Разработка и использование молекулярных маркеров на основе ПЦР-метода в селекции клевера лугового: Trifolium pratense L. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.05, кандидат сельскохозяйственных наук Клименко, Ирина Александровна

• Клименко, Ирина Александровна
• кандидат сельскохозяйственных наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат сельскохозяйственных наук Клименко, Ирина Александровна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Значение клевера как кормовой культуры; проблемы селекции клевера

1.2. Системы молекулярного маркирования генома

1.3. Использование молекулярных маркеров в современной селекции

1.4. Генетические карты и их использование в селекции растений

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 3.1. Описание и поддержание экспериментальной популяции клевера лугового ГП

3.1.1. Оценка фенотипического варьирования признаков

3.1.2. Введение генотипов изучаемой популяции в культуру in vitro

Глава 3.2. Молекулярный анализ и создание генетической карты сцепления клевера лугового

3.2.1. Оптимизация условий выделения ДНК из растительной ткани клевера

3.2.2. Сравнительный анализ различных систем молекулярного маркирования

3.2.3. Оптимизация условий и параметров PCR с использованием рандомных праймеров (RAPD-PCR)

3.2.4. Использование праймеров с дополнительным селективным нуклеотидом для повышения надёжности RAPD-маркеров

3.2.5. Исследование ДНК-полиморфизма с использованием сиквенс-специфических праймеров (STS-технология)

3.2.6. Детекция ДНК-полиморфизма с помощью CAPS-маркеров

3.2.7. Использование ДНК-маркеров в создании генетической карты клевера лугового (Trifolium pratense L.)

Глава 3.3. Анализ косегрегации полученных ДНК-маркеров с фенотипическими проявлениями устойчивости растений

3.3.1. Оценка зимостойкости гибридной популяции ГПв различных условиях

3.3.2. Оценка устойчивости к склеротиниозу (Sclerotinia trifoliorum Erikss.)

3.3.3. Детекция локусов генов, связанных с признаками устойчивости и локализация их на интегрированной генетической карте

3.3.4. Выделение новых источников хозяйственно ценных признаков для селекции клевера лугового

ВЫВОДЫ

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и использование молекулярных маркеров на основе ПЦР-метода в селекции клевера лугового: Trifolium pratense L.»

Клевер луговой - одна из важнейших кормовых бобовых культур, распространённых в регионах с влажным умеренным климатом. Большинство сортов, используемых сегодня, являются диплоидными (2п=2х=14), перекрёстноопыляющимися видами, с гаметофитной самонесовместимой системой.

Большое народнохозяйственное значение клевера определяется тем, что он является источником дешевого кормового растительного белка и высокоэнергетических кормов, сохраняет почву от водной и ветровой эрозии и повышает плодородие почвы, фиксируя азот.

Однако реализация потенциала клевера как кормовой культуры в; настоящее время ограничена недостатком сортов с улучшенными хозяйственными характеристиками, в частности, раннеспелостью,, зимостойкостью, долголетием и устойчивостью к различным неблагоприятным факторам среды, болезням и вредителям.

Важнейшая роль в создании сортов, отвечающих требованиям современного кормопроизводства, принадлежит селекции. Как правило, для создания новых сортов с улучшенными характеристиками применяется фенотипический отбор с последующей рекомбинацией генетических вариаций. В большинстве случаев селекционер работает со сложными признаками, которые контролируются большим количеством генов, а их фенотипическое проявление существенно варьирует в зависимости от условий внешней среды. В связи с этим суждение о генетической ценности материала, основанное на фенотипическом проявлении его признаков и свойств, в определённой степени ошибочно. Вот почему повышение эффективности оценки исходного материала и > отбора перспективных форм является коренным вопросом селекции (Серебровский, 1970).

Эти задачи особенно актуальны в исследованиях клевера, что обусловлено особенностями его генетической структуры. Сорта и популяции клевера лугового состоят из гетерогенных биотипов, полученных путём массового отбора. Наблюдается высокий уровень внутрипопуляционных и внутрисортовых вариаций (Kongkiathngam et al., 1996). Гетерозиготное состояние особей популяции обеспечивает её приспособительную пластичность и более высокую жизнеспособность, но создаёт определённые трудности в проведении генетического анализа. Выведение новых высокопродуктивных сортов осложняется и тем, что клевер луговой является самонесовместимым облигатным перекрестником, получение гомозиготных Ф линий крайне затруднено. Это, вг свою очередь, усложняет определение характера наследования отдельных признаков.

В этих условиях для успешной селекции особенно важен выбор оптимальных систем, маркирования. Маркерные или сигнальные признаки; как отмечал А.С. Серебровский (1970), позволяют «следить за наследованием того участка хромосом, в котором эти сигналы * расположены». Выявленное таким образом сцепленное наследование признаков в ряде случаев позволит исключить сложные биохимические анализы или другие трудоёмкие методы оценки исходного материала, что упрощает, ускоряет и удешевляет селекционный процесс.

Наиболее широкое распространение в практической селекции получили фенотипические маркеры, имеющие сравнительно простой тип генетического контроля. Однако классические методы маркирования на основе фенотипических признаков имеют ряд существенных ограничений. В частности, число «удобных» фенотипических маркеров, связанных с селектируемыми признаками, весьма ограничено, например, у клевера их насчитывается около 15, а у люцерны - около 20. Кроме того, для фенотипических маркеров зачастую характерно плейотропное действие, и, нередко,, их проявление зависит от условий окружающей среды, стадии; онтогенеза и генетического фона. Селекция, основанная на морфологических признаках, является длительной; трудоёмкой и часто требует большого числа повторных экспериментов при различных условиях.

Ряд недостатков фенотипических маркеров (изменение проявления признака в ходе онтогенеза, органоспецифичность) характерен и для маркёрной. системы, основанной на полиморфизме запасных белков и изоферментов. В этом случае возможности метода ограничиваются ещё и низким уровнем белкового полиморфизма в большинстве популяций.

