haemophilus parahaemolyticus , Haemophilus parasuis) bci SPF — ferheln.// Arch.exp. Vet. Med. 1977. - 31. - 4. - S. 347-357.

131. Melody K. Moore, Lidija Cicnjak-Chubbs and Robert J. Gates. A new selective enrichment procedure for isolating Pasteurella multocida from avian and environmental samples.// Avian diseases. 1994. - 38. - P.317-324.

132. Nielsen R. Seroepidemiology of Actinobacillus pleuropneumoniae.// Can.Vet.J. 1988. - 29. - P.580-582.

133. Nielsen R., Serological characterization of Haemophilus pleuropneumoniae (Actinobacillus pleuropneumoniae) strains and proposal of a new serotype: serotype 9. // Acta.Vet.Scand. 1985. - 26. -P.501 - 512.

134. Nielsen R. Detection of antibodies against Actinobacillus pleuropneumoniae, serotype 2 in porcine colostrums using a blocking enzymelinked immunosorbent assay specifie for serotype 2. //Vet.M. 1995. - 43. - A. -P. 277-284.

135. Nielsen R. Haemophilus pleuropneumoniae as the cause of pleuropneumonia in swine . Clinical, pathological and epidemiological studies . Nord.Vet.Ved. 1970/22/p.240-245.

136. Nielsen R. Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5, subtype a and b: cross protection experiments.// Acta.Vet.Scand. - 1988.- 29.- P. 67-75.

137. Nicolet J. Taxonomy and serological identification of Actinobacillus pleuropneumoniae.// Canad.Vet.J.- 1988. 29. - 7. - P.578-580.

138. Nicolet J., Scholl E., Haemophilus infections.// Disease of Swine. -1981.- P. 368-377.

139. Nicolet J., Sur L'hemophilus du pors.lll. Differenciation serologique de l'hemophilus parahaemolyticus.// Zbl.Bact.Hys.I.Abt.orig. -1971. — A216. P.487-495.

140. Nicolet J., De Meuron P.A., Bachmap Ph. Haemophilus infection pigs. The use of the complement fixation in the diagnosis of Haemophilus parahemolyticus infection.// Schweiz.Arch.Tierheilk. 1978. - 113. — P.191-200.

141. Neil D.H., Garcia M.M., et.al. A stable L - form of Haemophilus pleuropneumoniae.// Can.J.Compar.Med. - 1970. - 341. - P.50-57.

142. Nietfeld J.C., Franklin C.L., Riley L.K., Jemon D.H. Colonization of the tracheal epithelium of pigs by filamentous bacteria cesembling cilia — associated respiratory bacillus.//J.Vet.Diagn.Invest. 1995. - 7. - P. 338 — 342.

143. Nadew M., Lariviere S., Higgins R., Martinean G.P. Minimal inhibitory concentrations of antimicrobial agents against Actinobacillus pleuropneumoniae.//Can.J.Vet.Res. 1988. - 52. - P. 315-318.

144. Olsen L., Brondz J. Differentiation among closely related organisms of the Actinobacillus Haemophilus - Pasteurella group by means of lysozym and DTA. //J.Clin.Microbiol. - 1985.- 22. - 4. - P.629-636.

145. Pijoan C., HilleyH., Straw В., Fuentes M., Reman A. Inactivation of Haemophilus pleuropneumoniae by pig enbryo tracheal explants.// Jnt.Pig.Vet.Soc. Congress. Mexico. 1982. - P. 76.

146. Pijoan C., Crus G., Martinez H. et.al. Protection and immunity obtained with a gel-adjuvant bacterin of Haemophilus pleuropneumoniae.// Proc.J.PVS.Congress.Mexico. -1982. P.73.

147. Pohl S., DNA relatedness among members of Haemophilus, Pasteurella and Actinobacillus. p.245-253. Kilian M., Frederiksen W. et.al. Haemophilus Pasteurella and Actinobacillus.// Academic Press.Inc. (London) -1981.

148. Pejsak Z., Wasinski B. Skutecz nose tiamuliny i tetracykliny w terapii zakazen mieszanych ukladu oddechowego swin.// Med.Weter. 1996. -P.637-640.

