Разработка экспресс-системы скрининга ингибиторов вируса иммунодефицита человека (HIV-1) дикого типа и мутантных лекарственно-устойчивых форм тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Прокофьева, Мария Михайловна

• Прокофьева, Мария Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Прокофьева, Мария Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Введение.

1. Строение и жизненный цикл ШУ-1.

1.1. Строение ШУ-1.

1.2 Жизненный цикл ШУ-1.

1.3. Ферменты ШУ-1: структура и механизм действия.

1.3.1 Обратная транскриптаза.

1.3.2 Протеаза.

1.3.3 Интеграза.

2. Ингибиторы ШУ-1.

2.1 Нуклеозидные и нуклеотидные ингибиторы ОТ ШУ-1.

2.2 Ненуклеозидные ингибиторы ОТ НГУ-1.

2.3 Ингибиторы интегразы ШУ-1.

2.4 Ингибиторы протеазы ШУ-1.

2.5 Ингибиторы проникновения вируса в клетку.

2.6. Сульфатированные полисахариды.

2.7 Высооактивная антиретровирусная терапия.

3. Лентивирусные векторы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы.

1. Клеточные линии.

2. Плазмиды.

3. Реактивы.

4. Пластиковая посуда, другие материалы.

5. Оборудование.

Методы.

Культивирование клеток.

Пересев клеток.

Криоконсервация клеток.

Приготовление бактериальных культуральных сред.

Трансформация компетентных бактериальных клеток E.coli DH5-oc.

Получение псевдо-HIV-l частиц, несущих маркерный ген зеленого флуоресцентного белка (eGFP).

Определение титра псевдо-HIV-1 частиц.

Трансдукция прикреплённых клеток псевдо-HIV-l частицами.

Трансдукция суспензионных клеток псевдо-HTV-1 частицами.

Проточная цитофлуориметрия.

Определение цитостатичности и цитотоксичности исследуемых соединений.

Определение количества клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза.

Исследование антивирусной активности соединений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Характеристика системы.

2. Выбор белка оболочки для лентивирусных частиц.

3. Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы HTV-1.

3.1 Азидотимидин.

3.2 Действие азидотимидина на лекарственно-устойчивые формы ОТ.

3.3 Ламивудин (ЗТС).

3.4 Ставудин (с14Т) и другие нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы.

4. Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ЬПУ-1.

4.1 Невирапин.

4.2 Действие невирапина на лекарственно-устойчивые формы ОТ.

4.3 Эфавиренз.■.

5. Исследование новых ненуклеозидных ингибиторов ОТ.

6. Ингибиторы интегразы ШУ-1.

6.1 Ралтегравир и Ь-731,988.

6.2 Действие ралтегравира на лекарственно-устойчивые формы интегразы.

7. Сульфатированные полисахариды как ингибиторы проникновения вируса в клетку.

8. Получение псевдо-ШУ-1 частиц, несущих гены различных флуоресцентных белков.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка экспресс-системы скрининга ингибиторов вируса иммунодефицита человека (HIV-1) дикого типа и мутантных лекарственно-устойчивых форм»

НГУ-1 является возбудителем одного из самых опасных заболеваний человека - синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). СПИД как заболевание впервые был описан в 1981 году, двумя годами позже был выделен вирус, предполагаемая причина заболевания. За три десятилетия, прошедшие с момента открытия СПИДа, он стал причиной смерти более 25 миллионов человек. Согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), число ШУ-1 -инфицированных к концу 2011 года превысило 34 миллиона человек, ежегодно в мире от СПИДа умирает около двух миллионов человек, и число НЗУ-1 инфицированных постоянно растет.

Основной мишенью Н1У-1 являются СБ4+ Т-лимфоциты, особенно Т -хелперы, а также моноциты, макрофаги и дендритные клетки. СБ4+ Т-лимфоциты - главные клетки иммунной системы, обеспечивающие гуморальный (выработка антител) и клеточный иммунитет (контактное взаимодействие с клетками-жертвами), а также регулирующие деятельность клеток других типов. При недостаточном содержании лимфоцитов организм не способен защищаться от многих инфекций. Поражение иммунной системы и падение уровня СБ4+ лимфоцитов ниже критического уровня способствует развитию оппортунистических заболеваний (бактериальная пневмония, папиллома человека, опоясывающий лишай, простой герпес, туберкулез) и злокачественных новообразований.

К настоящему времени еще не разработано ни одной эффективной терапевтической вакцины против ШУ-1. Основным подходом при лечении является использование препаратов, действие которых направлено на подавление различных стадий жизненного цикла ШУ-1. В настоящее время существует 25 препаратов, одобренных для применения в клинических условиях. Однако против многих препаратов у вируса возникает лекарственная устойчивость, что требует постоянного продолжения исследований и создания новых лекарственных препаратов.

Одновременное применение нескольких соединений, имеющих разные мишени, в рамках высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) позволяет достигать относительно длительного и заметного снижения титра вируса в крови и, как следствие, существенно продлевать жизнь больного. Тем не менее, использование всех этих соединений имеет несколько ограничений. Во-первых, пожизненное носительство вирусной инфекции делает необходимым многолетний прием лекарственных средств, при котором возникают новые мутантные формы вируса, устойчивые к используемым препаратам и способные распространяться в популяции. Во-вторых, необходимость длительной терапии часто ставит на первый план возможное побочное действие противовирусных средств. Таким образом, поиск новых соединений, обладающих анти-ШУ-1-активностью, представляет серьезную задачу современной вирусологии и медицинской химии.

Изменчивость ШУ-1, приводящая к возникновению лекарственно-устойчивых форм осложняет задачу исследователей.