С развитием современных методов селекции? и созданием широкого сортового разнообразия культур возникли также определённые трудности в методиках достоверной идентификации сортов растений. Используемые для этой цели морфологические характеристики не всегда достаточны для маркирования и паспортизации сортов. Применение белковых маркеров часто не представляется возможным, особенно для растений с низким уровнем межсортового полиморфизма.

В настоящее время широкое распространение приобретает метод использования ДНК-технологий, в частности, PCR-анализ, основанный на амплификации ДНК. Метод достаточно прост, обладает большой ^ чувствительностью и дает быстрые результаты.

Разработка и использование молекулярных маркеров на основе различий в структуре гомологичных последовательностей ДНК гарантирует большую объективность, оценки, т.к. селекционер работает только с генотипом, и ошибки могут возникать лишь в связи с неполным сцеплением молекулярного маркера с признаком. С помощью ДНК-маркёров; можно маркировать любые участки ДНК, в том числе и некодирующие, и использовать для анализа любые ткани и органы, независимо от стадии развития организма. Достоинством новой технологии является также возможность проводить отбор ценных генотипов не по фенотипической оценке взрослого растения, а на основе прямой генетической информации на ранних стадиях развития* растения. Это сокращает время отбора и обеспечивает экономию материальных ресурсов и трудовых затрат.

Молекулярные маркеры, генерируемые с помощью PCR, позволяют оценить генетическое разнообразие исходного материала, классифицировать селекционные формы, маркировать гены хозяйственно важных признаков, картировать геномы. Уже сегодня известен ряд примеров эффективного использования s ДНК-маркёров ? в молекулярно-генетических исследованиях и селекции зерновых, зернобобовых, бобовых и овощных культур.

Однако практическое применение молекулярного маркирования для; создания новых сортов кормовых культур пока ещё сильно отстаёт от потенциальных возможностей* метода. Связано' это с необходимостью* использования > относительно сложных методов молекулярной биологии^ что требует индивидуального подхода к выбору систем и техник маркирования, а также наличия подготовленного персонала.

Исследования по разработке молекулярных маркёров и применению их в селекции кормовых культур стали появляться только в последние годы. Они немногочисленны, охватывают не все виды растений, условия ДНК-анализа, в большинстве случаев, нуждаются в оптимизации. К началу нашей работы, в отечественных и зарубежных источниках литературы не встречались данные о применении различных групп молекулярных маркеров, (на основе PCR- и RFLP-методов): для? исследований клевера лугового. Поэтому разработка системного подхода к ДНК-анализу этой: культуры и применение результатов в селекционных программах является актуальной научной задачей;

Целью настоящей работы являлось определение оптимальных условий молекулярно-биологических методик исследований? для клевера лугового; изучение использования, ДНК-маркеров для; оценки генетического полиморфизма и маркирования селекционно-ценных признаков, а также выделение новых источников для практической селекции.

В задачи исследований входило:

1. Изучить экспериментальную гибридную популяцию клевера лугового ГП-27 по основным морфобиологическим показателям.

2. Определить возможность и условия использования метода клонального микроразмножения для обеспечения максимального сохранения исходного генетического материала клевера лугового.

3. Установить оптимальные условия выделения ДНК из растительной ткани клевера и наилучшие параметры амплификации ДНК.

4. Провести сравнительный анализ применения различных систем молекулярного маркирования для оценки ДНК-полиморфизма в популяции клевера ГП-27.

5. Оценить возможность использования полученных ДНК-маркеров в создании генетической карты клевера лугового.

6. Провести анализ косегрегации ДНК-маркеров с фенотипическими характеристиками для выявления локусов генов хозяйственно ценных признаков клевера лугового.

7. Выделить новые селекционные источники.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Селекция и семеноводство», Клименко, Ирина Александровна

выводы

1. Изучена гибридная популяция клевера лугового ГП-27 по основным морфобиологическим показателям для проведения ДНК-анализа и выделения новых селекционных источников.

2. Установлено, что поддержание популяции в культуре in vitro обеспечивает сохранение генетически гетерозиготного материала и воспроизводимость молекулярно-генетических исследований.

3. Определены наилучшие условия выделения ДНК из растительной ткани; клевера: предварительное выдерживание растений в темноте (2 суток) для снижения содержания полисахаридов; дополнительная очистка образцов -растворами фенола и хлороформа; экстракция ^ ДНК из асептически, выращенных растений-регенерантов.

4: Установлены оптимальные параметры амплификации ДНК для клевера лугового. Показано, что снижение температуры отжига с 37,5°С до 36,0°С и уменьшение циклов PGR с 40 до 37 не отражалось на результативности амплификации, но» позволяло сократить продолжительность программы PCR на 35 минут.

5. Сравнительный анализ различных систем маркирования на основе PCR-метода показал эффективность использования RAPD-праймеров для оценки ДНК-полиморфизма в популяции клевера лугового^ Выделены наиболее информативные праймеры: ОРВ-ОЗ; ОРВ-11; ОРВ-13; ОРВ-18; ОРС-02 («Орегоп Technologies»).

6. Разработан способ повышения надежности RAPD-маркеров с помощью 2-х праймеров с дополнительным нуклеотидом при повышенной температуре отжига. Принцип избирательной амплификации ДНК способствовал повышению специфичности реакции, стабильности PCR-продуктов и получению высоковоспроизводимых маркеров.

7. Установлено, что STS-праймеры результативны для маркирования QTL-признаков в клевере луговом. Высокий уровень сиквенс-гомологии праймеров PhKinF/PhKinR; SiCasl7F/SiCasl7R; и PBSMCIRE с холодоиндуцируемыми генами в растениях повышает вероятность идентификации и маркирования; признаков, связанных с устойчивостью к неблагоприятным факторам среды.

8. Для повышения эффективности выявления ДНК-полиморфизма при использовании STS-праймеров целесообразно применять расщепление продуктов STS-PCR рестриктирующими эндонуклеазами EcoRl, Rsal и другими. Фрагменты рестрикции с различной молекулярной массой могут быть использованы для генерации CAPS-маркеров.

