Разработка биотехнологии высокобелковой кормовой добавки из побочного сырья птицеперерабатывающей промышленности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.04, кандидат наук Дмитриева Анастасия Игоревна

• Дмитриева Анастасия Игоревна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Дмитриева Анастасия Игоревна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Состав и свойства перопуховых отходов

1.2 Особенности переработки перопуховых отходов на кормовые цели

1.3 Характеристика кератинолитических штаммов

1.4 Заключение по обзору литературы и задачи исследований

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Организация выполнения работы

2.2 Объекты исследований

2.3 Оборудование

2.4 Методы исследований

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ... 54 3.1. Изучение свойств кератинолитических микроорганизмов с целью выбора консорциума, обладающего ценными производственными

признаками

3.2 Подбор условий культивирования консорциума кератинолитических микроорганизмов

3.3 Подбор параметров биоконверсии перопуховых отходов с использованием консорциума кератинолитических микроорганизмов

3.4 Подбор параметров распылительной сушки гидролизатов

перопуховых отходов

ГЛАВА 4 ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1 Разработка технологической схемы и рецептуры производства

кормовой добавки из перопуховых отходов

4.2. Состав и свойства кормовой добавки

4.3. Расчет ожидаемой экономической эффективности кормовой добавки

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СТИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕННЫХ ТЕРМИНОВ

АПК - агропромышленный комплекс

БГКП - бактерии группы кишечная палочка

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

КОЕ - колониеобразующие единицы

МПА - мясопептонный агар

МПБ - мясопептонный бульон

ФЦП - федеральная целевая программа

ЭМ - эффективные микроорганизмы

Т - продолжительность, мин

Т - температура, ° С

Н - гидромодуль

ё - размер фракций, мм

ф - относительная влажность, %

а - угол наклона лопаток, °

ю - массовая доля инокулянта, %

Ур-ра - скорость подачи раствора в установку, мл/мин

-5

Ув - скорость потока воздуха, м /ч ёяс. - диаметр ячеек сетки, мм

-5

Уф.м. - скорость подачи ферментируемой массы, м /ч

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка биотехнологии высокобелковой кормовой добавки из побочного сырья птицеперерабатывающей промышленности»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Птицеводство является одним из ключевых направлений бизнес-деятельности в структуре сельского хозяйства. Это наукоемкая и динамично развивающаяся отрасль с ежегодными мировыми темпами прироста производства 6-9 % и, как следствие, постоянно возрастающей потребностью в качественных кормах для птицы. В Российской Федерации одновременно со значительными успехами птицеводства ежегодно возрастают и объемы образования отходов птицеводческих предприятий, которые в настоящее время составляют более 17 млн тонн в год.

Растущую потребность в белковых кормах можно удовлетворить за счет максимального использования непищевых отходов, которые являются нетрадиционными источниками прироста ресурсов кормового белка.

По химическому составу (содержанию аминокислот, сбалансированности микро- и макроэлементов) перопуховое сырье является ценным источником питательных веществ и перспективным сырьем для кормовой промышленности. Существующие технологии переработки перопуховых отходов в белковые компоненты основаны на процессах высокотемпературной гидротермической обработки или кислотного (щелочного) гидролиза. Подобные способы часто приводят к потере и рацемизации незаменимых аминокислот, образованию циклопептидов и значительному снижению общей биологической ценности конечных продуктов.

Принципиально новым подходом в этом направлении является разработка биоконверсионных технологий, основанных на применении эффективных микроорганизмов, которые способны выделять ферменты и ферментные комплексы в окружающую среду и обеспечивать процесс конверсии сложных органических соединений, входящих в состав отходов, а также подавляющие рост и развитие патогенной микрофлоры отходов.

Изыскание путей рациональной переработки перопуховых отходов птицеводства в кормовые добавки, повышающих белковую ценность питания, имеет важное народнохозяйственное значение. Разработка кормовой добавки из перопуховых отходов представляет актуальную и востребованную задачу.

Степень проработки темы исследований. Существенный вклад в развитие инновационных технологий переработки и использования вторичного сырья в животноводстве внесли российские и зарубежные исследователи: Л.В. Антипова, A.A. Архипченко, В.Г. Волик, Т.М. Гиро, А.А. Завалин, Л.А. Изерская, Д.Ю. Исмаилова, М.Г. Курбанова, В.П. Лысенко, Л.Е. Матросова, П.В. Митрохин, С.Л. Тихонов, Е.В. Ульрих, A.M. Шония, Л.К. Эрнст, C. Meng, E. Tiwary, L. Tymczyna, C. Williams и др.

Цель и задачи исследований. Цель работы - обоснование технологии высокобелковой добавки из перопуховых отходов на основе консорциума кератинолитических микроорганизмов.

Задачи исследования:

- изучить свойства кератинолитических штаммов и выбрать консорциум, обладающих наиболее ценными производственными признаками;

- подобрать условия культивирования консорциума микроорганизмов;

- подобрать параметры биоконверсии перопуховых отходов с использованием консорциума кератинолитических микроорганизмов;

- подобрать параметры распылительной сушки гидролизатов;

- разработать технологическую схему и рецептуру производства кормовой добавки из перопуховых отходов;

- изучить состав и свойства разработанной кормовой добавки;

- разработать техническую документацию на кормовую добавку;

- рассчитать экономическую эффективность применения кормовой добавки из перопуховых отходов.

Научная новизна работы заключается в следующем:

- составлен консорциум микроорганизмов, обладающий максимально ценными производственными признаками (кератинолитическая активность, степень гидролиза,

накопление белка);

- доказана биосовместимость подобранных штаммов;

- установлено оптимальное соотношение штаммов в подобранном консорциуме - 15:45:15:25 и рациональные условия их культивирования;

- разработан процесс биоконверсии перопуховых отходов, конечные продукты которой отличаются высокой степенью гидролиза белковых компонентов.

Практическая значимость работы. На основании результатов проведенных исследований обоснована практическая значимость работы:

- определены условия культивирования консорциума кератинолитических микроорганизмов: температура 1=37,0 °С, показатель рН=7,0±0,4, продолжительность Т= 20,0±0,5 ч;

- обоснованы рациональные параметры биоконверсии перопуховых отходов консорциумом кератинолитических микроорганизмов: гидромодуля Н=0,4:0,6, 1=37,0 °С, массовая доля ю=6%, Т=12,0±0,5 ч;

- установлены рациональные параметры распылительной сушки гидролизатов перопуховых отходов: 1=70,0 °С; скорость подачи раствора в

-5

установку Ур-ра=6,5±0,5 мл/мин; скорость потока воздуха Ув=20,0±5,0 м /ч;

- разработаны технические условия ТУ 10.91.3-272-02068309-2021 «Кормовая добавка на основе отходов птицеводства» и технологическая инструкция на процесс производства кормовой добавки (Приложения Д, Е);

- рассчитана ожидаемая экономическая эффективность и проведена апробация технологии на ООО МИП «Кера-Тех». (Приложения Б-Г);

Положения, выносимые на защиту:

- научные результаты и положения, обосновывающие выбор штаммов кератинолитических микроорганизмов;

- параметры культивирования консорциума кератинолитических микроорганизмов;

- параметры биоконверсии перопуховых отходов штаммами кератинолитических микроорганизмов;

- параметры распылительной сушки гидролизатов перопуховых отходов.

Личный вклад автора заключается в обсуждении цели и задач диссертационной работы, выборе объектов и методов исследования, непосредственном участии в проведении экспериментов, обобщении и обсуждении полученных результатов, формулировке основных научных положений и выводов, в опубликовании полученных результатов и апробации материалов диссертации. Работа выполнена при поддержке: гранта Президента РФ по государственной поддержки ведущих научных школ (НШ-2694.2020.4) и поддержке стипендий Президента РФ для обучения за рубежом 2014/15 гг. (приказ № 304 от 10.04.2014 г. Минобрнауки России, приказ № 558 от 03.06.2015 г. Минобрнауки России) совместно с Каролинским Институтом (Karolinska Institute), Стокгольм, Швеция.