Важный этап разработки новых антиретровирусных средств - проверка их эффективности. В настоящий момент существуют два основных подхода для определения эффективности потенциальных противовирусных препаратов. Одним является ингибиторный анализ in vitro с использованием очищенных вирусных ферментов. Однако, при работе с очищенными ферментами невозможно установить эффективность взаимодействия противовирусных препаратов с клеткой in vivo, а именно: способность препарата проникать в клетку, его внутриклеточная стабильность, отсутствие цитотоксического воздействия, эффективность и специфичность противовирусного действия. Второй подход основан на работе с инфекционным вирусом и может быть применен в ограниченном числе лабораторий, специально предназначенных для работы с опасными патогенами человека.

Поиск потенциальных ингибиторов репликации лекарственно-устойчивых штаммов ШУ-1 ограничен не только необходимостью использования инфекционного лекарственно-устойчивого вируса, представляющего опасность для персонала лаборатории, но и сложностью получения штаммов, нечувствительных к препаратам заданной группы.

Большой интерес для быстрого и полностью безопасного скрининга потенциальных ингибиторов репликации ШУ-1 представляют лентивирусные векторы, функциональная эффективность которых проявляется в результате активности всех ферментов ШУ-1 - обратной транскриптазы, интегразы и протеазы.

Цели и задачи исследования.

Целью данного исследования является создание безопасной и эффективной системы скрининга потенциальных ингибиторов жизненного цикла ШУ-1 на основе лентивирусных векторов и скрининг потенциальных ингибиторов ШУ-1. Для достижения поставленной цели надо было решить следующие задачи:

1. Получить панель псевдо-ШУ-1 частиц, содержащих вирусные ферменты обратную транскриптазу и интегразу дикого типа или мутантные лекарственно-устойчивые формы.

2. Определить активность известных лекарственных препаратов -ингибиторов жизненного цикла ШУ-1 против псевдо-НГУ-1 частиц и сравнить с их активностью против инфекционного НГУ-1, известной по литературным данным.

3. Провести анализ активности потенциальных ингибиторов Н1У-1: бензофеноновых производных пиримидинов как ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ШУ-1 и сульфатированных полисахаридов в качестве ингибиторов проникновения ШУ-1 в клетку.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Введение.

Ретровирусы - семейство РНК-содержащих вирусов, вызывающие множество серьезных заболеваний, например, такие опасные заболевания человека, как СПИД и Т-клеточный лейкоз взрослых. Представители этого семейства обнаружены у всех видов позвоночных. Ретровирусы обладают рядом характерных свойств, отличающих их от прочих вирусов. Большинство других типов вирусов убивают зараженную клетку, а ретровирусы, как правило, вызывают хроническую инфекцию клеток-мишеней, причем продолжительная экспрессия генов ретровирусов часто не приводит к цитопатическим эффектам. Однако, некоторые ретровирусы, в частности, ШУ-1, обладают сильным цитопатическим эффектом. Главной особенностью ретровирусов является их уникальная система репликации. Вирусный геном в составе вириона представлен одноцепочечной РНК, но в ходе жизненного цикла он проходит стадию двухцепочечной ДНК (провируса), которая эффективно встраивается в геном хозяйской клетки. Экспрессия ретровирусных генов осуществляется с помощью клеточной системы транскрипции. Синтез ДНК-генома ретровируса, или провируса, осуществляет РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза), входящая в состав вириона. Ретровирусы могут существовать в виде эндогенных провирусов и ретровирусоподобных элементов (ретротранспозонов), которые интегрированы в ДНК клеток и передаются по наследству. В геноме человека и других млекопитающих присутствуют полные копии ретровирусных провирусов или их фрагментов [1, 2], доля которых в геномах человека составляет 8%.

Изначально классификация ретровирусов основывалась на морфологических особенностях вирионов, выявляемых с помощью электронной микроскопии. По морфологии ретровирусы делят на 4 типа. Ретровирусы типа А неинфекционны и обнаруживаются только внутри клеток. А-частицы представляют собой продукт экспрессии эндогенных ретровирусоподобных элементов, у которых не происходит протеолиза и созревания вирусных белков, поэтому они не дают продуктивной инфекции. Такие незрелые вирусные частицы накапливаются в эндоплазматическом ретикулуме клетки. Другой тип А-частиц — предшественники вирионов В и D типов. В настоящее время эти частицы не считаются самостоятельными вирусами [3].

Ретровирусы B-типа характеризуются тем, что сборка их нуклеокапсида происходит в цитоплазме, далее нуклеокапсид переносится к плазматической мембране, где формируется вирион, особенностью которого является эксцентричное положение капсида.

К С-типу относят ретровирусы с округлым капсидом в центре вириона, сборка которых происходит непосредственно у плазматической мембраны и окончательное созревание вириона происходит после отпочковывания от мембраны.

Ретровирусы D-типа, как и тип В, тоже созревают в цитоплазме, но в отличие от типа В обладают палочкообразным капсидом [4].

Эта классификация использовалась на ранних стадиях исследования ретровирусов. В настоящее время используется другая классификация, по которой ретровирусы делятся на простые, геном которых содержит только гены gag, pol, и env, кодирующие структурные белки и ферменты вируса, и сложные, геном которых содержат также гены, кодирующие набор регуляторных белков с различными функциями.

К простым ретровирусам относятся альфа-ретровирусы, бета-ретровирусы и гамма-ретровирусы. Альфа-ретровирусы характеризуются С-типом морфологии, типичным представителем этого класса является вирус лейкоза-саркомы птиц (ASLV). Бета-ретровирусы характеризуются либо морфологией B-типа, с круглым капсидом, расположенным по центру, либо морфологией D-типа, с палочкообразным капсидом. Наиболее известными представителями являются вирус опухолей молочной железы мышей (MMTV) и вирус обезьян Мэйзена-Пфейзера (M-PMV). Гамма-ретровирусы характеризуются морфологией С-типа. Этот род содержит наибольшее количество известных вирусов, в том числе и вирус лейкоза мышей (MuLV), вирус лейкоза кошек (FuLV), и вирус лейкоза гиббонов (GALV).

