Разработка диагностических тест-систем при фасциолезе крупного рогатого скота на основе иммуноферментного анализа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.11, кандидат ветеринарных наук Коробов, Артем Игоревич

• Коробов, Артем Игоревич
• кандидат ветеринарных наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Коробов, Артем Игоревич

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Иммунологические методы диагностики фасциолеза животных.

2.2. Использование дот-ИФА в диагностике фасциолеза.

3. Собственные исследования.

3.1. Материалы и методы.

3.1.1. Получение инвазионного материала и приготовление соматического антигена.

3.1.2. Получение гипериммунной сыворотки.

3.1.3. Истощение сырого антигена фасциол с помощью аффинной хроматографии.

3.1.4. Овоскопическое исследование фекалий крупного рогатого скота, зараженного F. hepatica.54,

3.1.5. Постановка и учет результатов ИФА (ELISA) при фасциолезе крупного рогатого скота.

3.1.6. Разработка дот-ИФА (dot-ELISA) при фасциолезе крупного рогатого скота.

3.1.7. Статистическая обработка данных.

3.2. Результаты исследований:.

3.2.1. Результаты исследований по постановке и учету ИФА (ELISA) при фасциолезе крупного рогатого скота.

3.2.2. Результаты исследований по разработке дот-ИФА (dot-ELISA) при фасциолезе крупного рогатого скота.

3.2.3. Диагностическая эффективность дот-ИФА и ИФА с истощенным соматическим антигеном из водно-солевого экстракта фасциол.

3.2.4. Экстенсивность и интенсивность фасциолезной инвазии при послеубойном обследовании.

3.2.5. Результаты копроовоскопичекого исследования и сравнения их с серологическими и данными послеубойной ветеринарно-санитарной экспертизы.

4. Обсуяадение.

5. Практические предложения.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка диагностических тест-систем при фасциолезе крупного рогатого скота на основе иммуноферментного анализа»

Актуальность темы. Фасциолез крупного рогатого скота — зооноз, который характеризуется течением болезни без проявления специфических симптомов с преимущественным поражением гепатобилиарной системы. Возбудителями являются трематоды Fasciola hepatica и Fasciola gigantica, локализующиеся в имагинальной стадии в желчных ходах печени. Данный биогельминтоз широко распространен на территории РФ. Однако степень его распространения и поражения животных неоднозначна в различных природно-климатических зонах нашей страны (H.A. Яременко, И.Ф. Кленова, В.В. Горохов, Н.П. Сорокина, И.А. Молчанов, 2005). На основании научных публикаций (И.Ф. Кленова, H.A. Яременко, В.В. Горохов, У.Г. Тайчинов, А.Н. Воличев, B.C. Любавин, 2002; A.A. Атаев, 1990; М.М. Бочарова, 1996; Н.И. Кошеваров, 2006; В.В. Репетун, 2004) можно утверждать, что в отдельных регионах до 30 % и более поголовья скота заражены фасциолезом. В связи, с чем фасциолезная инвазия наносит значительный экономический ущерб скотоводству России, экономические потери при этом складываются из сокращения удоев молока, часто снижения его качества, уменьшения привесов и утилизации ценного пищевого продукта - печени.

Актуальность разработки тест-системы для прижизненной диагностики фасциолеза крупного рогатого скота на основе дот-ИФА обусловлена необходимостью создания биологической безопасности среды засчет своевременного выявления больных животных и проведения оздоровительно-профилактических мероприятий в хозяйствах. Существующими же на сегодняшний день копрологическими методами диагностики фасциолез можно диагностировать только через 3-4 месяца после начала инвазии. К этому времени фасциола уже является болезнетворным агентом, который вызывает тяжело протекающий воспалительный процесс в печени, переходящий в хронический гепатит по пролиферативному типу, что ведет к патологическому состоянию организма и снижает продуктивные качества крупного рогатого скота. Данная патология обуславливает плохое откармливание и ухудшение качества получаемой от животных продукции, а также сокращение сроков хранения продуктов убоя.

Цели и задачи исследования. Основной целью нашей работы было разработать тест-систему на основе дот-ИФА для эффективной прижизненной диагностики фасциолеза крупного рогатого скота. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить водно-солевые экстракты фасциол и испытать их в качестве диагностического антигена.

2. Разработать метод очистки антигенов фасциол на основе аффинной хроматографии.

3. Отработать режимы постановки дот-ИФА при различной степени инвазии у фасциолезных животных.

4. Провести испытания дот-ИФА и ИФА с различными антигенами при фасциолезе крупного рогатого скота.

5. Дать оценку сравнительной диагностической эффективности тестов на основе дот-ИФА, ИФА и копрологических методов.

Научная новизна. Заключается в разработке диагностической тест-системы на основе дот-ИФА с помощью аффинно очищенного антигена для обнаружения антител в крови к возбудителю фасциолеза крупного рогатого скота РаБСю1а Ьерайса и определении ее сравнительной диагностической эффективности с другими методами прижизненной диагностики.

Практическая значимость. Разработанный тест на основе иммуно ферментной реакции (дот-ИФА) может использоваться органами ветеринарного контроля для оценки эпизоотической ситуации по фасциолезу крупного рогатого скота и закупочными организациями для формирования благополучных сырьевых баз. Он экономичен по затратам, прост в исполнении и перспективен для массовых обследований в полевых условиях, так как позволяет диагностировать данную болезнь уже через 3-4 недели после начала инвазии, что дает возможность разработать эффективные меры по борьбе с фасциолезом в хозяйствах. Результаты исследований использованы при разработке «Методических рекомендаций по иммунодиагностике фасциолеза крупного рогатого скота реакцией дот-ИФА», одобренных секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 21.05.2010.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертационной работы были доложены на международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Современный метод диагностики хронического фасциолеза продуктивных животных, Москва, 2008), XVI московском международном ветеринарном1 конгрессе (Диагностика фасциолеза крупного рогатого скота иммуноферментной реакцией, Москва, 2008). По теме диссертации и результатам исследований опубликовано 6 научных статей, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов по кандидатским диссертациям: в Российском паразитологическом журнале (№ 3, 2010), журнале «Овцы, козы и шерстяное дело» (№ 4, 2009), а также в материалах международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (2007, 2008, 2010) и XVI московского международного ветеринарного конгресса (2008). Основные положения, выносимые на защиту:

1. Экстенсивность и интенсивность фасциолезной инвазии при послеубойном обследовании.

