Разработка и экспериментальное исследование клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.24, кандидат наук Пономарева, Анна Сергеевна

• Пономарева, Анна Сергеевна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Пономарева, Анна Сергеевна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

§ 1. Хрящевая ткань: структура, функции, повреждения, методы лечения.. Л

1.1. Структура и функии хрящевой ткани

1Л Л. Клеточные элементы хрящевой ткани

1Л .2. Внеклеточный матрикс хрящевой ткани

1Л .3. Виды хрящевой ткани

1.2. Повреждения и способы лечения гиалинового хряща

1.2.1. Клеточные технологии для лечения дефектов хряща

§2. Биодеградируемые полимерные материалы для клеточно-инженерных конструкций хрящевой ткани

2.1. Гели

2.2. Губки

2.3. Сетки

§3. Мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека

3.1. Источники получения МСК

3.2. Иммунофенотип МСК жировой ткани человека

3.3. Дифференцировочный потенциал МСК ЖТч

3.3.1. Адипогенная дифференцировка

3.3.2. Остеогенная дифференцировка

3.3.3. Хондрогенная дифференцировка

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

§ 1. Выделение, культивирование и исследование культур МСК ЖТч

1.1. Метод выделения МСК из подкожно-жировой клетчатки человека

1.2. Культивирование МСК ЖТч

1.3. Кривая роста, время удвоения популяции МСК ЖТч

1.4. Исследование колониеобразующей способности МСК ЖТч

1.5. Хромосомный анализ культивируемых МСК ЖТч

1.6. Определение иммунофенотипа МСК ЖТч методом

иммуноцитофлюориметрического анализа

§2. Дифференцировочный потенциал МСК ЖТч условиях in vitro

2.1. Индукция адипогенной дифференцировки

2.2. Индукция остеогенной дифференцировки

2.3. Индукция хондрогенной дифференцировки

2.3.1. Хондрогенная дифференцировка МСК ЖТч в монослое

2.3.2. Хондрогенная дифференцировка МСК ЖТч в 3-D культуре

§3. Определение оптимального состава клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля и МСК ЖТч

3.1. Иммобилизация и культивирование МСК ЖТч в биополимерном гетерогенном гидрогеле

3.2. Клеточно-инженерная конструкция хрящевой ткани на основе

биополимерного гетерогенного гидрогеля и МСК ЖТч

§4. Подкожная имплантация клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля и не дифференцированных МСК ЖТч в условиях in vivo

4.1. Подготовка КИК XT для введения лабораторным животным

4.2. Животные и их содержание

4.3. Условия проведения эксперимента

4.3.1. Формирование групп и манипуляции с животными

4.3.2. Исследование биологического материала

4.3.3. Терминальные процедуры

§5. Гистологические и иммуногистохимические методы оценки

5.1. Окрашивание дифференцированной в адипогеном направлении культуры МСК ЖТч масляным красным О

5.2. Окрашивание дифференцированной в остеогенном направлении культуры МСК ЖТч ализариновым красным

5.3. Методика приготовления парафиновых срезов

5.4. Окрашивание парафиновых срезов гематоксилином и эозином, альциановым синим и по методу Маллори

5.4.1. Окрашивание парафиновых срезов альциановым синим

5.4.2. Окрашивание парафиновых срезов по методу Маллори

5.5. Окрашивание парафиновых срезов к коллагену II типа

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

§ 1. Характеристика популяций МСК ЖТч

1.1. Выход клеток, морфологическая характеристика МСК ЖТч

1.2. Параметры роста и время удвоения популяций МСК ЖТч

1.3. Колониеобразующая способность МСК ЖТч

1.4. Кариотип культуры МСК ЖТч

1.5. Иммунфенотип культуры МСК ЖТч

§2. Дифференцировочный потенциал МСК ЖТч в условиях in vitro

2.1. Адипогенная дифференцировка

2.2. Остеогенная дифференцировка

2.3. Хондрогенная дифференцировка

2.3.1. Хондрогенная дифференцировка МСК ЖТч в монослое

2.3.2. Хондрогенная дифференцировка МСК в 3-D культуре

§3. Исследование клеточно-инженерных конструкций хрящевой ткани в условиях in vitro

3.1. Иммобилизация и культивирование МСК ЖТч на поверхности биополимерного гетерогенного гидрогеля

3.2. Морфологические изменения КИК хрящевой ткани на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля и МСК ЖТч в условиях in vitro...S3 §4. Морфологические изменения КИК хрящевой ткани условиях in vivo (экспериментальная модель подкожной имплантации)

4.1. Интегральные показатели

4.2. Оценка заживления ран

4.3. Клинические и биохимические исследования крови

4.4. Патоморфологические данные

4.4.1. Макроскопическое исследование

4.4.2. Морфометрический анализ внутренних органов

4.4.3. Гистологическое исследование места имплантации

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и экспериментальное исследование клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани»

ВВЕДЕНИЕ

Современные потребности в трансплантации существенно ограничиваются нехваткой донорских органов, и прогнозы указывают на то, что потребность в донорских органах и тканях будет только увеличиваться. Следовательно, актуальной остается задача разработки альтернативных способов компенсации или замены поврежденных или утраченных жизненно важных функций органов и тканей. Анализ последних работ в области трансплантологии и искусственных органов дает основание говорить о том, что ученые пока не пришли к формированию искусственной биосовместимой поверхности, аналогичной по своим свойствам естественным тканям организма. Исследователи также далеки от создания искусственных органов на основе только синтетических материалов с заданными и контролируемыми свойствами. В связи с этим в последние годы основной акцент сделан на использование технологий тканевой инженерии -междисциплинарной области исследований, которая включает разработку биоискусственных тканей и органов — материалов и систем, наделенных структурой и функцией биологических тканей [1].

Одним из подходов к восстановлению трехмерной структуры ткани может быть формирование ее тканеинженерной конструкции (ТИК) на основе клеточно-инженерной конструкции (КИК), включающей в себя следующие компоненты:

- клетки, выделенные из эндогенных источников у пациента (аутологичные клетки) или от доноров (аллогенные клетки) и способные формировать функционирующий внеклеточный матрикс (В КМ);

- подходящий биосовместимый биодеградируемый носитель (матрикс, каркас) для трансплантации клеток и временного биоискусственного матрикса;

- биоактивные молекулы (цитокины, факторы роста), которые оказывают биостимулирующее действие на клетки поврежденной ткани.

В настоящее время дегенеративные заболевания суставов приобретают все большую социально-медицинскую значимость, поскольку в обществе растет процент пожилых людей, а также людей с повышенной массой тела, которые рассматриваются как группа риска развития тяжелого поражения крупных суставов нижних конечностей. По данным ВОЗ за 2006 год в мире от остеоартроза страдают около 80% населении старше 60 лет, при этом более половины из них имеют те или иные ограничения в движении, а 25% не могут справляться с ежедневными жизненными потребностями.

Остеоартроз - заболевание периферических, и/или центральных (позвоночных) суставов с деструкцией суставного хряща и дегенеративными изменениями в эпифизах сочленяющихся костей, с формированием субхондральных костных кист и краевых костных разрастаний [1].

