Разработка биотехнологии бета-глюкансодержащего концентрата из остаточных пивных дрожжей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.07, кандидат наук Иванова Вера Анатольевна

• Иванова Вера Анатольевна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Иванова Вера Анатольевна

Оглавление

РЕФЕРАТ

SYNOPSIS

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 - ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Бета-глюканы. Источники получения. Строение и свойства

1.2 Строение клеточной стенки дрожжей

1.3 Способы извлечения бета-глюканов из дрожжей S. cerevisiae

1.4 Основные виды дрожжей, используемых в пивоварении

ГЛАВА 2 - МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

2.1 Объекты исследований

2.2 Материалы исследований

2.3 Схема экспериментальных исследований

2.4 Методы исследований дрожжей

2.4.1 Исследование морфологии дрожжей

2.4.2 Исследование влияния температуры и рН на метаболизм дрожжей

2.4.3 Идентификация дрожжей с использованием метода ПЦР

2.4.4 Анализ сбраживающих способностей дрожжей

2.4.5 Культивирование дрожжей

2.5 Методика анализа содержания бета-глюканов в дрожжах

2.6 Методы исследования антимикробной активности концентратов бета-глюкансодержащих

2.7 Методы исследования тестовых полуфабрикатов и готовых хлебобулочных изделий

2.8 Методы исследований показателей качества и безопасности пищевой добавки, обогащенной бета-глюканом дрожжей

2.9 Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3 - ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Скрининг штаммов дрожжей, используемых в пивоварении

3.2 Исследование влияния физико-химических и технологических факторов на содержание бета-глюканов в дрожжах

3.2.1 Исследование влияния стадии роста культуры на содержание полисахаридов в клеточной стенке дрожжей

3.2.2 Исследование содержания бета-глюканов в псевдогифальных формах

дрожжей Brettanomyces

3.2.3 Влияние условий культивирования

3.2.4 Влияние числа промышленных генераций

3.3 Разработка технологии получения добавки, обогащенной дрожжевым бета-глюканом

3.4 Исследование антимикробной активности концентратов бета-глюкансодержащих

3.5 Исследование влияния препаратов бета-глюканов на показатели качества тестовых полуфабрикатов и хлебобулочных изделий

3.5.1 Исследование влияния концентрата бета-глюкансодержащего, полученного методом химической экстракции, на показатели качества тестовых полуфабрикатов и пшеничного хлеба

3.5.2 Исследование влияния концентрата бета-глюкана, полученного методом ферментативной экстракции, на показатели качества тестовых полуфабрикатов и пшеничного хлеба

3.5.3 Сравнительный анализ влияния концентратов, полученных с помощью химического и ферментативного гидролиза, на реологические свойства и ферментацию тестовых полуфабрикатов

3.6 Исследование показателей качества и безопасности концентрата, обогащенного бета-глюканом дрожжей

3.7 Технико-экономический расчет себестоимости концентрата бета-глюкансодержащего

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А

ПРИЛОЖЕНИЕ Б

ПРИЛОЖЕНИЕ В

ПРИЛОЖЕНИЕ Г

ПРИЛОЖЕНИЕ Д

ПРИЛОЖЕНИЕ Е

ПРИЛОЖЕНИЕ Ж

ПРИЛОЖЕНИЕ И

ПРИЛОЖЕНИЕ К

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

ТЕКСТЫ ПУБЛИКАЦИЙ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка биотехнологии бета-глюкансодержащего концентрата из остаточных пивных дрожжей»

РЕФЕРАТ

Актуальность работы. Роль пищевых волокон в питании человека трудно переоценить. Потребление пищевых волокон способствует снижению риска развития болезней сердца, ожирения, некоторых желудочно-кишечных заболеваний, снижению кровяного давления, уровня холестерина, кроме того улучшает гликемию и чувствительность к инсулину. При этом современное потребление пищевых волокон взрослыми и детьми в большинстве случаев не достигает рекомендуемой нормы. Согласно действующим методическим рекомендациям МР 2.3.1.2432-08 норма потребления пищевых волокон составляет 20 г/сутки для взрослого человека и 10-20 г /сутки - для детей старше 3 лет. Поэтому актуальной задачей является разработка пищевых добавок и продуктов питания, обогащенных пищевыми волокнами.