Степень достоверности и апробации работы. Основные работы докладывались на конференциях, конкурсах, форумах и фестивалях международного, всероссийского и регионального уровней: Зимняя научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2014); 8-я международная конференция «European Conference on Innovations in Technical and Natural Sciences» (Австрия, 2015); EuropeanJournal of Biomedical and Life Sciences (Австрия, 2015); IV Международная научно-практическая конференция «Наноматериалы и живые системы» (Москва, 2016); XI International scientific-practicial conference «The strategies of modern science development» (North Charleson, USA, 2016); XI International research and practice conference «Science, technology and higher education» (Westwood, Canada, 2016); «Продовольственная безопасность в контексте новых идей и решений» (Семей, Казахстан, 2017); Международная научно-практическая «Фараби алеми» (Алматы, Казахстан, 2017); Международная научно-практическая конференция «Перспективы развития отрасли и предприятий АПК: отечественный и международный опыт» (Омск, 2020).

Соответствие паспорту научной специальности. Проведенные исследования и содержание диссертационной работы соответствуют п. 2, 6, 8

паспорта научной специальности 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств и п. 1,2,4 паспорта научной специальности 05.18.07- Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованном ВАК РФ, 2 статьи журналах, индексированных в международных базах данных Scopus и Web of Science.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав, заключения, списка использованных источников и приложений. Основное содержание работы изложено на 129 страницах машинописного текста, содержит 64 таблицы и 23 рисунка. Список использованных источников включает 150 наименований.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы рассмотрены состав и свойства перопуховых отходов, аминокислотный и химический составы и свойства перопуховых отходов. Обозначены научные и практические особенности переработки перопуховых отходов на кормовые цели. Представлена характеристика кератинолитических штаммов микроорганизмов.

1.1 Состав и свойства перопуховых отходов

Природоохранная деятельность занимает значительное место в системе социально-экономических отношений. Актуальное и рациональное решение задач охраны окружающей среды позволяет предупреждать отрицательные экологические последствия от нерационального ведения деятельности человека, а также минимизировать связанные с этим экономические потери. В Российской Федерации потребность в развитие и содержание данного направления представлены в «Основах государственной политики в области экологического развития Российской Федерации на период до 2030 года», утвержденных Президентом Российской Федерации 30 апреля 2012 г [59]. Данный документ обозначает стратегические преимущества последующего развития России, а также ряд мер, нацеленных на предупреждение и устранение отрицательного влияния хозяйственной деятельности на окружающую среду. Одной из основополагающих целей политики в области экологии Российской Федерации является минимизация отрицательного воздействия отходов предприятий и на окружающую среду с помощью: наиболее полного потребления исходного сырья и материалов; устранения путей появления отходов; максимального уменьшения количества образования отходов и уменьшения их уровня опасности; регенерации,

многократного использования и переработки образовавшихся отходов; обезвреживания отходов [15].

Объем производства продуктов птицеводства в мире неуклонно растет. Вместе с ним постоянно растет и количество побочных продуктов переработки птицы в виде так называемых технических отходов [4, 13, 58, 98].

Для птицеводческих хозяйств, которые имеют в собственности цеха убоя птицы, характерны следующие отходы: послеубойные отходы, включающие перо, а также падеж [16, 73, 74, 124]. Одной из важнейших проблем обеспечения экологической безопасности современных производств является переработка образующихся органических отходов, которые накапливаясь, способны становиться источниками опасности для здоровья населения. Подобные отходы требуют качественной утилизации в полезный конечный продукт, что представляет собой актуальную и сложную задачу в связи с высоким уровнем контаминации птицеводческих отходов патогенной микрофлорой и широким спектром входящих в их состав сложных органических соединений [1, 132].

Вклад птицеводства в производство мяса в России в 2015 г составил 4113 тыс. т. В настоящее время, относительно общего объема производства мяса во всем мире, на производство мяса птицы приходится 54 %, в то время как в 1990 г. эта цифра составляла лишь 19 %. С ростом выпуска мяса птицы значительно возрастают объемы отходов потрошения птицы. В 2015 г. объем отходов птицепереработки составил 1,4 млн т [10, 11].

Одними из наиболее сложных с точки зрения полезной утилизации являются перопуховые отходы птицеводческих хозяйств [10, 14, 66, 76, 101, 104].

Общее количество перопуховых отходов (перья, пух, подкрылок) при переработке птицы составляет до 8 % от живой массы птицы [8, 96].

Перопуховые отходы представляют собой тонкодисперсную крошку бледно-серого цвета со средним размером частиц в диапазоне от нескольких микрометров до нескольких миллиметров [1 41].

Химический состав перопуховых отходов, по большому счету, представляет собой нативный (природный) кератин. Значительная механическая стабильность,

жесткость и высокое число дисульфидных связей кератина делает его устойчивым к действию пепсина, трипсина и папаина.

Кератины (от греч. кета8, род. падеж кетаО - рог) - это структурные белки нитевидной формы, состоящие из параллельных цепей полипептидов, расположенных в виде а-спирали или Р-структуры [20]. а-кератины - белки, из которых синтезируются внешние покровы позвоночных для их защиты. Кератин считается классическим представителем класса волокнистых белков. Кератином богаты волос, шерсть, копыта, рога, когти, перья и др. Модель структуры кератина представлена на рисунке 1.1.1. Химический состав кератинсодержащего сырья представлен в таблице 1.1.1 [8, 99].

Рисунок 1.1.1 - Трехмерная модель структуры кератина: а) стрежневая модель; б) мотив укладки; в) контактная поверхность белка, построенная с учетом

ван-дер-ваальсовых радиусов

Помимо перопуховых отходов кератин содержится в шерсти, волосе, рогах, когтях, копытах и др. Все вышеперечисленные ткани являются сложными многокомпонентными биологическими образованиями, которые состоят из отдельных клеток, формирующих их разнообразные гистоструктурные элементы.

Кератины являются фибриллярными белками, аминокислотный состав которых не постоянен и варьируется, в зависимости от природы происхождения.

а)

б)

в)

Подобная разница аминокислотных составов наблюдается в большинстве случаев из-за характерных особенностей эпителиальных тканей и процесса их ороговения в организме. Изменчивость состава аминокислот говорит о том, что данные белки являются не индивидуальными химическими веществами, а ассоциацией белковых веществ [47, 87]. Анализ аминокислотного состава белка пера позволяет говорить о строении основных структурных единиц кератина -молекулярных цепей и об активных группах, которые участвуют в формировании межмолекулярных связей и главным образом определяют характеристики кератина, а также их вариабельность под воздействием различных агентов [87].

Таблица 1.1.1 - Химический состав перопухового сырья

Малоценное кератинсодержащее сырье Массовая доля, %

протеина минеральных солей жира влаги

Перо кур, индюшат 76,4 1,5 3,3 18,8

Подкрылки кур 79,2-81,9 2,9 1,7 13,2-16,2

Перо бройлеров 82,5 2,2 1,8 13,5

Присутствие в составе белков пера большого количества остатков аспарагиновой и глутаминовой аминокислот указывает на амфотерность их характера, что обусловливает способность к активному взаимодействию с веществами основного и кислого характера, в том числе ионному (как внутримолекулярному, так и межмолекулярному) взаимодействию между отдельными фрагментами структуры белков кератинов [103, 105].

Особенностями белка кератина, выделенного из перопуховых отходов, являются значительная молекулярная масса, сложная структура и наличие сравнительно высоких концентраций серосодержащих аминокислот - метионина, цистина и цистеина [76, 115]. Белок пера и чешуек переваривается в организме птиц всего на 15-22 % (таблица 1.1.2) [3, 5, 20, 21, 23, 100, 128, 131].

Таблица 1.1.2 - Аминокислотный состав кератина различного происхождения

Аминокислоты Человеческий волос Волос лошади Овечья шерсть Куриное перо

Аланин 6,88 1,52 4,40 5,21

Валин - 0,93 2,8 6,02

Лейцин 12,12 7,16 11,5 10,83

Аспарагиновая кислота - 0,30 2,30 7,04

Глутаминовая кислота 8,06 3,70 12,9 14,03

Пролин - 3,45 4,40 4,79

Фенилаланин 0,62 - - 4,74

Метионин 3,30 3,25 2,90 5,06

Валин - 0,69 0,90 5,28

Цистеин 11,55 - 7,30 5,28

Метионин 7,80 6,36 7,34 7,02

Цистин 9,35 - 6,37 4,28

Так как аминокислоты формируют большое количество дисульфидных связей между пептидными цепочками белка, делая его эластичным, но при этом максимально недоступным для ферментов пищеварительного тракта птицы.