В основе заболевания лежит изнашивание, истончение и гибель суставного хряща с выпадением его амортизационной функции. В более позднем периоде возможно присоединение дегенеративно-дистрофических изменений в субхондральной костной ткани близ сустава.

Нередко болезнь приводит к значительному ухудшению качества жизни, устойчивой утрате трудоспособности и инвалидизации пациента, особенно, если поражены тазобедренные и коленные суставы. Это связано с ограничением подвижности и резкой болью при движении или нагрузке. Заболеваемость остеоартрозом в России занимает лидирующее место среди болезней суставов и наблюдается практически во всех возрастных группах.

Лечение дефектов суставного хряща представляет собой сложную ортопедическую проблему, т.к. регенерация гиалинового хряща крайне незначительна. Отсутствие кровоснабжения и низкий уровень метаболизма из-за малого количества клеток в единице объема ткани приводят к тому, что полноценная репаративная регенерация хряща возможна лишь при

небольших по площади повреждениях [2]. При обширных повреждениях хрящевой ткани (ХТ), сопровождающихся разрушением надхрящницы, регенерацию хрящевой ткани опережает развитие грануляционной ткани в месте дефекта [3]. Применение таких техник как стимуляция костного мозга, субхондральное просверливание кости, микропереломы и попытка закрытия дефекта надкостничными или перехондриальными трансплантатами не всегда приводит к приемлемым результатам [4]. Несколько улучшило ситуацию применение аутохондротрансплантации. Однако этот метод так же не лишен недостатков, основные из которых травматичность биопсии здорового участка хряща, сложность культивирования хондроцитов и неполнота восстановления хрящевой ткани. В связи с этим в качестве альтернативы данному методу были рассмотрены варианты замены хондроцитов на мезенхимальные стромальные клетки (МСК), которые присутствуют во всех органах и тканях человеческого организма и обладают мультилинейным потенциалом дифференцировки в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях. Одним из перспективных источников МСК, благодаря простоте технологии выделения, достаточному выходу клеток и минимальной травматичности для пациента, является жировая ткань [5].

Актуальной остается разработка технологий, позволяющих прицельно доставлять жизнеспособные МСК в патологический очаг, удерживать их там и создавать им условия для нормального функционирования. Ряд протоколов предписывает введение суспензии клеток в кровяное русло или в очаг поражения. Данные методики имеют некоторые ограничения и недостатки, наиболее существенными из которых являются сложность контроля локализации клеток в месте повреждения и их низкая жизнеспособность.

Применение подходов клеточной и тканевой инженерии, заключающихся в трансплантации МСК на матриксах-носителях, представляет собой перспективный способ лечения дефектов хряща с использованием функциональных тканевых заменителей. Основная цель

применения матриксов - это доставка и удержание клеток в месте повреждения, а также обеспечение клеткам необходимого трехмерного окружения для формирования хрящевой ткани [6].

Цель работы

Разработать и провести исследования в условиях in vitro и in vivo клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля и мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека.

Основные задачи работы

1. Отработать методики выделения и культивирования МСК из жировой ткани человека (ЖТч).

2. Исследовать параметры роста, провести анализ экспрессии поверхностных антигенов и кариотипический анализ полученных из ЖТч популяций МСК.

3. Подтвердить способность полученных из ЖТч культур МСК дифференцироваться в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях.

4. Разработать технологию культивирования МСК ЖТч на биополимерном гетерогенном гидрогеле в условиях in vitro.

5. Разработать и исследовать в условиях in vitro клеточно-инженерные конструкции на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля и МСК ЖТч с различной степенью хондрогенной дифференцировки.

6. Исследовать биологическую безопасность выбранной клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани в экспериментальной модели подкожной имплантации в условиях in vivo.

7. Изучить морфологические изменения клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани в условиях in vitro и in vivo в экспериментальной модели подкожной имплантации.

Научная новизна работы

1. Впервые показана способность биополимерного гетерогенного гидрогеля служить субстратом для культивирования, пролиферации и дифференцировки в хондрогенном направлении МСК ЖТч.

2. Исследовано влияние степени хондрогенной дифференцировки МСК ЖТч на возможность формирования в условиях in vitro ТИК хрящевой ткани из клеточно-инженерной конструкции, состоящей из биополимерного гетерогенного гидрогеля и МСК ЖТч.

3. Получены доказательства биологической безопасности разработанной КИК ХТ в условиях in vivo.

4. Впервые показана возможность формирования тканеинженерной конструкции ХТ при подкожной имплантации клеточно-инженероной конструкции хрящевой ткани на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля и не дифференцированных МСК ЖТч.

Практическая значимость

Основным результатом работы является разработка лабораторных образцов КИК хрящевой ткани и экспериментальных основ нового высокотехнологического метода коррекции и лечения заболеваний периферических и/или центральных (позвоночных) суставов, включая:

- протокол культивирования МСК ЖТч на биополимерном гетерогенном гидрогеле;

- протокол получения КИК ХТ, состоящей из биополимерного гетерогенного гидрогеля, МСК ЖТч и индукционной хондрогенной среды;

- протоколы экспериментальных исследований КИК хрящевой ткани. Полученные результаты позволяют перейти к доклиническим

исследованиям функциональной эффективности разработанной КИК ХТ на

экспериментальных моделях заболеваний периферических и/или центральных (позвоночных) суставов.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 49-й конференции МФТИ (г. Долгопрудный, 24-25 ноября, 2006 г.), Moscow-Bavarian Joint Advanced Student School (г. Зеленоград, 25 февраля - 5 марта, 2008 г.), Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (г. Москва, 21-26 сентября, 2009 г.), X и XII Китайско-Российском Симпозиуме «Новые материалы и технологии» (Китай, г. Дзясин, 20-24 октября, 2009 г., Китай, г. Куньмин, 18-21 ноября, 2013 г.), V Всероссийском съезде трансплантологов (г. Москва, 8-10 октября, 2010 г.), Ill, IV и V Всероссийской научной конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (г. Москва, 2528 октября, 2010 г., 24-27 октября, 2011 г., 17-22 ноября 2013 г.), Школе-конференции для молодых ученых «Клеточные технологии для регенеративной медицины» (г. Санкт-Петербург, 17-21 октября 2011 г.).

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 3 статьи в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья - в зарубежном журнале, 6 статей в сборниках научных трудов и одна глава в книге Биосовместимые материалы (учебное пособие) под ред. В.И. Севастьянова и М.П. Кирпичникова, МИА, М., 2011 г.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав основного содержания, включая обзор литературы, методическую главу, результаты исследования и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 111 наименований,

из них 23 российских и 88 иностранных. Диссертация, иллюстрирована 29 рисунками и 14 таблицами.

Место выполнения работы

Работа выполнена в лаборатории тканевой инженерии и систем доставки ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И.Шумакова» Минздрава России.

Настоящая работа проводилась в соответствии с планом научных исследований ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» на 2009-2011 гг. по направлению «Разработка и внедрение клеточных трансплантационных технологий для лечения широкого круга патологий» и государственному заданию Минздрава на 2012-2014 гг. по теме НИР «Разработка и экспериментальное исследование тканеинженерной конструкции хряща» (регистр, номер 01201251421).

