Разработка и апробация метода гибридизации на гидрогелевых биочипах для анализа MLL-транслокаций и SNP в геноме человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Митяева, Ольга Николаевна

• Митяева, Ольга Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Митяева, Ольга Николаевна

Список сокращений.

Введение.

Цель и задачи исследования.

Глава II. 2. Обзор Литературы.

1.1. Биочипы: история создания, типы, применение.

1.1.1 Основные этапы развития методов основанных на гибридизации нуклеиновых кислот.

1.1.2 Биологические микрочипы на основе трехмерных ячеек геля.

1.1.3 Применение гелевых биочипов в биологии и медицине.

1.2 Классификация мутаций.

1.3 Хромосомные транслокации при лейкозах.

1.3.1 Классификация лейкозов.

1.3.2 Хромосомные аберрации при лейкозах.

1.3.3 Транслокации с участием гена MLL.

1.3.4 Методы генодиагностики лейкозов.

1.4 Молекулярно-генетический анализ в судебно-медицинской экспертизе.

1.4.1 История применения молекулярно-генетических методов в судебно-медицинской экспертизе.

1.4.2 SNP - мишень для молекулярно-генетического анализа в судебно-медицинской экспертизе.

1.4.3 Ген ABO.

1.4.4 Ген HLA-DQA1.

1.4.5 Ген AMELXY.

1.4.6. Оценка идентификационной информативности локуса.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1 Источники генетического материала.

2.2 Общая схема проведения анализа.

2.3 Экстракция тотальной РНК из лимфоцитов костного мозга.

2.4 Экстракция геномной ДНК из слюны.

2.5 Аллель-специфичная ПЦР для генотипирования локуса HLA-DQA1.

2.6 Проведение полимеразной цепной реакции.

2.6.1 ОТ-ПЦР для анализа MZ-транслокаций.

2.6.2 ПЦР для идентификации личности.

2.7 Синтез олигонуклеотидов для иммобилизации в гелевых ячейках микрочипа.

2.8 Изготовление микрочипов.

2.8.1 Последовательности иммобилизованных олигонуклеотидов и схема МХ-Биочипа.

2.8.2 Последовательность иммобилизованных олигонуклеотидов и схема ИЛ-Биочипа.

2.9 Визуализация ПЦР продуктов в агарозном геле.

2.10 Гибридизация на олигонуклеотидном биочипе.

2.11 Регистрация изображения и обработка результата.

2.12 Статистическая обработка данных.

Глава III. 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Анализ транслокаций (MZ-Биочип).

3.1.1. Выбор транслокаций с участием гена

3.1.2. Выбор последовательностей праймеров для мультиплексной ПЦР и олигонуклеотидных зондов. Конструирование и принцип работы МХ-Биочипа.

3.1.3. Разработка процедуры анализа транслокаций.

3.1.4 Алгоритм анализа гибридизационной картины, используемый в программном обеспечении "ImageWare".

3.1.5. Частоты встречаемости анализируемых транслокаций при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) и остром нелимфобластном лейкозе (ОНЛЛ).

3.1 .б.Новое место перестройки t(l 1;19) MLL/ELL.

3.1.7. Особенности анализа dup(l 1).

3.1.8. Отличительные особенности метода гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе.

3.2. Биочип для идентификации личности (ИЛ-Биочип).

3.2.1. Выбор локусов.

3.2.2. Конструирование и принцип работы биочипа.

3.2.3. Алгоритм анализа гибридизационной картины, используемый в программном обеспечении "ImageWare".

3.2.4. Отработка протокола анализа.

3.2.5 Тестирование на модельных объектах.

3.2.6. Генотипирование коллекции ДНК.

3.2.6.1 Соответствие молекулярно-генетического анализа группы крови с серологическим.

3.2.6.2. Основные параметры информативности локусов HLA-DQA1 и ABO для популяции славян.

3.2.7 Сравнение предлагаемого метода с другими методами, используемыми для идентификации личности.