9. Полученные ДНК-маркеры были использованы для насыщения базовой; генетической карты; клевера; лугового. Интегрированная генетическая карта включает 157 RFLP-, 8 RAPD-, 3 STS-маркера и 1 морфологический маркер бе л оцветковости.

Генетические маркеры, генерированные праймерами ОРВ-02 и ОРС-02, помещены в LG1 и LG7 группах сцепления; ОРВ-ОЗ и ОРВ-18 — в LG2 и LG7 группах соответственно. STS-маркеры: SICAS; MSnatB; PBSMCIR локализованы в LG6 и LG7 группах сцепления на генетической карте клевера лугового.

10. Установлена связь различий в сроках цветения генотипов исследуемой популяции с RFLP-гибридизационными зондами. Детектированы маркеры, размещенные в LG1, LG2, LG3, LG4; LG5 и LG6 группах сцепления интегрированной карты клевера.

11. На основе RFLP- и STS-маркирования детектированы; 7 локусов устойчивости к склеротиниозу и зимостойкости в исследуемой популяции. Из них QTL-srli, детектированный маркером с2047Ь, и расположенный в LG3 группе сцепления, связан с устойчивостью к склеротиниозу. QTLs-whj a, whjb, whjc, whjd, whje, whjf, связанные с зимостойкостью популяции, локализованы в LG1, LG6 и LG7 группах сцепления на базовой карте клевера лугового. Идентифицированы 2 STS-маркера, кодирующие холодоиндуцируемые гены, сцепленные с признаком зимостойкости: SICAS, сцепленный с whjc и Msnat В, сцепленный с whjd.

12. Из состава популяции ГП-27 выделены 17 генотипов клевера лугового с повышенной зимостойкостью, раннеспелостью и устойчивостью к склеротиниозу, из них 5 генотипов (R18, R70, R76, R77 и R107), ценных в качестве материала для селекции по 2-3 признакам.

-108

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

1. В целях повышения эффективности селекционного процесса целесообразно использовать RAPD- и STS-праймеры для оценки внутрипопуляционного ДНК-полиморфизма, маркирования исходного материала и селекционно-ценных признаков клевера лугового.

2. Рекомендуем использовать разработанную генетическую карту клевера при определении генетических дистанций и для выявления степени сцепления между генами, ответственными за проявление хозяйственно важных признаков, в популяциях клевера лугового.

3. Для отбора перспективного материала при селекции на устойчивость к склеротиниозу следует использовать RFLP-маркер с2047Ь; при селекции на зимостойкость - RFLP-маркеры cl430f; c2426b; с1965а; cl961b; cl89b; и STS-маркеры SICAS и Msnat В.

4. Использовать в селекционной практике клевера лугового генотипы популяции ГП-27: WF1680, 272, R18, R43, R49, R70, R76, R84, R107, R118. R144, как источники повышенной зимостойкости. При селекции на устойчивость к раку клевера использовать генотипы: R16, R18, R63, R76, R77, R95, R105, R132. В качестве исходных форм с ранними сроками цветения использовать в селекции генотипы: R70, R76, R77, R107.

- 109

Список литературы диссертационного исследования кандидат сельскохозяйственных наук Клименко, Ирина Александровна, 2004 год

1. Айала Ф., Кайгер. Дж. Современная генетика. Москва "Мир" 1987,с. 293

2. Бороевич С. Принципы и методы селекции растений. — М., Колос, 1984. с. 9-11.

3. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Прокофьев М.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. Москва "Агропромиздат", 1990. с. 382.

4. Вартапетян А.Б. Полимеразная цепная реакция. -Молекулярная биология. М., Наука - 1991 - т. 25, - вып. 46 -с. 926-936.

5. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.Н. Большой практикум по физиологии растений. -М., Высшая школа, 1975. с. 135.

6. Глазко В.И., Дунин И.М., Глазко Г.В., Калашникова А.А. Введение в ДНК-технологии М., ФГНУ "Росинформагротех" 2001, с. 179-376.

7. Ю. Дорохов Д.Б., Лаптева М.Н. Быстрая технология RAPD-анализа генотипов луков. — Сельскохозяйственная биология, 1997, №5, с. 22-31.

8. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. Агропромиздат, 1985. с. 351.

9. Ефимова Г.К. Методы определения устойчивости клевера лугового к раку. — Селекция и семеноводство, 1981, № 10, с. 1819.

10. Журавлёв Ю.Н., Козыренко Е.В., Артюкова Г.Д., Реунова М.В., Илюшко K.JI. ДНК-типирование дальневосточных видов рода Iris L. с помощью метода RAPD-PCR. Генетика, т. 34, № 3, с. 368-379.

11. Н.Жученко А.А. Экологическая генетика культурных растений. Кишинев, 1980.

12. Захаров И.А. Генная инженерия, секвенирование геномов или генетическое картирование? В сб. Материалы научной генетической конференции. М., МСХА, 2002, М., МСХА, 2002, с. 120-121.

13. Зайцев B.C., Хавкин Э.Е. ДНК-маркёры устойчивости к болезням растений на основе генов рецептор-подобных киназ. В сб. Материалы научной генетической конференции. М., МСХА, 2002, с. 119-120.

14. Козлов Н.Н., Михайличенко Б.П., Ивашута С.И., Шаденков А.А. Перспективы использования молекулярных маркёров в селекции кормовых культур. Сельскохозяйственная биология, 1997, № 3, 68-73.

15. Козлов Н.Н., Прибыткова Т.Ф., Клименко И.А., Разгуляева Н.В. ДНК-маркирование селекционно-ценных признаков клевера лугового. В сб. Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования. М., 2003, т. 2, с. 326-328.

16. Клименко И.А., Ивашута С.И., Козлов Н.Н. Использование CAPS-маркёров для оценки ДНК-полиморфизма клевера лугового. В сб. Материалы научной генетической конференции. М., МСХА, 2002, с. 148-150.