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

§1. Хрящевая ткань: структура, функции, повреждения, методы лечения

1.1. Структура и функии хрящевой ткани

Хрящевая ткань развивается из мезенхимы и представляет собой разновидность соединительной ткани. Она состоит из хрящевых клеток (хондробласты, хондроциты) и большого количества внеклеточного матрикса (ВКМ). По своим физико-химическим свойствам хрящевая ткань - это гель, в котором содержится около 70-80% воды, 10-15% органических веществ и 47% минеральных солей [8]. Органические вещества представлены главным образом белками, гликозаминогликанами (ГАГ) и липидами. Среди белков различают фибриллярные белки - коллаген, эластин и нефибриллярные, связанные с ГАГ, такими как: хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, кератосульфат и т.д. По степени обеспеченности кровоснабжением, хрящевую ткань относят к наиболее слабо васкуляризованным тканям, а суставной хрящ вообще не содержит кровеносных и лимфоидных сосудов, нервов [9].

1.1.1. Клеточные элементы хрящевой ткани

Главные клеточные элементы хрящевой ткани - хондробласты и хондроциты [3, 8].

Структура хондробластов указывает на то, что эти клетки обнаруживают высокую метаболическую активность, в частности, связанную с синтезом ВКМ. Новообразованные белки, протеогликаны (ПГ) и ГАГ не располагаются непосредственно вблизи поверхности клетки, а распространяются диффузно на значительном расстоянии от клетки в образовавшемся ранее ВКМ. При участии хондробластов происходит периферический (аппозиционный) рост хрящевой ткани.

Хондроциты - зрелые клетки хрящевой ткани, имеют на поверхности микроворсинки, занимают, главным образом, центральные участки хряща, отделены друг от друга ВКМ и расположены в особых полостях - лакунах в межклеточном веществе в одиночку или группами из 2-8 клеток [8]. Это так называемые изогенные группы клеток, которые образовались в результате деления одной клетки. Форма хондроцитов в изогенных группах может быть различной - округлой, овальной, веретеновидной, треугольной - в зависимости от положения в том или ином участке хряща.

Синтетические способности хондроцитов значительно ниже, чем у хондробластов. Структура зрелых хондроцитов указывает на то, что они практически не способны к делению и заметному синтезу ВКМ. Но некоторые исследователи считают, что при определенных условиях митотическая активность в этих клетках все же возможна [3].

В современной научной литературе описан еще один тип клеток хрящевой ткани - хондрокласты [3, 10]. Они встречаются только при разрушении хрящевой ткани, а в условиях ее нормальной жизнедеятельности не обнаруживаются. По своим размерам хондрокласты значительно крупнее, чем хондроциты и хондробласты, так как содержат в цитоплазме несколько ядер. Функция хондрокластов связана с активацией процессов дегенерации хряща и участием в фагоцитозе и лизисе фрагментов разрушенных хрящевых клеток и компонентов хрящевого матрикса.

1.1.2. Внеклеточный матрикс хрящевой ткани

Основные свойства хряща - прочность и упругость - определяются молекулярной организацией хрящевого матрикса. Он подразделяется на основное аморфное (хондромукоид) вещество и фибриллярный компонент, который составляет примерно 40% сухой массы ВКМ и представлен главным образом коллагеном II типа (более 90%). Направление волокон определяется направлением силовых линий, возникающих при деформациях хряща в

физиологических условиях [3]. Основное вещество содержит воду, органические и минеральные вещества [8].

Органический компонент ВКМ представлен протеогликановыми агрегатами (ПГА) и гликопротеинами (ГП). В основе ПГА лежит длинная нить гиалуроновой кислоты, с которой при помощи небольших глобулярных белков с интервалом ЗООА0 нековалентно связаны 100-140 молекул ПГ (Рис. 1). ПГ в хряще представлены в виде комплексов, состоящих из корового белка к которому ковалентными связями присоединены олигосахаридные ветви - ГАГ - хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат и кератансульфат. Хондроитин-6-сульфат является основным ГАГ хряща. Его количество в основном веществе хряща, как и кератансульфата, увеличивается с возрастом, а концентрация хондроитин-4-сульфата существенно снижается [3,9-11].

Цепи хондроитинсульфата отдельных мономеров ПГ переплетаются и создают плотную пространственную сетку. Такая структура матрикса определяет устойчивость хряща к перегрузкам и объясняет хорошо известные его биологические свойства [11].

Распределение белков и ГАГ во ВКМ неравномерное. Лакуны, содержащие изогенные группы клеток, окружены узкой, более светлой, чем основное вещество, полоской, которая отличается оксифильностью и называется клеточной территорией, или территориальным матриксом. Более удаленные участки ВКМ называются интерстициальным матриксом. В пределах территориального матрикса коллагеновые волокна ориентированы вокруг поверхности изогенных клеточных групп. Переплетения коллагеновых фибрилл образуют стенку лакун. Пространства между клетками внутри лакун заполнены ПГ. Интерстициальный матрикс характеризуется слабобазофильной или оксифильной окраской и соответствует наиболее старым участкам межклеточного вещества.

Рост хрящей происходит как изнутри (интерстициальный рост), так и от надхрящницы (аппозиционный рост). Интерстициальный рост происходит за счёт пролиферации хондроцитов и увеличения объёма матрикса. Аппозиционный рост - наложение слоёв новообразованной хрящевой ткани по периферии хряща за счёт дифференцировки хрящевых клеток из хондрогенных клеток надхрящницы.

А

Гипауропоеая кислоте

Рисунок 1. А - протеогликан. Б - протеогликановый агрегат. В -протеогликановый агрегат электронная микрофотография [9].

1.1.3. Виды хрящевой ткани

Выделяют три разновидности хрящевой ткани - гиалиновую, эластическую и волокнистую (Рис. 2) [9].

Наиболее широкое распространение у человека получила гиалиновая хрящевая ткань. Она входит в состав, например, некоторых хрящей гортани, трахеи, крупных бронхов, реберных хрящей, формирует хрящевой остов носа, образует хрящи, покрывающие поверхности суставов [3]. У плода гиалиновый хрящ формирует скелет, а в растущем организме и при переломах кости гиалиновый хрящ является местом образования костной ткани.

В

Надхрящница

УПНЛПГ-К.Т Территориальный

Хондрочит метрике

Коллагеновые волокна

Хондроцит

Территориальный метрике

И »о генная группа Интерстициальныи хондроцитое метрике

Эластичные волокна

Рисунок 2. Виды хрящевой ткани: А — гиалиновая; Б — эластическая; В — волокнистая [12].

Гиалиновая хрящевая ткань полупрозрачная, голубовато-белого цвета, снаружи покрыта надхрящницей, богатой хондробластами [8]. Коллаген составляет 15-22% сухой массы ВКМ гиалинового хряща и на 90-95% представлен коллагеном II типа с небольшой долей коллагенов IX и XI типов

[2]. ПГ составляют 4-10% общей сухой массы ВКМ и присутствуют в агрегированном (50-85%) и неагегированном (10-40%) состоянии. Коллагеновые волокна переплетены в трехмерную сеть, которая удерживает остальные компоненты матрикса.