2. Антигены фасциол и их диагностическое значение.

3. Разработка диагностической тест-системы на основе дот-ИФА при фасциолезе крупного рогатого скота.

4. Сравнительный анализ эффективности классических копрологических исследований и серологических тестов на основе ИФА и дот-ИФА. Личный вклад соискателя. Представленная диссертационная работа является результатом четырехлетних научных исследований аспиранта. Основная экспериментальная часть исследований по разработке диагностической тест-системы на основе дот-ИФА при фасциолезе крупного рогатого скота выполнена автором лично. Работа выполнялась под руководством доктора ветеринарных наук, профессора кафедры инфекционных и паразитарных болезней ГОУ ВПО МГУПБ И.Г. Гламаздина, который оказывал научно-методическую помощь в проведении исследований и анализе полученных результатов. В четырех совместных публикациях личный вклад автора составлял не менее 75 %.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключения, а также выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Список литературы содержит 182 источника, из них 49 отечественных и 133 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 7 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Паразитология», Коробов, Артем Игоревич

7. ВЫВОДЫ

1. Разработана диагностическая тест-система на основе дот-ИФА при фасциолезе крупного рогатого скота с соматическим антигеном фасциол, очищенным с помощью аффинной хроматографии. Данная тест-система является более удобной для проведения исследований в полевых условиях.

2. Отработана методика получения соматического антигена из полного водно-солевого экстракта фасциол с последующим истощением против антигенов цистицерков (С. 1аепшсоШз), а так же биологически активных компонентов и белков воспаления при гепатитах неизвестной этиологии.

3. Установлено, что истощенный с помощью аффинной хроматографии антигенный экстракт имеет высокую диагностическую ценность, о чем свидетельствует повышение специфичности в ИФА с 82 до 90 % при его применении.

4. Проведен анализ диагностической эффективности ИФА и дот-ИФА при фасциолезе крупного рогатого скота. Установлена сопоставимость результатов по чувствительности и специфичности сравниваемых тестов. Специфичность ИФА и дот-ИФА составила 90 % и 92 %, а чувствительность - 89 и 87, соответственно.

5. Определена сравнительная диагностическая эффективность копрологических методов Демидова и Бреза и иммунологических тестов на основе ИФА и дот-ИФА при фасциолезе крупного рогатого скота. Диагностика серологическими методами оказалась эффективней в 2 раза по сравнению с копроовоскопическими методами.

6. Установлено, что дот-ИФА экономичен по затратам и может быть рекомендован для проведения массовых обследований в полевых условиях с целью уточнения эпизоотической ситуации по фасциолезу в хозяйствах.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Отработаны режимы постановки и учета результатов тест-системы на основе дот-иммуноферментного анализа с аффинно очищенным антигенным соматическим экстрактом для обнаружения антител в сыворотке крови против возбудителя фасциолеза крупного рогатого скота РаБсю1а Иерайса. Данная тест-система позволяет ставить диагноз на фасциолез в течение 3 месяцев острой преимагинальной стадии инвазии, когда трематоды еще не выделяют яйца в пищеварительный тракт и гельминтоовоскопические неэффективны. Апробация на собранной коллекции сывороток крови от крупного рогатого скота показала, что дот-ИФА не уступает в диагностической эффективности иммуноферментной реакции на планшетах.

В результате проведенного нами в течение года мониторинга серологических исследований на обнаружение антител и гельминтоовоскопических анализов фекалий от крупного рогатого скота, зараженного фасциолезом по данным ветеринарно-санитарной экспертизы специфические иммуноглобулины против Б. Ьерайса в ИФА выявлялись в период с июня по март, а яйца трематод находили с ноября по февраль. То есть время, в которое инвазированные серопозитивные животные имели копрологическое подтверждение диагноза, ограничивалось 4 месяцами. Положительные реакции в дот-ИФА отсутствовали лишь в марте-апреле.

На основании этого мы считаем, что применение ветеринарными лабораториями дот-ИФА для диагностики фасциолеза крупного рогатого скота в комплексе с трацидионными методами может оказаться более результативным с точки зрения установления острого фасциолеза у индивидумов и выявления хронической болезни на уровне стада. Это подтверждается фактом наличия антител длительный промежуток времени после дегельминтизации. Что позволит более точно определять неблагополучные по фасциолезу поголовья скота и регионы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Коробов, Артем Игоревич, 2010 год

1. Атаев A.A. Эколого—эпизоотологический анализ фасциолеза животных и совершенствование мер борьбы с ним в юго-восточном регионе Северного Кавказа: дисс.докт. вет. наук. — М., 1990. 540с.

2. Белозеров С.Н. Пути повышения эффективности метода иммуноферментного анализа и перспективы его применения при некоторых гельминтозах сельскохозяйственных животных. //

3. Иммуноферментный анализ в ветеринарии. Бюллетень Всесоюзного ордена Ленина НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. -М.: 1985. выпуск 58. -с.55-57.

4. Бережко В.К. Иммунологические методы диагностики гельминтозов животных (краткий обзор). // Труды Всероссийского ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. — 2000. — т.36. с. 10-26.