Аминокислотный анализ кератина различного происхождения показал, что этот белок содержит в составе незаменимые аминокислоты [23, 100, 128, 131].

Исследование аминокислотного состава кератина позволило установить строение структурных единиц кератина (рисунок 1.1.2) [44, 46, 67-71].

Основное отличие а-кератинов от у#-кератинов - это наличие поперечных дисульфидных связей между соседними цепями полипептидов. Цепи полипептидов состоят из остатков аланина, глицина и серина, но при этом

отсутствуют остатки метионина и цистеина. Полипептидная цепь имеет часто повторяющуюся последовательность —Gly—Ser—Gly—Ala—Gly—Ala— [135].

Аминокислотные остатки в кератине соединяются друг с другом за счет наличия пептидной связи, образуя при этом цепочки полипептидов, которые агрегируя, приводят к образованию макромолекулы белка. Их делят на:

- с высоким содержанием цистина и молекулярной массой 10 000 Да;

- с низким содержанием цистина и молекулярной массой до 80 000 Да.

Взаимосвязь полипептидных цепочек в кератинах, которая обусловливает

их ассоциацию в макромолекулу, обеспечивается посредством взаимодействия между главными и боковыми цепями за счет разнообразных типов химических связей [9, 78, 93].

Важное значение в образовании макромолекулы кератина имеет достаточно развитая система водородных связей, которая возникает между имидными и карбонильными группами кератина, а также между гидроксильными и карбонильными группами, аминогруппами и фенольными гидроксильными группами; между амидными группами и свободными карбоксильными группами соседних полипептидных цепочек.

Рисунок 1.1.2 - Структурная организация кератинов

Электровалентные связи, которые ответственны за взаимодействие боковых цепочек лизина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, образуются между цепочками полипептидов. Совместно с водородными связями солевые также занимают важное место в процессе образования макромолекулы белка и в процессе взаимодействия макромолекул между собой [71, 72, 108].

Преимущественным типом ковалентной связи, возникающей между полипептидными цепочками, является дисульфидная связь, формирующаяся остатками цистина, которые в свою очередь входят двумя половинками в две цепочки полипептидов. Аминокислота цистин относится к диамино-дикарбоновой кислоте и может принимать участие в образовании четырех пептидных связей, образуя при этом две различные полипептидные цепочки, которые соединены дисульфидной связью. Кроме того четыре группы - две аминные и две карбоксильные цистина, формирующие пептидные связи, которые входят в одну цепочку полипептидов. Дисульфидная связь в белках пера достаточно реакционноспособна. Например, данный вид связи может легко подвергается гидролизу и восстановлению [80, 84].

Кроме дисульфидной связи в макромолекуле белка кератина между боковыми цепочками могут образовываться ковалентные связи, такие как простые эфирные связи, амидопептидные связи, сложноэфирные, уреидные и имидные связи. Все перечисленные типы связей способны находится в белке, при этом связывая цепочки полипептидов в макромолекуле кератина, и осуществляя связь между отдельными макромолекулами белка и гистоструктурными компонентами.

Связи, существующие в кератине, представлены на рисунке 1.1.2.

Макромолекулы белка пера формируются значительным количеством различных и массивных полипептидных цепочек. Главной их характеристикой считаются очень малые размеры в поперечном сечении в сравнении с продольным направлением. В результате взаимного действия двух конкурирующих сил определяется конформация подобных длинных цепочек. К данным силам относят, во-первых, силы, стремящиеся придать цепочкам скрученную неупорядоченную форму, которая будет максимально сближать концевые участки цепочки, что

приведет к возрастанию системной энтропии, и, во-вторых, силы, которые стремятся стабилизировать форму полипептидной цепочки с помощью реакции между соседними цепочками (химически активными группами на их концах). В белках пера силы, которые действуют в направлении стабилизации структуры, значительно велики в связи с тем, что для кератинов характерно наличие остатков аминокислот, между атомными группировками которых осуществляется активное химическое взаимодействие.

Водородная

связь

сн, I 2 о н

с= сн.

н3с

сн

/ \

сн,

щс сн,

3 \ / 3 сн

он

Гидрофобное взаимодействие (кластеризация гидрофобных групп)

Полипептидная цепочка

— СН2—Э—Б—СН2 —

Дисульфидный мостик

—СН2—СН2—СН2—СН2

-МН3+ -О С

сн2-

Ионная связь

Рисунок 1.1.2 - Связи в молекуле кератина

1.2 Особенности переработки перопуховых отходов на кормовые цели

Мировой опыт утилизации кератинсодержащего сырья, в том числе перопуховых отходов птицефабрик с целью выработки кормовой продукции дает основания утверждать, что применение кормов, содержащих кератин в рационах

сельскохозяйственных животных, приводит к значимому положительному эффекту - увеличению массы птицы, снижению затрат на закупку корма, а также способствует получению высокого выхода съедобных продуктов убоя. Применение известных белковых кормовых добавок, полученных на основе кератинсодержащего сырья (перьевая, мясокостная мука и др.) свидетельствует о ценности исходной продукции в технологиях производства сухих кормов и кормовых добавок животного происхождения [68].

Химический и аминокислотный составы перопухового сырья обуславливает перспективность его использования в качестве вторичного ресурса для получения продукта - кормовой добавки [6, 12].

Существует ряд работ отечественных авторов, внесших существенный вклад в развитие науки в области кормления сельскохозяйственных животных [3, 45, 46, 50, 54, 57, 68, 69, 77].

Однако отмечается нехватка экспериментальных данных по значительному ряду аспектов данной проблемы, которая связана с переработкой вторичных перопуховых ресурсов и разработкой на их основе кормовых продуктов, а также с исследованием пригодности и результативности применения их в качестве высокобелковых кормовых добавок в рационах сельскохозяйственных животных, что открывает перспективность исследований в данном направлении.

Известны различные способы переработки и утилизации отходов органического происхождения с помощью химических, физико-химических, механических и биологических методов. Существует ряд методов переработки перопуховых отходов, позволяющих получать высокобелковые гидролизаты. Среди них преимущества имеют способы, обеспечивающие наиболее полное выделение полезных компонентов из отходов [4, 20, 51, 126].

Неоднократно учеными из разных стран разрабатывались и патентовались решения в области утилизации кератинсодержащего сырья в полезные конечные пищевые и кормовые продукты [16, 50, 110]. Многие нашли применение. Согласно работам Л.В. Антипоповй, В. Г. Волика, Д.С.Логинова [2-6, 20, 50], кислотный, щелочной и гидротермический (водный) гидролиз являются самыми

распространенными видами утилизации кератинсодержащего сырья.

Водный гидролиз является наиболее простым: кератин гидролизуется с высвобождением высокомолекулярных полипептидов. Большая часть получаемого гидролизата представлена растворимой формой белка.

В России водный способ широко применяется в мясной промышленности при изготовлении кормовых продуктов, а также технического жира.

В таких странах, как США, Япония, Германия, Франция, Китай его в основном применяют в птицеперерабатывающей промышленности для утилизации перопухового сырья в кормовые добавки для животных. Этот метод достаточно разнообразен как в технологическом исполнении, так и в аппаратурном оформлении. Модернизация его идет по пути увеличения параметров давления и температуры в ходе гидролиза отходов и за счет усложнения конструкции гидролизных аппаратов [114, 117].

Водный гидролиз отличается небольшой продолжительностью процесса, отменяет применение химических агентов, исключает необходимость очистки гидролизатов от химических солей и не требует сложного оборудования. Однако жесткие условия гидролиза приводят к разрушению некоторых незаменимых аминокислот, в результате чего продукт плохо усваивается [54, 147]. Гидротермическая обработка не может справиться с гидролизом дисульфидных связей и повысить доступность белка [43].

При кислотном гидролизе воздействие кипящими концентрированными кислотами на кератины не приводит к их разложению, в отличие от воздействия щелочами при пониженных температурах [146]. Чтобы перевести кератины в усвояемую форму, их измельчают и обрабатывают с добавлением химических катализаторов, либо ферментов [146, 147].