Макроскопически, гиалиновый хрящ представляет собой пласт, соответствующий по форме конфигурации костных суставных поверхностей. В суставном хряще выделяют 4 зоны (Рис. 3): поверхностный слой, средний слой, радиальный или глубокий слой и обызвествленный слой (или зона кальцификации) [2, 9].

Поверхностный слой отделен от суставной полости тонкой бесклеточной пластинкой. В нем располагаются плоские хондробласты, по своему строению напоминающие фибробласты, относительно мало ПГ и большое количество коллагеновых волокон, расположенных параллельно суставной поверхности. В этой зоне в норме отсутствуют погибшие клетки и высокомолекулярные продукты их разрушения.

В среднем (основном) слое располагаются типичные активные хондроциты округлой или овальной формы. Наибольшая их концентрация отмечается в зоне прилежащей к поверхностному слою, ниже они образуют изогенные группы и формируют клеточные колонки. Архитектоника данной зоны характеризуется, во-первых, присутствием волокон различной ориентации, формирующих сеть, пронизывающую всю толщу суставного хряща, и околоклеточные перилакунарные области, и, во-вторых, наличием мощных пучков коллагеновых волокон, поднимающихся из радиального слоя. Такое структурное построение ВКМ обеспечивает сохранность клеточных элементов в "капсулах" при высоких силах давления на ткань и практически полное гашение этих сил по направлению к кости. В среднем слое так же содержится наибольшее во всем хряще количество ПГ.

Радиальный и, особенно, обызвествленный слои бедны клетками. Здесь встречаются гипертрофированные клетки и хондроциты с дистрофическими изменениями (пикнотические ядра, кариорексис, обильная волокнистость в

Рисунок 3. Суставной хрящ человека [13].

Средний слой

Радиальный слой

Зона кальиификаиии

Субхондральная костная пластинка

цитоплазме и т.д.). В зоне кальцификации хондроциты заканчивают свой жизненный путь и гибнут, формируя так называемый пузырчатый хрящ. Субхондральная костная пластинка непосредственно прилегает к обызвествленному слою.

Гиалиновый хрящ не содержит кровеносных и лимфатических сосудов, нервов [8]. Его питание осуществляется путем осмоса из субхондральной пластинки и синовиальной жидкости. Толщина хряща зависит от типа сустава и функциональной нагрузки на него и колеблется от 1 до 7 мм.

Поверхностный слой

Эластичная хрящевая ткань встречается у млекопитающих в ушной раковине, бронхах среднего калибра. Из такой ткани построены надгортанник, рожковидные и клиновидные хрящи гортани. Эластичный хрящ входит в состав стенки наружных слуховых проходов и слуховых труб.

Хрящевая пластинка может быть гиалиновой в одной своей части и эластичной в другой [8]. По общему плану строения эластичный хрящ сходен с гиалиновым. Его клетки напоминают клетки гиалинового хряща, однако жира и гликогена в их цитоплазме накапливается меньше [8]. Хондроитинсульфатов в эластичном хряще также меньше, чем в гиалиновом. Эластичный хрящ отличается от гиалинового еще и тем, что в его ВКМ наряду с коллагеновыми волокнами имеются многочисленные хорошо разветвленные эластичные волокна, пронизывающие ВКМ во всех направлениях [3].

Волокнистый или фиброзный хрящ в своем составе кроме коллагена II типа, характерного для хрящевой ткани, содержит большое количество (до 90%) коллагена I типа. Данный вид хряща обычно встречается в местах перехода сухожилий и связок в гиалиновый хрящ, например в межпозвоночных дисках [8]. При этом там, где совершается переход, волокнистый хрящ становится похожим либо на плотную соединительную ткань сухожилия, либо его коллагеновые пучки постепенно разрыхляются и смешиваются с межклеточным веществом гиалинового хряща.

1.2. Повреждения и способы лечения гиалинового хряща

Отсутствие в суставном хряще кровоснабжения, а также низкий уровень метаболизма из-за малого количества клеток в единице объема ткани приводят к тому, что полноценная репаративная регенерация хряща возможна лишь при небольших по площади повреждениях [2]. При обширных повреждениях хрящевой ткани, сопровождающихся разрушением надхрящницы на большом протяжении, регенерацию хрящевой ткани опережает развитие грануляционной ткани на месте дефекта [3]. С течением времени грануляционная ткань трансформируется в рубцовую соединительную ткань.

Повреждения суставного хряща, часто связано с болью, нарушением функциональности хряща [14], способствуют его первичной дегенерации с

последующим поражением сочленяющихся компонентов сустава. Такие изменения приводят к разрушению системы связей между коллагеновыми волокнами. Изменения затрагивают как хондроциты, так и компоненты ВКМ. Происходит гипертрофия хондроцитов, приводящая к росту массы хряща в области хрящевых лакун. Кроме того, происходит постепенная утрата коллагена II типа, сначала в межтерриториальном матриксе, а затем и в околоклеточном матриксе вокруг хондроцитов в поверхностном слое и глубже. Происходит замещение коллагена II типа околоклеточного матрикса коллагеном X типа [3].

Консервативное лечение патологий сустава (остеоартроз с сопутствующим разрушением гиалиновой хрящевой ткани) достаточно недорого для потребителя, однако препараты используются фактически пожизненно и зачастую оказываются неэффективны [4, 14]. В терапии применяют главным образом, нестероидные противовоспалительные препараты в виде мазей (местная терапия), таблеток, инъекций. Препараты данного класса способны купировать признаки воспаления, но не останавливают деградацию хряща, и тем более не способствуют его восстановлению. Так же возможно применение хондропротекторов (ХП) -препаратов, получаемых из хрящевой ткани животных [14]. Действие ХП направлено на регуляцию метаболизма хондроцитов и торможение дегенеративных процессов. Однако, клинический эффект при использовании ХП развивается медленно, требует длительного лечения, а результат неустойчив [15, 16]. Как правило, при прогрессировании заболевания возникает необходимость в оперативном лечении - от артроскопического удаления поврежденных участков хряща с пластикой костно-хрящевых фрагментов с ненагружаемых участков, формированию микропереломов, до тотального эндопротезирования (ЭП) [2, 4, 9, 15-17].

К наиболее широко применяемым методикам лечения хряща можно отнести так называемые «методы стимулирования костного мозга», например, микрофрактурирование («микропереломы») или «субхондральное

просверливание кости» [4, 18]. В основе данных методов лежит принцип стимулирования миграции мезенхимальных клеток-предшественников из основной подхрящевой кости в поврежденный участок для запуска репаративных процессов в поврежденном хряще. Однако результат этих процедур чрезвычайно нестабильный и часто приводит к образованию волокнистой хрящевой ткани и рубцовой фиброзной ткани, которая по своим механическим свойствам хуже нативной ткани суставного хряща и значительно быстрее подвергается износу.