17. Кокаева З.Г., Боброва В.К., Петрова Т.В., Гостимский С.А*, Троицкий А.В; Генетический полиморфизм сортов, линий и мутантов гороха по данным RAPD-анализа. Генетика 1998, т. 34, №6. с. 771-777.

18. Конарев В. Г. Белки растений как генетические маркёры. М., Колос, 1983, 320 с.

19. Конарев А.В. Использование молекулярных маркёров в работе с генетическими ресурсами растений. Сельскохозяйственная биология 1998, № 5, с. 3-25.

20. Кочиева Е.З. Использование методов на основе полимеразной цепной реакции для анализа и маркирования растительного генома. Сельскохозяйственная биология, 1999, № 3, с. 3-13.

21. Кочиева Е.З., Рыжова Н.Н. Использование PCR-амплификации на основе сателлитных последовательностей для маркирования генома различных видов перца. Сельскохозяйственная биология, 2001, № 1, с. 94-97.

22. Куренина JI.В. Разработка системы регенерации in vitro для генетической трансформации клевера лугового (Trifolium pretense L.) Автореф. дисс. к. б. н., М., 2003, с. 25.

23. Мазин В.В., Лапотышкина Л.И., Соложенцев П.Д., Шарапов Н.В. Биотехнологические приёмы получения ценных форм клевера и люцерны. Селекция кормовых культур, М:, 1989, с. 66-75.

24. Малышев С.В., Корзун В.Н., Бёрнер А., Войлоков А.В:, Картель Н.А. Использование молекулярных маркёров в генетическом картировании генома ржи (Secale cereale L.). В сб. Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. М., 2000, с. 221-222.

25. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., Мир 1984., 480 с.

26. Мезенцев А.В., Любавина Л.А. Методические указания по регенерации клевера лугового в культуре in vitro. М., ВАСХННИЛ, 1983.

27. Международный классификатор СЭВ рода Trifolium. М., Ленинград, 1983, 12 с.-11334. Методические указания по селекции и первичному семеноводству клевера. М., 2002, 66 с.

28. Методические рекомендации. Современные методы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. М., МСХА, 1998.

29. Мироненко Н.В., Гусева Н.Н. Использование молекулярно-биологических методов для решения проблем иммунитета растений. Сельскохозяйственная биология, 1998, № 1.

30. Мухина Ж.М., Харитонов Е.М., Супрун ИИ. Полиморфизм микросателлитных маркёров применительно к российским сортам риса. В сб. Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования. М., 2003, т. 2, с. 376-378.

31. Мухина Н.А. Клевер красный. — Л., Колос, 1971, 88 с.

32. Навалихина Н.К. Генетические основы селекции тетраплоидного клевера красного. Киев "Наукова думка, 1977. с. 132.

33. Новосёлова А.С. Селекция и семеноводство клевера. М., Агропромиздат 1986, 196 с.

34. Новосёлова А.С. Повышение устойчивости клевера к болезням и вредителям. В сб. Клевер в России. М., 2002, с. 126-130.

35. Новосёлов М.Ю. Создание исходного селекционного материала клевера лугового при использовании химического мутагенеза. Автореф. дисс. к. с-х. наук.-.М., 1984. с 114.

36. Новосёлов М.Ю. Селекция клевера лугового (Trifolium pretense L.) М., 1999, 183 с.

37. Новосёлов М.Ю. Состояние, задачи и методы селекции. В сб. Клевер в России. М., 2002, с. 29-40.

38. Оганесян А.С., Кочиева Е.З., Рысков А.Р. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD PCR. Генетика, 1996:448-451.

39. Петербургский С.М. Агрохимия и физиология питания растений. Россельхозиздат, Москва, 1971, с. 330.

40. Поветкина А.Г., Сиволап Ю.М. Использование SSRP-анализа для определения "гибридности" простых гибридов. В сб. Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. М., 2000, с. 81.

41. Прибыткова Т.Ф. Селекция на повышенное содержание сырого протеина клевера лугового. Методические указания по селекции и первичному семеноводству клевера. М., 2002, с. 4143.

42. Пуца Н.М., Разгуляева Н.В. Селекция на устойчивость к патогенам корневой системы. Методические указания по селекции и первичному семеноводству клевера. М., 2002, с. 5257.

43. Разгуляева Н.В., Костенко Н.Ю., Пуца Н.М. Методы ранней диагностики устойчивости клевера лугового и костреца безостого к болезням. В сб. Теоретические и прикладные основы ресурсосбережения в сельском хозяйстве. Тюмень, 1999, с. 115-116.

44. Рокотянская JI.C. Селекция растений на устойчивость к болезням. В сб. Материалы научной генетической конференции. М., МСХА, 2002, с. 281-283.

45. Серебровский А.С. Генетический анализ. М., 1970.

46. Созинов А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. М., Наука, 1985, 272 с.

47. Солодкая Л.А., Агафодорова М.Н., Лапотышкина Л.И., Куренина Л.В., Покрышкина О.Л. Методы биотехнологии в селекции клевера лугового. Методические указания по селекции и первичному семеноводству клевера. М., 2002, с. 3033.

48. Солодкая Л.А., Новосёлова Е.Ю. Методы создания форм клевера лугового с повышенной устойчивостью к раку. В сб. Селекция кормовых культур, вып. 42, М., 1989, с. 57-65.

49. Солодкая Л.А. Генетические особенности соматических клеток клевера лугового (Trifolium pratense L.) в культуре и их использование в селекции. Автореф. дисс. к. б. н.-Минск, 1987.20 с.

50. Сорокатая Е.И. Тестирование в лабораторных условиях устойчивых к возбудителям корневой гнили растений-регенерантов ячменя. В сб. Материалы научной генетической конференции. М., МСХА, 2002, с. 306-308.

51. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. М., Мир т .2. 1998., с. 370.

52. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н. Генетический полиморфизм ячменя, детектируемый ПЦР с произвольными праймерами. Генетика, 1995, т. 31, №10, с. 1358-1364.

53. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н., Нецветаев Н.Ю. Использование продуктов полимеразной цепной реакции для картирования генома ячменя. Генетика растений, 1997, т. 33. № 1, с. 53-60.

54. Хавкин Э.Е. Молекулярные маркёры в растениеводстве. Сельскохозяйственная биология, 1997, № 5, с. 3-20.

55. Хавкин Э.Е. Молекулярная селекция растений: ДНК-технологии создания новых сортов сельскохозяйственных культур. Сельскохозяйственная биология, 2003, № 3, с. 26-41.

56. Шевелуха Е.А., Калашникова С.В., Дегтяров С.В. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высш. шк., 1998, 416 с.

57. Шпаков А.С., Новосёлова А.С., Кутузова А.А., Георгиади Н.И. Клевер в России. М., 2002, 297 с.

58. Akkaya, M.S., Bhagwat, A.A., Cregan, Р.В. 1992. Length polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean. Genetics 132: 1131-1139;

59. Akopyanz, N., Bukanov N.O., Westblom T.U., and Berg, D.E. 1992. PCR-based RFLP analysis of DNA sequence diversity in the gastric pathogen Helicobacter pilori. Nucleic Acids Res. 20: 6221-6225.

60. Anderson, J.A., Stack, R.W., Liu S.,Warldon, A.D. et al. DNA markers for Fusarium head blight resistance QTLs in two wheat populations. 2001. Theor Appl Genet, 102: 1164-1168.

61. Barcaccia, G. 1994. Development, comparability and potential application, of RAPD marker in the genus Medicago. Jornal of Genetic and Breeding 48: 161-168.

62. Beckman, J.S., and Soller, M. 1990. Toward a unified approach to the genetic mapping of eukaryotes based on sequence-tagged microsatellite sites. Bio/Tecchnology, 8: 930-932.

63. Blake, Т.К., Kadryshanova, D. STS-PCR markers appropriate for wheat-barley introgression. Theor. Appl. Genet., 1996, 5-6: 826-832.

64. Blair, M.W., Panaud, O., McCouch, S.R. 1999. Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatellitemotif frequency and'finge^rinting-in rice (Oriza sativa L.). Theor Appl Genet 98: 780-792.

65. Bonierbale, M.W., Plaisted, R.L., Pineda, O., Tanksley, S.D. 1994. QTL analysis of trichome-mediated insect resistance in potato. Theor Appl Genet 87: 973-987.

66. Botstein, D., White, R., Skolnick, M. 1980. Construction of a genetic map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J.Hum. Genet., 32: 314-331.

67. Briggs, S.P. 1998. Plant genomics: more then food for thought. Proc Natl Acad Sci USA 95:1986-1988.

68. Broun, P., Tankley, S.D. Characterization and genetic mapping of simple repeat seguences in tomato genome. Mol. Gen. Genet., 1996, 250: 39-49.

69. Brouwer, D.J.,& Osborn, T.C. A molecular marker linkage map of tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.). Theor Appl Genet 1999, 99: 1194-1200.

70. Chen, C., Sleper, D.A., Jonal, G.S., West, C.P. 1998. Comparative RFLP mapping of meadow and tall fescue. Theor Appl Genet 97: 255-260.'

71. Clements, R.J., Hay ward, M.D., Byth, D.E. 1983. Genetic adaptation in pasture plants. In: Mclvor J.G., Bray, R.A. (eds.) Genetic Resources of Forage Plants. CSIRO, Australia 101-106.

72. Dalbo, M.A., Ye, G.N., Weeden, N.F., Steinkellner, H., Sefc, K.M., and Reisch, B.I. 2000. A gene controlling sex in grapevines placed on a molecular marker-based genetic map. Genome v.43, № 2.

73. Devey, M.E., Bell, J.C., Smith, D.N., Neale, D.V., and Morgan, G.F. 1996. A genetic linkage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD, and microsatellite markers. Theor. Appl. Genet. 92: 673-679.

74. Devos, K.M., and Gale, M.D. 1997. Comparative genetics in the grasses. Plant molecular Biology 35,3-15.

75. Diwan, N., Bhagwat, A.A., Bauchan, G.B., Cregan, P.B. 1997. Simple sequence repeat DNA markers in alfalfa and perennial and annual Medicago species. Genome 40: 887-895.

76. Doyle, J.J., Doyle, J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue.

77. Echt, C.S., May-Marquardt, P., Hseih, M., and Zahorchak,R. 1996. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome, 39: 1102-1108.

78. Echt, C.S., ErDahl, L.A., and McCoy, T.J. 1991. Genetic segregation of random amplified polymorphic DNA in diploid cultivated alfalfa. Genome, 35: 84-87.

79. Echt, C.S., Kidwell, K.K., Knapp, S.L., Osborn, T.C., &McCoy, T.J. Linkage mapping in diploid alfalfa (Medicago sativa). Genome 1994,37:61-71.

80. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. 1991. A simple and rapid method for preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucl Acids Res 19(6): 1349.

81. Edwards, M.D., Helentjaris, Т., Wright, S., Stuber, C.W. 1992. Molecular-marker-facilitated investigations of quantitative trait loci in maize. Theor Appl Genet 83: 765-774.

82. Ganal, M.W., Czihal, R., Hannappel, U., Kloos, D.U., Polley, A. Ling, H.Q. 1998; Sequencing of cDNA clones from the genetic map of tomato (Lycopersicon esculentum). Genom Res 8: 842-847.

83. Guevara-Garcia, A., Herrera-Estrella, L., and Olmedo-Alvares, G. Use of PCRs in Plant Molecular Biology.

84. Halward, Т., Stalker, Т., LaRue, E., Kocchert, G. 1992. Use of single-primer DNA amplifications in genetic studies of peanut (Arachis hypogaeva L.). Plant Mol Biol 18: 315-325.