Проведение щелочного гидролиза кератинсодержащего сырья позволяет получить кератиновые гидролизаты. В качестве реагента применяют едкий натрий, едкий калий и раствор аммиака [17, 20].

Главным несовершенством гидролиза с применением щелочи является высвобождение аммиака и окрашенных примесей, которые формируются связи с

деструкцией лабильных аминокислот и из-за протекания реакции Майяра между альдегидными группами углеводов и аминокислотными аминокислот, которые образуются в ходе процессе гидролиза [118]. Согласно данным [57, 68, 97], существование подобных компонентов способно изменять кормовую ценность продукта и стать катализатором нежелательных реакций в организме. В. А. Антипова [3-5] отмечает, что в ходе обработки продукта щелочью «...продукт сильно загрязнен солями, что приводит к снижению выхода чистых пептидов и свободных аминокислот, плохо усваивается». Некоторые авторы [138, 139] сообщают, что при применении для нейтрализации гидролизата соляной кислоты выходит до 22 % соли, а при применении ортофосфорной кислоты гидролизат получает горький вкус. В процессе хранения соли выпадают в осадок.

К важным недостаткам щелочного гидролиза относят также разрушение аминокислот метионина, цистеина и цистина, частичную их рацемизацию. В процессе нейтрализации соляной кислотой высвобождается до 20-23% поваренной соли. При применении ортофосфорной кислоты образуются соли, придающие гидролизату горький вкус. Также недостатками щелочного гидролиза являются применение оборудования, устойчивого к агрессивным средам, длительность процесса и необходимость работы с концентрированными щелочами и кислотами [68, 114, 138].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Дмитриева Анастасия Игоревна, 2021 год

- температура

- скорость подачи раствора в установку

- скорость потока воздуха

- массовая доля влаги

- размер частиц

- выход продукта

- технологические параметры

- физико-химические показатели

- микробиологические показатели

- органолептические показатели

- содержание токсичных элементов

- содержание свободных аминокислот

- экономическая эффективность

Практическая реализация результатов исследования

Рисунок 2.1.1 - Общая схема проведения исследований

Подбор параметров распылительной сушки гидролизатов перопуховых отходов

Разработка технологической схемы и рецептуры производства кормовых добавок из перопуховых отходов

Следующий третий этап связан с подбором условий культивирования консорциума кератинолитических микроорганизмов с целью их активации. На данном этапе варьировали соотношения компонентов питательной среды (источников углерода и азота), а также параметры совместного культивирования штаммов (температуру, продолжительность культивирования, рН среды, контролируя концентрацию биомассы). Контролировали титр жизнеспособных клеток, кератинолитическую активность, концентрация биомассы, степень гидролиза кератина и массовую долю белка.

На четвертом этапе, связанном с подбором параметров биоконверсии перопуховых отходов консорциумом микроорганизмов, варьировали продолжительность гидролиза, гидромодуль, массовую долю инокулянта. Контролировали кератинолитическую активность, концентрация биомассы, степень гидролиза кератина, массовую долю белка и перевариваемость кератинового гидролизата.

Пятый этап исследований посвящен подбору параметров распылительной сушки для получения кормовой добавки из гидролизатов. Варьировали температуру, скорость подачи раствора и скорость потока воздуха; контролировали изменение массовой доли влаги в конечном продукте, выход конечного продукта и размер частиц.

На основании анализа полученных данных разрабатывали рецептуру и технологическую схему получения кормовой добавки из перопуховых отходов. Контролировали физико-химические, микробиологические, органолептические показатели, содержание токсичных элементов и свободных аминокислот в кормовых добавках. Рассчитывали ожидаемую экономическую эффективность.

Полученные результаты учтены при разработке технической документации и промышленной апробации технологии получения кормовой добавки из перопуховых отходов.

2.2 Объекты исследований

На разных этапах работы объектами исследований являлись:

- лиофилизированные штаммы, предоставленные ФГУП «ГосНИИгенетика», Россия (www.genetika.ru) и Американской коллекцией типовых культур, США (www.atcc.org): Bacillus brevis ATCC 8246, Bacillus licheniformis B-740, Bacillus pumilus B-508, Bacillus stearothermophilus ATCC 12980, Bacillus subtilis ATCC 6051, Bacillus velezensis B-64, Bifidobacterium longum ATCC 15707, Streptomyces albidoflavus ATCC 25422, Streptomyces sp. OWU 1633;

- консорциум кератинолитических микроорганизмов: Bacillus licheniformis B-740, Bacillus pumilus B-508, Bacillus subtilis ATCC 6051, Streptomyces albidoflavus ATCC 25422;

- перопуховые отходы, полученные от кур породы «Ломанн-ЛСЛ-Классик», «Ломанн Браун» и «РОСС 708» (ГОСТ Р 53397-2009, ООО

«Кузбасский бройлер», Россия, Новокузнецкий р-н);

- лиофилизированные патогенные и условно-патогенные штаммы: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella typhimurium ATCC 1353, Salmonella pullorum ATCC 19945, Clostridium perfringens ATCC 13124, Escherichia coli Б-5, Proteus vulgaris ATCC 13315, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853;

- кормовая добавка, полученная в результате биоконверсии отходов.

2.3 Используемое оборудование

Многорежимный ридер Glomax Multi (Promega, США).

Анализатор азота Rapid N Cube (Elementar, Германия).

Камера для вертикального электрофореза (Bio Rad, США).

УФ-трансиллюминатор TCP-20M (Vilber Lourmat, США).

Система гель-документирования Vitran Photo (ООО "Компания Биоком", Россия).

Аминокислотный анализатор ARACUS (Analytical Systems Gmb, Германия).

Биореактор BioStat A plus (Sartorius, Германия).

Распылительная сушка Mini Spray Dryer B-290 (Buchi, Швейцария).

Микроскоп AxioVert.Al (Carl Zeiss AG, Германия).

Спектрофотометр UV 1800 (Shimadzu, Япония).

Ультрацентрифуги (Beckman J2-HS, США).

рН-метр Sevew Compact (Mettler Toledo, Швейцария).

2.4 Методы исследований

1 Изучение свойств кератинолитических микроорганизмов с целью выбора штаммов, обладающих ценными производственными признаками.

Массовую долю сырого протеина определяли по ГОСТ 13496.4-93 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания азота и сырого протеина» [24].

Массовую долю сырой клетчатки определяли по ГОСТ 13496.2-91 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Метод определения сырой клетчатки» [25].

Массовую долю золы, нерастворимой в соляной кислоте, определяли по ГОСТ 13496.14-87 «Комбикорма, комбикормовое сырье, корма. Метод определения золы, нерастворимой в соляной кислоте» [25].

Массовую долю кальция определяли по ГОСТ 26570-85 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения кальция» [27].

Массовую долю фосфора определяли в соответствии с ГОСТ 26657-85 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания фосфора» [28].

Массовую долю натрия определяли по ГОСТ 13496.1-98 «Комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания натрия и хлорида натрия» [29].

Массовую долю влаги определяли по ГОСТ 13496.3-92 «Комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения влаги» [31].

Поиск и подбор штаммов проводили с использованием баз данных белковых последовательностей ишРюЖВ (www.uniprot.org), ШегРго (www.ebi.ac.uk/interpro) и (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Штаммы микроорганизмов для исследования кератинолитических свойств представлены в таблице 2.4.1.

Таблица 2.4.1. - Штаммы микроорганизмов для исследования кератинолитических свойств

Микроорганизм Номер штамма Оптимум t, °С Оптимум рН

Bacillus brevis ATCC 8246 37,0±0,5 6,8-7,0

Bacillus licheniformis B-740 37,0±0,5 6,8-7,0

Bacillus pumilus B-508 37,0±0,5 6,8-7,0

Bacillus stearothermophilus ATCC 12980 37,0±0,5 6,0-6,5

Bacillus subtilis ATCC 6051 37,0±0,5 6,0-6,5

Bacillus velezensis B-64 37,0±0,5 6,0-6,5

Bifidobacterium longum ATCC 15707 38,0±0,5 6,8-7,0

Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637 30,0±1,5 7,0-7,5

Streptomyces albidoflavus ATCC 25422 30,0±1,5 7,0-7,2

Streptomyces sp. OWU 1633 30,0±1,5 5,5-6,5

По результатам подобрали десять непатогенных штаммов, имеющие в

геноме гены, кодирующие дисульфидные редуктазы и сериновые протеазы -кератиназы, т.е. обладающие способностью к гидролизу кератина.