Еще один нередко применяемый метод лечения заключается в трансплантации участков хряща - надкостницы и надхрящницы [19] («остеохондральная трансплантация», «мозаичная пластика»). Из не- или мало-несущих отделов сустава высекаются костно-хрящевые кусочки и пересаживаются по возможности на всю площадь области дефекта. В этом случае волокнистый хрящ образуется только на переходах. Эта операция, как правило, тоже проводится артроскопически. Этот метод не годится при больших дефектах или при далеко зашедшем износе сустава из-за малого количества замещающего материала.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Пономарева, Анна Сергеевна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Atala A., Lanza R., Thompson J., Nerem R. Principles of regenerative medicine, Academic Press is an imprint of Elsevier, First edition, 2008, 1473 p.

2. Melero-Martin J. M., Al-Rubeai M. In vitro expansion of chondrocytes, Topics in Tissue Engineering, 2007, Vol. 3, p.37.

3. Мазуров В.И. Болезни суставов, Санкт-Петербург, «СпецЛит», 2008, с. 27-31.

4. Деев Р.В. Анализ рынка клеточных препаратов для коррекции патологии скелетных тканей, Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2006, № 2(4), с.78-83.

5. Zuk Р.А., Zhu М., Mizuno Н., Huang J., Futrell W., Katz A.J., Benhaim P., Lorenz P., Hedrik M.H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies, Tissue engineering, 2001, vol. 17, pp. 211-228.

6. Севастьянов В.И., Перова H.B., Немец E.A., Сургученко В.А., Пономарева А.С. Примеры экспериментально-клинического применения биосовместимых материалов в регенеративной медицине. В книге: Биосовместимые материалы (учебное пособие). Под ред. В.И. Севастьянова и М.П. Кирпичникова. Изд-во «МИА», М., 2011 г., Часть II, глава 3, с. 237-252.

7. Вёрткин А.Л., Шамуилова М.М., Наумов А.В., Плескановская Н.В. Остеоартроз в общемедицинской практике, Методические рекомендации, Правительство Москвы Департамент здравоохранения, Москва, 2008, с. 46.

8. Елисеев В.Г., Афанасьев Ю.И., Копаева Ю.Н., Юрин Н.А. Гистология, «Медицина», Москва, 1972, с. 185-189.

9. Flik K.R., Verma N., Cole B.J., Bach B.R. Articular Cartilage: Structure, Biology, and Function in book: Cartilage repair strategies, edited by Williams R.J., Humana Press, Totowa, New Jersey 2007, pp. 1-12.

10.Dreier R. Hypertrophic differentiation of chondrocytes in osteoarthritis: the developmental aspect of degenerative joint disorders, Arthritis Research & Therapy, 2010, vol. 12(216), p. 11.

П.Панасюк А.Ф., Ларионов Е.В. Хондроитинсульфаты и их роль в обмене хондроцитов и межклеточного матрикса хрящевой ткани, Научно-практическая ревматология, 2000, № 2, с. 46-55.

12.Kikuchi M., Kanama D. Current status of biomaterial research focused on regenerative medicine, Quarterly Review, 2007, 24, pp. 51-67.

13. http://cte.ucsd.edu/

14.Drakos M.C., Allenin A.A. Nonoperative Treatment Options for Symptomatic Cartilage Lesions in book: Cartilage repair strategies, edited by Williams R.J., Humana Press, Totowa, New Jersey 2007, pp. 55-68.

15. Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций, под редакцией Шумакова В.И., Онищенко Н.А., М. ЛАВР, 2009, стр. 213-224.

16. Голубев Г.Ш. Применение хондропротекторов в терапии остеоартроза, Digest for ours Osteoarthritis, приложение к № 2, 2005, стр. 2.

17. Redman S.N., Oldfield S.F., Archer C.W. Current strategies for articular cartilage repair, European Cells and Materials, 2005, vol. 9, pp. 23-32.

18. Solomon D.J., Williams R.J., Warren R.F. Marrow Stimulation and Microfracture for the Repair of Articular Cartilage Lesions in book: Cartilage repair strategies, edited by Williams R.J., Humana Press, Totowa, New Jersey 2007, pp. 69-84.

19.Miniaci A., Jambor C., Petrigliano F.A. Autologous Osteochondral Transplantation in book: Cartilage repair strategies, edited by Williams R.J., Humana Press, Totowa, New Jersey 2007, pp. 105-114.

20. Jones D.G., Peterson L. Autologous Chondrocyte Implantation in book: Cartilage repair strategies, edited by Williams R.J., Humana Press, Totowa, New Jersey 2007, pp. 137-166.

21. http://www.genzyme.com

22. http://www.osiristx.com

23. http://www.tigenix.com

24. http://www.biotissue.de

25. http://www.arthro-kinetics.com

26. http ://www. anikatherapeutics. com

27. http://www.codon.de

28. http://www.aci.dk

29.Husing B., Buhrlen B., Gaisser S. Human Tissue Engineered Products - Today's Markets and Future Prospects, Annex of the Final Report for Work Package 1: Analysis of the actual market situation - Mapping of industry and products, Fraunhofer Institute for Systems and Innovation Research, Karlsruhe, Germany, 2003, p. 54.

30. http://www.tetec-gmbh.de

31.Marlovits S., Hombauer M., Truppe M., Vecsei V., Schlegel W. Changes in the ratio of type-I and type-II collagen expression during monolayer culture of human chondrocytes, J. Bone Joint Surg., 2004, vol. 86B(2), pp. 286-295.

32.Binette F., McQuaid D.P., Haudenschild D.R., Yaeger P.C., McPherson J.M., Tubo R. Expression of a stable articular cartilage phenotype without evidence of hypertrophy by adult human articular chondrocytes in vitro, Jorunal of Orthopedic Research, 1998, vol. 16, pp. 207-216.

33.Mehlhorn A.T., Schmal H., Kaiser S., Lepski G., Finkenzeller G., Stark G.B., Sudkamp N.P. Mesenchymal Stem Cells Maintain TGF-(3-Mediated Chondrogenic Phenotype in Alginate Bead Culture, Tissue Engineering 2006, Vol. 12(6), pp 13931403.

34. Chung C., Burdick J.A. Engineering Cartilage Tissue, Adv Drug Deliv Rev., 2008, 60(2), pp. 243-262.

35.Chang C.-H., Lin H.-Y., Fang H.-W., Loo S.-T., Hung S.-C., Ho Y.-C., Chen C.-C., Lin F.-H., Liu H.-C. Chondrogenesis from immortalized human mesenchymal stem cells: comparison between collagen gel and pellet culture methods, Artificial Organs, 2008, vol. 32(7), pp. 561-571.

36.Yamaoka H., Asato H., Ogasawara T., Nishizawa S.,Takahashi T., Nakatsuka T., Koshima I., Nakamura K., Kawaguchi H., Chung U., Takato T., Hoshi K. Cartilage tissue engineering using human auricular chondrocytes embedded in different

hydrogel materials, Journal of Biomedical Materials Research Part, 2006, vol. 78A(1), pp. 1-11.

37.Bosnakovski D., Mizuno M., Kim G., Takagi S., Okumura M., Fujinaga T. Chondrogenic Differentiation of Bovine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells (MSCs) in Different Hydrogels: Influence of Collagen Type II Extracellular Matrix on MSC Chondrogenesis, Biotechnology and Bioengineering, vol. 93 (6), 2006, pp. 1152-1163.