Одним из широко известных видов пищевых волокон являются бета-глюканы. Бета-глюканы представляют собой полисахариды, входящие в состав высших грибов и микромицетов, бактерий, дрожжей и злаковых культур, в которых молекулы глюкозы связаны между собой в-1,3, в-1,6 или в-1,3, в-1,4 гликозидными связями. Данный полисахарид напрямую не усваивается человеком, но при этом является питательным субстратом для микрофлоры кишечника, кроме того, большое количество исследований подтверждает наличие у бета-глюканов целого ряда биологически активных свойств. Бета-глюканы демонстрируют противовоспалительные, антимикробные, иммуностимулирующие,

противоопухолевые, гипохолестеринемические и гипогликемические свойства.

На сегодняшний день на рынке пищевых добавок представлены препараты бета-глюкана импортного производства, что несомненно объясняет их высокую стоимость - по нашей оценке среднерыночная цена дрожжевого бета-глюкана составляет около 300 руб за 1 г чистого вещества. Несомненно, ингредиенты с такой стоимостью не могут быть использованы в крупномасштабных пищевых производствах. В данной работе остаточные пивные дрожжи рассматриваются в качестве источника этого вида пищевых волокон, так как бета-глюканы - один из

структурных полисахаридов клеточной стенки дрожжей. Использование дрожжей в пивоварении подразумевает рециркуляцию, но как правило не превышает 7-10 генераций. Остаточные семенные дрожжи - один из основных твердых отходов пивоваренной отрасли и составляют примерно от 1,5 до 3 кг с 1 гл готового продукта. Многочисленные исследования показали, что биологическая активность бета-глюканов дрожжей значительно выше активности глюканов растительного происхождения, что связано с особенностью структуры данного полисахарида. Благодаря отработанным технологиям получения и высокой скорости роста, дрожжи являются одним из перспективных и легко возобновляемых источников получения бета-глюкана.

С целью повышения конкурентоспособности пивоваренные предприятия стремятся разрабатывать новые уникальные сорта пива, применяя с этой целью нетрадиционные штаммы дрожжей. В этой связи актуально провести количественную оценку содержания бета-глюканов в различных видах дрожжей, используемых в пивоварении.

Разработка технологии получения концентрата, обогащенного бета-глюканом из остаточных пивных дрожжей, позволит получить новый ингредиент с широким спектром биологической активности для использования его в пищевой промышленности для создания функциональных продуктов питания.

Степень разработанности темы. Бета-глюканы могут быть получены из различных источников: зерна, бактерий, лишайников и грибов, включая дрожжи. Исследования бета-глюканов зерновых культур представлены в работах Канарского А.В., Гематдиновой В.М., White P.J., Liu Y. и других. Исследованиям бета-глюканов грибов посвящены работы Абылаевой Б.А., Шамцяна М.М., Chakraborty I. и многих других авторов. Известны работы Vetvicka V, Vetvickova J., Jamas S., посвященные изучению свойств и функций бета-глюканов дрожжей Saccharomyces cerevisiae. При этом, до сих пор нет достаточной информации о свойствах бета-глюканов и их количественном содержании в остаточных дрожжах, не относящихся к роду Saccharomyces.

Данные исследования продолжают серию работ по вторичному использованию отходов пивоваренного производства, выполненных учеными университета ИТМО - Смотраевой И.В. (2003г), Кораблиным Р.В. (2003 г), Чичиной Т.В. (2014г), Ефимовой С.В. (2015г). Во всех упомянутых работах в качестве вторичного материального ресурса были использованы только дрожжи рода 8асскаготусв8, кроме того, в этих исследованиях не рассматривалось получение из остаточных пивных дрожжей добавки, обогащенной бета-глюканом.