В качестве субстрата для исследования свойств, определяющих производственную пригодность кератинолитических штаммов, в данной работе использовали измельченное куриное перо, без посторонних примесей, предварительно промытое формальдегидом и высушенное на воздухе.

Культивирование штаммов вели согласно оптимальным условиям, представленным в таблице 2.4.1. Продолжительность культивирования - 12 ч.

Для определения кератиназной активности культур к навеске

-5

измельченного перопухового сырья, добавляли 10 см 0,05 М боратного буфера, в котором находилось количество фермента, эквивалентное 0,02 единиц общей протеолитической активности (pH 9,0). После этого навеску встряхивали и помещали в термостат для протекания гидролиза на 3,0±0,1 ч при температуре 37,0±0,5 °С. По окончании нераспавшийся белок осаждали с применением раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), отфильтровывали, применяя фильтр «Красная лента». Определяли оптическую плотность при 340 нм.

Измерения концентрации биомассы проводили через 12 и 24 ч культивирования с использованием многорежимного ридера Glomax Multi (Promega, США) согласно протоколам.

Белок определяли по Барнштейну. Сущность метода заключается в удалении из продукта водорастворимых небелковых азотосодержащих соединений при обработке продукта горячей водой, восстановлении азота оставшихся органических соединений при минерализации продукта серной кислотой до аммиака, титрометрическом определении аммиака и пересчете его количества на содержание белка по Барнштейну.

Степень гидролиза определяли как отношение аминного азота к общему.

Перевариваемость кератиновых гидролизатов определяли по ГОСТ Р 559872014 «Корма, комбикормовое сырье. Метод определения переваримости муки из гидролизованного пера in vitro».

Определение фракционного состава осуществляли с помощью

электрофоретического анализа в полиакриламидном геле. Перед нанесением на полиакриламидный гель образцы ферментированных гидролизатов кератина подготавливали следующим образом: 50 мкл образца (реакционной смеси) быстро ресуспендировали в объеме буфера разделяющего геля - 50 мкл, затем вносили 50 мкл диссоциирующей смеси, после этого в течение 10 мин инкубировали на кипящей водяной бане; добавляли 50 мкл окрашивающего раствора. Для анализа выбраны два маркера - Low range marker (Sigma Aldrich, США) и Wide range marker (Sigma Aldrich, США). Готовые образцы ферментированных гидролизатов наносили на гель и проводили электрофоретическое разделение смеси белков.

Для разделения смеси белков применяли денатурирующий полиакриламидный гель (12% разделяющий и 4% фокусирующий) с добавлением 0,1% додецилсульфата натрия. Проводили электрофоретическое разделение на однократном электродном буфере с внесением 0,1% додецилсульфата натрия при 15 мА. Гель окрашивали 0,2%-ным Coomassie(R) Brilliant Blue R 250 (Serva, Германия), который предварительно готовили на ледяной уксусной кислоте в течение 7-10 мин, после этого трижды промывали дистиллированной водой.

Просмотр и фотографирование гелей осуществляли с использованием УФ-трансиллюминатора TCP-20M («Vilber Lourmat», США), длина волны излучения -312 нм. Анализ и обработку электрофоретических данных производили на гель-документирующей системе Vitran-Photo (ООО «Компания Биоком», Россия).

Исследование аминокислотного состава гидролизатов кератина вели с использованием автоматического аминокислотного анализатора Aracus PMA GmbH (Analytical Systems Gmb, Германия). Принцип метода определения аминокислот состоит в их катионообменном разделении с шаговым варьированием pH и послеколоночной дериватизацией нингидрином. Анализ вели согласно протоколам прибора.

В качестве исходного сырья использовано куриное перо от кур породы «Ломан-Браун» (ООО «Кузбасский бройлер», Россия). Подготовку гидролизата исходного сырья для определения аминокислотного состава проводили методом щелочного гидролиза путем добавления водного раствора негашеной извести в

количестве 5% от массы сырья [60].

Антибиотикорезистентность определяли методом дисков, пропитанных растворами антибиотиков: колистин (ООО «РинФарм», Россия), тетрациклин (ПО «Биосинтез», Россия), энрофлоксацин (Hemofarm concern A.D., Сербия), ципрофлоксацин («Промед Экспорт. Лтд.», Россия) в концентрации 0,4%. Анализ результатов вели путем измерения радиуса зон ингибирования роста бактерий (R), включая диаметр самого диска после 24 и 48 ч инкубирования при 37±2°С.

Антагонистические свойства штаммов в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры изучались по стандартной методике - диффузии в агар на плотной питательной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-микроорганизмов. В качестве тест-культур для определения антагонистической активности в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры органических отходов использовали штаммы, представляющие естественную микрофлору отходов птицеводства [7, 56, 123]: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella typhimurium ATCC 1353, Salmonella pullorum ATCC 19945 Clostridium perfringens ATCC 13124, Escherichia coli Б-5, Proteus vulgaris ATCC 13315, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

Определение биосовместимости кератинолитических штаммов проводили методом взаимного присутствия (совместного культивирования) на плотной питательной среде - мясопептонном агаре (МПА). На поверхность плотной питательной среды с помощью бактериологической петли (d=3 мм) наносили лиофилизированные штаммы, предварительно стандартизированные по стандарту мутности. После того, как капля впитывалась, на поверхность этой же среды наносили каплю такого же объема другого испытуемого штамма, отступив при этом на 1-3 мм от края предыдущей, так чтобы последняя, растекаясь, примерно наполовину покрывала первую каплю.

При совместном культивировании в части культуры, где происходит наложение, штаммы развиваются, конкурируя друг с другом. После того как вторая капля подсыхала чашку переворачивали вверх дном и инкубировали при температуре 37 °С. Эксперимент ставили в трех повторностях, меняя при этом

взаимное положение штаммов (для исключения возможного влияния на характер роста культур в зоне последовательности наслоения).

Варьировали концентрацию микроорганизмов во вносимой бактериальной суспензии: 1 103 КОЕ/г, 1104 КОЕ/г, 1 ■ 105 КОЕ/г, 1 106 КОЕ/г.

Учет результатов эксперимента производили спустя 24 и 48 ч после начала инкубации. Задержку роста любой исследуемой культуры при совместном культивировании расценивали, как антагонистическое взаимодействие между штаммами, а сами культуры считали бионесовместимыми. Биосовместимыми считали те культуры, для которых фиксировали непосредственное слияние пятен на поверхности питательной среды или увеличение зон роста при совместном культивировании (данное наблюдение объясняли мутуализмом, синергизмом или сателлизмом). При наблюдении выхода наверх одной из культур в зоне совместного культивирования и подавлении роста другой культуры, независимо от последовательности их нанесения, фиксировали слабый антагонизм.

Существование четко выраженной зоны задержки роста одной культуры (зоны угнетения роста) по периферии пятна роста другой фиксировали сильный антагонизм культур по отношению друг к другу.

2 Подбор условий культивирования предложенной комбинации кератинолитических микроорганизмов с целью их активации.

Для выбора оптимального соотношения кератинолитических штаммов Bacillus licheniformis B-740, Bacillus pumilus B-508, Bacillus subtilis ATCC 6051, Streptomyces albidoflavus ATCC 25422 вели совместное культивирование штаммов в соотношениях 25:25:25:25, 15:45:15:25, 15:35:15:35, 35:15:35:15, согласно известным литературным данным о совместном культивировании родов Bacillus и Streptomyces [111, 119].

Культивирование вели в мясопептонном бульоне (МПБ) при температуре 37,0±0,5 °С и продолжительности культивирования 24 ч. Оптимальное соотношение выбирали с учетом сбалансированного роста культур по таким параметрам как: титр жизнеспособных клеток, кератинолитическая активность, концентрация биомассы, степень гидролиза кератина и массовая доля белка.

В соответствии с биохимическими данными, предоставленными ГосНИИГенетика и АТСС для штаммов, при подборе питательной среды варьировали содержание таких источников углерода, которые способны утилизировать все штаммы, входящие в консорциум, а именно глюкозу (ООО «Новэра», Россия), лактозу (Panreac, Испания), мальтозу (Panreac, Испания).

