Разработка экспресс-тестов для оценки ранних реакций клеточного иммунитета тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, кандидат биологических наук Кожушный, Андрей Петрович

• Кожушный, Андрей Петрович
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кожушный, Андрей Петрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 Клеточный иммунитет: виды и значение при вирусных инфекциях.

1.1 Врожденный и адаптивный клеточный иммунитет.

1.2 Общая характеристика иммунных ответов на антигены ВГВ.

1.3 Роль активации клеток и нарушения баланса цитокинов в патогенезе ВИЧ-инфекции.

2 Клеточный иммунитет: методы исследования.

2.1 Общая характеристика методов исследования клеточного иммунитета.

2.2 Автоматизация методов ПММ/РТМЛ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3 Материалы.

3.1 Контингент обследуемых лиц.

3.2 Антигены.

3.3 Используемые тест-системы.

3.4 Дополнительные реагенты.

4 Методы исследования.

4.1 Функциональные клеточные тесты для определения продукции цитокинов и экспрессии маркеров активации клеток in vitro.

4.2 База данных и статистические методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

5 Разработка экспресс-тестов in vitro для выявления ранних реакций клеточного иммунитета.

5.1 Алгоритм и методика тестирования реакций в уплотненных микрокультурах (УМК) и разреженных микрокультурах (РМК) лейкоцитов периферической крови человека (ЛПКЧ).

5.2 Кинетика развития антиген/митоген-сттимулированной и спонтанной продукции цитокинов в уплотненных и разреженных микрокультурах клеток

5.3 Антиген-/митоген-стимулированная продукция цитокинов на разные виды антигенов после 18 часовой инкубации (в контрольной группе).

6 Исследование клеточной миграции в уплотненных микрокультурах клеток (УМК) в разных группах.

6.1 Подбор концентраций и кинетика развития реакции клеточной миграции на разные антигены.

6.2 Оценка специфического клеточного иммунитета при вакцинации против гепатита В.

6.3 Ранние реакции клеточного иммунитета у носителей HBsAg.

6.4 Параметры клеточной миграции в группах риска и у больных вирусными инфекциями (ВГВ и ВИЧ).

7 Мониторинг параметров клеточного иммунитета у лиц, вакцинированных против гепатита В и при вирусных патологиях (ВГВ и ВИЧ).

7.1 Мониторинг ранней HBsAg-стимулированной продукции цитокинов при вакцинации против гепатита В.

7.2 Мониторинг параметров клеточного иммунитета у лиц с патологиями печени и ВИЧ-инфицированных лиц.

7.3 Результаты исследований клеточного иммунитета в группах риска и у больных вирусными инфекциями (ВГВ и ВИЧ).

ОБСУЖДЕНИЕ.

8 Методология уплотненных и разреженных микрокультур клеток (УМК и РМК).

9 Параметры врожденного иммунитета при ВГВ инфицировании определяемые в УМК и РМК.

10 Исследование реакций клеточного иммунитета при вакцинации против ВГВ.

11 Исследование реакций клеточного иммунитета при вирусных гепатитах и ВИЧ-инфекции.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка экспресс-тестов для оценки ранних реакций клеточного иммунитета»

Актуальность проблемы

В последние годы в России и за рубежом наблюдается рост заболеваемости многими инфекционными заболеваниями (вирусные гепатиты, ВИЧ, туберкулез и др.)* Полноценный контроль за течением инфекционного заболевания, мониторинг эффективности проводимой терапии (2, 33, 73, 74), оценка напряженности специфического клеточного иммунитета, индуцированного вакцинами, невозможны без надежных и доступных для клинической лаборатории тестов, позволяющих оценить функциональное состояние иммунной системы человека. Функциональные клеточные тесты важны для диагностики вирусных и бактериальных инфекций (117, 96, 97). Эти тесты широко применяются и для изучения активности врожденного клеточного иммунитета, механизмов его инструктивного (поляризующего) влияния на развитие адаптивного иммунитета (104, 115).

В настоящее время активно разрабатываются функциональные тесты для оценки состояния клеточного иммунитета in vitro, позволяющие определять уровень клеточных реакций на антигены или лиганды разной природы. Разработаны такие перспективные современные тесты для оценки функциональной активности клеток иммунной системы как ELISPOT, проточная цитофлуориметрия и ИФА для определения цитокинов (61, 64, 81). Однако внедрению этих и других клеточных тестов в широкую клиническую и научно-исследовательскую практику препятствуют их недостатки: трудоемкость, низкая воспроизводимость, сложность применения в условиях клинической лаборатории, высокая стоимость анализа (76, 77).

Практически неизученными остаются ранние антиген-стимулированные реакции врожденного клеточного иммунитета на антигены вируса гепатита В (ВГВ) и ВИЧ, хотя именно такие реакции играют решающую роль в защите организма от этих вирусных инфекций (122). 6

Недостаточно разработанной остается методология исследования этих реакций в культуральных тестах in vitro с учетом влияния спонтанной продукции цитокинов на антиген-стимулированные реакции и на функциональное состояние клеточного иммунитета в целом (76, 77, 143).