Цель и задачи работы. Целью работы является разработка технологии получения концентрата, обогащенного бета-глюканом, из дрожжей, применяемых в пивоварении. Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

- провести скрининг дрожжей, используемых в пивоварении по содержанию в них бета-глюканов;

- оценить влияние условий культивирования на содержание бета-глюканов в дрожжах, используемых в пивоварении;

- изучить влияние числа промышленных генераций на содержание бета-глюканов в дрожжах 8асскаготусв8 сегву181ав;

- обосновать выбор ферментных препаратов их дозировку и длительность направленного гидролиза клеточных стенок дрожжей, применяемых в пивоварении; режима перемешивания суспензии при получении препарата клеточных стенок;

- разработать технологию концентрата, обогащенного дрожжевым бета-глюканом;

- исследовать состав, свойства, показатели качества и безопасности концентрата;

- разработать пакет технической документации на концентрат;

- рассчитать себестоимость разработанного концентрата;

- изучить влияние концентрата на процесс тестоведения и качество пшеничного хлеба.

Научная новизна. Проведен анализ содержания бета-глюканов в дрожжах, используемых в пивоварении - 8асскаготусв8 свгву181ав, 8асскаготусв8

pastorianus, Brettanomyces bruxellensis, Saccharomycodes ludwigii, показана возможность их использования в качестве источников бета-глюканов.

Установлено, что количество бета-глюканов зависит от типа энергетического обмена дрожжей и максимальное их количество синтезируется при спиртовом брожении.

Установлено, что количество бета-глюканов зависит от стадии роста культуры и максимально накапливается в стационарной стадии роста.

Установлено, что для эффективного ферментолиза клеточных стенок дрожжей помимо протеолитических ферментов необходимо использовать ферментные препараты, в состав которых входят амилаза, липаза и маннаназа.

Показано, что использование периодического перемешивания вместо постоянного в процессе автолиза увеличивает долю бета-глюканов в получаемом в результате ферментолиза концентрате.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Разработана технология получения концентрата бета-глюкансодержащего из остаточных пивных дрожжей.

Разработан пакет технической документации (проекты ТУ и ТИ) на концентрат бета-глюкансодержащий.

Проведена технико-экономическая оценка предполагаемой технологии, при производительности предприятия 69,6 т концентрата в год себестоимость готового продукта составила 467 руб/кг

Подтверждена возможность использования концентрата бета-глюкансодержащего в хлебопечении в рецептуре пшеничного хлеба в дозировках до 0,5 % чистого бета-глюкана от массы муки.

Практическая значимость подтверждена актами производственных испытаний на базе Санкт-Петербургского филиала ФГАНУ НИИХП и ООО «Сарториус Стедим РУС».

Основные положения, выносимые на защиту: - данные о количественном содержании бета-глюканов в дрожжах,

применяемых в современном пивоварении;

- экспериментальные данные по влиянию условий культивирования на биосинтез бета-глюканов;

- данные о влиянии числа промышленных генераций на содержание бета-глюканов в дрожжах 8асскаготусв8 сегву181ав;

- обоснование выбора ферментных препаратов, их дозировок и режима перемешивания для деструкции клеточных стенок дрожжей;

- научно-практическое обоснование технологии получения концентрата, обогащенного дрожжевым бета-глюканом, его качественные показатели, свойства;

- сравнение себестоимости бета-глюкана, в составе концентрата бета-глюкансодержащего и среднерыночной стоимости бета-глюкана в составе коммерческих пищевых добавок;

- целесообразность использования концентрата бета-глюкансодержащего в рецептуре хлебобулочных изделий.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности работы подтверждается использованием физико-химических, микробиологических и молекулярных методов исследования дрожжей, полуфабрикатов и готовых продуктов согласно действующей нормативной документации, а также современных методик обработки и анализа информации, методов математической статистики.

