Разработка эффективного дрожжевого продуцента янтарной кислоты для ферментации при низких значениях pH тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Юзбашев, Тигран Владимирович

• Юзбашев, Тигран Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Юзбашев, Тигран Владимирович

I. ВВЕДЕНИЕ.

1. Актуальность темы.

2. Цели и задачи исследования.

3. Научная новизна.

4. Практическая ценность работы.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Потребность в янтарной кислоте и перспективы ее производства.

2. Пути синтеза янтарной кислоты в клетке.

3. Механизм токсичного действия слабых органических кислот.

4. Выбор метаболического пути и микроорганизма для продукции янтарной кислоты при низких значениях рН.

5. Некоторые особенности центрального метаболизма У Иро1уИса.

6. Экологический аспект производства био-сукцината.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Среды и штаммы.

2. Идентификация ОКР в геноме У Иро1уИса.

3. Конструирование плазмид р1ЖА-с!8ВН1 и риКА-сШЗБШ.

4. Конструирование плазмид риС19-иКАЗ-КРТ и рК-1гр4с1-Нр2.

5. Последовательное введение копий гена ЫР2 в геном У Нро1уйса.

6. Конструирование штамма с ТБ-мутацией в гене £ОЯ7.

7. Конструирование штамма с делецией по гену ££>//2.

8. Конструирование ига+ производного штамма от Ро15.

9. Химический мутагенез дрожжей У. Иро\уйса.

10. Условия культивирования и определение скорости роста.

11. Периодическое культивирование в ферментере.

12. ВЭЖХ анализ состава культуральной жидкости.

13. Измерение активности сукцинатдегидрогеназы.

14. Измерение активности липазы.

15. Гибридизация по Саузерну.

16. Анализ 13С-изотопомеров янтарной кислоты.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Инактивация сукцинатдегидрогеназы в штамме Y. lipolytica Polf.

1.1. Попытка инактивация гена SDH1 в штамме Y. lipolytica Polf.

1.2. Разработка подхода для отбора Ts-мутаций по летальным генам в Y. lipolytica, на примере гена SDH1.

1.3. Инактивация гена SDH2 в штамме Y. lipolytica Polf.

1.4. Измерение активности сукцинатдегидрогеназы в штаммах Y. lipolytica, дефектных по субъединицам Sdhl и Sdh2.

1.5. Влияние инактивации субъединиц Sdhl и Sdh2 в Y lipolytica на продукцию янтарной кислоты.

2. Селекция штамма Y lipolytica PolfAsdh2 на повышение продукции янтарной кислоты

2.1. Селекция штамма PolfAsdh2 на повышение жизнеспособности.

2.2. Селекция мутантов #3 и #18 на повышение устойчивости к янтарной кислоте

2.3. Селекция мутанта #18-12 на повышение устойчивости к янтарной кислоте.

3. Характеризация полученного штамма Y. lipolytica #18-12-35.

3.1. Динамика накопления янтарной кислоты штаммом #18-12-35.

3.2. Анализ метаболического пути синтеза янтарной кислоты в штамме Y. lipolytica, лишенном активности сукцинатдегидрогеназы.

4. Разработка системы для последовательной многокопийной интегративной трансформации штаммов Y. lipolytica.

4.1. Разработка интегративного вектора для последовательного введения копий в штаммы Y. lipolytica.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка эффективного дрожжевого продуцента янтарной кислоты для ферментации при низких значениях pH»

1. Актуальность темы

Биотехнология как наука в век высоких технологий является одной из востребованных и, как следствие, быстрорастущих областей знаний. Одной из основных задач современной биотехнологии является необходимость глобального перехода мировой промышленности с невозобновляемых природных ресурсов (таких, как нефть и газ) на возобновляемые (растительное сырье). Для этого необходимы технологии, которые позволят эффективно преобразовывать растительные углеводы и жиры в компоненты, служащие сырьем для химической промышленности и энергетики. Решением поставленной задачи является использование микроорганизмов, специально разработанных для этих целей.