К сложным ретровирусам относятся дельта-ретровирусы, эпсилон-ретровирусы, лентивирусы и спумавирусы, или пенящие вирусы. Дельта-ретровирусы характеризуются морфологией С-типа. Наиболее известными представителями этой группы вирусов являются Т-лимфотропный вирус человека (HTLV) и вирус лейкоза коров (BLV). Эпсилон-ретровирусы характеризуются морфологией С-типа, примером является вирус лейкомы роговицы (WDSV). Спумавирусы - вирусы со сложной морфологией вириона, включающей в себя острые выступы на поверхности и центральный неконденсированный кор. Примером может служить пенящийся вирус человека. Лентивирусы также характеризуются уникальной морфологией вириона, с палочкообразным или конусообразным капсидом. Наиболее известным представителем лентивирусов является HIV-1, в основном в эту группу входят вирусы приматов. Из других вирусов, в этот род включают вирус артрита-энцефалита жвачных(САЕУ) и вирус Висны-Маеди [4].

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Прокофьева, Мария Михайловна

выводы.

1. Разработана эффективная и безопасная экспресс-система для скрининга потенциальных ингибиторов/блокаторов ШУ-1, в том числе ингибиторов лекарственно-устойчивых форм вируса. Получена панель псевдо-ШУ-1 частиц, содержащих ферменты ШУ-1 обратную транскриптазу и интегразу как дикого типа, так и мутантных лекарственно-устойчивых форм.

2. Показано, что коммерческие нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы АЗТ и ЗТС, ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы невирапин и эфавиренз и ингибитор интегразы ралтегравир эффективно подавляют трансдукцию клеток человека и мыши псевдо-ШУ-1 частицами, содержащими ферменты дикого типа. В то же время, эти коммерческие ингибиторы неэффективны или малоэффективны в отношении псевдо-НГУ-1 частиц, содержащих мутантные лекарственно-устойчивые формы ферментов.

3. Установлена ингибиторная активность новых потенциальных ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ШУ-1 -бензофеноновых производных пиримидинов (1-[2-(3,5-диметилбензоил-4-хлорфенокси)этил]урацила, 1-[2-(3,5-дихлорбензоил-4-хлорфенокси)этил] урацила и 1-[2-(3,5-диметилбензоил-4-хлорфенокси)этил]-5,6-диметил-урацила) в отношении псевдо-НГУ-1 частиц, несущими обратную транскриптазу ШУ-1 дикого типа или мутантные лекарственно-устойчивые формы.

4. Показано, что сульфатированные полисахариды различной природы эффективно подавляют трансдукцию клеток псевдо-ШУ-1 частицами, несущими на своей поверхности белок оболочки §р12С^р41 ШУ-1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами была разработана система безопасного скрининга потенциальных ингибиторов репликации Н1У-1, которая позволяет проводить испытания ингибиторной активности соединений, действие которых направлено как на обратную транскриптазу и интегразу ШУ-1 дикого типа, так и на их мутантные формы, соответствующие лекарственно-устойчивым формам вируса. С использованием ряда коммерческих препаратов, обладающих анти-ШУ-1 активностью, доказана адекватность использования псевдо-ШУ-1 частиц для тестирования ингибиторов ШУ-1. Важно, что используемые в нашей системе псевдо-ЩУ-1 частицы неинфекционны и, по сути, представляют собой вирусы одноразового действия, содержащие полный набор вирусных ферментов, обеспечивающих синтез рекомбинантного двухцепочечного ДНК-провируса и его интеграцию в геном клеток-мишеней. Отсутствие в таком рекомбинантном геноме полного набора генов ШУ-1 гарантирует безопасность испытаний эффективности новых анти-ШУ-1 соединений, с одной стороны, и возможность адекватной оценки действия этих соединений на обратную транскриптазу и интегразу ШУ-1 в клетках,трансдуцированных псевдо-ЩУ-1 частицами.

Мы показали возможность формирования псевдо-ШУ-1 частиц, содержащих мутантную лекарственно-устойчивую обратную транскриптазу или интегразу, что позволяет проводить скрининг потенциальных ингибиторов лекарственно-устойчивых форм ШУ-1.

Псевдотипирование псевдо-ШУ-1 частицы белками оболочки ретровирусов различной природы, в том числе и белком оболочки НГУ-1 (81^р120 + TMgp41), существенно расширяет возможности системы скрининга, позволяя проводить тестирование ингибиторов проникновения вирусов в клетку. Показано, что сульфатированные полисахариды различной природы (животного и растительного происхождения) с разной степенью эффективности подавляют трансдукцию клеток псевдо-ШУ-1 частицами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Прокофьева, Мария Михайловна, 2013 год

1. Stocking C., Kozak C.A. Murine endogenous retroviruses. Cell Mol. Life Sci. 2008. 65, 3383 -3398

2. Jern P., Coffin J.M. Effects of retroviruses on host genome function. Annu. Rev. Genet. 2008. 42, 709-732

3. Kuff E.L., Lueders K.K. The intracisternal A-particle gene family: structure and functional aspects. Adv Cancer Res 1988. 51,183-276

4. Goff S.P. Retroviridae: The Retroviruses and Their Replication. Fields Virology.// Eds. Knipe D.M., Howley P.M., Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2007. P. 2002-2069

5. Popovic M., Sarin P.S., Robert-Gurroff M., Kalyanaraman V.S., Mann D., Minowada I., Gallo R.C. Isolation and transmission of human retrovirus (human T-cell leukemia virus). Science. 1983. 219, 856-859.

6. Popovic M, Sarngadharan MG, Read E, Gallo R.C. Detection, isolation, and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science. 1984. 224 (4648), 497-500.