3.2.8 Область применения разработанного ИЛ-Биочипа.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и апробация метода гибридизации на гидрогелевых биочипах для анализа MLL-транслокаций и SNP в геноме человека»

Сегодня все чаще в различных областях медицины используются данные о геноме конкретного человека. Это анализ мутаций при диагностике наследственных заболеваний, исследование изменений в геноме при уточнении диагноза и назначении терапии при онкологических заболеваниях. Также зарождается новое направление в медицине - предиктивная медицина, которая изучает генетическую предрасположенность индивида к различным заболеваниям и пытается свести к минимуму шансы возникновения заболевания или снизить тяжесть протекания болезни путем корректировки образа жизни и ранней диагностики. Широкое использование молекулярно-генетических методов в практике невозможно без создания новых технологий, позволяющих проводить одновременный анализ множества генетических изменений. Одним из наиболее перспективных подходов на сегодняшний день является сочетание мультиплексной ПЦР с гибридизацией на олигонуклеотидной матрице или биологическом микрочипе (биочипе).

В работе предложены два биочипа: биочип для анализа ряда хромосомных транслокаций при лейкозах у детей и биочип для идентификации личности, позволяющий анализировать набор однонуклеотидных полиморфизмов (SNP - single nucleotide polymorphism).

Необходимость анализа транслокаций при лейкозах связана с тем, что это заболевание занимает ведущее место среди онкологических заболеваний у детей. Всего лишь 20 лет назад выживаемость при детских лейкозах составляла 5-10%, тогда как в настоящее время она составляет 60-80% (по данным 5-летней оценки). Такой успех в лечении был достигнут благодаря использованию наиболее эффективных комбинаций различных цитостатических препаратов, а так же рационализации терапии, основанной на углубленной диагностике заболевания, в том числе и с использованием молекулярно-генетических методов. (Алейникова О.В. и др., 2002)

Ранее в Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН был разработан ЛК-Биочип, который позволяет анализировать 8 наиболее часто встречающихся при лейкозах транслокаций: t(9;22) BCR/ABL р190 и р210, t(4;l 1) MLL/AF4, t(12;21 )TEL/AML, t(l;19) E2A/PBX, t(15;17) PML/RARA, t(8;21) AML/ETO, invlö CBFB/MYH. Хотя эти транслокации и являются наиболее частыми, они не охватывают весь спектр транслокаций, которые необходимо выявлять при постановке точного диагноза и назначении терапии. Поэтому, первая часть диссертационной работы посвящена созданию биочипа, предназначенного для анализа дополнительных семи транслокаций, в которых участвует ген MLL (Myeloid or Lymphoid Leukemia). Эта группа транслокаций особенно важна для больных лейкозом детей младше года, так как MLL-транслокации в этих случаях наблюдаются в 50%-80%, в зависимости от типа лейкоза и, кроме этого, тяжесть заболевания тесно связана с тем, какая именно MIZ-транслокация присутствует в клетках пораженного костного мозга.

Биочип для идентификации личности предназначен для другой области современной медицины - судебно-медицинской экспертизы. К сожалению, довольно часто встает задача идентификации личности, это не только поиск преступника, оставившего следы на месте преступления, но и опознание тел погибших при природных или техногенных катастрофах, при террористических актах. В настоящее время основными методами анализа при идентификации личности остаются серологический анализ крови, и молекулярно-генетический анализ полиморфных локусов генома, известных как тандемные повторы с изменяющимся числом копий, в частности микросателлитов или STR (shot tandem repeats). Однако серологический анализ часто не эффективен при исследовании малых количеств биологических следов, а также деградированных образцов. В этих случаях достаточно эффективен STR-анализ, однако он не дает фенотипической информации и требует дорогостоящего импортного оборудования. Нами предложен альтернативный подход на основе метода гибридизации на олигонуклеотидном биочипе, который не требует дорогостоящего импортного оборудования, обладает высокой специфичностью и чувствительностью, позволяет получать такие фенотипические данные об индивиде, как группа крови и половая принадлежность.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы являлось исследование возможности использования метода гибридизации на олигонуклеотидных биочипах для анализа хромосомных транслокаций с участием гена МЫ при лейкозах и для анализа БМ* при молекулярно-генетической идентификации личности. Достижение этой цели предусматривало решение следующих задач:

1. Исследовать частоты МХ-транслокаций при лейкозах у детей с целью оценки необходимости создания тест-системы для клинической диагностики.