Янтарная кислота — двухосновная карбоновая кислота, интермедиат цикла Кребса, накапливается некоторыми анаэробными бактериями в качестве продукта брожения (Song and Sang 2006). Наличие двух карбоксильных групп, расположенных по краям молекулы, позволяет получать на ее основе многие химические соединения, среди которых важные предшественники органического синтеза, полимеры, растворители, детергенты и др. (Sauer et al. 2008). Янтарная кислота в виде солей, сукцинатов, в больших масштабах применяется в роли антиобледенителей на ответственных участках дорог и аэропортов. По оценке специалистов министерства энергетики США, янтарная кислота входит в список 12 веществ, которые в ближайшем будущем будут производиться из биомассы и придут на смену продуктам нефтехимииhttp://www 1 .eere.eneray.gov/biomass/pdfs/35523.pdi'). Тем* не менее в настоящее время основным источником янтарной кислоты является 1,4-бутандиол, получаемый из нефти. Однако в Европе и США уже действуют 5; экспериментальных установок, производящих янтарную; кислоту путем ферментации из возобновляемого сырья (Chailener 2009).

Производство янтарной кислоты- с применением» бактериальных: культур- имеет существенный недостаток с точки зрения экономичности;1 процесса;, В ходе: ферментации происходит накопление кислоты, и, так, как ферментацию необходимо, вести при нейтральных значениях рН, требуется эквимолярный расход ¡щелочи. Более подходящими для этих целой могли бы быть- грибные или дрожжевые: культуры, среди которых многие штаммы обладают, способностью1 адаптироваться к кислотной среде. Однако в немногочисленных работах, опубликованных на данный момент . и описывающих накопление сукцината эукариотами, уровни .продукции несопоставимо низки по . сравнению с результатами, продемонстрированными на бактериях (Gallmetzer et al. 2002: Lupianez et al. 1974; Muratsubaki 1987; Sato 1972). Исходя из' этого перед нами была; поставлена задача, конструирования дрожжевого; штамма, накапливающего янтарную' кислоту в условиях, не требующих добавления нейтрализующего агентш .Потенциально применение такого; штамма: в промышленргости может позволить снизить, себестоимость производимой янтарной кислоты, а значит, увеличить конкурентоспособность продукта по отношению к янтарной кислоте, производимой из нефти.

2. Цёли и задачи исследования

Данная работа посвящена изучению возможности микробиологической продукции янтарной кислоты в условиях, не требующих добавления титрующего агента.,

В связи: с этим ставились следующие.задачи:

- выбор; подходящего микроорганизма^ оптимальных условий ферментации и. пути синтеза, для продукции янтарной кислоты в. условиях без титрующего агента;

- конструирование штамма дрожжей, накапливающего янтарную кислоту;

- оптимизация штамма методом селекции для продукции янтарной кислоты в условиях без титрующего агента;

- анализ и характеристика полученного дрожжевого штамма-продуцента.

3. Научная новизна

В работе впервые продемонстрирована потенциальная возможность микробного синтеза янтарной кислоты в условиях без добавления титрующего агента. До настоящего времени были описаны лишь бактериальные штаммы, продуцирующие значимые количества янтарной кислоты (Jantama et al. 2008а). Биосинтез у них происходит по восстановительной ветви цикла Кребса в анаэробных условиях культивирования. Из энергетических соображений при этой метаболической схеме синтеза невозможно вести ферментацию без рН-статирования. В представленной работе синтез янтарной кислоты осуществляется дрожжами Yarrowia lipolytica при использовании окислительной ветви-цикла Кребса в аэробных условиях. Благодаря активной дыхательной цепи клетки обладают большей энергией и способны адаптироваться к низким значениям рН и высокой концентрации янтарной кислоты1 в среде. В работе использован оригинальный подход для изоляции Ts-мутаций по гену • SDH1, кодирующему флавин-содержащую субъединицу сукцинатдегидрогеназы. Полученный штамм использован для подбора условий селекции трансформанта с делецией по гену SDH2. На основе штамма с делецией по гену SDH2 селекцией в три этапа получен мутант #18-12-35, накапливающий янтарную кислоту в условиях без нейтрализующего агента в количестве до 63 г/л. С использованием методов ЯМР и ПМР определены особенности биосинтеза янтарной кислоты у предшествующего мутанта #18-12.