7. Levy J.A., Hoffman A.D., Kramer S.M., Landis J.A., Shimabukuro J.M., Oshiro L.S. Isolation of lymphocytopathic retroviruses from San Francisco patients with AIDS. Science. 1984. 225 (4664), 840-842.

8. Coffin J, Haase A, Levy JA, Montagnier L., Oroszlan S., Teich N., Temin H., Toyoshima K., Varmus H., Vogt P., et al. Human immunodeficiency viruses. Science. 1986. 232 (4751), 697.

9. Ratner L., Haseltine W., Patarca R., Livak K.J., Starcich B., Josephs S.F., Doran E.R., Rafalski J.A., Whitehorn E.A., Baumeister K., et al. Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV-III. Nature. 1985. 313 (6000), 277-284

10. Wain-Hobson S., Sonigo P., Danos O., Cole S., Alizon M. Nucleotide sequence of the AIDS virus, LAV. Cell. 1985. 40 (1), 9-17.

11. Clavel F., Guetard D., Brun-Vezinet F., Chamaret S., Rey M.A., Santos-Ferreira M.O., Laurent A.G., Dauguet C., Katlama C., Rouzioux C., et al. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science. 1986. 233 (4761), 343-346.

12. Brady J., Kashanchi F. Tat gets the "Green" light on transcription initiation. Retrovir ology. 2005. 2,1-8

13. Henriet S., Richer D., Bernacchi S., Decroly E., Vigne R., Ehresmann B., Ehresmann C., Paillart J. C., Marquet R. Cooperative and specific binding of Vif to the 5' region of HIV-1 genomic RNA. J.Mol.Biol. 2005. 354, 55-72.

14. Lever A. M., Strappe P. M., Zhao J. Lentiviral vectors. J.Biomed.Sci. 2004. 11,439-449.

15. Das S. R., Jameel S. Biology of the fflV Nef protein. Indian J.Med.Res. 2005. 121,315-332

16. Long D., Berson J.F., Cook D.G., Doms R.W. Characterization of human immunodeficiency virus type 1 gpl20 binding to liposomes containing galactosylceramide. J. Virol. 1994. 68, 5890-5898

17. WuDunn D., Spear P.G. Initial interaction of herpes simplex virus with cells is binding to heparan sulfate. J. Virol. 1989. 63, 52-58

18. Compton T., Nowlin D.M., Cooper N.R. Initiation of human cytomegalovirus infection requires initial interaction with cell surface heparan sulfate. Virology. 1993.193, 834-841

19. Su C.M., Liao C.L., Lee Y.L., Lin Y.L. Highly sulfated forms of heparin sulfate are involved in Japanese encephalitis virus infection. Virology. 2001. 286, 206-215

20. Klimstra W.B., Ryman K.D., Johnston R.E. Adaptation of Sindbis virus to BHK cells selects for use of heparan sulfate as an attachment receptor. J. Virol. 1998. 72, 7357-7366

21. Clapham P.R., McKnight A. HIV-1 receptors and cell tropism. Br. Med. Bull. 2001. 58, 43-59.

22. Michael N.L. Host genetic influences on HIV-1 pathogenesis. Curr. Opin. Immunol. 1999. 11, 466^74

23. Benkirane M., Jin D.Y., Chun R.F., Koup R.A., Jeang K.T. Mechanism of transdominant inhibition of CCR5-mediated HIV-1 infection by CCR5 delta32. J. Biol Chem. 1997. 272, 30603-30606

24. Scarlatti G., Tresoldi E., Bjorndal A., Fredriksson R., Colognesi C., Deng

25. H.K., Malnati M.S., Plebani A., Siccardi A.G., Littman D.R., Fenyö E.M., Lusso P. In vivo evolution of HIV-1 co-receptor usage and sensitivity to chemokine-mediated suppression. Nat. Med. 1997. 3 (11), 1259-1265

26. Habasque C., Aubry F., Jegou B., Samson M. Study of the HIV-1 receptors CD4, CXCR4, CCR5 and CCR3 in the human and rat testis. Mol. Hum. Reprod. 2002. 8 (5), 419-425.

27. Grivel J., Margolis L.B. CCR5- and CXCR4-tropic fflV-1 are equally cytopathic for their T-cell targets in human lymphoid tissue. Nat. Med. 1999. 5 (3), 344-346.

28. Hunter E., Swanstrom R. Retrovirus envelope glycoproteins. Curr. Top. Microbiol Immunol. 1990. 157, 187-253.

29. Davis C.B., Dikic I., Unutmaz D., Hill C.M., Arthos J., Siani M.A., Thompson D.A., Schlessinger J., Littman D.R. Signal transduction due to HIV-1 envelope interactions with chemokine receptors CXCR4 or CCR5. J. Exp. Med. 1997.186, 1793-1798

30. Chang, M. I., Panorchan P., Dobrowsky T. M., Tseng, Y., Wirt D. Single-molecule analysis of human immunodeficiency virus type 1 gpl20-receptor interactions in living cells. J. Virol. 2005. 79, 14748-14755.

31. McDonald D., Vodicka M.A., Lucero G., Svitkina T.M., Borisy G.G., Emerman M., Hope T.J. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. J. Cell. Biol. 2002. 159 (3), 441-452.