Для определения оптимальных источников азота использовали: пептон (ООО «АГАТ- МЕД», Россия), сульфат аммония (ООО «Конверт-Сервис М», Россия), дрожжевой экстракт (ДИА-М, Россия), триптон (ООО «АГАТ-МЕД», Россия), как наиболее доступные.

Состав питательных сред культивирования консорциума микроорганизмов Bacillus licheniformis B-740, Bacillus pumilus B-508, Bacillus subtilis ATCC 6051, Streptomyces albidoflavus ATCC 25422 представлен в таблице 2.4.2.

Таблица 2.4.2 - Состав питательных сред для культивирования

консорциума микроорганизмов-деструкторов

Компонент -5 Массовая доля, г/дм

Номер среды 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Глюкоза 10 - - 10 - - 10 - - 10 - -

Лактоза - 10 - - 10 - - 10 - - 10 -

Мальтоза - - 10 - - 10 - - 10 - - 10

Пептон 12 12 12

Триптон - - - 12 12 12

Дрожжевой экстракт 12 12 12 - - -

Сульфат аммония 12 12 12

Хлорид натрия 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6

Культивирование вели при температуре 37,0±0,5 °С, что является оптимумом для большинства штаммов, входящих в консорциум. Измерение

концентрации биомассы производили спустя 4, 8, 12 и 24 ч культивирования с использованием многорежимного ридера Glomax МиШ (Promega, США).

Для установления оптимальной питательной среды оуенивали полученные данные с помощью многофакторного анализа.

Для определения оптимальной температуры, продолжительности и кислотности питательной среды также проводили многофакторный эксперимент.

Многофакторный эксперимент обычно применяется при большой длительности процесса и/или большом количестве параметров, способных влиять на результаты опытов. В этом случае проводят одновременное изменение всех параметров системы, в результате чего получают не последовательные сечения статических характеристик исследуемого процесса, а функциональную зависимость требуемого выхода от всех влияющих факторов. Данный подход позволяет существенно сократить число экспериментов, требующихся для нахождения оптимального сочетания исходных параметров.

Зависимость некоей характеристики процесса на выходе у от варьируемых параметров процесса хь х2, х3,..., хп в общем виде записывается как квадратичное уравнение (2.4.1).

где коэффициенты а.р (/ □ у) отражают совместное влияние факторов л*, и х]-на результат, а квадратичные члены аХ отражают возможную нелинейность зависимости у от фактора х, которая может проходить через оптимальное значение. Таким образом, анализ приведенной выше зависимости позволяет определить оптимальное сочетание факторов для достижения требуемого результата. Для определения коэффициентов данного уравнения чаще всего используется композиционный план постановки эксперимента, предложенный Боксом и Бехнкеном.

На первом этапе для определения коэффициентов при линейных членах ставится эксперимент из 2к опытов, где к - число варьируемых параметров. Здесь

реализуют все возможные сочетания крайних (+1 и -1) значений влияющих на результат факторов. На втором этапе проводят 2к дополнительных экспериментов, в которых каждый из варьируемых параметров задают на крайних значениях, в то время как остальные факторы находятся на среднем (0) уровне. Матрицы композиционного плана эксперимента для варьирования трех исходных факторов приведены в таблицах 2.4.3 и 2.4.4.

Таблица 2.4.3 - Матрица композиционного плана эксперимента для варьирования двух параметров согласно плану многофакторного эксперимента Бокса-Бехнкена

№ опыта Уровни факторов

Х1 Х1

Матрица сочетания параметров первого плана

1 -1 -1

2 +1 -1

3 -1 +1

4 +1 +1

5 -1 -1

6 +1 -1

7 -1 +1

8 +1 +1

Матрица сочетания параметров второго плана

9 -1 0

10 +1 0

11 0 -1

12 0 +1

Таблица 2.4.4 - Матрица композиционного плана полнофакторного эксперимента для варьирования двух параметров

Уровни факторов

№ опыта Х1 Х2

1 -1 -1

2 -1 0

3 -1 +1

4 0 -1

5 0 0

6 0 +1

7 +1 -1

8 +1 0

9 +1 +1

Линейные коэффициенты уравнения (2.4.1) определяются после проведения первого этапа эксперимента согласно уравнениям 2.4.2-2.4.5.

аг

а] =

= N Т У

Т Х 2

] = 1, к

(2.4.2)

(2.4.3)

ал =

Т , у, I = 1к,} < I

ХАХА

(2.4.4)

Здесь Ж - общее число проведенных опытов на первом этапе. Коэффициенты уравнения (2.4.2) при квадратичных членах

определяются на втором этапе по уравнению (2.4.5)

Е|

х

\2

ал =

- - Е

N Е

х

\1 Л

Уг

Е|

х

2 Л

- Е

N Е

хт

2 Л

2

,У = 1, к

(2.4.5)

В данном случае суммирование проводят по результатам всех (в том числе первого плана) экспериментов.

Следует отметить, что квадратичные функции типа уравнения (2.4.1) в зависимости от знака коэффициента а]у могут иметь либо максимум (при отрицательном значении) либо минимум (при его положительном значении).

С целью проведения статистической оценки результатов многофакторного эксперимента для каждого пронумерованного опыта вычисляли среднее значение у и величину построчной дисперсии (дисперсии воспроизводимости), согласно уравнениям 2.4.6-2.4.7.

Е У г

(2.4.6)

У г =■

т

Е(Уг - Уг )2

2 _ г=1

воспр

(2.4.7)

т -1

где т - число повторностей каждого из опытов.

Оценку дисперсий рассчитанных коэффициентов уравнения (2.4.1) проводили по формулам 2.4.8-2.4.11:

2

2 ствоспр

ст =

а. N

,} = 1, к

(2.4.8)

Е-

г=1

т

2

ст2 = °воспр ,у,I = й,I > у

а» N < у, ^ ^ (2.4.9)

£ (х уЛ I2

I=1

_2

ст2 = СТвоспр-, у =

^ ^ .2 Т2У (2.4.10)

: (х 2 - Х212

I=1

2 1 2 ^ 2 ^ (2.4.11)

Уравнение 2.4.11 получено по закону сложения дисперсий. Оценку значимости коэффициентов регрессии проводили по критерию Стьюдента в соответствии с уравнением 2.4.12.

а

и = Ь0-, у = 0,1,2,..., п

з

а.

СТ ау (2.4.12)

где п - общее число коэффициентов уравнения (2.4.1).

Существуют таблицы значений критерия Стьюдента при различных доверительных вероятностях и числе степеней свободы (число степеней свободы определяется как Ж(п-1)). Коэффициент ц считается значимым (значимо отличается от нуля) с некоторой доверительной вероятностью, если вычисленный ^ больше табличного значения 1т при той же доверительной вероятности и соответствующем числе степеней свободы.

Возможен и обратный подход - расчет доверительного интервала на основе табличного значения т

(2.4.13)

В данном случае коэффициент ц уравнения (2.4.1) считается значимым,

если его абсолютная величина больше доверительного интервала.

Проверку адекватности полученной модели реальному эксперименту проводили по критерию Фишера, анализируя отношения дисперсий воспроизводимости и адекватности (чтобы его величина была всегда больше единицы, в числитель ставят большую их двух дисперсий).

Дисперсию адекватности рассчитывали по уравнению (2.4.14):

(2.4.14)

где yj и y, - экспериментально полученные величины ответа системы и величины

ответа, рассчитанные с помощью используемой модели, соответственно;

Если расчетный коэффициент Фишера меньше табличной величины при соответственных числах степеней свободы для дисперсий воспроизводимости и адекватности и заданной доверительной вероятности, то с этой доверительной вероятностью полученную математическую модель можно считать адекватно описывающей результаты эксперимента. В противном случае необходимо усложнение модели с введением дополнительных членов.

С целью определения оптимального сочетания исходных параметров для каждого из факторов, меняющихся в процессе эксперимента, находили частную производную уравнения (2.4.1) и приравнивали ее к нулю. Решение подобной системы линейных уравнений позволяет определить совокупность значений факторов, при которых отклик экспериментальной системы в максимальной степени соответствует желаемому.