Основные положения диссертационного исследования представлены на международных научных конференциях, всероссийских конгрессах и форумах: XLVI научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО (Санкт-Петербург, 2017), VI Всероссийский конгресс молодых ученых (Санкт-Петербург, 2017); III Международная научно-практическая конференция "Инновационные решения при производстве продуктов питания из растительного сырья" (Воронеж, 2017); ХЬУП научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО (Санкт-Петербург, 2018); VII Всероссийский конгресс молодых ученых (Санкт-Петербург, 2018); XLVШ научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО (Санкт-Петербург, 2019); XVI Всероссийская конференция

молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием "ПИЩЕВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ" (Казань, 2019); 9th International Euro-aliment Symposium (Romania, 2019); Annual Conference of Heilongjiang Institute of Natural Products Engineering & Sion-Russia Natural Products Processing Innovation Symposium (China, 2019); THE INTERNATIONAL CONFERENCE OF FOOD SAFETY AND HEALTH (FSAH 2019) (Taiwan, 2019); XLIX научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО (Санкт-Петербург, 2020); IX Всероссийский конгресс молодых ученых (Санкт-Петербург, 2020).

Публикации. По теме работы опубликовано 20 печатных работ, включая 3 статьи в рецензируемых изданиях перечня ВАК, 1 патент РФ, 1 статью - в издании, индексируемом в базе данных Scopus.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, списка литературы и приложений. Работа изложена на 222 страницах, содержит: 66 рисунков, 59 таблиц, 9 приложений. Список литературных источников включает 152 источника, из них 104 на иностранном языке.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Иванова Вера Анатольевна, 2020 год

ЛИТЕРАТУРА

1 к ..ил* В. Technology malt, and beer 1\ ®ro fessiya. 2003. 1 912.

2 Annerriuller Щ Blast in brewing 11 Pro-fessiya. 2015. P. 428.

3Bekatorou A., Psarianos C., Koutinas A.Js Production of food grade yeasts // Food Tech. Biotech 2006. V. 44. P. 407-415.

4 Novakovsfcaya S,S. Production of baker's yeast //Agropromizdat. 1990. P. 335.

5 SuomalainenH;. The effect, of biotin deficiency on the synthesis of fatty acids by yeast // Biochim. Bio-p-ys \c.:a 1963. V.70. P. 493-503.

6Meledina T.V. The yeast SMcharomyces cere-visiae.Morphology, chemical composition, metabolism //ITMO University. 2015. P. 88.

7 OuraE.,Suomalainen H.Biotin and the metabolism of baker's yeast // J. Inst, Brew. 1.978. V. 84. P.2S3-2S7.

8Bohlscheid J C„ Fellman J.K., Wand X.D. et al. The influence of nitrogen and biotin interactions on the performance of Saccharomyces in alcoholic fermentation // Journal of Applied Microbiology. 2007. V. 102. P. 390-400.

80, № 2, 2018

in the absence of a limit on nitrogen nutrition) indicates a low activity of biosynthetic processes, as a result of which there is a low yield of biomass (No. 1 and 3 in Table 2). In the biotin-rich medium, the average amino acid content in cells is 8.7%, and the maximum amount of amino acids is contained in yeast obtained in a medium with a high nitrogen content and a low seed material flowrate. In this case, one cannot speak of low yeast activity, because the yields in No. 6 and 7 (Table 2) are almost the same; on the contrary, it follows from these data that when the inoculum content is low in a medium that does not limit cell growth, the yeast reproductive activity will be higher.