32. Roberts J.D., Bebenek K., Kunkel T.A. The accuracy of reverse transcriptase from HIV-1. Science. 1988. 242 (4882), 1171-1173

33. Depienne C., Mousnier A., Leh H., Le Rouzic E., Dormont D., Benichou S., Dargemont C. Characterization of the nuclear import pathway for HTV-1 integrase. J. Biol. Chem. 2001. 276, 18102-18107

34. Piller S.C., Caly L., Jans D.A. Nuclear import of the pre-integration complex (PIC): the Achilles heel ofHTV? Curr. Drug Targets. 2003. 4, 409-429

35. Nakienly S., Dreyfuss G. Transport of proteins and RNAs in and out of the nucleus. 1999. Cell. 99, 677-690

36. Goh W.C., Rogel M.E., Kinsey C.M., Michael S.F., Fultz P.N., Nowak M.A., Hahn B.H., Emerman M. HIV-1 Vpr increases viral expression by manipulation of the cell cycle: a mechanism for celection of Vpr in vivo. Nat. Med. 1998. 4, 65-71

37. Delelis O., Carayon K., Saïb A., Deprez E., Mouscadet J.F. Integrase and integration: biochemical activities of HIV-1 integrase. Retrovirology. 2008. 5, 114-126.

38. Schroder A.R., Shinn P., Chen H., Berry C., Ecker J.R., Bushman F. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 2002. 110, 521-529

39. Mikaélian I., Krieg M., Gait M. J., Karn J. Interactions of INS (CRS) elements and the splicing machinery regulate the production of Rev-responsive mRNAs. J. Mol. Biol. 1996. 257, 246-264.

40. Ott D. E. Cellular proteins detected in MV-1. Rev. Med. Virol. 2008. 18, 159— 175.

41. Willey R.L., Maldarelli F., Martin M.A., Strebel K. Human immunodeficiency virus type 1 Vpu protein induces rapid degradation of CD4. J. Virol. 1992. 66 (12). 7193-7200

42. Ganser-Pornillos B. K., Yeager M., Sundquist W. The structural biology of HIV assembly. Curr. Opin. Struct. Biol. 2008. 18, 203-217.

43. Briggs J. A. G., Krausslich H. The Molecular Architecture of HIV. J. Mol. Biol. 2011. 410, 491-500

44. McBride M.S., Panganiban A.T. The human immunodeficiency virus type 1 encapsidation site is a multipartite RNA element composed of functional hairpin structures. J. Virol. 1996. 70, 2963-2973.

45. Kohlstaedt L. A., Wang J., Friedman J. M., Rice P. A., Steitz T. A. Crystal structure at 3.5 A resolution of HIV-1 reverse transcriptase complexed with an inhibitor. Science. 1992. 256 (5065), 1783-1790

46. Sluis-Cremer N., Arion D., Abram M.E., Parniak M.A. Proteolytic processing of an HIV-1 pol polyprotein precursor: insights into the mechanism of reverse transcriptase p66/p51 heterodimer formation. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. 36(9), 1836-1847.

47. Huang H., Chopra R., Verdine G., Harrison S. Structure of covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: implications for drug resistance. Science. 1998. 282 (5394), 1669-1675

48. Bavand M.R., Wagner R., Richmond T.J. HIV-1 reverse transcriptase: polymerization properties of the p51 homodimer compared to the p66/p51 heterodimer. Biochemistry. 1993. 32(40), 10543-10552.

49. Zheng X., Mueller G.A., Cuneo M.J., Derose E.F., London R.E. Homodimerization of the p51 subunit of HTV-1 reverse transcriptase. Biochemistry. 2010. 49(13), 2821-2833.

50. Cihlar T., Ray A.S. Nucleoside and nucleotide HIV reverse transcriptase inhibitors: 25 years after zidovudin. Antiviral Res. 2010. 85, 39-58

51. De Clercq E. The history of antiretrovirals: key discoveries over the past 25 years. Rev. Med. Virol. 2009. 19, 287-299.

52. Lavie A., Schlichting I., Vetter I. R., Konrad M., Reinstein J. and Goody R. S. The bottleneck in AZT activation. Nat. Med. 1997. 3, 922-924

53. Lavie A., Vetter I. R., Konrad M., Goody R. S., Reinstein J., Schlichting I. Structure of thymidylate kinase reveals the cause behind the limiting step in AZT activation. Nat. Struct. Biol. 1997. 4, 601-604

54. Schneider B., Xu Y. W., Sellam O., Sarfati R., Janin J., Veron M., Deville-Bonne D. Pre-steady state of reaction of nucleoside diphosphate kinase with anti-HTV nucleotides. J. Biol. Chem. 1998. 273 (19), 11491-11497

55. Rosenblum L.L., Patton G., Grigg A.R., Frater A.J., Cain D., Erlwein O., Hill C.L., Clarke J.R., McClure M.O. Differential susceptibility of retroviruses to nucleoside analogues. Antivir. Chem. Chemother. 2001. 12 (2), 91-97

56. Smith R.A., Gottlieb G.S., Miller A.D. Susceptibility of the human retrovirus XMRV to antiretroviral inhibitors. Retrovirology. 2010. 7, 70-81

57. Dahlberg J. E., Mitsuya H., Blam S. B., Broder S., Aaronson S. A. Broad spectrum antiretroviral activity of 2',3'-dideoxynucleosides. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1987. 84, 2469-2473

58. Doong S.L., Tsai C.H., Schinazi R.F., Liotta D.C., Cheng Y.C. Inhibition of the replication of hepatitis B virus in vitro by 2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine and related analogues. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. 88 (19), 8495-8499.

59. Antimicrob. Agents Chemother. 1992. 36 (11), 2423-2431.

60. Schinazi R.F., Boudinot F.D., Ibrahim S.S., Manning C., McClure H.M., Liotta D.C. Pharmacokinetics and metabolism of racemic 2',3'-dideoxy-5-fluoro-3'-thiacytidine in rhesus monkeys. Antimicrob. Agents Chemother. 1992. 36, 2432-2438.