В настоящее время существует достаточное число программ, позволяющих проводить математическую обработку результатов многофакторных экспериментов (SPSS, Statistica и др). При расчетах данные программы реализуют

алгоритмы, описанные ранее. В рамках настоящего исследования для математической обработки результатов многофакторных экспериментов использовали пакет программ Statistica 10.0 (StatSoft Inc., 2007, США).

3 Подбор параметров биоконверсии перопуховых отходов с использованием консорциума кератинолитических микроорганизмов

Ключевым контролируемым фактором процесса гидролиза перопуховых отходов являются кератинолитическая активность, концентрация биомассы, степень гидролиза кератина, массовая доля белка и перевариваемость кератинового гидролизата, а также аминокислотный состав. В качестве вариабельных параметров процесса биоконверсии использовали гидромодуль (соотношение твердой и жидкой фаз), массовую долю вносимого инокулянта кератинолитического консорциума и продолжительность биоконверсии.

Массовую долю белка определяли по ГОСТ 13496.4-93 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания азота и сырого протеина» [24].

Массовую долю сырой клетчатки определяли по ГОСТ 13496.2-91 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Метод определения сырой клетчатки» [25].

Массовую долю золы, нерастворимой в соляной кислоте, определяли по ГОСТ 13496.14-87 «Комбикорма, комбикормовое сырье, корма. Метод определения золы, нерастворимой в соляной кислоте» [26].

Массовую долю кальция определяли по ГОСТ 26570-85 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения кальция» [27].

Содержание фосфора определяли по ГОСТ 26657-85 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания фосфора» [28].

Массовую долю натрия определяли по ГОСТ 13496.1-98 «Комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания натрия и хлорида натрия» [29].

4 Подбор параметров сушки гидролизатов перопуховых отходов с целью получения кормовой добавки.

Сушку растворов вели на установке распылительной сушки, модель Mini

Spray Dryer B-290 (Buchi, Швейцария), с возможностью регулировки скорости рабочего раствора и распыляющего потока газа.

Установка позволяет получать готовый продукт с размером частиц 1-25 мкм. Материалы, вступающие в контакт с продуктом: кислотоустойчивая нержавеющая сталь, боросиликатное стекло, силикон. Схема установки приведена на рисунке 2.4.1.

Рисунок 2.4.1 - Схема установки распылительной сушки: 1 — распыляющая форсунка; 2 — нагреватель Fuzzy-logic; 3 — сушильная камера; 4 — циклон;

5— выходной фильтр; 6 — потоковый аспиратор

Нагрев газа, который подается в корпус сушилки и двухпоточной форсунки (1) производит микропроцессорная автоматика Fuzzy-logic (2), оснащенная цифровым дисплеем и температурным датчиком PT 100, обеспечивающим надежность и точность при изменении температурного параметра. Исходный раствор пропускается через форсунку, которая распыляет его на мельчайшие капли, после чего капли попадают в сушильную камеру (3), где непосредственно

протекает процесс распылительной сушки.

Частицы сухого продукта, подхваченные потоком газа, переносятся в циклон (4) для осуществления их разделения под действием собственной силы тяжести. Распылительная сушилка оснащена текстильным выходным фильтром (5), который удерживает мелкие частицы, а также оборудована аспиратором (6) для создания потока воздуха во всей установке.

Основными параметрами, влияющими на показатель массовой доли влаги, размер частиц и выход конечного продукта, согласно технической документации к установке распылительной сушки Mini Spray Dryer B-290 (BUCHI Labortechnick AG, Швейцария), являются температура сушки, аспирация (скорость потока воздуха) и скорость подачи раствора в установку. В соответствии с этим варьировали данные параметры при сушке гидролизатов кератина.

Размер частиц определяли микроскопированием образцов высушенных гидролизатов с применением микроскопа AxioVert.Al (Carl Zeiss AG, Германия).

Массовую долю влаги определяли по ГОСТ 13496.3-92 «Комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения влаги» [31].

При изучении состава и свойств кормовой добавки определяли органолептические, физико-химические и микробиологические показатели, токсичные элементы, а также аминокислотный состав.

Определение внешнего вида, цвета и запаха проводили органолептически: образец кормовой добавки массой 100 г помещали на лист белой бумаги, имеющий гладкую и чистую поверхность, тщательно перемешивали, после чего разравнивали тонким слоем на поверхности бумаги. Определяли запах и, рассматривая при естественном освещении, определяли внешний вид и цвет.

Определение крупности кормовой добавки производили следующим образом: отбирали образец массой 100 г и помещали его на лабораторное сито для рассева, плотно закрывая крышкой и, установив на рассевочной платформе.

Просеивание вели в течение 10 мин, скорость 200-210 колебаний/мин. После просеивания остаток взвешивали. Погрешность не более 0,1 г.

Массовую долю остатка на сите в процентах вычисляли по формуле 2.4.1:

где m - масса навески анализируемого продукта, г;

mi - масса остатка на сите, г.

Микробиологические показатели определяли по ГОСТ 25311-82 «Мука кормовая животного происхождения. Методы бактериологического анализа» и «Правилам бактериологического исследования кормов» (утв. ГУВ МСХ СССР 10.06.1975г.) [34]

Содержание токсичных элементов определяли по ГОСТ 30692-2000 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Атомно-абсорбционный метод определения содержания меди, свинца, цинка и кадмия» [32].

Математическую обработку результатов проведенных исследований проводили с использованием метода регрессионного анализа и применением полнофакторного планирования, градиентного метода, метода наименьших квадратов и линейного программирования. Графические зависимости, представленные на рисунках экспериментальной части работы приведены после обработки результатов исследований по методу наименьших квадратов и реализованы в Microsoft Excel и MatLAB 6.5.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение свойств кератинолитических микроорганизмов с целью выбора штаммов, обладающих ценными производственными признаками

Наиболее ценным структурным компонентом перопуховых отходов является кератин. Высокое содержание сырого протеина (более 80% в пересчете на сухое вещество) и наличие серосодержащих аминокислот делают перо перспективным кормовым источником. Результаты определения химического состава перопуховых отходов представлены в таблице 3.1.1.

Таблица 3.1.1 - Химический состав перопуховых отходов

Массовая доля, % Значение показателя*

Ломанн Браун Ломанн-ЛСЛ-Классик РОСС 708

Сырого протеина 86,32±1,29 89,57±1,25 83,94±1,16

Сырой клетчатки 0,72±0,01 0,49±0,01 0,63±0,01

Золы 0,09±0,01 0,21±0,01 0,19±0,01

Кальция 0,79±0,04 0,85±0,04 0,81±0,03

Фосфора 0,65±0,04 0,74±0,04 0,59±0,04

Натрия 0,16±0,01 0,24±0,01 0,20±0,01

*среднее значение для трех наблюдений, Р <0,05

Из таблицы 3.1.1 следует, что кератинсодержащие отходы, полученные от кур всех исследованных пород, характеризуются высоким содержанием сырого протеина (83,94-89,57 %), сравнительно низким содержанием клетчатки (0,49 -0,72%) и золы (0,09 - 0,21%) и соответствуют требованиям нормативных документов. Комплексно анализируя данные, представленные в таблице 3.1.1,

делаем вывод о перспективности использования перопуховых отходов от кур породы «Ломанн-ЛСЛ-Классик» для дальнейших исследований.

Кератинолитические бактерии - специфическая группа микроорганизмов, обуславливающих гидролиз белка пера - кератина за счет продуцирования внеклеточных ферментов, способных атаковать и полностью разлагать белки.

Анализ сходства аминокислотных последовательностей белков штаммов, обладающих кератинолитической активностью, представлен на рисунке 3.1.1. Для построения древа родства белков использовались данные из базы данных NCBI (Genbank).

Рисунок 3.1.1 - Древо сходства аминокислотных последовательностей

белков

Из рисунка 3.1.1 видно, что гомологичные (гомология более 98%) по белкам штаммы относятся к родам Streptomyces и Bacillus, что подтверждает данные литературного анализа [96, 137, 140, 146].

Известно, что большинство кератинолитических штаммов не способно продуцировать сразу два вида ферментов (дисульфидные редуктазы и

кератиназы) с одинаковой активностью, что приводит к замедлению одного из этапов гидролиза [89, 92, 112].