Необходимо отметить, что исходный штамм, несущий делецию по гену SDH2,' оказался не способен утилизировать глюкозу, по рос на средах с, глицерином. Такой; фенотип может быть объяснен с: точки зрения разной энергии окисления глицерина и глюкозы, получаемой« в виде: АТР при-окислительном; фосфорилировании. Однако в ходе дальнейшей селекции на основе штамма» с: делецией были получены производные;, способные утилизировать глюкозу и накапливать янтарную кислоту. Трудно^ предположить, будет ли такое предпочтение в отношении субстратов.общим для других аэробных дрожжей, поскольку инактивация, сукцинатдегидрогеназы у облигатно аэробного микроорганизма, т.е. микроорганизма; не способного к брожению, в работе показана впервые. 4. Практическая ценность работы

Производство янтарной- кислоты является одним из приоритетных направлений? современной; биотехнологии. Наиболее затратной стадией при производстве янтарной кислоты является ферментация, • требующая для поддержания нейтральных значений рН расхода эквимолярных количеств щелочи.' В работе впервые показана принципиальная возможность микробного синтеза янтарной кислоты- при низких значениях рН, что позволяет избежать нежелательного расхода- нейтрализующего; агента, и; как следствие, существенно снизить себестоимость продукта. Основным физиологическим: фактором, препятствующим накоплению слабой органической кислоты без ее нейтрализации-щелочью, является недостаток метаболической? энергии, необходимой« для адаптации» клеток к кислотным условиям среды в, ходе ферментации. В связи с этим в работе-сконструирован дрожжевой штамм, синтезирующий янтарную кис лоту через окислительную ветвь цикла Кребса. Такой путь синтеза. позволяет вести процесс, в аэробных условиях при? активном- дыхании, что обеспечивает клетку избытком: энергии, необходимой для адаптации клеток к высокой концентрации кислоты и низкому значению рН. Результаты исследования представляют потенциальный интерес для биотехнологии и могут быть использованы для получения промышленного дрожжевого штамма-продуцента янтарной кислоты, обладающего рядом преимуществ по сравнению с существующими бактериальными продуцентами. Сконструированный дрожжевой штамм #18-12-35 накапливает янтарную кислоту в количестве до 63 г/л при росте на среде с глицерином и не требует поддержания нейтральных значений рН среды при ферментации.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Юзбашев, Тигран Владимирович

VI. выводы

1. Разработан подход для направленного получения Тэ-мутаций в летальных и условно-летальных генах дрожжей У. Иро1уйса. Предложенный подход успешно использован для получения Тэ-мутаций (С1и483Ьуз и 8ег675РЬе) в гене БЭШ дрожжей У. Иро1уИса.

2. Впервые на облигатно-аэробном микроорганизме изучены свойства штамма, лишенного активности сукцинатдегидрогеназы. Инактивация сукцинатдегидрогеназы в диком штамме дрожжей У. Иро1уИса приводит к неспособности культуры расти на средах с глюкозой, при этом культура утилизирует глицерин и накапливает значительные количества янтарной кислоты. В результате использования селекционного подхода из штамма с делецией по гену 57Ж2 получен мутант #18-12, способный утилизировать глюкозу и накапливать янтарную кислоту.

3. Впервые продемонстрирована принципиальная возможность микробной продукции янтарной кислоты в условиях без рН-статирования. Полученный штамм У Нро1уйса #18-12-35 способен накапливать до 63 г/л янтарной кислоты без добавления нейтрализующего агента.

4. Определены особенности биосинтеза янтарной кислоты в штамме

17

18-12, утилизирующем глюкозу. Анализ распределения С-меченых атомов углерода в спектре ЯМР и ПМР показал, что более 32% глюкозы утилизируется через пентозофосфатный путь и более 83% янтарной кислоты синтезируется по окислительной ветви цикла Кребса в митохондрии.

У. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе была поставлена цель по изучению возможности микробиологической продукции янтарной кислоты в условиях, не требующих добавления титрующего агента. На основе анализа литературы было сделано предположение, что основным препятствием на пути к конструированию такого микроорганизма-продуцента является нехватка метаболической энергии, необходимой для выброса из клетки анионов янтарной кислоты и поддержания нейтральных значений внутриклеточного рН. Исходя из этого, было предложено в конструируемом продуценте для синтеза янтарной кислоты в аэробных условиях использовать окислительную ветвь цикла Кребса. В качестве объекта были выбраны аэробные дрожжи Y. lipolytica, т.к. этот организм лишен метаболических путей, необходимых для брожения, и способен накапливать существенные количества ряда органических кислот — интермедиатов цикла Кребса.

