Разработка биотехнологического процесса получения комплексного ферментного препарата пуллуланазы и использование его для крахмалопаточной промышленности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Кривова, Ирина Анатольевна

• Кривова, Ирина Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кривова, Ирина Анатольевна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Крахмал-запасное вещество растительной клетки

2.2. Особенности строения и свойства пуллуланана 2.2.1. Пуллулан и амилопектин: сходство и различие

2.3. Микробная деградация крахмалистого сырья

2.3.1. Расщепление крахмала амилолитическими ферментами.

2.3.2. Механизм действия амилолитического комплекса ферментов на крахмал

2.3.3. Пуллуланаза и механизм действия внеклеточной пуллуланазы

2.4. Получение высокомальтозных сиропов из крахмалосодержащего сырья

3. Экспериментальная часть

3.1. Материалы и методы исследования.

3.1.1. Материалы

3.1.2. Методы исследования

3.1.2.1 .Метод определения содержания сухих веществ в растворах с использованием рефрактометра

3.1.2.2.0предедление восстанавливающих Сахаров по методу Бертрана

3.1.2.3.0предедление количества сырой клетчатки методом Кюршнера и Ганака

3.1.2.4.0пределение общего азота по Неслеру

3.1.2.5.Определение свободных минеральных кислот

3.1.2.6.0пределение цветности раствора

3.1.2.7.0пределение вязкости на капиллярном вискозиметре

3.1.2.8.0пределение пуллуланазной активности методом Шомодьи-Нельсона

3.1.2.9.0пределение а-амилазной активности колориметрическим методом

3.1.2.10.Определение глюкоамилазной активности с применением метода Зихера-Блейера в модификации Смирновой В.А. для опреления глюкозы.

3.1.2.11 Определение (3-амилазной активности

3.1.2.12.Методы статистической обратки результатов

3.2. Результаты и их обсуждение

3.2.1. Скрининг микроорганизмов на их спсобность образовывать пуллуланазу

3.2.2. Идентификация видовой принадлежности перспективного штамма микроорганизмов.

3.2.3. Хранение культуры Micrococcus amylofaciens в лабораторных условиях

3.2.4. Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза пуллуланазы бактериальной культурой Micrococcus amylofaciens

3.2.5. Подбор условий культивирования бактериальной культуры Micrococcus amylofaciens

3.2.6. Выделение, очистка и физико-химичекие свойства препарата пуллуланазы.

3.2.6.1. Выделение и физико-химические свойства препарата пуллуланазы

3.2.6.2. Очистка и физико-химические свойства препарата пуллуланазы

3.2.7. Гидролиз крахмалосодержащего сырья ферментными препаратами

3.2.7.1. Результаты исследования процесса разжижения крахмалов

3.2.7.2. Исследование процесса осахаривания крахмала

3.2.7.3. Влиянии различных факторов на процесс осахаривания крахмалистых субстратов (3-амилазы и оптимизация условий

3.2.7.4. Определение оптимальной дозы вносимого ферментного препарата (3-амилазы на стадии осахаривания

3.2.7.5. Применение композиции а и {3-амилазы для получения высокомальтозных сиропов

3.2.7.6. Использование мультиэнзимной композиции ферментов для гидролиза крахмалов

3.2.8. Варианты технологии ферментативного гидролиза крахмалов.

3.2.9. Некоторые свойства высокомальтозных сиропов, полученных из крахмалосодержащего сырья.

4. Обсуждение результатов 174

5. Выводы 181

6. Литература 183

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка биотехнологического процесса получения комплексного ферментного препарата пуллуланазы и использование его для крахмалопаточной промышленности»

В настоящее время тяжелая экологическая обстановка, вызванная загрязнением окружающей среды отходами химических и микробиологических производств, не совершенностью технологических процессов, воздействием производства на окружающую среду привели к неправильному использованию огромного количества сырья, изымаемого из природы. В конечный продукт превращается в среднем лишь 1,5-2,5%, остальная же его масса переходит в производственные и бытовые отходы, из которых только лишь 3,0% используется в качестве вторичного сырья. Ограниченность сырьевых ресурсов и экологически вредные для человека изменения в природе ставят вопрос о разработке комплексной и правильной технологии переработки отходов растительного сырья (Витол И.С. и др.,2000). Нарушение структуры питания приводит к дефициту отдельных видов пищевых продуктов, например, таких как углеводы. В свою очередь это, вызывает необходимость организации и развития производства сахаристых веществ из крахмалосодержащего сырья и их отходов для обеспечения населения пищевыми заменителями сахара, такими как патока с высоким содержанием мальтозы и глюкозы. Такие патоки являются ценными пищевыми продуктами, более сладкими и менее вязкими по сравнению с обычной карамельной патокой. Они не гигроскопичны, не кристаллизуются при хранении, в связи с чем, пригодны для замены сахара в кондитерской, хлебопекарной, консервной, молочной и других отраслях промышленности.