Представляется важным разработать надежные и простые культуральные экспресс-тесты in vitro, позволяющие оценивать ранние антиген (АГ)-стимулированные реакции на вирусные АГ в норме и давать количественную характеристику их изменений при развитии вирусной патологии или в ходе вакцинации с учетом влияния спонтанной продукции цитокинов.

Цель работы

Разработка клеточных экспресс-тестов in vitro в условиях клинической лаборатории для оценки ранних антиген-стимулированных и спонтанных реакций клеточного иммунитета в норме, при вакцинации и при вирусной патологии.

Задачи исследования:

1. Разработать экспресс—тесты in vitro на основе уплотненных (УМК) и разреженных (РМК) микрокультур лейкоцитов периферической крови человека, позволяющие: 1/ в одних и тех же уплотненных микрокультурах последовательно тестировать клеточную миграцию по типу PTMJ1 и определять продукцию цитокинов; 2/ в разреженных микрокультурах, с тем же количеством клеток как и в УМК, определять продукцию цитокинов.

2. С помощью экспресс-тестов исследовать изменение соотношения уровней спонтанной и антиген/митоген (АГ/МГ) - стимулированной продукции цитокинов в уплотненных и разреженных микрокультурах клеток нормальных лейкоцитов человека в кинетике с 1-го по 18-й час культивирования in vitro.

3. Тестируя в уплотненных микрокультурах PTMJI на поверхностный антиген ВГВ (HBsAg), изучить изменения клеточной миграции (стимуляция 7 или подавление миграции) в разные сроки после вакцинации против гепатита В, при хронических заболеваниях печени и на разных стадиях ВИЧ-инфекции в сравнении со здоровыми донорами.

4. Сравнить в уплотненных микрокультурах уровни спонтанной и HBsAg-стимулированной продукции цитокинов (IL-ip, IL-6, IL-8, TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-1RA) в разные сроки вакцинации против гепатита В, а также в разреженных микрокультурах у лиц отвечающих и не отвечающих на вакцинацию против гепатита В, используя разработанные экспресс-тесты.

5. Провести в уплотненных микрокультурах оценку ранних АГ— стимулированных реакций лейкоцитов периферической крови на антигены ВГВ и ВИЧ, определяемых по продукции цитокинов (IL-ip, IL-6, IL-8, TNF-a, IL-1RA), у больных гепатитом В и ВИЧ-инфицированных пациентов.

Научная новизна работы

Разработана и исследована на клинических моделях система клеточных экспресс—тестов, позволяющая количественно определять как раннюю АГ/МГ -стимулированную, так и спонтанную активность лейкоцитов периферической крови человека по параметрам клеточной миграции и продукции цитокинов (IL-ip, IL-6, TNF-a) в стандартных клеточных микрокультурах in vitro.

Впервые обнаружена ранняя антиген- и митоген-стимулированная реакция ЛПК у здоровых не привитых доноров на антигены вируса гепатита В, а также антигены ВИЧ и соникат М. tuberculosis в качестве антигенов сравнения, определяемая по клеточной миграции (подавление или стимуляция миграции лейкоцитов) и продукции провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-8, TNF-a, IL-ip).

Впервые дана оценка ранних АГ-стимулированных реакций на HBsAg при вакцинации против гепатита В и обнаружено индуцированное вакциной усиление HBsAg-стимулированной продукции цитокинов IL-6, IL-8, IL-ip, TNF-a и IFN-y, после 3-й дозы вакцинации и снижение HBsAg— стимулированной и рост спонтанной продукции этих же цитокинов по сравнению с контрольной группой после 1-й и 2-й доз вакцинации, а также у ранее привитых против ВГВ.

Впервые у пациентов с гепатитом В и ВИЧ-инфекцией при оценке ранних АГ-стимулированных реакций выявлены изменения, важные для иммунопатогенеза этих инфекций, выражающиеся в усилении или снижении продукции цитокинов IL-6, IL-8, IL-ip, TNF-a и IL-1RA в ответ на гомологичные и гетерологичные антигены ВГВ и ВИЧ.

Научно-практическая значимость

1. Проведенное исследование ранних реакций клеточного иммунитета позволило разработать методологию оценки изменений клеточного иммунитета, вызванных вакцинацией или инфекционной патологией, в сравнении с состоянием нормального врожденного иммунитета, что открывает перспективу мониторинга напряженности клеточного иммунитета в клинической практике, возможность применения экспресс-тестов для диагностики инфекционных заболеваний и оценки эффективности вакцинации или противовирусной терапии.

2. Разработанные методические подходы дают возможность проведения более детальных исследований по противовирусной резистентности и состоянию врожденного иммунитета в скрытый период взаимодействия вируса и иммунной системы хозяина.