2. Выбрать наиболее часто встречающиеся при лейкозах у детей транслокации с участием гена МЫ и разработать олигонуклеотидный микрочип для их диагностики. Определить чувствительность метода.

3. Разработать олигонуклеотидный микрочип для судебно-медицинской генетической экспертизы. Определить чувствительность метода.

4. Оценить принципиальную возможность использования предложенного метода в судебно-медицинской практике при работе с малыми количествами ДНК.

5. Определить идентификационную информативность локусов, анализируемых с помощью разработанного микрочипа для идентификации личности в популяции славян.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Митяева, Ольга Николаевна

Выводы.

1. Определены частоты встречаемости МП-транслокаций при различных типах лейкозов. Они составили: при остром лимфобластном лейкозе у детей от 0 до года - 46%, от года до трех лет - 9%; при остром нелимфобластном лейкозе у детей старше года

8%. Таким образом, MZZ-транслокации являются распространенным диагностическим маркером при лейкозах у детей.

2. Разработан олигонуклеотидный биочип для анализа хромосомных транслокаций с участием гена МП. Чувствительность - 1 клетка с транслокацией на 103-104 здоровых клеток, что позволяет отслеживать эффективность терапии.

3. Сконструирован олигонуклеотидный микрочип для анализа 9 аллелей гена HLA-DQA1, 5 аллелей ABO, 2 аллелей гена AMEL. Чувствительность метода составила около 100 пкг ДНК на анализ.

4. На 3 модельных объектах показана принципиальная возможность использования предложенного метода в судебно-медицинской практике.

5. Определена идентификационная информативность локусов HLA-DQA1 и ABO для популяции славян. Было получено, что информативность 3 данных локусов близка к информативности 8 STR-локусов, анализируемых методом полиморфизма длин амплифицированных фрагментов, и используемых в коммерческом наборе PowerPlex (Promega).

Заключение.

В современной медицине все чаще требуется знание о генетических особенностях человека. Это и выявление мутаций при наследственных заболеваниях, и исследование генетических изменений в опухолях для постановки диагноза и назначении терапии при онкологических заболеваниях.

Однако такие молекулярно-генетические исследования требуют новых методов исследования, которые позволили бы надежно и быстро анализировать одновременно большое количество генетических маркеров.

Один из таких методов был предложен в данной работе для анализа ряда хромосомных транслокаций при лейкозе и для идентификации личности путем анализа набора SNP.

В первой части работы описан биочип для анализа семи MLL-транслокаций, а также показано, что предложенный метод анализа обладает достаточной чувствительностью для использования его в клинической практике для отслеживания минимальной остаточной болезни.

Во второй части работы исследована возможность использования биочипов при молекулярно-генетической идентификации личности. Был определен порог чувствительности предлагаемого метода, который составил 100 пкг на анализ, также на модельных образцах показана принципиальная возможность использования предложенного метода в судебно-медицинской практике.

Кроме этого определена идентификационная информативность локусов, анализируемых на предложенном биочипе. Мы получили, что при анализе SNP в трех локусах - HLA-DQA1, ABO, AMEL - вероятность случайного совпадения генотипов составляет 0,46%, что является слишком большой величиной для доказательства причастности индивида к преступлению, однако, позволяет значительно сузить круг подозреваемых. Вероятность случайного совпадения может быть существенно понижена путем расширения набора анализируемых локусов, причем к существенному усложнению методики это не приведет.

Таким образом, была показана возможность использования предложенного метода на практике, как в диагностике лейкозов для анализа хромосомных транслокаций, так и в судебно-медицинской экспертизе для идентификации личности.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Митяева, Ольга Николаевна, 2007 год

1. Алейникова О.В., Сыцкевич О.Н., Потапнев М.П. Современные методы диагностики острых лейкозов у детей и взрослых (методические рекомендации) // Минск. 2000.

2. Алейникова О.В., Потапнев М.П., Углова Т.А. Стратификация групп риска у детей с острым лимфобластным лейкозом. Методические рекомендации. Минск. 2001.