5. Бережко В.К. Видоспецифические антигены гельминтов и иммуноферментная реакция в диагностике гельминтозов. // Труды всесоюзного ордена трудового красного знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 1988. -т.29. - с.8-22.

6. Бочарова М.М. Эколого-популяционный анализ трематод D.lanceatum, Stiles et Hassal, 1885, F. hepatica L., 1758, и их хозяев в условиях северных склонов Центрального Кавказа и Восточного Предкавказья: дисс.докт.биол. наук. М., 1996. - 546с.

7. Веренич С.И. Получение антигена для диагностики фасциолеза. // Вет наука производству. - Минск. - 1993. — выпуск 31.- с.136-137.

8. Гламаздин И.Г. Диагностика цистицеркоза крупного рогатого скота иммуноферментной реакцией: дисс.канд. вет. наук. — М., 1990. 144с.101

9. Гламаздин И.Г. Цистицеркозы жвачных и свиней, тениидозы плотоядных (физико-химическая характеристика антигенов возбудителей, иммуногенез и принципы иммунодиагностики): дисс.док. вет. наук. — М., 2005.-333с.

10. Ершов B.C., Наумычева М.И., Михайлов П.Н. Иммуноферментный анализ и его применение в паразитологии. // Труды всесоюзного ордена трудового красного знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. — 1983. -Т.26. — с.47-53.

11. Золоткова Т.С., Новак М.Д. Пути повышения эффективности диагностики ' фасциолеза животных. // Труды Костромской государственнойсельскохозяйственной академии. Кострома. - 2001. - выпуск 59. - с. 1924.

12. Кленова И.Ф., Яременко H.A., Горохов В.В., Тайчинов У.Г., Воличев А.Н, Любавин B.C. Проблема гельминтозов животных в современных условиях. // Труды Всероссийского ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 2002. - т.38. - с.53-77.

13. Клименко В.В., Лукеш Ш. Перспективы использования иммуноблоттинга для дифференциальной диагностики. // Труды Всероссийского ин-таIгельминтологии им. К.И. Скрябина. 2004. - т.40. - с. 125-138.

14. Клименко В.В. Объективные факторы, ограничивающие диагностическую эффективность паразитарных антигенов, и пути их преодоления. // Труды Всероссийского ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 2004. - т.40. - с.116-124.

15. Клименко В.В. Иммунохимический анализ антигенов гельминтов, способы их получения и перспективы практического использования. // Труды Всероссийского ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 2002.-т.38. с.78-129.

16. Клименко В.В. Опыт использования биоспецифической адсорбционной (аффинной) хроматографии для очистки диагностических гельминтов. //

17. Труды Всероссийского ин-та гельминтологии им; К.И; Скрябина. — 2000. •-Т.36.--С.65-81.

18. Клименко В.В; Обнаружение в желчи специфического антигена Fasciola hepatica диагностический критерий фасциолеза. // Паразитология. - JI:

19. Наука. 1980. - т. 14. - вып.5. - с.444-451.

20. Клименко В.В. Сравнительное исследование антигенной активности белковых экстрактов фасциол и продуктов их метаболизма. // Труды всесоюзного ордена трудового красного: знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 1977. -т.23. - с.75-81.

21. Клименко В.В. Получение антигенных препаратов из БаБсшк Ьерайса и Раэсюк gigantica и их испытание при экспериментальном фасциолезе. // В кн.: Иммунитет сельскохозяйственных животных. М.: Колос. - 1973. -с.296-299.

22. Клименко В.В. Разделение и характеристика* функциональных антигенов Раясюк Ьерайса и РаБсю1а gigantica. // Труды всесоюзного ордена трудового красного знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. -1971. т. 18. - с. 129-143.

23. Клименко В.В. Исследование динамики антител при экспериментальном фасциолезе овец. // Труды всесоюзного ордена трудового красного знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 1971. - т.18. - с.145-151.

24. Клименко В.В. Содержание белка в экстрактах РаБсЫа Иерайса и РаБсю1а gigantica и некоторые факторы, влияющие на его определение. // Труды всесоюзного ордена трудового красного знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 1969. -т.15. - с.153-158.

25. Котельников Г.А. Гельминтоовоскопические исследования животных и | окружающей среды. М.: Колос, 1984. - с.7-9.

26. Кошеваров Н.И. Распространение трематодозов крупного рогатого скота в нечерноземной зоне России. // Труды Всероссийского ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 2006. - т.42. - с. 158-162.

27. Кузьмичев В.В. Фасциолез животных в Центральном районе Нечерноземья Российской Федерации (эпизоотология, динамика формирования микропаразитоценозов, патогенез, лечение): Автореф. дис.док. вет. наук. Уфа, 1997. - 40с.

28. Мартыненко Л.Д., Лысенко А.Я., Васильев В.И. Реакция энзиммеченныхантител в иммунодиагностике паразитарных болезней. Сообщение 5.

29. Тест-система для диагностики фасциолеза. // Медицинская паразитология104и паразитарные болезни. Москва: - Медицина. — 1982. — т.60. - № 6. — с.41-46.

30. Мартыненко Л. Д., Клименко В!В. Разработка тест-системы для ^ диагностики фасциолеза на основе реакции энзим-меченных антител. //

31. Бюллетень всесоюзного ордена трудового красного > знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 1981. — вып.ЗО. - с.52-55.

32. Михайлов А.Т., Симирский В.Н. Методы иммунохимического анализа,в биологии развития. // М.: Наука. 1991. - 288с.

33. Написанова Л.А. Диагностическая эффективность иммуноферментных тест-систем (ИФР и дот-ИФА) при трихинеллезе свиней: Автореф. дис. . канд. биол. наук. — М., 2004. -24с.