Приоритетным направлением в области решения проблем, обеспеченности' пищевыми ресурсами народонаселения нашей планеты является внедрение в народное хозяйство экологически безопасных и экономически выгодных новых технологий. В связи с этим, перспективным представляется способ получения заменителей сахара путем ферментативного гидролиза крахмала с помощью амилолитического комплекса ферментов (Кислухина О.В., 2002). Особая роль отводится ферменту пуллуланазе, которая гидролизует в пуллулане а-1,6 связи, в результате возникают молекулы триоз, состоящих из трех остатков глюкоз (Грачева И.М. и.др.,2000).

Важно отметить, что пуллуланазы расщепляют не только пуллулан, а также а-1,6 связи в крахмале, предельных декстринах и гликогене. Это свойство пуллуланазы ценное и имеет большое практическое значение при получении сахаристых веществ на основе крахмала особенно при совместном действии а-амилазы, [3- амилазы и глюкоамилазы, при этом не образуется продуктов кислой деструкции Сахаров, а также продуктов их термического разложения, рН конечного продукта колеблется от 5,5 до 6,0.

Учитывая тот факт, что в нашей стране промышленного производства пуллуланазных препаратов нет, вопрос о поиске продуцентов внеклеточной пуллуланазы, разработке условий культивирования последнего, выделении фермента из культуральной жидкости, а также о возможности использования мультиэнзимных композиций ферментных препаратов пуллуланазы при биоконверсии крахмалистого сырья с целью получения высокомальтозно-глюкозной патоки является весьма актуальным. Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлся поиск активного продуцента внеклеточной пуллуланазы, разработка условий культивирования последнего, получение ферментного препарата, обладающего пуллуланазной активностью и последующее использования мультиэнзимных амилолитических композиций ферментных препаратов при деградации крахмалистого сырья для получения высокомальтозно-глюкозной патоки.

Для достижения данной цели были поставлены следующие 'задачи: . - скрининг микроорганизмов на их способность образовывать пуллуланазу; '

- подбор оптимальной среды и режимов культивирования штамма - продуцента пуллуланазы;

- разработка оптимального способа хранения посевного материала микроорганизма-продуцента пуллуланазы;

- выделение и очистка внеклеточной пуллуланазы;

- исследование'физико-химических свойств очищенного ферментного препарата пуллуланазы;

- использование амилолитического комплекса ферментов при деградации крахмалистого сырья для получения высокомальтозно - глюкозной патоки;

- разработка технологии получения высокомальтозно-глюкозной патоки из крахмалосодержащего сырья.

Научная новизна.

В представленной диссертационной работе научно обосновано и экспериментально доказано:

- по результам скрининга бактериальных культур, выделенных из различных' почвенных образцов, найден продуцент пуллуланазы, изучены его культурально-физиологические особенности и определена видовая принадлежность - Micrococcus amylofaciens;

- оптимизированы условия питания и культивирования продуцента пуллуланзы;

- изучены условия выделения препарата внеклеточной пуллуланазы, хранения и очистки;

- на основании выявленных зависимостей выхода высокомальтозно- глюкозной патоки от - степени биоконверсии крахмалистого сырья впервые обоснован оптимальный состав ферментативных систем амилолитического действия;

- разработана технология получения высокомальтозно-глюкозной патоки при использовании мультиэнзимных композиций амилолитических ферментов;

Практическая значимость работы.