61. Richman D. D. Susceptibility to nucleoside analogues of zidovudine-resistant isolates of human immunodeficiency virus. Am. J. Med. 1990. 88 (5B), 8S-10S

62. Anderson P. L., Rower J. E. Zidovudine and Lamivudine for HIV Infection. Clin. Med. Rev. Ther. 2010. 2, a2004.

63. De Clercq E. Emerging antiviral drugs. Exp. Opin. Emerging Drugs. 2008. 13, 393-416.

64. Arion D., Parniak M.A. HIV resistance to zidovudine: the role of pyrophosphorolysis. Drug Resist. Updat. 1999. 2(2), 91-95.

65. Cruchaga C., Anso E., Rouzaut A., Martinez-Irujo J. J. Selective excision of chain-terminating nucleotides by HIV-1 reverse transcriptase with phosphonoformate as substrate. J. Biol. Chem. 2006. 281(38), 27744-27752

66. Coffin J. M. HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy. Science. 1995. 267 (5197), 483^89

67. Larder B. A., Darby G., Richman D. D. HIV with reduced sensitivity to zidovudine (AZT) isolated during prolonged therapy. Science. 1989. 243 (4899), 1731-1734

68. Kellam P., Boucher C. A., Larder B. A. Fifth mutation in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase contributes to thedevelopment of high-level resistance to zidovudine. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1992. 89, 1934-1938,

69. Larder B. A., Kemp S. D. Multiple mutations in HIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine (AZT). Science. 1989. 246 (4934), 1155-1158

70. Richman D. D., Guatelli J. C., Grimes J., Tsiatis A., Gingeras T. Detection of mutations associated with zidovudine resistance in human immunodeficiency virus by use of the polymerase chain reaction. J. Infect. Dis. 1991. 164, 1075— 1081

71. Larder B. A., Coates K. E., Kemp S. D. Zidovudineresistant human immunodeficiency virus selected by passage in cell culture. J. Virol. 1991. 65, 5232-5236

72. Gao Q., Gu Z. X., Parniak M. A., Li X. G., Wamberg M.A. In vitro selection of variants of human immunodeficiency virus type 1 resistant to 3'-azido-3'-deoxythymidine and 2',3'-dideoxyinosine. J. Virol. 1992. 66, 12-19

73. Izopet J., Bicart-See A., Pasquier C., SandRes. K., Bonnet E., Marchou B., Puel J., Massip P. Mutations conferring resistance to zidovudine diminish the antiviral effect of stavudine plus didanosine. J. Med. Virol. 1999. 59 (4), 507511

74. Lacey S. F., Larder B. A. Mutagenic study of codons 74 and 215 of the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase, which are significant in nucleoside analog resistance. J. Virol. 1994. 68 (5), 3421-3424

75. Frost S. D., Nijhuis M., Schuurman R., Boucher C. A., Brown A. J. Evolution of lamivudine resistance in human immunodeficiency virus type 1-infected individuals: the relative roles of drift and selection. J. Virol. 2000. 74 (14), 6262-6268

76. Goldschmidt V., Marquet R. Primer unblocking by HIV-1 reverse transcriptase and resistance to nucleoside RT inhibitors (NRTIs). Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2004. 36 (9), 1687-1705

77. Deval J., Courcambeck J., Selmi B., Boretto J., Canard B. Structural determinants and molecular mechanisms for the resistance of HIV-1 RT to nucleoside analogues. Curr. Drug Metab. 2004. 5 (4), 305-316

78. Feng J. Y., Anderson K. S. Mechanistic studies examining the efficiency and fidelity of DNA synthesis by the 3TC-resistant mutant (184V) of HIV-1 reverse transcriptase. Biochemistry. 1999. 38 (29), 9440-9448

79. Larder B.A., Kemp S.D. Multiple mutations in HIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine (AZT). Science. 1989. 246(4934),1155-1158.

80. Pokholok D.K., Gudima S.O., Yesipov D.S., Dobrynin V.N., Rechinsky V.O., Kochetkov S.N. Interactions of the HTV-1 reverse transcriptase 'AZT-resistant' mutant with substrates and AZT-TP. FEBS Lett. 1993. 325(3), 237241.

81. Hsieh J. C., Zinnen S., Modrich P. Kinetic mechanism of the DNA-dependent DNA polymerase activity of human immunodeficiency virus reverse transcriptase. J. Biol. Chem. 1993. 268 (33), 24607-24613

82. Reardon J. E. Human immunodeficiency virus reverse transcriptase: a kinetic analysis of RNA-dependent and DNAdependent DNA polymerization. J. Biol. Chem. 1993. 268 (12), 8743-8751

83. Naeger L. K., Margot N. A., Miller M. D. ATP-dependent removal of nucleoside reverse transcriptase inhibitors by human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Antimicrob. Agents Chemother. 2002. 46 (7), 2179-2184

84. De Clercq E., Holy A., Rosenberg I., Sakuma T., Balzarini J., Maudgal P.C. A novel selective broad-spectrum anti-DNA virus agent. Nature. 1986. 323 (6087), 464-467.

85. Miyasaka T., Tanaka H., Baba M., Hayakawa H., Walker R.T., Balzarini J., De Clercq E. A novel lead for specific anti-HIV-1 agents: l-(2-hydroxyethoxy)methyl.-6-(phenylthio)thymine. J. Med. Chem. 1989. 32(12),2507-9.

86. Grob P.M., Wu J.C., Cohen K.A., Ingraham R.H., Shih C.K., Hargrave K.D., McTague T.L., Merluzzi V.J. Nonnucleoside inhibitors of HTV-1 reverse transcriptase: nevirapine as a prototype drug. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1992. 8(2), 145-152

87. Scott L.J., Perry C.M. Delavirdine: a review of its use in HIV infection. Drugs. 2000. 60 (6), 1411-1444

88. De Clercq E. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs): past, present, and future. Chem. Biodivers. 2004. 1 (1), 44-64.