34. Онуфриенко М.Э. Диагностика фасциолеза крупного рогатого скота. // Ветеринария. 2003. - № 3. - с.30-33.

35. Петров Ю.Ф., Абдуллаев Х.С., Кузнецов В.М., Кузьмичев В.В., Садов , K.M., Еремеева О.Р. Распространение трематодозов крупного рогатого ^ скота в центральных районах Нечерноземья РФ Данные за 1975-2005 гг.

36. Труды Всероссийского ин-та гельминтологии — 2006 т.44. - с. 182-186.

37. Савицкий И.Г., Бенедиктов И.И. Иммуноферментный анализ антигенных фракций Dicrocoelium lanceatum. // Труды всесоюзного ордена трудового1.105красного знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. — 1989. — т.ЗО. -с.105-111.

38. Сивкова Т.Н. Диагностическая эффективность ELISA и dot-ELISA с антигенами клеточных культур при цистном гидатидозе Эхинококкоз.: Автореф. дис.канд. биол. наук. М., 2002. — 24с.

39. Тимербаева P.P. Использование иммунологических методов в диагностике фасциолеза крупного рогатого скота. // Матер, науч.-практ. конф., посвящ. 75-летию образования зооинженер. Факультета. — Казань. -2005. -с.185-187.

40. Трус И.А. Изучение эффективности аллергической диагностики фасциолеза крупного рогатого скота. // Вет наука — производству. — Минск. 2007. - выпуск 39. - с.256-262.

41. Шемякова С.А. Иммунодиагностика острого фасциолеза крупного роатого скота. // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии, сборник научных трудов молодых ученых. — Москва. 2006. - выпуск 3. - с. 123124.

42. Шемякова С.А. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) для диагностики фасциолеза крупного рогатого скота. // Труды Всероссийского ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. Москва. -2004. - т.40. — с.402-404.

43. Шемякова С.А. Сопоставление результатов серологического, копроовоскопического и послеубойного исследований крупного рогатогоскота на фасциолез. // Труды Всероссийского ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. Москва. - 2007. - т.45. - с.270-275.

44. Уркхарт Г. Ветеринарная паразитология: Учебник / пер. с англ. М.: Аквариум ЛТД, 2000. - 3 52с.

45. Яременко Н.А., Кленова И.Ф., Горохов В.В., Сорокина Н.П., Молчанов И.А. Эпизоотологический анализ фасциолеза крупного рогатого скота. // Ветеринария. 2005. - № 4. - с.30-31.I

46. Abrous M., Rondelaud D., Dreyfuss G. Paramphistomum daubneyi and Fasciola hepatica: influence of temperature changes on shedding of cercariae from dually infected Lymnaea truncatula. // Parasitol. Res. 1999. - v.85(8/9). -p.765-769.

47. Afshar A., Dubuc C., Dulac G.C., Thomas F.C., Nielsen K., Henning D. Dotimmunoperoxidase assay using monoclonal antibody for detection of bluetongue virus antigens. // J. Virol. Methods. 1991. - v.31. - p. 105-112.

48. Allan J.C., Avila G., Garcia N.J., Flisser A., Craig P.S. Immunodiagnosis of taeniasis by coproantigen detection. // Parasitology. 1990. - v. 101. - p.473-477.

49. Almazan C., Avila G., Quiroz H., Ibarra F., Ochoa P. Effect of parasite burden on detection of Fasciola hepatica antigens in sera and feces of experimentally infected sheep. // Veterinary parasitology. 2001. - v.97. - p.101-112.

50. Anderson N., Luong T.T., Vo N.G., Bui K.L., Smooker P.M., Spithill T.W. The sensitivity and specificity of two methods for detecting Fasciola infections in cattle. // Veterinary parasitology. 1999. - v.83. - p.l5-24.

51. Veterinary parasitology. 1989. - v.30. - p.l97-203.107

52. Augot D., Rondelaud D., Dreyfuss G., Cabaret J. Fasciola hepatica: in vitro production of daughter rediae and cercariae from first and second generation rediae. // Parasitol. Res. 1997. - v.83. - № 4. - p.383-385.

53. Barbieri M., Sterla S., Battistoni J., Nieto A. High performance latex reagent for hydatid serology using an Echinococcus granulosus lipoprotein antigen fraction purified from cyst fluid in one step. // Int. J. Parasit. — 1993. v.23.p.565-572.

54. Barsoum I.S., Kamal K.A., Bassily S., Deelder A.M., Colley D.G. Diagnosis of human shistosomiasis by detection of circulating cathodic antigen with monoclonal antibody. // J. Infect. Dis. 1991. - v. 164. - p. 1010-1013.

55. Baronet D., Waltner-Toews D. Echinococcus granulosus infections in dogs of Kathmandu, Nepal. // Ann. Trop. Med. Parasitol. 1994. - v.88. - p.485-492.

56. Batteiger B., Newhall W.J., Jones R.B. The use of Tween 20 as blocking agent in the immunological detection of proteins transferred to nitrocellulose membranes. // J. Immunol. Methods. 1982. - v.55. - p.297-307.I

57. Berasain P., Goni F., McGonigle S., Dowd A., Dalton J.P., Frangione B., Carmona C. Proteinases secreted by Fasciola hepatica degrade extracellular matrix and basement membrane components. // J. Parasitol. 1997. - v.83. -p.1-5.

58. Biguet J., Capron A., Tranvanky P., Haussy P. Comparative immuno-electrophoretic study of antigen from various helminths. // C. R. Acad. Sci. -1962. v.254. -p.3600-3602.