Для конструирования штамма Y. lipolytica, продуцирующего янтарную кислоту, в первую очередь были изучены возможные подходы для инактивации ферментного комплекса сукцинтадегидрогеназы. На основе генетического эксперимента с использованием штамма Y. lipolytica со встроенной в геном плазмидой pURA-dSDHl было сделано предположение о летальном или условно летальном действии делеции по гену SDH1. Был разработан подход для направленного получения Ts-мутаций по летальным генам в Y. lipolytica. Полученные штаммы Ts#l, Ts#6 и Ts#8, несущие Ts-мутаций в гене SDH1, позволили установить, что инактивация сукцинатдегидрогеназы в Y. lipolytica ведет к условной летали, т.к. полученные штаммы оказались способны расти в непермиссивных условиях на средах, содержащих глицерин, но не росли на средах с глюкозой. Благодаря этому стало возможно отобрать трансформант PolfAsdh2 с делецией по гену SDH2. Измерение активности фермента сукцинатдегидрогеназы в штаммах Тб#6 и PolfAsdh2 показало, что мутация в каждой из двух субединиц, флавин-содержащей и железо-серной, приводит к потере функциональности всего комплекса. Также оба штамма при росте в богатой среде с глицерином- в присутствии нейтрализующего агента СаСОз накапливали около 20 г/л янтарной кислоты.

Штамм сделецией Ро1ТДзёЬ2 использовали для трехэтапной селекции на повышение продукции янтарной кислоты. В первом раунде, селекции после мутагенеза был получен штамм #18, обладающий большей жизнеспособностью и способный накапливать 17,5 г/л янтарной-кислоты в, условиях без стабилизации рН. В двух последующих раундах селекции на повышение устойчивости к янтарной, кислоте были получены- штаммы #18-1-2 и #18-12-35, накапливающие, соответственно, 32;2 и 47,6 г/л продукта в условиях без стабилизации рН.

При ферментации в колбах в богатой, среде с оптимальной концентрацией глицерина (10%) продукция штамма #18-12-35 на 6-ые сутки составила 63,2 г/л. Анализ динамики, накопления* янтарной кислоты в аналогичной среде в ферментере показал, что секреция основной массы продукта наблюдается уже после понижения рН* до- уровня 3,0, что свидетельствовало о* достижении поставленной цели исследования. Для анализа пути синтеза янтарной кислоты в полученных штаммах было предложено использовать изотопный анализ. Однако среди коммерчески доступных субстратов для такого исследования могла быть использована 1 только 1,6- С-глюкоза. Несколько мутантов, из числа полученных в ходе селекции, среди которых оказался* и промежуточный штамм #18-12, оказались способными расти на среде с глюкозой. Анализ распределения 13С-меченых атомов углерода в спектре ЯМР и ПМР выявил, что более 32% глюкозы утилизируется через пентозофосфатный путь и более 83% янтарной кислоты синтезируется по окислительной ветви цикла Кребса. По результатам анализа и с учетом наличия существенной (около 15% по массе) примеси а-кетоглутаровой кислоты было сделано предположение о недостаточной активности в полученных штаммах а-кетоглутаратдегидрогеназы. Для оптимизации свойств полученных штаммов-продуцентов в качестве дальнейшей перспективы было предложено увеличить активность этого ферментного комплекса путем повышения экспрессии соответствующих генов. Однако для реализации такой возможности требовалось разработать систему для эффективной одновременной экспрессии в У Нро1уНса нескольких различных генов.