149. Riising H.J. Haemophilus pleuropneumoniae infections in pigs.//Pig Veter.Soc.Prece/ 1982. - 9 - P.77-83.

150. Rohrbach B.W., Hall R.F., Hitchock J.P., Effect of subclinical infection with Actinobacillus pleuropneumoniae in commingled feeder swine.//J.Am. Vet.Med.Assoc. 1993. - 202. - P. 1095-1098.

151. Rosendal S., Mitchell W.R., Weber M. et.al. Haemophilus pleuropneumoniae lung lesons induced by soincated bacteria and sterile culture supernatant.//Pig Vet.Soc. Copenhegen. - Dammark. — 1980. — 211.

152. Rosendal S., Devenich J. et.al. Evaluation of heat sensitive, neutrophil-toxic and hemolytic activity of Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae.//Am.J.Vet.Res. 1988. - 49. - P. 1053-1058.

153. Smith M.A., Smith H.E., Kamp E.M. Cytolyisins of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 9.//Infect.and immunity. 1991. - 59 (12) - P.4497-4505.

154. Suzuki S., Ohmae K., Ohishi K. et.al. Antimicrobial susceptibility of Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae isolated from pigs with pleuropneumoniae.//Jpn.J.Vet.Sci. 1989. -51.- P.450-452.

155. Sidoli L., Barigazzi G. Minimum inhibitory concentrations of 22 antibacterial agents 79 strains Haemophilus pleuropneumoniae from swine.//Veter.Med.smoll Anim.Clin. 1984. - 79 (5). - P.703-705.

156. Sugimoto C., Sayata V. Susceptibility of Haemophilus equigenitalis, the causal agents of contagious equine metritis.// Nat.Inst.Anim.Health.- 1981.-21 (4).-P. 159-162.

157. Shimizu H., Kuninori K., sakano T. et.al. Antibiotic susceptibility of Haemophilus pleuropneumoniae an Pasteurella multocida isolates from swine.// S.Pn.S.Vet.Sci. 1982. - 44. - P.359-363.

158. Slee K.J. Selective medium for isolation of Haemophilus somnus from ovis.//J.Vet.Med. 1985. - 116 (8). - P.215-217.

159. Schultz R.A. Haemophilus overvien, diagnostic tests and potencial treatment.//Agri.Practica. 1985. - 6. - P.25-28.

160. Tyrpe P., Schafer R., Drescher R. Charakteristik und Verlauf einer Haemophilus-parahaemolyticus-Enzootic in einer Schweineaufzuchtenlage.// Mitt.Vet.Med. 1977. - 32 (19). - S.750-753.

161. Touil F., Higgins R. Isolation of strains from the suis.// J.Vet.Med. 1988.- 17(20.-P.171-177.

162. Urbain В., Mast S., Beerens B. Effect of inhalation of dust and endotoxin en respiratory tracts of pigs.// Am.J.Veter.Res. 1999. - 60 (9). -P.1055-1066.

163. Veary C.M. Haemophilus pleuropneumoniae in pigs: a review.//S.Afr.Vet.Ver. 1989. - 60 (1). - P.56-61.

164. Van Leengoed L.A., Kamp E.M., Pol J.M.A. Toxicity of Haemophilus pleuropneumoniae to Porcine lung macrophagas.//Vet.Micr. -1989. 19. - P.337-349.

165. Vaillancourt J.-P., Higgins R., Martineau G.-P. et.al. Changes in the susceptibility of Actinobacillus pleuropneumoniae to antimicribial agents in Quebec (1981-1986).//J.Vet.Med/Assoc. 1988. - 193. - P.470-473.

166. Woods G.E., Jensen A.H., Gossling J. et.al. The effect of medicated feed on the nasal microflora and weight gain of pigs.//Can.J.camp.Med. 1972. — 36.-P.49-53.

167. Wasteson V.et.al. Characterization of tetracycline and erythromycin resist in Actinobacillus pleuropneumoniae.// Vet.Micr. 1996. - 48.