59. Boctor F.N., Fabrid Z., El-Scherif N. Using whole bacteria, LPS and soluble antigens to detect IgG, IgM, IgA in human brucellosis by dot-ELISA with nitrocellulose as a solid phase. // Clin. Chemistry. 1987. - v.33. - p. 15701571.

60. Boray J.C., Pearson- I.G. The anthelmintic efficiency of tetrachlorodifluoroethane in sheep infected with Fasciola hepatica. // Aust. Vet. J. 1960. - v.36. - p.331-337.

61. Boray J.C. Studies on relative susceptibility of some lymnaeids to infection with F.hepatica and F.gigantica and on adaption of Fasciola spp. // Ann. Trop. Med. Parasitol. 1964. - v.60. -p.l 14-124.

62. Bossaert K., Farnir F., Leclipteux T., Protz M., Lonneux J.-F., Losson B.

63. Humoral immune responses in calves to single-dose, trickle and challengeinfections with Fasciola hepatica. // Veterinary parasitology. 2000. - v.87. -p.103-123.

64. Bulgin M.S., Anderson B.C. Serum gamma transpeptidase activity in cattle with induced fascioliasis. // Res. Vet. Sci. 1984. — v.37. — p.167-171.

65. Carmona C., Dowd A.J., Smith A.M., Dalton J.P. Cathepsin L proteinase secreted by Fasciola hepatica in vitro prevents antibody-mediated eosinophil attachment to newly excysted juveniles. // Mol. Biochem. Parasitol. 1993. -v.62. -p.9-17.i

66. Castro E., Freyre A., Hernandez Z. Serological responses of cattle after treatment and during re-infection with Fasciola hepatica, as measured with a dot-ELISA system. // Veterinary parasitology. 2000. - v.90. - p.201-208.

67. Castro E., Freyre A., Falcon D., Molinari C. Posibilidades del dot-ELISA para el diagnostico de la fascioliasis bovina. // Vet. Uruguay. — 1995. v.30. - p.8-16.

68. Castro J., Dumenigo B., Espino A.M. Detección de coproantigenos para evaluar infección active por Fasciola, hepatica en ganado bovino. // Parasitol. Dia. -1994. -v.l 8. -p.33-38.

69. Chapman C.B., Mitchell G.F. Proteolytic cleavage of immunoglobulin by enzymes released by Fasciola hepatica. // Vet. Parasitol. 1982. - v.ll. -p.165-178.

70. Chauvin A., Moreau E., Boulard C. Responses of Fasciola hepatica infected sheep to various infection levels. // Veterinary research. 2001. - v.32. — p.87-92.

71. Chauvin A., Bouvet G., Boulard C. Humoral and cellular immune responses tof

72. Fasciola hepatica experimental primary and secondary infection in sheep. // Int. J. Parasitol. 1995. — v.25. -p.1227-1241.

73. Clery D., Torgerson P., Mulcahy G. Immune responses of chronically infectedadult cattle to Fasciola hepatica. // Vet. Parasitol. 1996. - v.62. - p.71-82. i .

74. Cohen S., Warren K.S. Immunology of parastic infection, 2 edition. //

75. Blackwell Scientific, Oxford. 1982. -220pp.

76. Cordova M., Herrera P., Nopo L., Bellatin J., Naquira C., Guerra H., Espinoza J.R. Fasciola hepatica cysteine proteinases: immunodominant antigens in human fascioliasis. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1997. - v.57. -p.600-666.

77. Cordova M., Reategui L., Espinoza J.R. Immunodiagnosis of human fascioliasis with Fasciola hepatica cysteine proteinases. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1999. - v.93. -p.54-57.

78. Dalton J.P., Heffernan M. Thiol proteases released in vitro by Fasciola hepatica. // Mol. Biochem. Parasitol. 1989. — v.15. - p.161-166.

79. De Jonge N., Fillie Y.E., Deelder A.M. A simple and rapid treatment (trichloroacetic acid precipitation) of serum samples to prevent non-specific reactions in the immunoassays of a proteoglycan. // J. Immunol. Methods. — 1987. —v.99. —p. 195-197.

80. Deplazes P., Eckert J., Paulowski S., Machowska L., Gottstein B. An enzyme-linked immunosorbent assay for diagnostic of Taenia saginata coproantigens in humans. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1990. - v.85. - p.391-396.

81. Doy T.G., Hughes D.L. Fasciola hepatica: site of resistance to reinfection in' cattle. // Exp. Parasitol. 1984. - v.57. -p.274-278.

82. Doyle J.J. Acquired immunity to experimental infection with Fasciola hepatica in cattle. // Res. Vet. Sci. 1971. - v. 12. - p.527-534.

83. Dumenigo B.E., Espino A.M., Finlay C.M. Detection of Fasciola hepatica antigen in cattle faeces by a monoclonal-based sandwich immunoassay. // Res.

84. Vet. Sci. 1996. - v.60. - p.278-279.

85. Dumenigo B.E., Espino A.M., Finlay C.M., Mezo M. Kinetics of antibody-based antigen detection in serum and feces of sheep experimentally infected with Fasciola hepatica. // Veterinary parasitology. 1999. - v.86. - p.23-31.

86. Ellis T.M., Gregory A., Turnor M., Kalknoven M., Wroth R.H. Detection of Haemonchus contortus surface antigens in faeces from infected sheep. // Vet. Parasitol. 1993. - v.51. - p.85-97.

87. Espino A.M., Finlay C.M. Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detection of excretory-secretory antigens in humans with fasciolosis. // J. Clin.

88. Microbiol.- 1994.-v.32.-p.190-193.

89. Espino A.M., Marcet R., Finlay C.M. Fasciola hepatica: detection of antigenemia and coproantigens in experimentally infected rats. // Experim. Parasitol. 1997. - v.85. -p.l 17-120.