В соответствии с этим была разработана система для последовательной многокопийной интегративной трансформации штаммов У. Иро1уйса. В качестве примера в геном штамма У. Нро1уНса РоН были последовательно введены 3 дополнительные копии гена ЫР2. Наличие копий и их эффективная экспрессия были продемонстрированы методом гибридизации по Саузерну и повышением активности липазы в культуральной жидкости, соответственно. В дальнейшем данная система может быть использована на полученных штаммах, продуцирующих янтарную кислоту при низких значениях рН, для одновременной экспрессии генов, кодирующих субъединицы а-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Юзбашев, Тигран Владимирович, 2011 год

1. Ильченко АП, Чернявская ОГ, Шишканова НВ, Финогенова ТВ. 2001.

2. Особенности метаболизма дрожжей Yarrowia lipolytica при синтезе из этанола а-кетоглутаровой и лимонной кислот. Влияние NH4+. и [Оо] на синтез и дыхание. Микробиология 70(2): 189-195.

3. Ильченко АП, Чернявская ОГ, Шишканова НВ, Финогенова ТВ. 2002.

4. Особенности метаболизма дрожжей Yarrowia lipolytica при синтезе из этанола а-кетоглутаровой и лимонной кислот. Сравнительное изучение функционирования ферментов центрального метаболизма. Микробиология 71(3):316-22.

5. Лозинова АБ, Финогенова ТВ, Шишканова НВ, Илларионова ВИ, Карклинь Р Я, Пелцмане ИЖ, Раминя ЛО, Лука ВТ, Кестарис Б Я; 1982. А.с. №695230 // Б.И. №23. С.307.

6. Синеокий СП, Юзбашев ТВ, Лаптев ИА, Юзбашева ЕЮ, Выборная ТВ, Соболевская ТИ; 2007. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica -продуцент липазы. Патент РФ № 2355754. Дата приоритета 25.12.2007.

7. Финогенова ТВ, Гринчак АВ, Илларионова ВИ, Шишканова НВ. 1979.

8. Биосинтез лимонной и изолимонной кислот природным и мутантным штаммами Candida lipolytica на средах с различными источниками углерода. Прикл. биохимия и микробиология 15(6):811-16.

9. Финогенова ТВ, Моргунов ИГ, Камзолова ОГ, Чернявская ОГ. 2005.

10. Перспективы производства органических кислот дрожжами Yarrowia lipolytica. Прикл. биохимия и микробиология 41(5):478-86.

11. Arikawa Y, Kuroyanagi T, ShiniosakaM,MuratsubakiFI, Enomoto K, Kodaira . R, Okazaki M. 1999. Effect of gene disruptions of the TCA cycle on production of succinic acid in Saccharomyces cerevisiae. J Biosci.Bioeng '■■'■; 87(l):28-36. \ ■ "

12. Bahler J, Wu JQ, Longtine MS, Shah NG, McKenzie A, 3rd, Steever AB, Wach. A, Philippsen P, Pringle JR. 1998. Heterologous modules for efficient;and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast 14(10):943-51. ' " ' . " ; v

13. Bankar AV, Kumar AR, Zinjarde SS. 2009. Environmental and industrialapplications of Yarrowia lipolytica. Appl Microbiol Biotechnol 84(5):847-65. V ' ' . . '

14. Barth G, Gaillardin C. 1997. Physiology and genetics of the dimorphic fungus

15. Yarrowia lipolytica. FEMS^-Micrpbipl-^^Rev 19(4);219-37. Bart h G, ScheuberT. 1993. Cloning of the isocitrate lyase gene (ICL1) from

16. Blank EM, Lehmbeck F, Sauer U. 2005. Metabolic-flux and'network analysis in fourteen'hemiascomycetous yeasts. FEMS Yeast Res 5(6-7):545-58.

17. Bordes F, Fudalej F, Dossat V, Nicaud JM, Marty A. 2007. A new recombinant protein expression system for high-throughput screening in the yeast Yarrowia lipolytica. J MicrobiolMethods 70(3):493-502.

18. Borges ER, Jr. PereiraN. 2010. Succinic acid production'from sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate by Actinobacillus succinogenes. J Ind Microbiol Biotechnol.

19. Bradford'MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-54.

20. Branduardi P, Fossati T, Sauer M, Pagani R, Mattanovich D, PorroD. 2007. Biosynthesis of vitamin C by yeast leads to increased.stress resistance. PEoSOne 2(10):el092.