Внедрение полученных результатов в практику

1. Заявка на патент № 2008138410/049480/ «Способ определения функциональной активности клеточной микрокультуры» от 29.09.2008 в Федеральный институт промышленной собственности.

2. Методические рекомендации «Способ комплексного контроля функциональной активности клеточного иммунитета при вакцинации против гепатита В», методические рекомендации «Использование алгоритма прогнозирования недостаточности иммунного ответа у лиц, вакцинированных против гепатита В, на основе комплексной функциональной оценки реакции клеточного иммунитета», методические рекомендации «Способ оценки напряженности клеточного иммунитета в автоматизированном PTMJI при ВИЧ-инфекции, осложненной коинфекцией вирусным гепатитом В», утвержденные советом по внедрению научных достижений в практику НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, протокол № 10 от 27.11.09 3. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций для слушателей на кафедре инфектологии медико-профилактического факультета последипломного профессионального образования ММА им. И.М. Сеченова.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Клиническая иммунология, аллергология», Кожушный, Андрей Петрович

ВЫВОДЫ:

1. Разработаны экспресс-тесты для оценки ранних спонтанных и антиген-стимулированных реакций клеточного иммунитета двух типов: 1/ последовательное тестирование клеточной миграции по типу PTMJI и продукции цитокинов методом ИФА в одних и тех же уплотненных микрокультурах лейкоцитов периферической крови человека; 2/ определение продукции цитокинов в разреженных микрокультурах лейкоцитов с концентрацией клеток в 5-10 раз меньше, по сравнению со стандартно используемой.

2. С помощью экспресс—тестов в уплотненных и разреженных микрокультурах лейкоцитов здоровых доноров обнаружены реакции врожденного клеточного иммунитета в виде HBsAg-стимулированной продукции провоспалительных цитокинов на 1-18 часу культивирования. К 18-му часу в разреженных микрокультурах уровень реакции на HBsAg возрастает в сотни раз относительно 1-го часа, тогда как в уплотненных микрокультурах он остается без изменений вследствие роста спонтанной продукции цитокинов.

3. С помощью PTMJI, тестированной в уплотненных микрокультурах, установлено развитие специфического клеточного иммунитета на HBsAg в виде подавления миграции лейкоцитов после 2-й и 3-й доз вакцинации, а также у больных и переболевших гепатитом В, и ослабление клеточного иммунитета, проявляющееся в виде реакции стимуляции миграции лейкоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов на антигены ВИЧ: gpl20 (1-2 стадии инфекции) и на p24gag (3-4 стадии инфекции).

4. При вакцинации против гепатита В в уплотненных микрокультурах усиление HBsAg-стимулированной продукции цитокинов IL-6, IL-8, IL-1(3, TNF-a и IFN-y, индуцированное вакциной, выявлено только после 3-й дозы вакцинации; после 1-й и 2-й доз вакцинаций, как и у ранее привитых лиц, отмечено снижение HBsAg-стимулированной и рост спонтанной продукции этих же цитокинов по сравнению с контрольной группой.

135

5. Тестирование двух групп ранее привитых лиц (не менее 2-х лет после вакцинации), различающихся по уровню анти-HBs антител, в разреженных микрокультурах, показало, что у отвечающих (>10 МЕ/мл) лиц продукция IL-ip, TNF-a, IL-6 и IL-10 выше, чем у неотвечающих (<10 МЕ/мл) лиц.

6. У пациентов с гепатитом В и ВИЧ-инфекцией оценка ранних АГ— стимулированных реакций в уплотненных микрокультурах выявила изменения по сравнению с контрольной группой, важные для иммунопатогенеза этих инфекций: 1/ усиление АГ-стимулированной продукции провоспалительных цитокинов IL-6, IL-8, IL-ip у носителей HBsAg при реакции на антигены ВГВ и у пациентов с тяжелой формой гепатита В при реакции на неродственные гетерологичные антигены ВИЧ; 2/ снижение АГ—стимулированной продукции провоспалительных цитокинов IL-6, IL-8, IL-ip, TNF-a у ВИЧ-инфицированных пациентов при реакции на неродственный гетерологичный антиген ВГВ (HBsAg) и продукции IL-1RA при реакции на HBsAg во всех исследованных группах с вирусной патологией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В целом, полученные нами данные показывают, что в разработанных нами клеточных микрокультурах — уплотненных и разреженных - можно обнаружить самые ранние ответы ЛПКЧ от здоровых невакцинированных индивидуумов на присутствие вирусных антигенов — ВГВ или ВИЧ. Эти ответы выражаются преимущественно в изменениях клеточной миграции и продукции провоспалительных цитокинов. Использование таких клеточных микрокультур для исследования антиген-стимулированных реакций врожденного иммунитета весьма эффективно, так как индексы стимуляции (ИС) были весьма значительны и достигали увеличения ответа в несколько сотен раз, а результаты высоко достоверны. Использование уплотненных микрокультур позволило отследить параллельно у одних и тех же людей и изменения клеточной миграции в присутствии антигенов вирусов и продукцию цитокинов разного типа. В этих же микрокультурах можно было количественно определить спонтанную продукцию цитокинов и изменения уровня нормальной антиген-стимулированной продукции провоспалительных, иммунорегуляторных и противовоспалительных цитокинов в динамике при вакцинации против гепатита В, а также при патологиях, связанных с инфекциями ВГВ и ВИЧ.