85. Hayward; M.D., McAdam, N.J., Jones, J.G., Evans, G.M., Forster, J.W., et al. 1994. Genetic markers and the selection of quantitative traits in forage grasses. Euphytica, 77: 269-275.

86. Hearn, C., Ghosh, S., and Todd, J. 1992. Microsatellite for linkage analysis of genetic traits. Trends genet. 8: 288-2941

87. Heun M., Kennedy A.E., Anderson J.A., Lapitan N.L., Sorrells M.E., Tanskley S.D. 1991. Construction of a restriction fragment length polymorphism map for barley (Hordeum vulgare). Genome 34: 437-447.

88. Hirochika, H. 1997. Retrotransposons of rice: their regulation and use for genome analysis. Plant. Mol. Biol. 35, 231-240.

89. Hughes M.A. Dunn M.A. 1996. The molecular biology of plant acclimation to low temperature. Journal of Experimental Botany 47, 291-305.

90. Ivashuta, S., Naumkina, M., Gau, M., et al. 2002. Genotype-development transcriptional5 activation of novel repetitive elements during cold acclimation of alfalfa {Medicago sativa). The Plant Journal, 31(5), 615-627.

91. Isobe, S., Klimenko, I., Ivashuta, S., Gau, Mi, Kozlov, N.N. First RFLP linkage map of red clover {Trifolium pratense L.) based on cDNA probes and its transferability to other red clover germplasm. Theor Appl Genet (2003) 108: 105-112.

92. Jansen R.C. A general Monte Carlo method for mapping multiple quantitative trait loci. Genetics 142: 305-311.

93. Jarvis, P., Lister, C., Szabo, V., Dean, C. Integration of CAPS markers into lines of Arabidopsis thaliana. Pit mol Biol 1994, 24: 685687.

94. Johan, W., van Ooijen, Chric Maliepaard 1993, MapQTL ver.4.0.

95. Jung, G. Molecular markers associated with plant architecture and resistance to common blight in common beans. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 1996,121, 5: 794-803.

96. Kalo, P., Endre, G., Zimany, L., Csanadi, G., and Kiss, G.B. 2000. Construction of an improved linkage map of diploid alfalfa (Medicago sativa L.). Theor Appl Genet 100: 641-657.

97. Kangfu, Yu and Pauls, K.P. 1992. Optimization of the PCR program for RAPD analysis. Nucleic Acids Research, Vol. 20, № 10.

98. Karp, A. On the current understanding of clonal, variation. Oxford Surweys of Plant Molecular and Cell Biology/ Ed. B.J. Miflin. 1991. V.7.P. 1-58.

99. Karp, A., Seberg, O., Buiatti, M. 1996. Molecular techniquesbin the assessment of botanical diversity. Annals of Botany 78: 143-149.

100. Keim, P., Schupp, J.M., Travis, S.E., Clayton, K., et al. 1997. A high-density soybean genetic map based upon AFLP markers. Crop Sci. 37: 537-543.

101. Kidwell, K.K., Bingham, E.T., Woodfield, D.R., Osborn, T.C. 1994. Relationships among genetic distance forage yield and heterozygosity in isogenic diploid and tetraploid alfalfa populations. Theor Appl Genet 89: 323-328.

102. Kiss G.B., Csanadi, G., Kalman, K., Kalo, P., Okresz, L. 1993. Construction of a basic genetic map for alfalfa using RFLP, RAPD, isozyme and morphological markers. Mol Gen Genet 238: 129-127.

103. Lander, E.S., Green, P., Abrahamson, J., Barlow, A., et al., 1987. MAPMAKER. Mcintosh version 2,0, Genomics 1: 174-181.

104. Landry, B.S. and Michelmore, R.W. Methods and applications of restriction fragment length polymorphism analysis to plants, in Tailoring Genes for Crop Improvement. Brueing. Ed., 25.1985.

105. Landry B.S., Kesseli R.V., Farrara В., Michelmore R.W. 1987. A genetic map for lettuce (Lactuca sativa L.) with restriction fragment length polymorphism, isozyme, disease resistance and morphological markers. Genetics 116: 331-337.

106. Lodhi, M.A., Ye, G.N., Weeden, N.F., and Reisch, B.I. 1994 A. simple and efficient method for DNA extraction from grape vine cultivars and Vitis species. Plant Mol. Biol. Rep. 12: 6-13.

107. Maniatis, Т., Fritsch, E.F., Sambrook, J. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring laboratory Press, New York.

108. Markert, C.L., and Moller, F. Multiple forms of enzymes: tissue, ontogenetic, and species-specific patterns. Proc Natl Acad Sci USA 1959,45:753-763.

109. McCouch, S.R., Kochert, G., Yu, Z.H., Khush, G.S., Coffman, W.R., and Tanksley, S.D. 1988. Molecular mapping of the rice chromosome. Theor Appl Genet. 76: 815-829.

110. Mershall, P., Marchand, M.C., Lisieezko, G. A simple method to estimate the percentage of hybridity in canola (Brassica napus. L.) F1 hybrids. Theor Appl Genet, 1994, 89, 7/8: 853-858.

111. McGregor, C.E., Lambert, C.A., Greyling, M.M., Louw, J.H., Warnich. 2000. A comparative assessment of DNA fingerprintingtechniques (RAPD, ISSR, AFLP and SSR) in tetraploid potato (Solanum tuberosum L.) germplasm. Euphtica 113: 135-144.

112. Michelmore, R. Molecular approaches to manipulation of disease resistance genes. Annu. Rev. Phytopathol., 1995, 33: 393427.

113. Morgan, Т.Н. Sex-linked inheritance in Drosophila. Science 1910,32:120-122.

114. Mori, N., Liu, Y.G., Tsunewaki, K. Wheat phylogeny determined by RFLP analysis of nuclear DNA. Theor Appl Genet, 1995,90, 1: 129-134.

115. Mullis, R.B., Fallona, F.A., Scharf, S. Specific synthesis of DNA in vitro: the Polymerase Chain Reaction. Cold Spring Harbor Simposia on Quantitative Biology, 1986, 51: 263-273.