38.Hannouche D., Terai H., Fuchs J.R., Terada S., Zand S., Nasseri B.A., Petite H., Sedel L. Vacanti J.P., Engineering of implantable cartilaginous structures from bone marrow-derived mesenchymal stem cells, Tissue Engineering, 2007, vol. 13(1), pp. 87-99.

39. Diekman B.O., Rowland C.R., Lennon D.P., Caplan A.I., Guilak F. Chondrogenesis of Adult Stem Cells from Adipose Tissue and Bone Marrow: Induction by Growth Factors and Cartilage-Derived Matrix, Tissue Engineering, vol. 16 (2), 2010, pp. 523-533.

40. Vinardell T., Sheehy E.J., Buckley C.T., Kelly D.J. A Comparison of the Functionality and In Vivo Phenotypic Stability of Cartilaginous Tissues Engineered from Different Stem Cell Sources, Tissue Engineering, 2012, Part A, vol. 18(11-12), pp. 1161-1170.

41.Kisiday J.D., Kopesky P.W., Evans C.H., Grodzinsky A.J., Mcllwraith C.W., Frisbie D.D. Evaluation of adult equine bone marrow- and adipose-derived progenitor cell chondrogenesis in hydrogel cultures, J Of Orthopaedic Research, 2008, vol. 26(3), pp. 322-331.

42. Zhao H., Ma L., Gong Y., Gao C., Shen J. A polylactide/fibrin gel composite scaffold for cartilage tissue engineering: fabrication and an in vitro evaluation, J. Mater Sci: Mater Med, 2009, vol. 20, pp. 135-143.

43. Tigli R.S., Ghosh S., Laha M.M., Shevde N.K., Daheron L., Gimble J., Gumusderelioglu M., Kaplan D.L. Comparative chondrogenesis of human cell sources in 3D scaffolds, J. Tissue Eng Regen Med, 2009, vol. 3(5), pp. 438^160.

44. Jancar J., Slovikova A., Amler E., Krupa P., Kecova H., Planka L., Gal P., Necas A. Mechanical response of porous scaffolds for cartilage engineering, Physiol. Res., 2007, vol. 56(1), pp. 17-25.

45.Francioli S.E., Candrian C., Martin K., Hebeber M., Martin I., Barbero A. Effect of three-dimentional expantion and cell seeding density on the cartilage-forming capacity of human articular chondrocytes in type II collagen sponges, Journal of Biomedical Materials Research, 2010, vol. 95A (3), pp.924-931.

46. Chen H., Yang x., Liao Y., Zeng X., Liang P., Kang N., Tan J., Liang Z. MRI and histologic analysis of collagen type II sponge on repairing the cartilage defects of rabbit knee joints, Journal of Biomedical Materials Research, 2011, vol. 96B (2), pp. 267-275.

47. Liu J., Zhao B., Zhang Y., Lin Y., Hu P., Ye C. PHBV and predifferentiated human adipose-derived stem cells for cartilage tissue engineering, Journal of Biomedical Materials Research, 2010, vol. 94A (2), pp. 603-610.

48.Grad S., Gorna K., Gogolewski S., Alini M. Scaffolds for cartilage tissue rngineering: effect of pore size, European Cells and Materials, 2004, vol. 7(2), p. 3.

49.Nehrer S., Chiari C., Domayer S., Barkay H., Yayon A. Results of chondrocyte implantation with a fibrin-hyaluronan matrix. Clin Orthop Relat Res, 2008, 466(8), pp.1849-1855.

50. Domayer S.E., Welsch G.H., Nehrer S., Chiari C., Dorotka R., Szomolany P., Mamisch T.C., Yayon A., Trattnig S. T2 mapping and dGEMRIC after autologous chondrocyte implantation with a fibrin-based scaffold in the knee: Preliminary results, European Journal of Radiology, 2010, vol. 73(3), pp. 636-642.

51. Wise J.K., Yarin A.L., Megaridis C.M., Cho M. Chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells on oriented nanofibrous scaffolds: engineering the superficial zone of articular cartilage, Tissue Engineering, vol. 15A, 2009, pp. 913921.

52. Nam J., Rath B., Knobloch T.J., Lannutti J.J., Agarwal S. Novel electrospun scaffolds for the molecular analysis of chondrocytes under dynamic compression, Tissue Engineering, vol. 14A, 2008, pp. 1-11.

53. Shao X., Goh J.C.H., Hutmacher D.W., Lee E.H., Zigang G. Repair of large articular osteochondral defects using hybrid scaffolds and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in a rabbit model, Tissue Engineering, vol. 12 (6), 2006, pp. 1539-1551.

54. Li W.J., Danielson K.G., Alexander P.G., Tuan R.S. Biological response of chondrocytes cultured in three-dimentional nanofibrous poly(s-caprolactone) scaffolds, Journal of Biomedical Materials Research, 2003, vol. 67A (4), pp. 1105— 1114.

55.Pei M., He F., Kish V.L., Vunjak-Novakovic G. Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining, Clin Orthop Relat Res, 2008, vol. 466, pp. 1880-1889.

56. Zhao L., Detamore M.S. Chondrogenic differentiation of stem cells in human umbilical cord stroma with PGA and PLLA scaffolds, J. Biomedical Science and Engineering, 2010, vol. 3, pp. 1041-1049.

57. Stewart K., Pabbruwe M., Dickinson S., Sims Т., Hollander A.P., Chaudhuri J.B. The effect of growth factor treatment on meniscal chondrocyte proliferation and differentiation on polyglycolic acid scaffolds, Tissue Engineering, 2007, vol. 13(2), pp. 271-280.

58.Cui J.H., Park S.R., Park K., Choi B.H., Min B.H. Preconditioning of mesenchymal stem cells with low-intensity ultrasound for cartilage formation in vivo, Tissue Engineering, 2007, vol. 13(2), pp. 351-360.

59. Shin H.J., Lee C.H., Cho I.H., Kim Y., Lee Y., Kim I., Park K., Yui N., Shin J. Electrospun PLGA nanofiber scaffolds for articular cartilage reconstruction: mechanical stability, degradation and cellular responses under mechanical stimulation in vitro, J. Biomater. Sci. Polymer Edn, 2006, vol. 17(1-2), pp. 103-119.

60. Сургученко B.A. Матриксы для тканевой инженерии и гибридных органов. В книге: Биосовместимые материалы (учебное пособие). Под ред. В.И. Севастьянова и М.П. Кирпичникова. Изд-во «МИА», М., 2011 г., Часть II, глава 1, с. 199-226.

61.Штильман М.И. Биодеградация имплантатов из полимерных материалов. В книге: Биосовместимые материалы (учебное пособие). Под ред. В.И.

Севастьянова и М.П. Кирпичникова. Изд-во «МИА», М., 2011 г., Часть I, глава 5, с. 159-194.

62. Scholten P.M., Ng K.W., Joh К., Serino L.P., Warren R.F. A semi-degradable composite scaffold for articular cartilage defects, Journal of Biomedical Materials Research, 2011, vol. 97A (2), pp. 8-15.