3. Вуд М.Э., Банн П.А. Секреты гематологии и онкологии // Москва. Бином. 1997.

4. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний // Специальная литература. СПб. 1997.

5. Гра O.A., Глотов A.C., Кожекбаева Ж.М., Макарова О.В., Самочатова Е.В., Заседателев A.C., Наседкина Т.В. Опыт использования биочипов для анализа полиморфных вариантов гена CYP1 Al при лейкозах у детей // Медицинская генетика.2006. В. 4. Стр. 34-38.

6. Под редакцией Иванова В,И., Киселева Л.Л. Геномика -медицине // ИКЦ «Академкнига». Москва. 2005.

7. Иванов П.JI. Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфозма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства // Суд. Мед. Эксп. 1999. В 4. Стр. 35-41.

8. Иванов П.Л. Индивидуализация человека и идентификация личности: молекулярная биология в судебной экспертизе // Вестник Российской Академии Наук. 2003. Т 73. В. 12. Стр. 10851097.

9. Колчинский A.M., Грядунов Д.А., Лысов Ю.П., Михайлович В.М., Наседкина Т.В., Турыгин А.Ю., Рубина А.Ю., Барский В.Е., Заседателев A.C. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы // Молекулярная биология. 2004. Т. 38. Стр. 5-16.

10. Мирзабеков А.Д. Биочипы в биологии и медицине XXI века. Выступление на научной сессии общего собрания РАН // Вестник Российской Академии Наук. 2003.Т. 73 В. 5. Стр. 412 .

11. Лысов Ю., Флорентьев В., Хорлин А., Храпко К., Шик В., Мирзабеков А. Определение нуклеотидной последовательности ДНК гибридизацией с олигонуклеотидами. Новый метод // Докл. Акад. Наук СССР. 1988. Т. 303. Стр. 1508-1511.

12. Пименов М.Г., Культин А.Ю., Кондрашов С.А. Научные и практические аспекты криминалистического ДНК-анализа: Учебное пособие. // ГУ ЭКЦ МВД России. Москва. 2001.

13. Сергеев А.Г., Иванов Р.А. Генодиагностика лейкозов. Пособие для врачей // Екатеринбург. 1998.

14. Хедрик Ф. Генетика популяций // Техносфера. Москва. 2003.

15. Под ред. Херрингтона С., Магки Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. //Мир. Москва. 1999.

16. Шик В.В., Лебедь Ю.Б., Крюков Г.В. Идентификация аллелей HLA-DQA1 методом гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами // Мол. Биол. Гена. 1998. Т32. В.5. Стр. 813-822.

17. An Atlas on Chromosomes in Hematological Malignancies. Example: 1 lq23 and MIL partners // Leukemia. 2001. V. 15. P. 987-999.

18. Akane A, Shiono H, Matsubara K, Nakahori Y, Seki S, Nagafuchi S, Yamada M, Nakagome Y. Sex identification of forensic specimens by polymerase chain reaction (PCR): two alternative methods // Forensic Sci Int. 1991. V49(l). P. 81-88.

19. Auton PM. and Cleary ML. Molecular mechanisms of leukemogenesis mediated by MLL fusion proteins // Oncogene. 2001. V. 20. P. 5695-5707.

20. Biondi A, Cimino G, Pieters R, Ching-Hon Pui. Biological and therapeutic aspects of infant leukemia // Blood. 2000. V. 96(1). P. 2433.

21. Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW. Construction of a Genetic Linkage Map in Man Using Restriction Fragment Length Polymorohisms // Am J Hum Genet. 1980. V. 32. P. 314-331.

22. Brenner C, Morris J. Paternity index calculations in single locus hypervariable DNA probes: validation and other studies // In

23. Proceedings for the International Symposium on Human Identification 1989. P. 21-53.

24. Dupont M., Goldsborough A., Levayer T., J. Savare et. al. Multiplex Fluorescent RT-PCR to Quantify Leukemic Fusion Transcripts // BioTechnicues. 2002. V. 33. P. 158-164.