21. Burghoorn HP, Soteropoulos P, Paderu P, Kashiwazaki R, Perlin DS. 2002. Molecular* evaluation of the plasma membrane proton pump from* Aspergillus fumigatus. Antimicrob*Agents Chemother 46(3):615-24.

22. Carmelo V, Santos H, Sa-Gorreia I. 1997. Effect of extracellular acidification on the activity of plasma membrane ATPase and on'the cytosolic and vacuolar pH of Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta 1325(l):63-70.

23. Challener C. 2009. Sugar never tasted so sweet. Speciality Chemicals Magazine (ISSN 0262-2262) 29 (5):42-44.

24. Corte-Real M, Eeao C. 1990. Transport of malic acid and other dicarboxylicacids in the yeast Hansenula anomala. Appl Environ Microbiol 56(4): 110913.

25. Donnelly MI, Millard CS, Clark DP, Chen MJ, Rathke JW. 1998. A novelfermentation pathway in an Escherichia coli mutant producing succinic acid, acetic acid, and ethanol. Appl Biochem Biotechnol 70-72:187-98.

26. Dower WJ, Miller JF, Ragsdale CW. 1988. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res 16(13):6127-45.

27. Dujon B, Sherman D, Fischer G, Durrens P, Casaregola S, Lafontaine I, De Montigny J, Marck C, Neuveglise C, Talla E and others. 2004. Genome evolution in yeasts. Nature 430(6995):35-44.

28. Fickers P, Destain J, Thonart P. 2009. Improvement of Yarrowia lipolytica lipase production by fed-batch fermentation. J Basic Microbiol 49(2):212-5.

29. Fickers P, Fudalej F, Nicaud JM, Destain J, Thonart P. 2005. Selection of new over-producing derivatives for the improvement of extracellular lipase production by the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica. J Biotechnol 115(4):379-86.

30. Fickers P, Le DallMT, Gaillardin C, Thonart P, Nicaud JM. 2003a. Newdisruption cassettes for rapid gene disruption and marker rescue in the yeast Yarrowia lipolytica. J Microbiol Methods 55(3):727-37.

31. Fickers P, Nicaud JM, Destain J, Thonart P. 2003b. Overproduction of lipase by Yarrowia lipolytica mutants. Appl Microbiol Biotechnol 63(2): 136-42.

32. Flores CL, Gancedo C. 2005. Yarrowia lipolytica mutants devoid of pyruvate carboxylase activity show an unusual growth phenotype. Eukaryot Cell 4(2):356-64.

33. Fournier P, GuyaneuxL, Chasles M, Gaillardin C. 1991. Scarcity of ars sequences isolated in a morphogenesis mutant of the yeast Yarrowia lipolytica. Yeast 7(l):25-36.

34. Gabrielczyk T. 2009. BASF setzt auf fermentation von plattformchemikalie.

35. Transkript (ISSN 1435-5272) Life Sciences-Magazine 15 Jahrgang 11:2829 (in german).

36. Gallmetzer M, Meraner J, Burgstaller W. 2002. Succinate synthesis and excretion by Penicillium simplicissimum under aerobic and anaerobic conditions. FEMS Microbiol Lett 210(2):221-5.

37. Goldberg I, Rokem S, Pines O. 2006. Organic acids: old metabolites, new themes. J Chem Tech Biotechnol 81(10): 1601-11.

38. Guettler MV, Jain MK, Rumler D; 1996. Method for making succinic acid,bacterial variants for use in the-process, and methods of obtaining variants. Patent US 5,573,931.

39. Jantama K, Zhang X, Moore JC, Shanmugam KT, Svoronos SA, Ingram LO. 2008b. Eliminating side products and increasing succinate yields in engineered strains of Escherichia coli C. Biotechnol Bioeng 101(5):881-93.

40. Juretzek T, Le Dall M, Mauersberger S, Gaillardin C, Barth G, Nicaud J. 2001. Vectors for gene expression and amplification in the yeast Yarrowia lipolytica. Yeast 18(2):97-113.

41. Kadonaga JT, Knowles JR. 1985.,A simple and efficient method for chemical mutagenesis of DNA. Nucleic Acids Res 13(5): 1733-45.