90. Fagbemi B.O., Obarisiagbon I.O., Mbuh J.V. Detection of circulating antigen in sera of Fasciola gigantica-infected cattle with antibodies reactive with a Fasciola-specific 88-kDa antigen. // Veterinary parasitology. 1995. - v.58. -p.235-246.

91. Fagbemi B.O., Guobadia E.E. Immunodiagnosis of fasciolosis in ruminants ' using a 28-kDa cysteine protease of Fasciola gigantica adult worms. //

92. Veterinary parasitology. 1995. - v.57. - p.309-318.

93. Fagbemi B.O., Hillyer G.V. The purification and characterization of a cysteine protease of Fasciola gigantica adult worms. // Vet. Parasitol. — 1992. v.43. -p.223-232.

94. Ferre I., Lopez P., Gonzalo-Orden M., Julian M.D., Rojo-Vazquez F.A., Gonzalez-Gallego J. The effects of subclinical fasciolosis on hepatic secretory function in sheep. //Parasitol. Res. 1995a. - v.81. - p. 127-131.

95. Ferre I., Ortega-Mora L.M., Rojo-Vazquez F.A. Seroprevalence of Fasciola hepatica infection in sheep in northwestern Spain. // Parasitol. Res. 1995b. -v.81. -p.137-142.

96. Gundlach J.L., Sandizikowaski A. Precipitin dynamics and use of sérodiagnostic reactions of immunoelectroprecipitation and double diffusion in fasciolosis in sheep. // Medycyna-Weteiynaryjan. 1980. — v.36. -p.21-26.

97. Guobadia E.E., Fagbemi B.O. Time-course analysis of antibody response by EITB and ELISA before and after chemotherapy in sheep infected with Fasciola gigantica. // Veterinary parasitology. 1995. - v.58. - p.247-253.

98. Halton D.W. Observations on the nutrition of digenetic trematodes. // Parasitology. 1967. - v.57. -p.639-660.

99. Hanna E.R., Hillyer G.V. Fasciola hepatica and Schistosoma mansoni: I immunoflourescent antigen localization and cross-reactivity. // Exp. Parasitol.1984.-v.57.-p.1-4.

100. HannaE.R.B., Hughes D.E., Taylor S.M. Fasciola hepatica: antibody levels in sheep serum before and after treatment with anthelmintic. // Res. Vet. Sci. —1.1982. v.33. -p:328-332.

101. Hanna E.R.B'. Fasciola-hepatica: glycocalyx replacement in the juvenile as possible mechanism^ for protection against host immunity. // Exp: Parasitol. — 1980a. v.50. — p.103-114*.

102. Hanna E.R.B'. Fasciola hepatica: an immunofluorescent study of antigenic changes in the tegument during development in the rat and. the sheep. // Exp. Parasitol. 1980b. - v.50. - p. 155-170.

103. Haroun E.M., Hillyer G.V. Resistance to fascioliasis A review. // Vet. Parasitol. - 1986. - v.20. - p.63-93.

104. Hardman E., Jarvis H.M. Nitrocellulose-based assays for the detection of glucolipids and other antigens: mechanism of binding to nitrocellulose. // J. Immunol. Methods. 1985. - v.33. -p.l 13-123.

105. Hawkes R., Niday E., Gordan J.A. A dot immunobinding assay for monoclonal and other antibodies. // Analyt. Biochem. 1982. - v. 119. - p. 142147.

106. Hillyer G.V., Galanes M.S. Identification of potential sérodiagnostic Fasciola hepatica antigens by electroelution by polyacrylamide gels. // Am. J. Trop. Med. Hyg.- 1988. — v.32. -p.1210-1217.

107. Hillyer G.V., Sanchez Z.D. Immunodiagnosis of bovine fascioliasis by enzyme linked immunosorbent assay and immunoprecipitation methods. // J.

108. Parasitol. 1985. - v.71. -p.449-454.113

109. Hillyer G.V., Santiago de Weil N. Use of immunologic techniques to detect chemotherapeutic success in infections with Fasciola hepatica. The enzymej linked immunosorbent assay in infected rats, and rabbits. // J*. Parasitol. — 1979.- v.65. p.680-684.

110. Hughes D.L., Hanna R.E.B., Symonds H.W. Fasciola hepatica: IgG and IgA levels in serum and bile of infected cattle. // Exp. Parasitol. 1981. - v.52 — 'p.271-279,

111. Ibarra F., Montenegro N., Vera Y., Boulard C., Quiroz H., Flores J., Ochoa P. Comparison of three ELISA tests for seroepidemiology of bovine fasciolosis. // Veterinary parasitology. 1998. - v.77. -p.229-236.

112. Jonson M.J., Benke J.M. Detection of gastrointestinal nematodes by a | coproantigen capture ELISA. // Res. Vet. Sci. 1996. - v.60. - p.7-12.

113. Keegan P.S., Trudgett A. Fasciola hepatica in the rat: immune responses associated with the development of resistance to infection. // Parasite Immunol.- 1992. v.14. -p.657-669.

114. Langley R.J., Hillyer G.V. Detection of circulating immune complexes by enzyme-linked immunosorbent assay in sera from cattle infected with Fasciola hepatica. // J. Parasitol. 1989a. - v.75. - p.690-695.

115. Langley R.J., Hillyer G.V. Detection of circulating parasite antigen in murine fasciolosis by two-site enzyme-linked immunosorbent assays. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1989b. -v.41. -p.480-486.

116. Lee C.G., Zimmerman G.L., Mulrooney D.M. Isoelectric focusing of soluble proteins from Fasciola hepatica L, 1758 and Fascioloides magna B, 1975. // Am. J. Vet. Res. 1992. - v.53. - p.246-250.

117. Levieux D., Levieux A. Early immunodiagnosis of caprine fasciolosis using the specific £2 antigen in a passive hemagglutination test. // Vet. Parasitol. — 1994. -v.53. -p.59-66.