Было проведено количественное сравнение изменений продукции цитокинов в разных исследуемых группах, используя коэффициенты относительной стимуляции (КОС) (Таб. 5).

Были продемонстрированы эффекты вакцинации против гепатита В на состояние врожденного и адоптивного клеточного иммунитета, которые заключались в параллельном развитии позитивной реакции РТМЛ, усиленной продукции провоспалительных цитокинов и появлении продукции IFN-y после третьей вакцинации, а также в существенном снижении уровня антиген-стимулированной реакции продукции цитокинов после первой и второй вакцинации, а также в поствакцинальный период, в основном за счет роста спонтанной продукции этих цитокинов.

132

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кожушный, Андрей Петрович, 2010 год

1. Галактионов В.Г., Иммунология: Учеб. для студ. вузов. 3-е изд., испр. и доп. - М.: издательский центр «Академия». - 2009. - 528 с.

2. Ершов Ф.И., Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств). — М.: ГЭОТАР Медиа, 2005. - 368 с.

3. Левицкая А.В., Макось Р.П., Василик Л.В. Реакция торможения миграции лимфоцитов при вирусных гепатитах // Врачебн. дело 1982. - Т.1. -С.114-116

4. Суслов А.П., Головин В.П., Скворцов В.Т., Коронцвит Т.А. Скрининговый тест клеточной миграции из микрокультур in vitro.// Иммунология. . -1989. -№ 1.-С. 73-76

5. Ю.Титов М.Б., Герсун Б. А., Шевченко Л.Ю. Замедленная гиперчувствительность к поверхностному антигену вируса гепатита В. // ЖМЭИ. 1982. - Т. 7. - С.82-85.

6. П.Чередниченко Т.В., Тамарова Л.Д. Клиническое значение реакции торможения миграции лейкоцитов к HBsAg при вирусном гепатите В у детей. // Вопрос.охр. матер. Детства. 1980. - Т. 25. - С. 8-12

7. Alfano М., Poli G. Cytokine and chemokine based control of HIV infection and replication. // Curr Pharm Des. 2001 Jul. - Vol. 7 (11). - P. 993-1013.

8. Altman J.D., Moss P.A., Goulder P.J., Barouch D.H., McHeyzer-Williams M.G., Bell J.I., McMichael A.J., Davis M.M. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. // Science. 1996 Oct 4. - V. 274 (5284). - P. 94-6.

9. Ando K., Guidotti L.G., Wirth S. Class I restricted cytotoxic T lymphocytes are directly cytopathic for their target cells in vivo. // J. Immunol. -1994. V. 152. -P. 3245-3253.

10. Barcellini W., Rizzardi G.P., Borghi M.O., Fain C., Lazzarin A., Meroni P.L. TH1 and TH2 cytokine production by peripheral blood mononuclear cells from HIV-infected patients. // AIDS. 1994 Jun. - V. 8(6). - P.757-62.

11. Baron J.L., Gardiner L., Nishimura S., Shinkai K., Locksley R., Ganem D. Activation of a nonclassical NKT cell subset in a transgenic mouse model of hepatitis В virus infection.// Immunity. 2002. - V. 16. - P.583-594.

12. Becker Y. HIV-1 induced AIDS is an allergy and the allergen is the Shed gpl20~a review, hypothesis, and implications. // Virus Genes. 2004 Apr. -28(3).-319-31.

13. Belardelli F. Role of interferons and other cytokines in the regulation of the immune response. // APMIS. 1995 Mar. - Vol. 103 (3). - P. 161-79.

14. Benhamou Y., Poynard T. Treatment of chronic hepatitis В virus infection in patients co-infected with human immunodeficiency virus. // J Hepatol. 2003. -Vol. 39 Suppl l.-P. SI 94-9.

15. Bertoletti A., Maini MK. Protection or damage: a dual role for the virus-specific cytotoxic T lymphocyte response in hepatitis В and С infection? // Curr Opin Microbiol. 2000 Aug. - Vol. 3 (4). - P. 387-92.

16. Bertoletti A., Gehring AJ. The immune response during hepatitis В virus infection. // J Gen Virol. 2006 Jun. - Vol. 87 (Pt 6). - P. 1439-49.

17. Blander J.M., Medzhitov R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. // Nature 2006 Apr. Vol. 6. № 440 (7085). P. 808-12.

18. Bloemena E., Roos M.T., Van Heijst J.L., Vossen J.M., Schellekens P.T. Whole-blood lymphocyte cultures. // J Immunol Methods. 1989 Sep 1. - Vol. 122 (2).-P. 161-7.