42. Kubo Y, Takagi H, Nakamori S. 2000. Effect of gene disruption of succinate dehydrogenase on succinate production in a sake yeast strain. J Biosci Bioeng 90(6):619-24.

43. Kunze M, Pracharoenwattana I, Smith SM, Hartig A. 2006. A central role for the peroxisomal membrane in glyoxylate cycle function. Biochim Biophys Acta 1763(12):1441-52.

44. Dall MT, Nicaud JM, Gaillardin C. 1994. Multiple-copy integration in the yeast Yarrowia lipolytica. Curr Genet 26(l):38-44.1.e SJ, Song H, Lee SY. 2006. Genome-based metabolic engineering of

45. Madzak C, Gaillardin G, Beckerich JM. 2004. Heterologous protein: expression-andsecretionin the non-conveiitionalyeast Yarrowialipolytica.J Biotechnol 109(l-2):63-81.

46. Madzak C, Treton B, Blanchin-Roland S. 2000: Strong hybrid promoters:andintegrative expression/secretionwectors for quasirconstitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J Mol Microbiol Biotechnol 2(2):207-16. •

47. Makri A, Fakas Si Aggelis G. 2010. Metabolic activities of biotechnological:interest m-Yarrowia lipolytica grown on glycerol inirepeated batch cultures. Bioresour Technol 101 (7):2351 -8.

48. Matsuoka MjUeda Y, Aiba S. 1980. Role and control of isocitrate lyase in Candida lipolytica. J Bacteriol 144(2):692-7.

49. McKinlay JB, Vieille C, Zeikus JG. 2007- Prospects for a bio-based succinate industry. Appl Microbiol Biotechnol 76(4):727-40. ,

50. Meynial-Salles I, Dorotyn S, Soucaille P. 2008. A new process for the continuous production of succinic acid from glucose at high yield, titer, and productivity. Biotechnol Bioeng 99(1): 129-35.

51. Muratsubaki H. 1987. Regulation of reductive production of succinate under anaerobic conditions in baker's yeast. J Biochem 102(4):705-14.

52. Nelson DL, Cox MM. 2004. Lehninger: Principles of Biochemistry: W. H. Freeman and Company.

53. Nicaud JM, Fabre E, Gaillardin C. 1989. Expression of invertase activity in ,

54. Yarrowia lipolytica and its use as a selective marker. Curr Genet 16(4):253-60.

55. Nicaud JM, Madzak C, van den Broek P, Gysler C, Duboc P; Niederberger P, Gaillardin C. 2002. Protein expression and secretion in the yeast Yarrowia lipolytica. FEMS Yeast Res 2(3):371-9.

56. Okino S, Noburyu R, Suda M, Jojima T, Inui M, Yukawa H. 2008. An efficient succinic acid production ^process in a metabolically engineered Corynebacterium glutamicum strain. Appl Microbiol Biotechnol 81(3):459-64.

57. Papanikolaou S, Galiotou-Panayotou M, Chevalot I, Komaitis M, Marc I, Aggelis G. 2006. Influence of glucose and saturated free-fatty acid mixtures on citric acid and lipid production by Yarrowia lipolytica. Curr Microbiol 52(2): 13442.

58. Papanikolaou S, Muniglia L, Chevalot I, Aggelis G, Marc I. 2002. Yarrowia lipolytica as a potential producer of citric acid from raw glycerol. J Appl Microbiol 92(4):737-44.

59. Pigiiede G, Wang H, Fudalej F,.Gaillardin G, Seman M, Nicaud JM: 2000.

60. Characterization of an extracellular lipase encoded by L1P2 in Yarrowia lipolytica. J Bacteriol 182(10):2802-10.

61. Pines O, Even-Rain S, Elnathan N, Battat E, Aharonov O, Gibson D, Goldberg 1. . 1996. 1'he cytosolic pathway of E-malic acid synthesis in Saccharomyces cerevisiae: the roleofliimarase. ApplMicrobiol Biotechnol 46(4):393-9.

62. Piot P. 2010. Manufacturing new platform chemicals. European biotechnology science'and; industry news (ISSN .1618-8276) issue 5-6; 9:38-39^

63. Piper PW. 1999: Yeast,superoxide dismutasemutants reveal,a pro-oxidant'action-ofweak organicacidlfood: preservatives. Free Radic BiolMed27(lT- • ' 12): 1219-27. . ' .'• . ■ '" •

64. Rane KD, Sims KA. 1994. Oxygen uptake and citric acid production by Candida lipolytica Y 1095. Biotechnol Bioeng 43(2): 131 -7.