Conclusions The composition of the nutrient medium should be adjusted in accordance with the dose of the seed material. In case of the decrease in the amount of inoculum, the cells biotin and sources of nitrogen nutrition needs are increased. The content of reserve carbohydrates in yeast at the end of the cultivation process doesn't practically depend on the pitching value. The increase in pitching decreases the protein content in cells and reduces the free amino acids pool in them.

Acknowledgements We show our appreciation to the LLC 'Sartorius Stedim RUS* company representative office in Russia of Sartorius Stedim. Biotech (Germany) for the equipment provided for the research - the BIOSTAT A bioreactor.

9Rogers T.O., Lichstein H.C. Regulation of biotin transport in Saccharomyces cerevisiae // J. Bacte-nol. 1969. V.100. P. 565-572.

10 Sales K. The LEA-like protemHSP12 in Saccharomyces cerevisiae has a plasma membrane location and protects membranes against desiccation and e-tha-nol-induced stress//Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1463. P. 267-278.

11 Lillie S.H., Pringle J.R. Reserve carbogydrate metabolism in S.cerevisiae responses to nutrient limitation 111. Bacterial. 1980. V. 143. P. 1384-1394.

12Panek A.D. Storage carbogydfates during starvation of yeasts // Ann. Acad, brasil. cienc. 1974. V. 46 P. 329-332.

13Panek A.D. Trehalose synthesis during starvation iaf baker's yfeasts // Europ. J Appl. .Microbiol. 1975 . Y 2 P 39-46

14Mizunaga T., Kuraishi H., Aida K. Levels of biotin enzyjfljgf during unbalanced growth and death of biotin-deficient yeàst cells II J- Gen. Appl. Microbiol. 1973. V. 19. P. 1-9.

cBecmHU%J$<pyWl£/<Procee£ngs afcVSiOE% 911'.

15 Lowry OH. Protein measurement with the fo-Im phenol reagent // J. Biol. :Chem, 1951. V.13. №61. P. 265-275.

16Waterborg, J.H. The Lowry method for protein quantitation//MethodsMolBiol. 1994. V. 32. P. 1-4.

17Swenson P.O. Aerobic fermentation and the deplation of the amino acid pool In yeasts cells // J. Gen. Physiol. 1953. V. 46. P. 387-403"

ISMoore S. Photometric nm-hydnn method for use in the chromatography of ammo acids // J. biol. Chem. 1948. V. 176. P. 367-388.

l9Moore S. A modified mnhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds I J. biol. Chem. 1954. V. 211. P. 907-913.

20Moore S Stein WH. Chromatographic determination of amino acids by the use of automatic recording equipment // Methods in Enzymology. 1963. V.

6. P. 819-831. ......

21 Trevelyan W.E. Studies on yeast metabolism. I. Fractionation andmicrodeterminationof cell carbohydrates //Biochem J. 1950. V: .50. №3. P. 298-303.

22 Trevelyan W.E. Determination of yeast carbohydrates with the anthrone reagent //Nature. 1952. V. 170. P. 826^627:

23 Trevelyan W.E. Studies on yeast metabolism. 5. The trehalose content of baker's yeast during anaerobic fermentation. // Brochem J. 1956a. V. 62. № 2. P. 177-183.

24 Trevelyan WE. Studies on yeast metabolism.

7. Yeast carbohydrate fractions. Separation from nucleic acid,, analysis,..and behaviour during anaerobic fermentation// Biochem J. 1956b. V. 63. № 3. P. 23-33.

25 Meledina T.V. Methods of planning and processing the results of scientific- research // ITMO. IHBT. 2015. P. 110.

REFERENCES I Kunze B. Technology malt and beer. Pro-fessiya. 2003. pp. 912.

2Annemuller G. Yeast in brewing. Pro-fessiya. 2015. pp. 428.

3Bekatorou A, Psarianos C, Koutinas A.A. Production of food grade yeasts. Food Tech. Biotech. 2006. vol. 44. pp. 407-415.

4Novakovskaya S.S. Production of baker's yeast. Agropromizdat. .1990. pp. 335.