Проведенные исследования являлись основой доя решения эколого-биологических задач по совершенствованию комплексной переработки различного крахмалосодержащего сырья и его отходов при использовании амилолитического комплекса ферментов микробного происхождения. 'Наряду с получением ценного продукта, а, именно, высокомальтозно-глюкозной патоки, нами одновременно решались вопросы снижения загрязнения окружающей среды отходами крахмалистого сырья и токсичными продуктами их деструкции:

- получен новый высокоактивный штамм - Micrococcus amylofaciens - продуцент пуллуланазы и разработана технология получения препарата пуллуланазы. -разработана технологическая схема переработки растительного сырья, содержащего крахмал с целью получения высокомальтозной- глюкозной патоки;

- разработана стадия осахаривания сырья с использованием энзиматических комплексов;

- увеличен выход глюкозы по сравнению с традиционной технологией на 18,0+1,5%;

- улучшены разнообразные свойства и качественные характеристики паток . Результаты проделанной работы подтверждены в полупроизводственных условиях на промышленной установке опытного участка апробаций научных разработок при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова.

2 . Обзор литературы.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Кривова, Ирина Анатольевна

5. Выводы.

1.Путем скрининга 187 прокариотных микроорганизмов из различных систематических групп найден продуцент, обладающий высокой биосинтетической способностью к образованию пуллуланазы. Определена видовая принадлежность микроорганизма с использованием международной системы API - Micrococcus amylofaciens.

2. Подобранные экспериментальным путем условия культивирования продуцента позволили увеличить продуктивность штамма в 3,2 раза , при этом л уровень активности пуллуланазы составил 38,0 ед/ см ,для этого: -разработаны эффективные методы поддержания штамма-продуцента; -сконструированы новые питательные среды для культивирования и биосинтеза пуллуланазы;

-экспериментально обоснованы оптимальные параметры биосинтеза пуллуланазы ( рН среды, возраст, и доза посевного материала, длительность культивирования и аэрация), обеспечивающие максимум накопления фермента;

3.Разработаны методы выделения ферментного препарата ' пуллуланазы из фильтрата культуральной жидкости Micrococcus amylofaciens :

- определен спектр ферментативных активностей препарата, показано наличие амилолитической, пуллуланазной, глюкоамиЛазной активностей последнего;

- дана характеристика физико-химических свойств ферментного препарата.

4. Обоснована целесообразность применения мультиэнзимного биокатализа крахмала для повышения эффективности процесса гидролиза последнего, увеличен выход мальтозы до 60,0±1,5%, при уровне содержания глюкозы в сиропах до 10%. '

Подобраны оптимальные условия гидролиза крахмала |3-амилазой из B.polymyxa ,препарата а-амилазы, комплекса ферментов из Micrococcus -amylofaciens;

5. Усовершенствована традиционная технология производства высокомальтозных паток на основе ферментативного гидролиза крахмала:

- на основании экспериментальных данных исключена из традиционной технологии ферментативного гидролиза крахмалосодержащего сырья стадия инактивации ферментов после этапа разжижения крахмала;

- показана целесообразность сохранения а-амилазы, вносимой на стадии разжижения крахмала, в процессе осахаривания;

- предложены альтернативные технологии осахаривания крахмала с использованием мультиэнзимного комплекса на основе Micrococcus amylofaciens и импортного препарата «Глюкозим Л-100С+»;

- определена экономическая эффективность предложений, позволившая снизить себестоимость получения высокомальтозных паток на 4,7%, тем самым увеличить прибыль при использовании разработанной технологии на 2720 рублей на 1000т сырья. L

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кривова, Ирина Анатольевна, 2006 год

1.Балаян A.M., Маркосян J1.C. Характеристика внутриклеточной пуллуланазы термофильного штамма Bac.spp.//Биохимия, 1989,т.54, вып.1, 273-281.

2. Баразненок В.А. Выделение и свойства эндоглюконаз и ксилоназ .// Диссертация кандидата химических наук, М, МГУ, 1999,175 с.

3. Беликов П.С.Дмитриева Г.А. Физиология растений.//РУДН,М, 1992,248 с.

4. Бендецкий К.М., Яровенко B.J1. Действие альфа-амилазы из Bac.subtilis на крахмал.//Биохимия. 1987 , т.38, №3, 568-572.

5. Бородин З.М., Ладур Т.А. Исследование процесса разжижения крахмала при производстве глюкозы ферментативным способом.// Сахарная промышленность, 1974,№2, 53-58.6.Бутова С.Н.

6. Бутова С.Н., Кривова И.А., Ладур Т.А., Воробьева И.В.

7. Витол И.С.,Кобелева И.Б.Драубенберг С.Е. Ферменты и их применение в пищевой промышленности. // М: Издательский комплекс МГУПП, 2000,213с.