116. Nakagawa, H., and Ebina, M. Development of Molecular Markers for the Analysis of Apomixis. 2001. In Spangenberg (ed), Molecular Breeding of Forage Crops, 161 -173.

117. Mullis, K.B. and Faloona, F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Meth. Enzymol., 155,335.1987.

118. Paterson, A.H. Making Genetic Maps. 1996. In Genome mapping in Plants, ch. 3, R.G. Landes Company.

119. Paterson, A.H. Mapping Genes Responsible for Differences in Phenotype. 1996. In Genome mapping in Plants, ch. 4, R.G. Landes Company.

120. Paterson, A.H., Tanksley, S.D., Sorrels, M.E. DNA markers in plant improvement. Adv. Agron., 1991, 46: 39-90.

121. Paran, I., Michelmore, R.W. Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor Appl Genet, 1993, 85: 985-993.

122. Powell, W., Morgante, M., Andre, C., Hanafey, M., Vogrl, J., Tingey, S. and Rafalski, A. 1996. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers fpr germplasm analysis. Mol Bred 2: 225-238.

123. Quesenberry, K.H., Smith, N.L., Taylor, D.D., Baltensberg, and parrott, W.A. 1991. Genetic nomenclature in clovers and special-purpose legumes. Crop Sci. 31: 861-867.

124. Rafalski, A., Tingey, S., Williams, J.G.K. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Plant Molecular Biologi Manual. Klubedr Acad. Publ., c.8: 1-9.

125. Rajora,. O.P., Rahman, M.H., Buchert, G.P., and Dancik, B.P:, 2000. Microsatellite DNA analysis of genetic effects of harvesting in old-growth eastern white pine (Pinus strobus) in Ontario. Mol. Ecol. 9: 339-348.

126. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

127. Sambrook, J., and Russel F. 2001. "Quantitation of Nucleic Acids", in Molecular cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y).

128. Sanchez-Escribano, E.M., Martin, J.P., Carreno, J;, and Cenis, J.L. 1999. Use of sequence-tagged microsatellite site markers for characterizing table grape cultivars. Genome, 42: 87-93.

129. Smith, J.S.C., Smith, O.S. Fingerprinting crop varieties. Adv. Agron., 1992, 47: 85-140.

130. Spangenberg, G., Molecular Breeding of Forage Crops. Proc. of the 2nd International Symposium, Molecular Breeding of Forage Crops, Lome and Hamilton, Victoria, Australia, November 19-24, 2000. Kluwer Academic Publishers (Dordrecht/Boston/London).

131. Spangenberg, G., Wang, Z.Y., Potrykus (1998) Biotechnology in forage and turf grass improvement. In: Frankel R. et al. (eds) Monographs on Theor Appl Genet, v. 23, 10 ch., Spring Verlag, Heidelberg, 192.

132. Stam, P., Ooijen, J.W. 1995. JoinMap vers 2,0: Software for the calculation of genetic linkage maps. CPRO-DLO, Wageningen.

133. Sweeney, P.M:, & Danneberger, Т.К. 1994. Random amplified polymorphic DNA in perennial ryegrass: A comparison of bulk samples vs. individuals. HortSci. 29: 624-626.

134. Taramino, G., Tingley, S. Simple sequence repeats for germplasm analysis and mapping in maize. Genome, 1996, 39, 2: 277-287.

135. Tauts, D. 1989. Hypervariability of simple sequences as a general source of polymorphic markers. Nucleic Acids Res. 17: 6463-6471.

136. Taylor, N.L. 1982. Registration of gene marker germplasm for red clover. (Reg. CP 1 for CP). Crop Sci.: 1226-1269.

137. Teutonico, R., Yandell, В., Satadopan,J.M. e.a. Genetic analysis and mapping of genes controlling freezing tolerance in oilseed Brassica. Molecular Breeding, 1995, 1, 4: 329-339.

138. Thomas, M.R., and Scott, N.S. 1993. Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphisms when analyzed as sequence-tagged sites (STSs). Theor Appl Genet 86: 985-990.

139. Warren, J.M., Raybould, A.F., Ball, Т., Gray, A.J., Hayward, M.D. (1998). Genetic structure in the perennial grasses Lolium perenne and Agrostis curtisii. Heredity 81: 556-562.

140. Wang, Z., Weber, J.L., Zhong, G., and Tanksley, S.D. 1994. Survey of plant short tandem repeats. Theor Appl Genet 88: 1-6.

141. Weber, J.L. (1990) Human DNA polymorphism based on length varations in simple-sequence tandem repeats. In: Davies K.E., Tilghman S.M. (eds) Genetic and physical mapping. V I genome analysis. Cold Spring Harbour laboratory Press, Plainview, New York.

142. Welsh, J., and McClelland, M. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18: 72137218.

143. Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J;, Rafalski, J.A., and Tigney, S.V. 1990. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful genetic markers. Nucleic Acids Res. 18: 65316535.

144. Wing, R.A., Zhang, H.B., Tanksley, S.D. 1994. Map-based cloning in crop plants. Tomato as a model system. Genetic and physical mapping of jointless. Mol. Gen. Genet., 242: 681-688.

145. Wolfraim L.A., Langis R., Tyson H., Dhindsa RS.1993. cDNA sequence, expression and transcript stability of a cold acclimation-specific gene of alfalfa (Medicago falcata ) cells. Plant Physiology 101, 1275-1282.

146. Yamada, Т., Fukuoka, H., Wakamatsu, T. (1989a). Recurrent selection programs for white clover (Trifolium repence L.) using self-compatible plants. Euphytica 44: 167-172.

147. Yu, K.F., and Pauls, K.P. 1993. Segregation of random amplified polymorphic DNA markers and strategies for molecular mapping in tetraploid alfalfa. Genome 36: 844-851.