5 SuomalainenH. The effect of biotin deficiency on the synthesis of fatty acids by yeast. Biochim. Bio-phys. Acta. 1963. vol 70 pp. 493-503.

6Meledina T.V. The yeast Saccharomyces cere-visiae.Morphology, chemical composition, metabolism. ITMO University. 2015. pp. 88.

7 Oura E., Suomalamen H.Biotin and the metabolism of baker's yeast. J. Inst. Brew. 1978. vol 84. pp. 283-287.

8Bohlscheid J.C,, Fellman J.K., Wand XD et al. The influence of nitrogen and biotin interactions on the performance of Saccharomyces in alcoholic fermentation . Journal of Applied Microbiology. 2Q07. vol. 102. pp. 390-400.

80, № 2, 2018

9 Rogers T.O., Lichstein EL0. Regulation of biotin transport in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacterial. 1969. vol. 10(3. pp. 565-572.

10 Sales K. The LEA-like protein HSP12 in Saccharomyces cerevisiae has a plasma membrane location and protects membranes against desiccation and etha-nol-induced stress:,.Biochim. Biophys. Acta. 2000. vol. 1463, pp. 267-278.

11 LillieS.H., Pringle J.R. Reserve carbogydrate metabolism in S.celffivisiaeresponses to nutrient limitation. J. Bacterid. 19fl vol 143. pp. 1384-1394.

12Panek A.D. Storage carbogydrates during starvation of yeasts. Ann. Acad, brasil. cienc. 1974. vol. 46. pp. 329-332.

13Panek.A.D. Trehalose synthesis during starvation of baker's yeasts. EuTOp. J. Appl. Microbiol. 1975. vol. 2. pp. 39-46.

14Mizunaga T., Kuraishi H., Aida K. Levels of biotin enzymes during unbalanced growth and death Of biotm-deficient yeast Cells. J. Gen. Appl. Microbiol. 1973. vol. 19. pp. 1-9.

15 Lowry O.H. Protein measurement with the loir phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951. vol.13, no. 6.1. pp. 265-275.

16Waterborg, J.H. The Lowry method for protein quantitation Methods Mol Biol. 1994. vol. 32, pp. 1-4.

17Swenson P.O. Aerobic fermentation and the deplation af the amino acid pool In yeasts cells. J! Gen. Physiol. 1963. vol.46, pp. 387-403.

ISMoore S. Photometric nm-hydrin method for use in the chromatography of ammo acids. J. biol. Chem. 1948. vol. 176: pp. 367-388.

19MooreS. Ainodifiedninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J. biol Chem. 1954. vol. 211. pp. 907-913.

2OMo0re S., Stein W.H. Chromatographic determination of amino acids by the use of automatic recording equipment. Methods in Enzymology. 1963. vol,

6. pp. 819-831.

21 Trevelyan W.E. Studies on yeast metabolism. L Fractionation and m lcrodeterm mation of cell carbohydrates .Biochem J. 1950. vol. 54 no 3. pp. 2§g-303.

22TrevelyartW.E. Determination of yeast carbohydrates with the anthrone reagent. Nature. 1952. vol. 170. pp. 626-627.

23 Trevelyan W.E. Studies on yeast metabolism. 5. The trehalose content of baker's; yeast during anaerobic fermentation. Biochem J. 1956a. vol. 62. no. 2. pp. 177-183.

24Trevelyan W.E. Studies on yeast metabolism.

7. Yeast carbohydrate fractions. Separation from nucleic acid, analysis, and behaviour during anaerobic fermentation. Biochem J. 1956b. vol, 53. no. 3. pp. 23-33.

25 Meledina T.V. Methods of planning and processing the results of ^scientific research. ITMO. IHBT. 2015. pp. 110.

cBecmHm{ßr(yWlff<Procee£ngs ofVSVE?, ffl. SO, № 2, 2018-