19. Boehm U., Klamp Т., Groot M., Howard J.C. Cellular responses to interferon-gamma. // Annu Rev Immunol. 1997. - Vol. 15. - P. 749-95.

20. Brehm M.A., Pinto A.K. T cell immunodominance and maintenance of memory regulated by unexpectedly cross-reactive pathogens. // Nat Immunol. 2002 Jul.-Vol. 3(7).-P. 627-34.

21. Brenchley J.M., Ruff L.E., Casazza J.P., Koup R.A., Price D.A., Douek D.C. Preferential infection shortens the life span of human immunodeficiency virus-specific CD4+ T cells in vivo. // J Virol. 2006 Jul. - Vol. 80 (14). - P. 6801-9.

22. Calabrese L.H., Zein N., Vassilopoulos D. Safety of antitumour necrosis factor (anti-TNF) therapy in patients with chronic viral infections: hepatitis C, hepatitis B, and HIV infection. // Ann Rheum Dis. 2004 Nov. - Vol. 63 Suppl 2.-P. 18-24.

23. Chedid M.G., Deulofeut H., Yunis D.E., Lara-Marquez M.L., Salazar M., Deulofeut R., Awdeh Z., Alper C.A., Yunis E.J. Defect in Thl-like cells of nonresponders to hepatitis В vaccine. // Hum Immunol. 1997 Nov. — Vol. 58 (l).-P. 42-51.

24. Chen Y., Wei H., Gao В., Hu Z., Zheng S., Tian Z. Activation and function of hepatic NK cells in hepatitis В infection: an under investigated innate immune response.// J. Viral. Hepat. 2005. - V.12. - P.38-45.

25. Chisari F.V., Ferrari C. Hepatitis В virus immunopathogenesis. // Annu. Rev. Immunol. 1995. - V. 13. - P. 29-60.

26. Clausen J.E. Migration inhibition of human leukocytes mixed with phytohemagglutinin-preincubated mononuclear leukocytes. // Acta Allergol. -1975 Nov. Vol. 30(5). - P. 239-49.

27. Clerici M., Sison A.V., Berzofsky J.A., Rakusan T.A., Brandt C.D., Ellaurie M., Villa M., Colie C., Venzon D.J., Sever J.L. Cellular immune factors associated with mother-to-infant transmission of HIV. // AIDS. 1993 Nov. -Vol. 7 (11).-P. 1427-33.

28. Cooper A., Tal G., Lider O., Shaul Y. Cytokine induction by the hepatitis В virus capsid in macrophages is facilitated by membrane heparan sulfate and involves TLR2. // J Immunol. 2005 Sep 1. - Vol. 175(5). - P. 3165-76.

29. Czerkinsky C.C., Nilsson L.A., Nygren H., Ouchterlony O., Tarkowski A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. // J Immunol Methods. 1983 Dec 16. - Vol. 65 (1-2).-P. 109-21.

30. Douek D.C. Disrupting T-cell homeostasis: how HIV-l infection causes disease. // AIDS Rev. 2003 Jul-Sep. -V. 5 (3). -P. 172-7.

31. Geneva-Popova M., Murdjeva M. Study on proinflammatory cytokines (IL-1 beta, IL-6, TNF-alpha) and IL-2 in patients with acute hepatitis B. // Folia Med (Plovdiv). 1999.-Vol. 41(1).-P. 78-81.

32. Gewirtz A.T. Intestinal epithelial toll-like receptors: to protect. And serve? // Curr Pharm Des. -2003- Vol. 9(1). P. 1-5.

33. Ghanekar S.A., Stranford S.A., Ong J.C., Walker J.M., Maino V.C., Levy J.A. Decreased HIV-specific CD4 T cell proliferation in long-term HIV-infected individuals on antiretroviral therapy. // AIDS. 2001 Sep 28. - Vol. 15 (14). -P. 1885-7.

34. Graziosi C., Pantaleo G., Gantt K.R., Fortin J.P., Demarest J.F., Cohen O.J., Sekaly R.P., Fauci A.S. Lack of evidence for the dichotomy of TH1 and TH2 predominance in HIV-infected individuals. // Science. 1994 Jul 8. — Vol. 265 (5169).-P. 248-52.

35. Griffin D.E. Immune responses to RNA-virus infections of the CNS. // Nat Rev Immunol 2003. - Vol. 3(6). - P. 493-502.

36. Guidotti L.G., Chisari F.V. To kill or to cure: options in host defense against viral infection. // Curr Opin Immunol. 1996 Aug. Vol. 8(4). - P. 478-83.

37. Guidotti L.G., Ishikawa Т., Hobbs M.V., Matzke В., Schreiber R., Chisari F.V. Intracellular inactivation of the hepatitis В virus by cytotoxic T lymphocytes.// Immunity. 1996. - V.4. - P.25-36.