118. Levieux D., Levieux A., Mage C., Garel J.P. Immunological detection ofchemotherapeutic success in bovine fascioliasis using the specific antigen F2. //

119. Vet. Parasitol. 1992. - v.45. -p.81-88. 1 114

120. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.I., Randall R.J. Protein measurement with Folin-phenol reagent. I I Journal biological chemistry. 1951 — v. 193. -p.265-275.

121. Maisonnave J. Standardization of a dot immunoperoxidase assay for field diagnosis of Fasciola hepatica infected cattle. // Veterinary parasitology. -1999: v.85. - p.259-268.

122. Maisonnave J., Hernandez S., Rossi S., Acosta D., Yarzabal L. Immunodiagnostico de fascioliasis. // Proc. 3rd Cong. Latin american Assoc. of Immunology (ALAI), 15-17 April, Santiago, Chile. 1993. - p. 101.

123. Mandal S., Yadav S.C., Sharma R.L. An evaluation of seroreactivity of antigenic preparations of Fasciola gigantica in goats. // Indian journal of animal sciences. v.69. -№11.- p.875-879.

124. Martin S.W., Meek A.H., Willeberg P. (Eds.) Measurements of disease frequency and production. // In: Veterinary epidemiology, Iowa State University Press, Ames. 1987. -p.48-76.

125. McKerrow J.H. Parasite proteases. // Exp. Parasitol. 1989. - v.68. - p. 111 -115.

126. Moreau E., Chauvin A., Boulard C. IFNy and IL-10 production by local and peripheral lymphocytes in Fasciola hepatica infected sheep. // Parasite. 1998. - v.5. -p.307-315.

127. Mousa W.M. Evaluation of cercarial antigen for the serodiagnosis of fasciolosis in experimentally and naturally infected sheep. // Veterinary parasitology. 2001. - v.91. - p.47-54.

128. Mousa W.M., Fouad S., Saad A., Saad A.H. Evaluation of the different development stages of F. gigantica for serodiagnosis of human fascioliasis. // Egypt J. Immunol. 1996. - v.3. - № 1. - p.63-68.

129. Nati A., Cárdozo H. Prevalencia y distribución geográfica de la fascioliasis hepato-billiar en bovines de carne del Uruguay. // Veterinaria, Uruguay. 1976: -v.13.-p.H-16.

130. Neyra V., Chavarry E., Espinoza J.R. Cysteine proteinases Fas 1 and Fas2 are diagnostic markers for Fasciola hepatica infection in alpacas (Lama pacos). // Veterinary parasitology. — 2002. — v. 105. p.21-32.

131. Nodet P., Grange J., Fevre M. Dot-blot. assays and their use as direct antigenbinding method to screen monoclonal antibodies to 1,4-B and 1,3-B glucan sunthases. // Analyt. Biochem. 1988. - v. 174. - p.662-666.

132. Ortiz P.L.,1 Cláxton JiRl, Clárksonf M:J:, McGany J;, Williams. D;Ji Specificity of antibody responses in cattle: naturally exposed to Fasciola hepatica. // Vet. Parasitol. 2000. - v.93. - p.121-134.

133. Pappas M.G. Recent applications of the Dot-ELISA in immunoparasitology. // Vet. Parasitol. 1988. - v.29. - p.105-129.

134. Pappas M.G., Hajkowski R., Hockmeyer; W.T. Dot enzyme-linked immunosorbent assay (dot-ELISA): a micro technique for the rapid diagnosis of visceral leishmaniasis. // J. Immunol. Methods. 1983. —v.64. -p.205-214.

135. Prosad S., Thraves P. A dot-blot method for screening polyclonal and monoclonal antisera to poly (ADP-ribose). // J. Immunol. Methods. 1989. -v.116. — p.79-85.

136. Quiroz R.H. Impacto economico, epidemiología, control y prevención de Fasciola hepatica en la ganadería. // En: Trematodiasis Transmitidas por Alimentos: Epidemiología, Manejo Clinico y Control. Ed. OPS-OMS, Santiago de Chile. 1995. -pp.81-101.

137. Randall G.R., Goldsmith R.S., Shek J., Mehalko S., Haneyman D. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of Entamoeba histolytica antigen in feacal samples. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. — 1984. v.78. - p.593-595.

138. Rickard L.G. Development of a dot-ELISA test for detection of serum antibodies to Fasciola hepatica antigens in llamas. // Veterinary parasitology. -1995.-v.58.-p.9-15.

139. Rivera Marrero C.A., Santiago N., Hillyer G.V. // J. Parasitol. 1998. -v.74(4). - p.646-652.

140. Rodriguez-Perez J., Hillyer G.V. Detection of excretory-secretory circulating antigens in sheep infected with Fasciola hepatica and with Shistosoma mansoni and Fasciola hepatica. // Vet. Parasitol. 1995. — v.56 — p.57-66.

141. Ross J.G. Experimental infections of cattle with Fasciola hepatica. Challenge infections. //Nature. 1966. - v.212. -p.1464-1465.

142. Sampaio-Silva M.L., Da Costa J.M., Da Costa A.M., Pires M.A., Lopes S.A., Castro A.M., Monjour L. Antigenic compounds of excretory-secretory products of adult F.hepatica recognized in human infections. // Am. J. Trop.

143. Med. Hyg. 1996. - v.54. 2. -p.146-148.117

144. Sanches-Andrade R., Morondo P., Lopez C., Panadero R., Diez P. Evaluation of Fasciola hepatica infection prevalence in cattle in Galicia (Northwest Spain) by enzyme linked immunosorbent assay. // Res. Rev. Parasitol. 1995. - v. 55. -p.103-107.