148. Yu, K.F., and Pauls, K.P. 1993. Rapid estimation of genetic relatedness among heterogenous populations of alfalfa by random amplification of bulked genomic DNA samples. Theor Appl Genet 86, 788-794.

149. Список основных аббревиатур и сокращений, используемых вдиссертационной работе

150. NARCH-National Agricultural Research Center for Hokkaido region -Национальный Центр сельскохозяйственных исследований для Хоккайдского региона.

151. PCR-polymerase chain reaction полимеразная цепная реакция (ПЦР).

152. MAS-marker-assisted selection селекция с помощью маркеров.

153. QTL-quantitative trait loci локусы количественных признаков.

154. RFLP-restriction fragment length polymorphism —полиморфизм длины рестрикционных фрагментов.

155. RAPD-randomly amplified polymorphic DNA полиморфизм рандомно амплифицированной ДНК.

156. STS-sequence-tagged site полиморфизм длины фрагментов определенных сайтов.

157. CAPS-cleaved amplified polymorphism site полиморфизм сайтов расщепленной (расколотой) ДНК.

158. AFLP-amplified restriction length polymorphismполиморфизм длины амплифицированных последовательностей нуклеотидов

159. SSR-simple sequence repeats простые повторяющиеся последовательности

160. DAF-DNA amplification fingerprinting фингерпринтинг, (отпечаток) амплифицированной ДНК.

161. DDRT-differential display RNA technique техника дифференциального дисплея для РНК.

162. DD-AFLP-differential display AFLP дифференциальный дисплей для AFLP-метода.

163. Map-based-cloning клонирование генов на основе генетических карт.-130 1.d-skore логарифм частной вероятности.

164. RNasel РНКаза, фермент для удаления РНК из растворов.bp-base pear — пары оснований (нуклеотидов).ng нанограмм.

165. DMPLC денатурирующая жидкостная хроматография.

166. Fingerprint высокоспецифичная картина спектров амплификации оцениваемого генотипа.

167. ВС популяция типа беккрос.

168. Comparative mapping «сравнительное картирование» родственных видоводной таксономической группы. Tag DNA Polymerase термостабильная ДНК-ролимераза.

169. ТАЕ трис-ацетатный буфер для проведения электрофореза.Ф

170. СТАВ-буферы для экстракции ДНК (Doyle et al., 1990)1,5Х СТАВ-буфер (1л) 10% СТАВ-буфер (1л) СТАВ-осаждающий буфер (1л)

171. СТАВ 15 г СТАВ - 100 г СТАВ - Юг1М Tris-HCl 75 мл NaCl -40,95 г 1М Tris-HCl-50 мл0,5М EDTA 30 мл 0,5М EDTA - 20 мл1. NaCl 61,43 г

172. Буфер для выделения ДНК методом Эдвардса (Edwards et al., 1991)

173. Компоненты Объем (1мл) Конечная концентрация

174. Tris-HCl (рН 7,5) 200 мкл 200 шМ1. EDTA (о,5 М) 50 мкл 25 шМ1. NaCl (5М) 50 мкл 250 шМ1. SDS (10%) 50 мкл 0,5 %1. Н20 (рН 7,0) 650 мкл

175. Состав рабочих растворов для проведения электрофореза:

176. ТАЕ (трис-ацетатный)-буфер 5 ОХ раствор (1л)

177. Рабочий раствор: 0,04М Трис-ацетат (50Х): 0,002М ЭДТА Концентрированный раствор (1л)1. Трис-НС1 242 г0,5М ЭДТА (рН 8,0) 100 мл

178. Ледяная уксусная кислота 57 мл2. ТЕ-буфер (рН 7,4)1. ЮмМTris-HCl (рН 7,4)1.M EDTA (рН 8,0)

179. Загрузочный буфер для нанесения проб (6Х) с продуктами PCR0,25% бромфеноловый синий0,25% ксилолцианол30% глицерин2+

180. Состав буфера для приготовления смеси для PCR (XI0), Mg добавляли вреакционную смесь1. Tris-HCl, рН 8,8 670 mM1. NH)2S04 166 mM1. Tween 20 0,01%

181. Оценка экспериментальной популяции ГП-27 по основнымморфобиологическим показателям

182. Условные обозначения к значениям признака (Международный классификатор рода Trifolium», Ленинград, 1983).

183. Оценка сроков цветения популяции клевера ГП-27 в полевых условиях (Хоккайдо, июль 2001-2002г.,* генотипы, не прошедшие оценку)

184. Результаты RAPD-анализа популяции клевера лугового ГП-27

185. Праймер Нуклеотидная Наличие продуктов Полиморфизмпоследовательность амплификации фрагментов1 2 3 41. KIT А code)

186. ОРА-01 5'-CAGGCCCTTC-3' — —

187. ОРА-02 5'-TGCCGAGCTG-3' + — ■

188. ОРА-ОЗ 5AGTC AGCC АС-3 + —1. ОРА-04 5-AATCGGGCTG-3 + —1. ОРА-05 5-AGGGGTCTTG-3 + —

189. ОРА-О6 S'-GGTCCCTGAC-S1 + —

190. ОРА-07 S'-GAAACGGGTGS' — —1. ОРА-08 5-GTGACGTAGG-3 + —

191. ОРА-09 5'-GGGTAACGCC-3 — —

192. ОРА-Ю 5 '-GTG ATCGC AG-3 + —

193. ОРА-11 5'-CAATCGCCGT-3' + —1. ОРА-12 5-TCGGCGATAG31 + —

194. ОРА-13 5'-CAGCACCCAC3' + —

195. ОРА-14 5'-TCTGTGCTGG-3' + —

196. ОРА-15 5'-TTCCGAACCC-3* + —1. ОРА-16 S-AGCCAGCGAAS' + —

197. ОРА-17 5-GACCGCTTGT-3' + —1. ОРА-18 5-AGGTGACCGT-3 + —1. ОРА-19 5-CAAACGTCGG31 + —

198. ОРА-20 5'-GTTGCGATCC-3' + +Ф