25. Carey L., Mitnik L. Trends in DNA forensic analysis.// Electrophoresis. 2002. V. 23. P. 1386-1397.

26. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal.Biochem. 1987. V. 162. P. 156-159.

27. Clark J., Smith F., Arceci J. Update in childhood acute myeloid leukemia: recent developments in the molecular basis of disease and novel therapies // Current Opinion in Hematology. 2003. V. 10. P. 31-39.

28. D.O. Fesenko, T.V. Nasedkina, D.V. Prokopenko, A.D. Mirzabekov. Biosensing and monitoring of cell populations using the hydrogel bacterial microchip // Biosensors and Bioelectronics. 2005. V. 20. P. 1860-1865.

29. Frudakis T, Thomas M, Gaskin Z, Venkateswarlu K, Chandra KS, Ginjupalli S, Gunturi S, Natrajan S, Ponnuswamy V, Ponnuswamy K.

30. Sequences associated with human iris pigmentation // Genetics. 2003. V. 165(4). P. 2071-2083.

31. Frudakis T, Venkateswarlu K, Thomas M, Gaskin Z, Ginjupalli S, Gunturi S, Ponnuswamy V, Natarajan S, Nachimuthu P. A classifier for the SNP-based inference of ancestry // J Forensic Sei. 2003. V. 48(4). P.771-782.

32. Jeffreys AJ., Wilson V., Thein S.L. Individual-specific "fingerprints" of human DNA // Nature. 1985. V. 316. P.76

33. M. Jungerman. Proceedings of 12th International Histocompatibility // Workshop. 1996. V. 2. P. 194.

34. Hashimoto M, Kinoshita T, Yamasaki M, Tanaka H, Imanishi T, Ihara H, Ichikawa Y, Fukunishi T. Gene frequencies and haplotypic associations within the HLA region in 916 unrelated Japanese individuals//Tissue Antigens. 1994.V. 44(3). P. 166-73.

35. Henegariu, N.A. Heerema, S.R. Dlouhy, G.H. Vance and P.H. Vogt. "Multiplex PCR: Critical Parameters and Step-by-step Protocol" // BioTechniques. 1997. V. 23(3). P. 504-511.

36. Hoyer B, McCartny B, Bolton E. Complementary RNA in nucleus and cytoplasm of mouse liver cells // Science. 1963. V. 140. P.1408-12.

37. Gill P. An assessment of the utility of single nucleotide polymorphisms (SNPs) for forensic purposes // Int J Legal Med. 2001. V. 114. P. 204-210.

38. Gill P., Jeffreys AJ., Werrett D.J. Forensic application of DNA "Fingerprints"//Nature. 1985. V.318. P.577.

39. Greaves M. Childhood leukaemia // BMJ. 2002. V. 324(7332). P. 283-287.

40. Greene SR, Yuan ZA, Wright JT, Amjad H, Abrams WR, Buchanan JA, Trachtenberg DI, Gibson CW. A new frameshift mutationencoding a truncated amelogenin leads to X-linked amelogenesis imperfecta //Arch Oral Biol. 2002. V. 47(3). P. 211-217.

41. Griffin TJ, Smith LM. Genetic identification by mass spectrometric analysis of single-nucleotide polymorphisms: ternary encoding of genotypes // Anal Chem. 2000. V.15. V.72(14). P. 3298-3302.

42. Gu Y., Nakamura T., Alder H. et. al. The t(4;l 1) Chromosome Translocation of Human Acute Leukemias Fuses the ALL-1 Gene, Related to Drosophila trithorax, to the AF-4 Gene // Cell. 1992. V. 71. P. 701-708.

43. Lander E. Array of hope // Nat Genet. 1999. V. 21. P. 3-4.

44. Mitani K., Kanada Y., Ogawa S., Tanaka T., Inazawa J., Yazaki Y., Hirai H. Cloning of several species of MLL/MEN chimeric cDNA inmyeloid leukemia with t( 11 ; 19)(q23;p 13.1 ) translocation // Blood. 1995. V. 85. P. 2017-2024.

45. Moradian-Oldak J, Bouropoulos N, Wang L, Gharakhanian N. Analysis of self-assembly and apatite binding properties of amelogenin proteins lacking the hydrophilic C-terminal // Matrix Biol. 2002. V. 21(2). P. 197-205.