65. Rane KD, Sims KA. 1995. Citric acid production by Candida lipolytica Y 1095 in cell recycle and fed-batch fermentors. Biotechnol Bioeng 46(4):325-32.

66. Saliola M, Bärtoccioni PC, De-Maria I, EodilT, Falcone C. 2004.The deletion of. the succinate dehydrogenasegenei^/SD/fiin Kluyveromyces lactis does not lead to respiratory deficiency. Eukaryot Cell 3(3):589-97.

67. Sambrook Jj Maniatis T, Fritsch EF. . 1989: Molecularcloning: a laboratory manual. ;N.:Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor.

68. Sato M, T. Nakahara, and K. Yamada. 1972. Fermentative production of succinic acid from n-paraffin by Candida.brumptii IFO 0731. Agric Biol Chem 36:1969-1974. .

69. Sauer M, Porro D; Mattanovich D, Branduardi P. 2008. Microbial production of organic acids: expanding the markets. Trends Biotechnol 26(2): 100-8.

70. Scholten E, Renz T, Thomas J. 2009. Continuous cultivation approach for fermentative succinic acid production from, crude glycerol by Basfia succiniciproducens DDI. Biotechnol Lett 31(12):1947-51.

71. Schuller C, Mamnun YM, Mollapour M, Krapf G, Schuster M, Bauer BE, Piper PW, Kuchler K. 2004. Global phenotypic analysis and transcriptional profiling defines the weak acid stress response regulon in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell 15(2):706-20.

72. Serrano R. 1988. H+-ATPase from plasma membranes of Saccharomycescerevisiae and A vena sativa roots: purification and reconstitution. Methods Enzymol 157:533-44.

73. Sineoky SP; Yuzbashev TV, Yuzbasheva EY, Sobolevskaya TI, Laptev IA,

74. Vybornaya TV; 2009. A method for production succinic acid using a yeast belonging to the genus Yarrowia. Patent Application WO 2010/087503 Al.1. Priority date 30.01.2009.

75. Smith EH, Janknecht R, Maher LJ, 3rd. 2007. Succinate inhibition of alphaketoglutarate-dependent enzymes in a yeast model of paraganglioma. Hum Mol Genet 16(24):3136-48.

76. Song H, Sang YL. 2006. Production of succinic acid by bacterial fermentation. Enzyme Microb Technol 39(3):352-61.

77. Szeto SS, Reinke SN, Sykes BD, Lemire BD. 2007. Ubiquinone-binding site mutations in the Saccharomyces cerevisiae succinate dehydrogenase generate superoxide and lead to the accumulation of succinate. J Biol Chem 282(37):27518-26.

78. Vemuri GN, Eiteman MA, Altman E. 2002a. Effects of growth mode and pyruvate carboxylase on succinic acid production by metabolically engineered strains of Escherichia coli. AppL Environ Microbiol 68(4): 1715

79. Vemuri GN, Eiteman MA, Altman E. 2002b. Succinate production in dual-phase Escherichia coli fermentations depends on the time of transition from aerobic to anaerobic conditions. J Ind Microbiol Biotechnol 28(6):325-32.

80. Vernis L, Abbas A, Chasles M, Gaillardin CM, Brun C, Huberman JA, Fournier P. 1997. An origin of replication and a centromere are both needed to establish a replicative plasmid in the yeast Yarrowia lipolytica. Mol Cell Biol 17(4): 1995-2004.

81. Yuzbashev TV, Yuzbasheva EY, Laptev IA, Sobolevskaya TI, Vybornaya TV, Larina AS, Gvilava IT, Antonova SV, Sineoky SP. 2011. Is it possible to produce succinic acid at a low pH? Bioeng Bugs 2(2):(in press).

82. Zeikus JG, Jain MK, Elankovan P. 1999. Biotechnology of succinic acidproduction and markets for derived industrial products. Appl Microbiol Biotechnol 51:545-552.27.