89. Jayaweera D.T., Espinoza L., Castro J. Etravirine: the renaissance of nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors. Exp. Opin. Pharmacother. 2008. 9 (17), 3083-3094

90. Ding J., Das K., Moereels H., Koymans L., Andries K., Janssen P.A., Hughes S.H., Arnold E. Structure of HTV-1 RT/TIBO R 86183 complex reveals similarity in the binding of diverse nonnucleoside inhibitors. Nature Struct. Biol. 1995. 2 (5), 407-415.

91. Tachedjian G., Goff S.P. The effect of NNRTIs on HIV reverse transcriptase dimerization. Curr. Opin. Investig. Drugs. 2003. 4 (8), 966-73

92. Ren J., Milton J., Weaver K.L., Short S.A., Stuart D.I., Stammers D.K. Structural basis for the resilience of efavirenz (DMP-266) to drug resistance mutations in HIV-1 reverse transcriptase. Structure. 2000. 8 (10), 1089-1094.

93. Fletcher R.S., Syed K., Mithani S., Dmitrienko G.I., Parniak M.A. Carboxanilide derivative non-nucleoside inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase interact with different mechanistic forms of the enzyme. Biochemistry. 1995. 34 (13), 4346-4353.

94. Rittinger K., Divita G., Goody R.S. Human immunodeficiency virus reverse transcriptase substrate-induced conformational changes and the mechanism of inhibition by nonnucleoside inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. 92 (17), 8046-8049.

95. Zhou Z., Madrid M., Evanseck J.D., Madura J.D. Effect of a bound non-nucleoside RT inhibitor on the dynamics of wild-type and mutant HIV-1 reverse transcriptase. J. Am. Chem. Soc. 2005. 127 (49), 17253-17260.

96. Hang J.Q., Li Y., Yang Y., Cammack N., Mirzadegan T., Klumpp K. Substrate-dependent inhibition or stimulation of HIV RNase H activity by non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs). Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. 352 (2), 341-350.

97. Cheung P.K., Wynhoven B., Harrigan P.R. 2004: which HIV-1 drug resistance mutations are common in clinical practice? AIDS Rev. 2004. 6 (2), 107-16.

98. Pommier Y., Johnson A.A., Marchand C. Integrase inhibitors to treat HIV/AIDS. Nature Rev. DrugDiscov. 2005. 4 (3), 236-248.

99. Di Santo R., Costi R., Artico M., Tramontano E., La Colla P., Pani A. fflV-1 integrase inhibitors that block HIV-1 replication in infected cells. Planning synthetic derivatives from natural products. Pure and Applied Chemistry. 2003. 75 (2-3), 195-206

100. Madruga J.V., Cahn P., Grinsztejn B., Haubrich R., Lalezari J., Mills A., Pialoux G., Wilkin T., Peeters M., Vingerhoets J., de Smedt G., Leopold L., Trefiglio R., Woodfall B.; DUET-1 study group. Efficacy and safety of

101. TMC125 (etravirine) in treatment-experienced HIV-1-infected patients in DUET-1: 24-week results froma randomised, double-blind, placebocontrolled trial. Lancet. 2007. 370 (9581), 29-38.

102. Pauwels R. Aspects of successful drug discovery and development. Antiviral Res. 2006. 71 (2-3), 77-89

103. Roberts N.A., Martin J.A., Kinchington D., Broadhurst A.V., Craig J.C., Duncan I.B., Galpin S.A., Handa B.K., Kay J., Krohn A., et al. Rational design of peptide-based HIV proteinase inhibitors. Science. 1990. 248 (4953), 358-361.

104. Erickson J.W. 2001. HTV-1 protease as a target for AIDS therapy. In Protease Inhibitors in AIDS Therapy. Ogden RC, Flexner CW (eds). Marcel Dekker Inc., New York, Basel, 1-25.

105. Wensing A.M.J., van Maarseveen N.M., Nijhuis M. Fifteen years of HIV Protease Inhibitors: raising the barrier to resistance. Antiviral Res. 2010. 85 (1), 59-74

106. Clavel F., Hance A.J. HIV drug resistance. N. Engl. J. Med. 2004. 350 (10), 1023-1035.

107. Nijhuis M., van Maarseveen N.M., Boucher C.A. HTV protease resistance and viral fitness. Curr. Opin. HIV AIDS. 2007. 2(2), 108-15.

108. Matthews T., Salgo M., Greenberg M., Chung J., DeMasi R., Bolognesi D. Enfuvirtide: the first therapy to inhibit the entry of HTV-1 into host CD4 lymphocytes. Nature Rev. Drug Discov. 2004. 3 (3), 215-225.

109. Wild С., Greenwell Т., Matthews Т. A synthetic peptide from HIV-1 gp41 is a potent inhibitor of virus-mediated cell-cell fusion. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1993. 9 (11), 1051-1053

110. Briz V., Poveda E., Soriano V. HIV entry inhibitors: mechanisms of action and resistance pathway. J. Antimicrob. Chemother. 2006. 57 (4), 619-627

111. Este J.A., Telenti A. 2007. HIV entry inhibitors. Lancet. 370 (9581), 81-88.

112. Perros M. CCR5 antagonists for the treatment of HIV infection and AIDS. Adv. Antiviral Drug Design 2007. 5, 185-212

113. Pirrone V., Wigdah В., Krebs F.C. The rise and fall of polyanionic inhibitors of the human immunodeficiency virus type 1. Antiviral Res. 2011. 90 (3), 168-182.

114. Ghosh Т., Chattopadhyay K., Marschall M., Karmakar P., Mandal P., Ray B. Focus on antivirally active sulfated polysaccharides: From structure-activity analysis to clinical evaluation. Glycobiology. 2009. 19 (1), 2-15

115. Venkataraman G, Shriver Z, Raman R, Sasisekharan R. Sequencing complex polysaccharides. Science. 1999. 286 (5439), 537-542

116. Painter T.J. Algal polysaccharides. In: Aspinall GO, editor. The Polysaccharides. New York: Academic Press, 1983. V. 2, 195-285.