145. Sandeman R.M., Howell MJ. Response of sheep to challenge infection with Fasciola hepatica. // Res. Vet. Sci. 1981. - v.30. - p.294-297.

146. Sandeman R.M., Howell M.J. In vitro studies of the response of sheep to infection with Fasciola hepatica. // Vet. Parasitol. 1980. - v.6. - p.347-357.

147. Santiago de Weil N., Hillyer G.V. Antibody profiles by EITB and ELISA of cattle and sheep infected with Fasciola hepatica. // J. Parasitol. 1988. - v.74 — № 5. — p.810-818.

148. Santiago de Weil N., Hillyer G.V. Isolation of potential serodiagnosis of F.hepatica antigens by electro-elution from polyacrylamide gels. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1986. - v.35. 6. -p.1210-1215.

149. Scicchitano R., Husband A. J., Cripps A.W. Biliary transport of serum IgA in sheep. //Immunology. 1984. -v.53. -p.121-129.

150. Smith A.M., Dowd A.J., Heffernan M., Robertson C.D., Dalton J.P. Fasciola hepatica: a secreted cathepsin L-like proteinase cleaves host immunoglobulin. // Int. J. Parasitol. 1993. - v.23 -p.977-983.

151. Sood M., Kaur G., Parmar A., Kapur J. Development of Dot-ELISA for detection of Haemonchus contortus antigen. // Helmintology. 1996. - v.33. -p.73-75.

152. Soulsby E.J.L. Textbooks of veterinary clinical parasitology. I. Helminths. // Blackwell Scientific, Oxford. 1965. - 1120pp.

153. Spithill T.W., Peidrafita D., Smooker P.M. Immunological approaches forthe control of fasciolosis. // Int. J. Parasitol. 1997. - v.27. - p.1221-1235.118

154. Straus W., O'Neill S.M:, Parkinson M., Angles R., Dalton J:P. Short report: diagnosis of human fascioliasis: detection of anti-cathepsin L antibodies« in blood samples collected on filter paper. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1999: — v.60. -p.746-748.

155. Stephenson W. Physiological and histochemical observations on the adult liver fluke, Fasciola hepatica L. // Parasitology. 1947a. - v.38. - p.l 16-122.

156. Stibbs H.H., Mansour S., Foster M. Enzyme immunoassay for detection of Giardia lamblia cyst antigen in formalin-fixed and unfixed human stool. // J. Clin. Microbiol. 1988. -v.26. - p. 1665-1669.

157. Swarup D., Pachauri S.P., Sharma B., Bandhopadhyay S.K. Serodiagnosis of Fasciola gigantica infection in bufalloes. // Vet. Parasitol. 1987. - v.24. -p.67-74.

158. Thienpont D., Rochette F., Vanparijs O.F. Diagnosing helminthiasis through coprological examination. // Janssen Reseach Foundation, Beerse, Belgium. -1979. 180pp.

159. Tsang V.C., Peralta J.M., Simmons A.R. Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot technique (EITB) for studying the specificities and antibodies separated by gel electrophoresis. // Methods Enzymol. 1983.• v.92. — p.377-391.

160. Vertosich F.T., Kelly R.H. Antibodies to native and denatured DNA. Quantitation using on immuno slot-blot technique. // J. Immunol. Methods. -1987.-v. 102.-p. 15-21.

161. Wassail D.A., Sinclair I J. The serum antibody response of infected rats, rabbits, lambs and calves to Fasciola hepatica adult antigen fractions separated by preparative flatbed iso-electrofocussing. // Parasite Immunol. 1985. - v.7. -p.359-366.

162. Warburg O., Christian W. Isolierung und kristallisattiondes Garunsferments Enolase. // Biochem. Z. 1941. - v.310. - s.384-421.

163. Wedrychowicz H., Turner K. Antibody isotypes involved in local and« systemic humoral-response in rats to primary and secondary infections with Fasciola hepatica. // Acta parasitologica — Polonica. 1987. - v.32. - p.369382.

164. Welch R.D., Smith P.H., Malone J.B., Holmes R.A., Geaghan J.P. Herd evalution of Fasciola hepatica infection levels in Louisiana cattle by an enzyme-linked immunosorbent assay. // Am. J. Vet. Res. 1987. - v.48. -p.345-347.

165. Wycoff J.H., Bradley R.E. An optimised enzyme-linked immunosorbent assay for quantitative diagnosis of bovine fascioliasis. // J. Parasitol. — 1986. — v.72. — p.439-444.

166. Yadav S.C., Gupta S.C. Immune response of goats against Fasciola giganticai irradiated metacercariae. // Journal of veterinary parasitology: 1989. — v.3. p.121-123.

167. Yamasaki A., Hiroshi H., Aoki T., Aya H. A cysteine proteinase from the liver fluke Fasciola spp.: purification, characterization, localization and application to immunodiagnosis. // J. Parasitol. 1989. - v.38. - № 6. — p.373-384.

168. Zimmerman G.L., Nelson M.J., Clark C.R.B. Diagnosis of ovine fascioliasis by a dot enzyme-linked immunosorbent assay: a rapid microdiagnostic technique. // Am. J. Vet. Res. 1985. - v.46. -p.1513-1515.

169. Zimmerman G.L., Hjen L.W., Cerro J.W., Farasworth B.S., Wescott R.B. Diagnosis of Fasciola hepatica infections in sheep by an enzyme-linked immunosorbent assay. // Am. J. Vet. Res. 1982. - v.43. - p.2097-2100.

170. Zimmerman G.L., Nelson M.J. Diagnosis of ovine-fascioliasis by a dot enzyme-linked immunosorbent assay: a rapid microdiagnostic technique. // Am. J. Vet. Res. 1981. - v.42. -p.237-240.