38. Guidotti L.G., Chisari F.V. Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response. // Annu Rev Immunol. 2001. - Vol. 19. -P. 65-91.

39. Guidotti L.G., Chisari F.V. Immunobiology and pathogenesis of viral hepatitis. // Annu Rev Pathol. 2006. - Vol. 1. - P. 23-61.

40. Harari A., Vallelian F., Pantaleo G. Phenotypic heterogeneity of antigen-specific CD4 T cells under different conditions of antigen persistence and antigen load. // Eur J Immunol. 2004 Dec. - Vol. 34 (12). - P. 3525-33.

41. Heimark R.L., Twardzik D.R., Schwartz S.M. Inhibition of endothelial regeneration by type-beta transforming growth factor from platelets. // Science. 1986 Sep 5. - Vol. 233 (4768). - P. 1078-80.

42. Heine H., Lien E. Toll-like receptors and their function in innate and adaptive immunity. // Int Arch Allergy Immunol 2003. - Vol. 130(3). - P. 180-92.

43. Hernandez-Fuentes M.P., Warrens A.N., Lechler R.I. Immunologic monitoring. // Immunol Rev 2003. Dec. - Vol. 196. - P. 247-64.

44. Heydtmann M. Macrophages in hepatitis В and hepatitis С virus infections. // J Virol. 2009 Apr. - Vol. 83 (7). - P. 2796-802.

45. Holm G.H., Gabuzda D. Distinct mechanisms of CD4+ and CD8+ T-cell activation and bystander apoptosis induced by human immunodeficiency virus type 1 virions. // J Virol. 2005 May. - Vol. 79(10). - P. 6299-311.

46. Honorati M.C., Dolzani P., Mariani E., Piacentini A., Lisignoli G., Ferrari C., Facchini A. Epitope specificity of Th0/Th2 CD4+ T-lymphocyte clones induced by vaccination with rHBsAg vaccine. // Gastroenterology. 1997 Jun. - Vol. 112 (6).-P. 2017-27.

47. Huang C.-F., Lin S.-S., Ho Y-C., Chen F.-L., Yang C.-C. The immune response induced by Hepatitis В Virus principal antigens. Cell.molec. Immunol. 2006. -V. 3.-N.2.-P. 97-106.

48. Isogawa M., Robek M.D., Furuichi Y., Chisari F.V. Toll-like receptor signaling inhibits hepatitis В virus replication in vivo. // J Virol. 2005 Jun. — Vol. 79(11).-P. 7269-72.

49. Janetzki S., Cox J.H., Oden N., Ferrari G. Standardization and validation issues of the ELISPOT assay. // Methods Mol Biol. 2005. - Vol. 302. - P. 51-86.

50. Janeway C.A. Jr. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1989. - Vol. 54. Pt. 1. -P. 1:1-13.

51. Jason J., Archibald L.K., Nwanyanwu O.C., Bell M. The effects of iron deficiency on lymphocyte cytokine production and activation: preservation of hepatic iron but not at all cost. // Clin Exp Immunol. 2001 Dec. - Vol. 126 (3).-P. 466-73.

52. Jason J., Archibald L.K., Nwanyanwu O.C. Comparison of serum and cell-specific cytokines in humans. // Clin Diagn Lab Immunol. 2001 Nov. - Vol. 8 (6).-P. 1097-103.

53. Kaisho Т., Akira S. Regulation of dendritic cell function through Toll-like receptors. // Curr Mol Med 2003. - Vol. 3(4). - P.373-85.

54. Kakimi K., Guidotti L.G., Koezuka Y., Chisari F.V. Natural killer T cell activation inhibits hepatitis В virus replication in vivo. //J. Exp. Med. 2000. -V.192. - P.921-930.

55. Keilholz U., Martus P., Scheibenbogen C. Immune monitoring of T-cell responses in cancer vaccine development. // Clin Cancer Res. — 2006 Apr 1. — Vol. 12 (7 Pt 2). P. 2346s-2352s.

56. Kedzierska K., Crowe S.M. Cytokines and HIV-1: interactions and clinical implications. // Antivir Chem Chemother. 2001 May. - Vol. 12 (3). - P. 13350.

57. Lee W. M. , Reed W.D., Mitchell C.G.et al, Cellular and humoral immunity to hepatitis-B surface antigen in active chronic hepatitis.// Br Med J. 1975. -V.29 -P.705-708

58. Lee WM. Hepatitis В virus infection // N. Engl. J. Med. 1997. - Vol. 337 - P. 1733-1745.

59. Li J.R., Gong R.Y., Tian K.L., Wang J., Wang Y.X., Huang H.J. Study on the blood-borne virus co-infection and T lymphocyte subset among intravenous drug users. // World J Gastroenterol. 2007 Apr 28. - Vol. 13(16). - P. 235762.