В процессе расщепления кератина под действием бактерий участвуют две группы ферментов. Первая - дисульфидные редуктазы. Ферменты этой группы способны уменьшать количество дисульфидных связей в молекуле кератина, что делает его доступным для действия ферментов второй группы - сериновых протеаз, а именно кератиназ. Обе группы ферментов продуцируются бактериями только при условии наличия в субстрате нативного кератина [89, 145, 150].

В базе данных ЦшРго! осуществлен поиск двух групп ферментов -дисульфидных редуктаз и сериновых протеаз по их наличию в микроорганизмах: бактериях, дрожжах и микроскопических грибах (таблица 3.1.2).

Таблица 3.1.2 - Поиск ферментов по базе данных UniProt

Фермент EC Количество

Бактерии Грибы Дрожжи

Дисульфидные редуктазы 1.8.4.2 5593 91 2

Сериновые протеазы 3.4.21 15948 1052 59

В соответствии с данными, представленными в таблице 3.1.2, наибольшее количество ферментов наблюдается у бактерий, что подтверждает результаты литературного анализа [96, 137, 140, 146].

В таблице 3.1.3 приведены ферменты, способные непосредственно разрушать пептидные и дисульфидные связи в молекулах сложных белков, а следовательно, потенциально способны деградировать кератин.

Все ферменты из таблицы 3.1.3 получены путем последовательных выборок из двух групп ферментов, представленных в таблице 3.1.2.

Домены, которые наиболее часто встречаются в ферментах, представленных в таблице 3.1.3, идентифицированы и аннотированы с использованием двух баз данных белковых последовательностей InterPro (Protein sequence analysis &

classification, https://www.ebi.ac.uk/interpro/) и Pfam (The Pfam protein families database, http://pfam.sanger.ac.uk/). Результаты представлены в таблице 3.1.4.

Таблица 3.1.3 - Ферменты, потенциально участвующие в деградации кератина

Фермент Количество Деградируемые связи

Кератиназы 11 CO-NH

Дисульфидные редуктазы 13694 S-S

Сериновые протеазы 10239 CO-NH

Щелочные протеазы 125 CO-NH

Металлопротеазы 158 CO-NH

Субтилизин 220 CO-NH

Треодоксин 553 S-S

В результате анализа найдены домены, повторяющиеся в кератиназе, и в других ферментах (в таблице выделены цветом). Соответствующие домены в кератиназе и других ферментах выделены оранжевым цветом. В скобках указано количество ферментов с повторяющимися доменами.

Исходя из данных таблицы 3.1.4 видно, что во всех ферментах, вовлеченных в процесс деградации кератина, действующих на CO-NH связи, присутствует один и тот же домен, имеющий порядковый номер в базе данных InterPro IPR000209 и аннотированный как Peptidase S8/S53.

Отличительной особенностью дисульфидных редуктаз, действующих на SS связь является отсутствие сходных с кератиназой доменов. Это подтверждает литературные данные [89, 145, 149] о необходимости наличия двух типов ферментов для протекания процесса гидролиза.

Для филогенетической идентификации ферментов, которые потенциально могут быть вовлечены в метаболические пути деградации кератина проведен

анализ с использованием программы Inparanoid 8 (http://InParanoid.sbc.su.se). Inparanoid это специализироанный алгоритм для поиска ортологичных генов. Результаты анализа частично приведены на рисунке 3.1.2.

Так как Inparanoid 8 требует значительных затрат вычисленных мощностей, а также по причине высокой гомологичности кератинолитических штаммов алгоритм был применен для одного штамма Bacillus pumilus.

В левом столбце находится список белков данного штамма (первая строка таблицы - кератиназа). В правой части таблицы находятся ортологичные штаммы. Алгоритм ищет ортологичные белки. Случаи совпадения отмечаются цифрой «1», отрицательный результат «0».

Анализ Inparanoid 8 показал наличие кератиназных ортологов у Bacillus pumilus среди Bacillus licheniformis, Bacillus brevis, Streptomyces sp, некоторых коринебактерий и микробактерий (выделены зеленым).

Полученные результаты легли в основу выбора штаммов для создания кератинолитического консорциума.

Выбор штаммов обусловлен доступностью входящих в состав питательной среды компонентов, высокой кератиназной активностью, меньшими сроками культивирования и продолжительностью биосинтеза ферментов.

Важными свойствами кератинолитических микроорганизмов, определяющих их производственную пригодность, являются следующие: кератинолитическая активность, концентрация биомассы, степень гидролиза нативного кератина, массовая доля белка, перевариваемость кератинового гидролизата (таблица 3.1.6).

Согласно данным таблицы 3.1.6 установлено, что наибольшее значение концентрации биомассы за 12 ч культивирования наблюдается для четырех штаммов: Bacillus licheniformis B-740 (370,40±22,10 КОЕ/ г-дм ), Bacillus pumilus B-508 (451,3±25,50 КОЕ/ г-дм3), Bacillus subtilis ATCC 6051 (289,5±13,50 КОЕ/ г-дм3), Streptomyces albidoflavus ATCC 25422 (232,0±14,70 КОЕ/ г-дм3).

Таблица 3.1.4 - Доменная архитектура кератинолитических ферментов

Enzyme Database

InterPro Pfam

ID Annotation ID Annotation

Keratinase (11) IPR000209 (10*) Peptidase S8/S53 PF00082 (10*) Peptidase S8/S53 domain

IPR015500 (10) Peptidase S8, subtilisin-related PF05922 (6) Peptidase inhibitor I9

IPR023827 (9) Peptidase S8, subtilisin, Asp-active site PF04151 (3) Bacterial pre-peptidase C-terminal domain

IPR023828 (8) Peptidase S8, subtilisin, Ser-active site

Disulfiede reductase (13694) IPR012336 (5634) Thioredoxin-like fold PF02683 (5549) Cytochrome C biogenesis protein transmembrane region

IPR003834 (5549) Cytochrome c assembly protein, transmembrane domain PF11412 (5549) Thiol:disulfide interchange protein DsbD, N-terminal domain

IPR017937 (4814) Thioredoxin, conserved site PF13098 (320) Thioredoxin-like fold

Alkaline protease (125) IPR000209 (67) Peptidase S8/S53 PF00082 (8) Peptidase S8/S53 domain

IPR022398 (53) Peptidase S8, subtilisin, His-active site PF05922 (4) Peptidase inhibitor I9

Продолжение таблицы 3.1.4

Enzyme Database

InterPro Pfam

ID Annotation ID Annotation

Serine protease (10239) IPR002610 (3237) Peptidase S54, rhomboid PF01694 (3237) Domain relationships

IPR022764 (3237) Domain relationships PF12122 (3229) Protein of unknown function

IPR022732 (3229) Peptidase S54, GlpG peptidase, N-terminal PF13180 (357) Domain relationships

IPR023662 (3229) Rhomboid protease GlpG PF00595 (131) Domain relationships

Metalloprotease (158) IPR000209 (99) Peptidase S8/S53 PF00082 (99) Peptidase S8/S53 domain

IPR015500 (98) Peptidase S8, subtilisin-related

IPR023828 (94) Peptidase S8, subtilisin, Ser-active site

Thioredoxin protease (553) IPR012336 (129) Thioredoxin-like fold PF02943 (128) Ferredoxin thioredoxin reductase catalytic beta chain

IPR004209 (128) Ferredoxin thioredoxin reductase beta subunit PF00085 (83) Thioredoxin

IPR005746 (83) Thioredoxin PF00070 (65) Pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductase

Subtilisin protease (220) IPR000209 (94) Peptidase S8/S53 PF00082 (94) Peptidase S8/S53 domain

(*) - количество ферментов с соответствующим доменом

BAC7TRIA

ARCHAEA

J?

(> 1Л

■a

fM

m

S

c

a. С < <

<я .J

Ü < ~ о I ^ ™ 3

£ £ 2 с

О- ro

I I

3 3 3

л re

го ш

<n < u"l ^

3 $

E 2 ЙГ rr\

> 5

I I

cr £

£ £ с

I

E а

Ü 8? £

з' з' 3

re re cn m

re Ü m ш

01 £

I

I

re

Ш

J s

-Э J5

§ s' 3

O. =

a1 re

— £ 5

CO >.

5 s

4 V

«>j <л О

I - ='

J2 с