117. Berteau O, Mulloy B. Sulfated fucans, fresh perspectives: Structures,functions and biological functions of sulfated fucans and an overview of enzymes active towards this class of polysaccharides. Glycobiology. 2003. 13 (6), 29R-40R

118. Rabenstein D.L. Heparin and heparan sulfate: structure and function. Nat. Prod. Rep. 2002.19 (3), 312-331

119. Malavaki C.J., Theocharis A.D., Lamari F.N., Kanakis I., Tsegenidis Т., Tzanakakis G.N., Karamanos N.K. Heparan sulfate: biological significance, tools for biochemical analysis and structural characterization. Biomed. Chromatogr. 2011. 25 (1-2), 11-20

120. Kellam P., Larder B. Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates. Antimicrob Agents Chemother. 1994. 38(1),23-30.

121. Walter H., Schmidt В., Korn К., Vandamme A.M., Harrer Т., Uberla К. Rapid, phenotypic HTV-1 drug sensitivity assay for protease and reverse transcriptase inhibitors. J. Clin. Virol. 1999. 13 (1-2), 71-80

122. Garcia-Perez J., Sanchez-Palomino S., Perez-Olmeda M., Fernandez В., Alcami J. A new strategy based on recombinant viruses as a tool for assessing drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1. J. Med. Virol. 2007. 79 (2), 127-137.

123. Naldini L., Blomer U., Gallay P., Ory D., Mulligan R., Gage F.H., Verma I.M., Trono D. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 1996. 272 (5259), 263-267

124. Zufferey R., Nagy D., Mandel R.J., Naldini L., Trono D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat. Biotechnol. 1997. 15 (9), 871-875.

125. Poeschla E. M., Wong-Staal F., Looney D.J. Efficient transduction of nondividing human cells by feline immunodeficiency virus lentiviral vectors. Nat. Med. 1998. 4 (3), 354-357.

126. Berkowitz R., lives H., Lin W.Y., Eckert K., Coward A., Tamaki S., Veres G., Plavec I. Construction and molecular analysis of gene transfer systems derived from bovine immunodeficiency virus. J. Virol. 2001. 75 (7), 33713382.

127. Olsen J.C. Gene transfer vectors derived from equine infectious anemia virus. Gene Ther. 1998. 5 (11), 1481-1487.

128. Metharom P., Takyar S., Xia H.H., Ellem K.A., Macmillan J., Shepherd R.W., Wilcox G.E., Wei M.Q. Novel bovine lentiviral vectors based on Jembrana disease virus. J. Gene Med. 2000. 2 (3), 176-185.

129. Carroll R., Lin J.T., Dacquel E.J., Mosca J.D., Burke D.S., St Louis D.C. A human immunodeficiency virus type 1 (HTV-l)-based retroviral vector system utilizing stable HIV-1 packaging cell lines. J. Virol. 1994. 68 (9), 6047-6051

130. Blomer U., Naldini L., Kafri T., Trono D., Verma I.M., Gage F.H. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J. Virol. 1997. 71 (9), 6641-6649

131. Haselhorst D., Kaye J.F., Lever A.M. Development of cell lines stably expressing human immunodeficiency virus type 1 proteins for studies in encapsidation and gene transfer. J. Gen. Virol. 1998. 79 (2), 231-237.

132. Farson D., Witt R., McGuinness R., Dull T., Kelly M., Song J., Radeke R., Bukovsky A., Consiglio A., Naldini L. A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors. Hum. Gene Ther. 2001. 12 (8), 981997.

133. Sparacio S., Pfeiffer T., Schaal H., Bosch V. Generation of a flexible cell line with regulatable, high-level expression of HIV Gag/Pol particles capable of packaging MV-derived vectors. Mol. Ther. 2001. 3 (4), 602-612.

134. Ikeda Y., Takeuchi Y., Martin F., Cosset F.L., Mitrophanous K., Collins M. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nat. Biotechnol. 2003. 21 (5), 569-572

135. Coil D.A., Miller A.D. Phosphatisylserine is not the cell surface receptor for vesicular stomatitis virus. J. Virol. 2004. 78, 10920-10926

136. Bjerke M., Franco M., Johansson M., Balzarini J., Karlsson A. Increased mitochondrial DNA copy-number in CEM cells resistant to delayed toxicity of 2'.3'-dideoxycytidine. Biochem. Pharmacol. 2008. 75(6), 1313-1321

137. Groschel B., Hover G., Doerr H.W., Cinatl J. Jr. Zidovudine (AZT) resistance in H9 cells due to decreased TK expression is associated with hypermethylation of TK gene Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2001. 20(4-7), 487-492

138. Arion D., Parniak M.A. HIV resistance to zidovudine: the role of pyrophosphorolysis. Drug Resist Updat. 1999. 2(2), 91-95.

139. Isaguliants M.G., Belikov S.V., Starodubova E.S., Gizatullin R.Z,. Rollman E., Zuber В., Zuber A.K., Grishchenko O.I., Rytting A.S., Källander

140. C.F., Kochetkov S.N., Karpov V.L., Wahren В. Mutations conferring drug resistance affect eukaryotic expression of HIV type 1 reverse transcriptase. AIDS Res Hum Retroviruses. 2004. 20(2), 191-201.

141. Ni X., Delelis O., Charpentier C., Storto A., Collin G., Damond F., Descamps

142. D. Mouscadet J. G140S/Q148R and N155H mutations render HIV-2 Integraseresistant to Raltegravir whereas Y143C does not. Retrovirology. 2011. 8, 6877

143. Piralla A., Paolucci S., Gulminetti R., Comolli G., Baldanti F. HIV integrase variability and genetic barrier in antiretroviral na'ive and experienced patients. Virology Journal 2011. 8, 149-157