60. Lieberman J., Shankar P, Manjunath N., Andersson J. Dressed to kill? A review of why antiviral CD8 T lymphocytes fail to prevent progressive immunodeficiency in HIV-1 infection. // Blood. 2001 Sep 15. - Vol. 98 (6). -P. 1667-77.

61. Maciaszek J.W., Parada N.A., Cruikshank W.W., Center D.M., Kornfeld H., Viglianti G.A. IL-16 represses HIV-1 promoter activity. // J Immunol. 1997 Janl.-V. 158(1).-P. 5-8.

62. Maecker H.T., Maino V.C., Picker L.J. Immunofluorescence analysis of T-cell responses in health and disease. // J Clin Immunol. 2000 Nov. - V. 20 (6). -P. 391-9.

63. Maini M.K., Bertoletti A. How can the cellular immune response control hepatitis В virus replication? // J Viral Hepat. 2000 Sep. - V. 7(5). - P. 321-6.

64. Marchetti G., Tincati C., Monforte A., Gori A. The challenge of IL-2 immunotherapy in HIV disease: "no through road" or turning point? // Curr HIV Res. 2008 May. - V. 6(3). - P. 189-99.

65. Marshall J.D., Chehimi J., Gri G., Kostman J.R., Montaner L.J., Trinchieri G. The interleukin-12-mediated pathway of immune events is dysfunctional in human immunodeficiency virus-infected individuals. // Blood. 1999 Aug 1. -V. 94(3).-P.l003-11.

66. Martin C.M., Welge J.A., Shire N.J., Shata M.T., Sherman K.E., Blackard J.T. Cytokine expression during chronic versus occult hepatitis В virus148infection in HIV co-infected individuals. // Cytokine. 2009 Sep. - V. 47(3). -P.194-8.

67. Matthews S.J. Entecavir for the treatment of chronic hepatitis В virus infection. // Clin Ther. 2006 Feb. - V. 28 (2). - P. 184-203.

68. McClary H., Koch R., Chisari F.V., Guidotti L.G. Relative sensitivity of hepatitis В virus and other hepatotropic viruses to the antiviral effects of cytokines. // J Virol. 2000 Mar. - V. 74(5). - P. 2255-64.

69. Medzhitov R. Approaching the asymptote: 20 years later. // Immunity. -2009 Jun 19. V. 30 (6). - P. 766-75.

70. Milich DR, Schodel F, Hughes JL, Jones JE, Peterson DL. The hepatitis В virus core and e antigens elicit different Th cell subsets: antigen structure can affect Th cell phenotype.// J. Virol. 1997. - V.7. - P.2192-2201.

71. Milich D.R., Chen M.K., Hughes J.L., Jones J.E. The secreted hepatitis В precore antigen can modulate the immune response to the nucleocapsid: a mechanism for persistence. // J Immunol. 1998 Feb 15. - V. 160(4). - 201321.

72. Mogensen Т.Н., Paludan S.R. Virus-cell interactions: impact on cytokine production, immune evasion and tumor growth. // Eur Cytokine Netw. 2001 Jul-Sep. - Vol. 12(3). - P. 382-90.

73. Nicole A., Spertini O., Lavanchy D., Frei P.C. Immune response to purified non-A, non-B hepatitis-related antigen demonstrated by leukocyte migration inhibition in patients recovering from the infection.// Infection. — 1986. -V.14 -P.13-16

74. Niederau C., Heintges Т., Haussinger D. Treatment of chronic hepatitis С with a-interferon: an analysis of the literature. // Hepatogastroenterology. — 1996 Nov-Dec. Vol. 43 (12). - P. 1544-56.

75. Nomura L.E., Walker J.M., Maecker H.T. Optimization of whole blood antigen-specific cytokine assays for CD4(+) T cells. // Cytometry. 2000 May 1. - Vol. 40(1).-P. 60-8.

76. Palm N.W., Medzhitov R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. // Immunol Rev 2009 Jan. Vol. 227(1). - P. 221-33.

77. Peters M.G., Hann Hw. H., Martin P., Heathcote E.J., Buggisch P. Adefovir dipivoxil alone or in combination with lamivudine in patients with lamivudine-resistant chronic hepatitis B. // Gastroenterology. 2004 Jan. - Vol. 126 (1). -P. 91-101.

78. Rapicetta M., Ferrari С., Levrero M. Viral determinants and host immune responses in the pathogenesis of HBV infection. // J. Med. Virol. 2002. - V. 67.-P. 454-457.

79. Rassa JC, Ross SR. Viruses and Toll-like receptors. // Microbes Infect. -2003 Sep. Vol. 5 (11). - P. 961-8.

80. Ratnam D., Visvanathan K. New concepts in the immunopathogenesis of chronic hepatitis B: the importance of the innate immune response. // Hepatol Int. 2008 May. - Vol. 2. - P. 12-8.

81. Rehermann В., Nascimbeni M. Immunology of hepatitis В virus and hepatitis С virus infection. // Nat Rev Immunol. 2005 Mar. - Vol. 5 (3). - P. 215-29.