63.Bryant S.J., Anseth K.S. Controlling the spatial distribution of ECM components in degradable PEG hydrogels for tissue engineering cartilage, Journal of Biomedical Materials Research, 2003, vol. 64A (1), pp. 70-79.

64. Chang H.-I. Wang Y. Cell responses to surface and architecture of tissue engineering scaffolds in regenerative medicine and tissue engineering - Cells and Biomaterials ed. By Daniel Eberli, 2011, pp. 569-588.

65.Singhvi R., Stephanopoulos G., Wang D.I.C. Effects of substratum morphology on cell physiology, Biotechnol. and Bioeng., 1994, Vol. 43 (8), pp. 764-771.

66. Iwasa J., Ochi M., Uchio Y., Katsube K., Adachi N., Kawasaki K. Effects of cell density on proliferation and matrix synthesis of chondrocytes embedded in atelocollagen gel, Artificial Organs, 2003, vol. 27, pp. 249-255.

67. Thevenot P., Nair A., Dey J., Yang J., Tang L. Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds, Tissue Engineering, 2008, vol. 14(4), pp. 319-331.

68. Перова H.B., Порунова Ю.В., УрьяшВ.Ф., Фаминская JI.A., Крашенинников М.Е., Расулов М.Ф., Онищенко Н.А., Севастьянов В.И., Шумаков В.А. Биодеградируемый коллагенсодержащий матрикс Сферогель™ для биоискусственных органов и тканей, Перспективные материалы, 2004, № 2, с. 52-59.

69. Williams R.J., Niederauer G.G. Articular Cartilage Resurfacing Using Synthetic Resorbable Scaffolds in book: Cartilage repair strategies, edited by Williams R.J., Humana Press, Totowa, New Jersey 2007, pp. 115-136.

70. Lu L., Zhu X., Pederson L.G., Jabbari E., Currier В., O'Driscoll S., Yaszemski M. Effects of Dynamic Fluid Pressure on Chondrocytes Cultured in Biodegradable

Poly(glycolic acid) fibrous scaffolds, Tissue Engineering, vol.11, 2005, pp. 18521859.

71. Scholten P.M., Ng K.W., Joh K., Serino L.P., Warren R.F., Torzilli P.A., Maher S.A. A semi-degradable composite scaffold for articular cartilage defects, Journal of Biomedical Materials Research, 2011, vol. 97A (1), pp. 8-15.

72.Василец B.H. Методы изготовления матриксов. В книге: Биосовместимые материалы (учебное пособие). Под ред. В.И. Севастьянова и М.П. Кирпичникова. Изд-во «МИА», М., 2011 г., Часть II, глава 2, с. 229-236.

73. Севастьянов В.И., Егорова В.А., Немец Е.А., Перова Н.В., Онищенко Н.А. Биодеградируемый биополимерный материал ЭластоТЮЬ™ для клеточной трансплантации, Перспективные материалы, 2004, № 3, с. 35-41.

74. Севастьянов В.И. Немец Е.А., ВоловаТ.Г., Марковцева М.Г. Трехмерные пористые матриксы для трансплантации клеток на основе биодеградируемого бактериального сополимера «Биопластотан». Перспективные материалы, 2007, №6, с. 5-10.

75. Пальцев М.А., Иванов А.А., Смирнов В.Н., Романов Ю.А. Стволовые клетки в современной медицине: настоящее и будущее, Молекулярная медицина, 2006, 2, с. 5-9.

76.Экспертный совет Минздрава России, Временная инструкция о порядке исследований в области клеточных технологий и их использования в учреждениях здравоохранения, разработана 18.04.2002.

77.Сергеев В. Иммуногенность эмбриональных стволовых клеток - реакция отторжения при аллогенной трансплантации, Клеточная технология, 2005, с. 5.

78.Danisovic Е., Lesny P., Havlas V., Teyssler P., Syrova Z., Kopani M., Fujerikova G., Trc Т., Sykova E., Jendelova P. Chondrogenic differentiation of human bone marrow and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, Applied Biomedicine, 2007, 5, pp. 139-150.

79. Романов Ю.А., Смирнов B.H. Мезенхимальные стволовые клетки: биология и перспективы клинического применения, в книге: Биология стволовых клеток и

клеточные технологии (учебное пособие), под редакцией Пальцева М.А., изд-во «Медицина», «Шик», М., 2009, том 1, глава 9, с. 193-206.

80. Мусина Р.А., Бекчанова Е.С., Белявский А.В., Сухих Г.Т. Дифференцировочный потенциал мезенхимальных стволовых клеток разного происхождения, Клеточные технологии в биологии и медицине, 2006, 1, с. 3943.

81.Паюшина О.В., Старостин В.И., Хрущов Н.Г. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки: характеристика, потенции к дифференцировке и перспективы клинического использования, в книге: Биология стволовых клеток и клеточные технологии (учебное пособие), под редакцией Пальцева М.А., изд-во «Медицина», «Шик», М., 2009, том 2, глава 5, с. 100-124.

82. Zuk P.A., Zhu М., Ashjian P., De Ugarte D.A., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrik M.H. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells, Molecular Biology of the Cell, 2002, 13, pp. 4279-4295.

83.Gimble J.M., Guilak F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential, Cytotherapy, 2003, 5(5), pp. 362-369.

84.Gronthos S., Brahim J., Li W., Fisher L.W., Cherman N., Boyde A., DenBesten P., Gehron Robey P., Shi S. Stem Cell Properties of Human Dental Pulp Stem Cells, J. Dent. Res., 2002, 81(8), pp. 531-535.

85. Lee O.K., Kuo Т.К., Chen W., Lee K., Hsieh S., Chen T. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood, Blood, 2004, vol. 103(5), pp.1669-1675.

86. Goodwin H.S., Bicknese A.R., Chien S-N., Bogucki B.D., Oliver D.A., Quinn C.O., Wall D.A. Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood: expression of bone, fat, and neural markers, Biology of Blood and Marrow Transplantation, 2001, 7, pp. 581-588.

87. Ariffin S.H.Z., Abidin I.Z.Z., Yazid M.D., Wahab R.M.A. Differentiation analyses of adult suspension mononucleated peripheral blood cells of Mus musculus, Cell Communication and Signaling, 2010, vol. 8(29), pp. 1-7.

88. Miao Z., Jin J., Chen L., Zhu J., Huang W., Zhao J., Qian H., Zhang X. Isolation of mesenchymal stem cells from human placenta: Comparison with human bone marrow mesenchymal stem cells, Cell Biology International, 2006, 30, pp. 681-687.

89. Kern S., Eichler H., Stoeve J., Kliiter H., Bieback K. Comparative Analysis of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Umbilical Cord Blood, or Adipose Tissue, Stem Cells 2006, 24, pp. 1294-1301.

90. Wexler S.A., Donaldson C., Denning-Kendall P., Rice C., Bradley B., Hows J.M. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal 'stem' cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not, British Journal of Haematology, 2003, 121, pp. 368-374.