46. Pardue ML, Gall JG. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations // PNAS. 1969. V.64(2). P.600-604.

47. Rajalingam R., Ge P., Reed E.F. A sequencing-Based Typing Method for HLA-DQA1 Alleles // Human Immunology. 2004. V. 65. P. 373379.

48. Rubnitz J.E., Raimondi S.C., Tong X., Srivastava D.K., Razzouk B.I., Shurtleff S.A., Downing J.R., Pui C.H., Ribeiro R.C., Behm F.G. Favorable impact of the t(9;l 1) in childhood acute myeloid leukemia //J Clin Oncol. 2002. V. 20. P. 2302-2309.

49. Sambrook J., Fritsch EP., Maniatis. Molecular cloning: a Laboratory Coldspring Harbour Lab. Coldspring Harbour. NY. 1989.

50. Satake N, Maseki N, Nishiyama M, Kobayashi H, Sakurai M, Inaba H, Katano N, Horikoshi Y, Eguchi H, Miyake M, Seto M, Kaneko Y. Chromosome abnormalities and MLL rearrangements in acute myeloid leukemia of infants //Leukemia. 1999. V.13(7). P. 10131017.

51. Schildkraut CL, Marmur J, Doty P. The formation of hybrid DNA molecules and their use in studies of DNA homologies // J Mol Biol. 1961. V.3.P. 595-617.

52. Schnittger S, Wormann B., Hiddemann W., Griesinger F.Partial tandem duplications of the MLL gene are detectable in peripheral blood and bone marrow of nearly all healthy donors // Blood. 1998. V. 92. P. 1728-1734.

53. Seltsam A., Hallensleben M., Kollmann A., Blasczyk R. Tne nature of diversity and diversification at the ABO locus // Blood. 2003. V. 102. P. 3035-3042.

54. Seltsam A., Gupta C., Wagner F., Blasczyk R. Nondeletional AB0*0 alleles express weak blood group A phenotypes // Transfusion. 2005. V. 45. P. 359-365.

55. Stephen P. Hunger and Micaael L. Cleary. What Significance Should We Attribute to the Detection of MLL Fusion Transcripts? // Blood. 1998. V. 92(3 ). P. 709-711.

56. So CW and Cleary ML. Common mechanism for oncogenic activation of MLL by forkhead family proteins // Blood. 2003. V. 101(2). P. 633-639.

57. Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J Mol Biol. 1975. V. 98(3). P. 503517.

58. Stephen P. Hunger and Micaael L. Cleary. What Significance Should We Attribute to the Detection of MLL Fusion Transcripts? // Blood. 1998. V. 92(3). P. 709-711.

59. Thirman M., Levitan D., Kobayashi H., Simon M., Rowley J. Cloning of ELL, a gene that fuses to MLL in a t(l I;19)(q23;pl3.1) in acute myeloid leukemia//PNAS. 1994. V. 91. P.12110-12114.

60. Walsh SJ. Recent advances in forensic genetics.// Expert Rev Mol Diagn. 2004. V. 4(1). P. 31-40.

61. Yamamoto F., Clausen H., White T., Marken J., Hakamori S. Molecular genetic basis of the histo-blood group system // Nature. 1990. V. 345. P. 229-233.

62. Ye J, Parra EJ, Sosnoski DM, Hiester K, Underhill PA, Shriver MD. Melting curve SNP (McSNP) genotyping: a useful approach for diallelic genotyping in forensic science // J Forensic Sci. 2002 V. 47(3). P. 593-600.

63. Yip SP. Single-tube multiplex PCR-SSCP analysis distinguishes 7 common ABOalleles and readily identifies new alleles // Blood. 2000. V. 95. P. 1487-1492.

64. Благодарю д.б.н., профессора В.В. Носикова, д.б.н., профессора П. Л. Иванова, Р.Я. Якшимбетова за предоставленные образцы ДНК.

65. Также благодарю Ольгу Гра, Ольгу Макарову и к.б.н. Жанну Кожекбаеву за помощь в сборе образцов слюны для проведения исследований.