82. Roederer M., Dubs J.G., Anderson M.T., Raju P.A., Herzenberg L.A., Herzenberg L.A. CD8 naive T cell counts decrease progressively in HIV-infected adults. // J Clin Invest. 1995 May. - Vol. 95 (5). - P. 2061-6.

83. Rodriguez В., Sethi A.K., Cheruvu V.K., Mackay W., Bosch R.J., Kitahata M. Predictive value of plasma HIV RNA level on rate of CD4 T-cell decline in untreated HIV infection. // JAMA. 2006 Sep 27. - Vol. 296(12). - P. 1498506.

84. Sarzotti M., Robbins D.S., Hoffman P.M. Induction of protective CTL responses in newborn mice by a murine retrovirus. // Science. 1996 Mar 22. -Vol. 271 (5256).-P. 1726-8.

85. Semenzato G. Immunology of interstitial lung diseases: cellular events taking place in the lung of sarcoidosis, hypersensitivity pneumonitis and HTV infection. // Eur Respir J. 1991 Jan. - Vol. 4 (1). - P. 94-102.

86. Sheridan J.F., Aurelian L., Quinn TC. Modulation of virus-specific immunity in vitro by the addition of interleukin-1 and interleukin-2 in patients with the acquired immune deficiency syndrome. // Ann N Y Acad Sci. 1984. -Vol. 437.-P. 530-4.

87. Shubina N.G., Iushchenko Iu.A., Kolontsov A.A. Development of delayed-type hypersensitivity to hog cholera. // Vopr Virusol. 2001. - V.46, №1. - P. 42-44.

88. Sudharshan S., Biswas J. Introduction and immunopathogenesis of acquired immune deficiency syndrome. // Indian J Ophthalmol. 2008 Sep-Oct. — Vol. 56 (5).-P. 357-62.

89. Suni M.A., Picker L.J., Maino V.C. Detection of antigen-specific T cell cytokine expression in whole blood by flow cytometry. // J Immunol Methods. . 1998 Mar 1. - Vol. 212 (1). - P. 89-98.

90. Trinchieri G. Interleukin-12: a cytokine at the interface of inflammation and immunity. // Adv Immunol. 1998. - Vol. 70. - P. 83-243.

91. Ullum H., Gotzsche P.C., Victor J., Dickmeiss E., Skinhoj P., Pedersen B.K. Defective natural immunity: an early manifestation of human immunodeficiency vims infection. // J Exp Med. 1995 Sep 1. -Vol. 182 (3). -P. 789-99.

92. Vingerhoets J., Vanham G., Kestens L., Penne G., Leroux-Roels G., Gigase P. Deficient T-cell responses in non-responders to hepatitis В vaccination: absence of TH1 cytokine production. // Immunol Lett. 1994 Feb. - Vol. 39(2). -P. 163-8.

93. Walker D., Jason J., Wallace K., Slaughter J. Spontaneous cytokine production and its effect on induced production. // Clin Diagn Lab Immunol. 2002 Sep. Vol. 9 (5). - P. 1049-56.

94. Watford W.T., Moriguchi M., Morinobu A., O'Shea J.J. The biology of IL-12: coordinating innate and adaptive immune responses. // Cytokine Growth Factor Rev. 2003 Oct. - Vol. 14 (5). - P. 361-8.

95. Wieland S.F., Guidotti L.G., Chisari F.V. Intrahepatic induction of alpha/beta interferon eliminates viral RNA-containing capsids in hepatitis В virus transgenic mice. // J Virol. 2000 May. - Vol. 74 (9). - P. 4165-73.

96. Wieland S., Thimme R., Purcell R.H., Chisari F.V. Genomic analysis of the host response to hepatitis В virus infection. // Proc Natl Acad Sci USA. — 2004 Apr 27. Vol. 101 (17). - P. 6669-74.

97. Wieland S.F., Chisari F.V. Stealth and cunning: hepatitis В and hepatitis С viruses. // J Virol. 2005 Aug. - Vol. 79 (15). - P. 9369-80.154

98. Waldrop S.L., Davis K.A., Maino V.C., Picker L.J. Normal human CD4+ memory T cells display broad heterogeneity in their activation threshold for cytokine synthesis. // J Immunol. 1998 Nov 15. - Vol. 161 (10). - P. 5284-95.

99. Wu Т., Chen M., Ou S.H., Cheng Т., Zhang J., Xia NS. Immune response induced by a different combined immunization of HBsAg vaccine. // Intervirology. 2007. - Vol. 50 (5). - P. 336-40.

100. Zajac A.J., Blattman J.N., Murali-Krishna K., Sourdive D.J., Suresh M., Altman J.D., Ahmed R. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function. // J Exp Med. -1998 Dec 21. Vol. 188 (12). — P. 2205-13.

101. Zinkernagel R.M. Immunology taught by viruses. // Science. 1996 Jan 12. -V. 271 (5246).-P. 173-8.