91.Kogler G., Sarnowski A., Warnet P. Volume reduction of cord blood by Hetarstarch for long-term stem cell banking, Bone Marrow Transpl., 1998, 22 Suppl 1: S 14-5.

92.0gawa R. The Importance of Adipose-Derived Stem Cells and Vascularized Tissue Regeneration in the Field of Tissue Transplantation, Current Stem Cell Research & Therapy, 2006, 1, pp. 13-20.

93.De Ugarte D.A., Alfonso Z., Zuk P.A., Elbarbary A., Zhu M., Ashjian P., Benhaim P., Hedrick M.H., Fraser J.K. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow, Immunology Letters, 2003, 89, pp. 267-270.

94. Gronthos S., Franklin D.M., Leddy H.A., Robey P.G., Storms R.W., Gimble J.M. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells, Journal of cellular physiology, 2001, 189, pp. 54-63.

95. Lei L., WeiMing L., PuYi S., Ming F., AiShan H., Gang H. Biological character of human adipose-derived adult stem cells and influence of donor age on cell replication in culture, Science in China Series C: Life Sciences, June 2007, 3 (50), pp. 320-328.

96. Katz A.J., Tholpady A., Tholpady S.S., Shang H., Ogle R.C. Cell Surface and Transcriptional Characterization of Human Adipose-Derived Adherent Stromal (hADAS) Cells, Stem Cells, 2005, 23, pp. 412-423.

97. Mitchell J.B., Mcintosh K., Zvonic S., Garrett S., Floyd Z.E., Kloster A., Halvorsen Y.D., Storms R.W., Goh B., Kilroy G., Wu X., Gimble J.M. Immunophenotype of

Human Adipose-Derived Cells: Temporal Changes in Stromal-Associated and Stem Cell-Associated Markers, Stem Cells, 2006, 24, pp. 376-385.

98.Dominici M., Le Blank K., Mueller I, Slaper-Cortenbach I., Marini F., Krause D., Deans R., Keating A., Prockop Dj., Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells, The International Society for Cellular Therapy position statement, Cytotherapy, 2006, vol.8(4), 315-317.

99. Lee R.H., Kim B.C., Choi I.S., Kim H., Choi H.S., Suh K.T., Bae Y.C., Jung J.S. Characterization and Expression Analysis of Mesenchymal Stem Cells from Human Bone Marrow and Adipose Tissue, Cell Physiol Biochem, 2004, 14, pp. 311-324.

100. Киселева E.B., Васильев A.B. Мультипотентные клетки стромы жировой ткани, в книге: Биология стволовых клеток и клеточные технологии (учебное пособие), под редакцией Пальцева М.А., изд-во «Медицина», «Шик», М., 2009, том 2, глава 6, с. 124-162.

101. Strem В.М., Hicok С.К., Zhu М., Wulur I., Alfonso Z., Schreiber R.E., Fraser J.K., Hedrick M.H. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells, Keio J. Med., 2005, vol. 54(3), pp. 132-141.

102. Mizuno H., Hyakusoku H. Mesengenic potential and future clinical perspective of human processed lipoaspirate cells, Nippon Med. Sch., 2003, 70(4), pp. 300-306.

103. Hauner H., Entenmann G., Wabitsch M., Gaillard D., Ailhaud G., Negrel R., Pfeiffer E.F. Promoting Effect of Glucocorticoids on the Differentiation of Human Adipocyte Precursor Cells Cultured in a Chemically Defined Medium, The American Society for Clinical Investigation, Inc., 1989, 84, pp. 1663-1670.

104. Hausman G.J. The influence of insulin, triiodothyronine (T3) and insulin-like growth factor-1 (IGF-1) on the differentiation of preadipocytes in serum-free cultures of pig stromal-vascular cells, Sci., 1989, 67, pp. 3136-3143.

105. Hashemibeni В., Razavi Sh., Esfandiary E., Karbasi S., Mardani M., Nasresfanani M. Induction of chondrogenic differentiation of human adipose-derived stem cells with TGF-J33 in pellet culture system, Iranian Journal of Basic Medical Sciences, 2008, vol. 11(1), pp.10-17.

106. Xu Y., Balooch G., Chiou M., Bekerman E., Ritchie R.O., Longaker M.T. Analysis of the material properties of early chondrogenic differentiated adipose-derived stromal cells (ASC) using an in vitro three-dimensional micromass culture system, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, 359, pp. 311-316.

107. Boeuf S., Richter W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors, Stem Cell Research & Therapy, 2010, vol. 1(31), pp. 110.

108. Karlsson C., Brantsing C., Svensson Т., Brisby H., Asp J., Tallheden Т., Lindahl A. Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells and Articular Chondrocytes: Analysis of Chondrogenic Potential and Expression Pattern of Differentiation-Related Transcription Factors, Journal of Orthopaedic Research, 2007, vol. 25(2), pp. 152-163.

109. Савченко И.П., Кордикова C.B. патент № 2354693, 2009.

110. Пальцев М.А., Терских В.В., Васильев А.В. Что есть стволовая клетка, в книге: Биология стволовых клеток и клеточные технологии (учебное пособие), под редакцией Пальцева М.А., изд-во «Медицина», «Шик», М., 2009, том 1, глава 1, с. 13-31.

111. Merceron С., Portron S., Masson М., Lesoeur J., Fellah B.H., Gauthier О., Geffroy О., Weiss P., Guicheux J., Vinatier C. The effect of two- and three-dimensional cell culture on the chondrogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stem cells after subcutaneous transplantation with an injectable hydrogel, Cell Transplant, 2011, vol. 20(10), pp.1575-1588.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АХ - аутологичные хондроциты

БГГ - биополимерный гетерогенный гидрогель

ВКМ - внеклеточный матрикс

ГАГ - гликозаминогликан

ГП - гликопротеин

ЖТч - жировая ткань человека

КИК - клеточно-инженерная конструкция

МСК - мезенхимальные стромальные клетки

ОСП - органо-соматический показатель

ПГ - протеогликан

ПГА - протеогликановый агрегат

ПК - пуповинная кровь

PC - ростовая среда

СК - стволовые клетки

ТИК - тканеинженерная конструкция

ФБ - фосфатный буфер

ФИТС - флюоресцеинизотиоционат

ФЭ - фикоэритрин

ХП - хондропротекторы

XT - хрящевая ткань

ЩФ - щелочная фосфатаза

ЭСК - смбриональные стволовые клетки

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

ЭП - эндопротезирование

BMP - bone morphogenetic protein, костный морфогенетический белок CD - cluster of differentiation, кластер дифференцирови DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium, минимальная среда игла в модификации Дюльбекко

GMP - good manufacturing practice, надлежащая практика производства HCT - hematocrit, гематокрит HGB - Hb, hemoglobin, гемоглобин

IGF - insulin-like growth factor, инсулиноподобный фактор роста

LYM - lymphocyte, лимфоциты

MID - middle lymphocyte, средние лимфоциты

PLT - platelets , кровяные пластинки, тромбоциты

RBC - red blood cells, красные кровяные тельца, эритроциты

TGF-P - transforming growth factor p, трансформирующий ростовой фактор (3

WBC - white blood cells, белые кровяные тельца, лейкоциты