8. Гаспарян А., Абелян Р., Африкян Р. Характеристика бета-амилазы Bac.polymyxa. // Биохимия, 1992,т.57, вып.6, 356.

9. Ю.Герна Р.Л. Хранение микроорганизмов. Методы общей бактериологии . // Мир,М, 1983,т. 1,512с.11 .Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. // М: Элевар,2002, 512с.

10. Грачев Ю.П. Математические методы планирования эксперимента. // Пищевая промышенность, М, 1979,199с.

11. З.Громов М.А. Термофизические характеристики мальтозы и ее водных растворов. // Сахарная промышленность, 1987,№11, 59-61.

12. М.Гулюк Н.Г., Жушман А.И. и др. Крахмал и крахмалопродукты.// Агропромиздат., М, 1985,238с.

13. Канбурова М. Оптимизация условий синтеза термофильной пуллуланазы Вас. stearothermophilus.// Acta Microbiol. Bulg., 1986, №9,48-51.

14. Каприлянц Т., Тарахтий С., Стынгач Р. Ферментативный гидролиз пшеничного крахмала различными амилазами.// Микробиология, 1991, №6, с.50.

15. Квеситадзе Г.М. Грибные и бактериальные амилазы.//Тбтлиси : Мецниереба, 1990,154 с.

16. Квеситадзе Г.М. Эндоглюканазы термофильных и мезофильных грибов. // Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук,Тбилиси,1994, 40 с.

17. Киселева 3.JI. Окислительно-щелочная и водно-бутанольная делигнификация растительного сырья для получения глюкозы ферментативным гидролизом.// автореферат диссертации на соискание степени кандидата химических наук, м, 1993,24 с.

18. Кислухина О.В. 2002 Ферменты в производстве пищи и кормов.//М.ДеЛи принт, 2002, 336 с.

19. Кондратьева Н.А., Исакова Е.П., Бирюков В.В. Выделение и изучение термофильных анаэробных бактерий, утилизирующих целлюлозосодержащие материалы.// прикладная биохимия и микробиология, 1998, т.34,№4, 388-398.

20. Кудряшова О.А., Юрлова Н.А. Изучение естественной изменчивости Aureobasidium pullulans шт. 11 продуцента эндосахарида.// Микробиология, 1997,т.66,№3,354-357.

21. Ладур Т.А. Временная технологическая инструкция по применению ферментного препарата «Глюкозим Л-400С+Нео» в крахмало-паточном производстве.// Коренево:ВНИИК, 2001,-сЗ.

22. Ладур Т.А. Выдача рекомендаций по внедрению ферментных препаратов при производстве глюкозы. // Отчет ВНИИК,№3551, 1971,47с.

23. Ладур Т.А. Производство и применение низкосахаристых продуктов ферментативного гидролиза крахмала.// АгроНИИТЭИПП, 1988, сер.19, вып.2., 9-16.

24. Ладур Т.А. , Лукин Н.Д. Совершенствование техники и технологии сахаристых крахмалопродуктов в СССР и за рубежом.// АгроНИИТЭИПП, 1987, сер. 19, вып.9,с.7-16.

25. Ладур Т.А. , Лукин Н.Д. Применение биотехнологии для получения сахаристых продуктов для зернового крахмалосодержащего сырья.//Пищепромиздат,М, 2004, с.263-266.

26. Ладур Т.А., Пучкова Т.С. Глюкозо-фруктозный сироп новый сахарозаменитель. // Сахарная промышленность, 1983,9, 53-54.

27. Ладур Т.А. ,Сидорова Е.К., Лукин Н.Д. и др. Новое в технике и технологии производства сахаристых крахмалопродуктов и их применение в СССР и за рубежом. // ЦНИИТЭИ1111ищепром., 1983,сер.5,вып.6,11-16.

28. Лукин Н.Д., Сидорова Е.К., Дубинская И.П. Пути совершенствования паточного производства.// АгроНИИТЭИПП, 1986, сер.19, вып.5, 1-36.

29. Ленинджер А. Основы биохимии, тт.1-3- М.:Мир,1990,-957с.

30. Маркосян Л.С.Балаян A.M. Внеклеточная пуллуланаза термофильного штамма Bacillus sp.// Прикладная биохимия и микробиология, 1990,т. 26,№3, 313-320.

31. Мазуренко А.Н., Каменский А.А., Сериченко Л.Г., Сазонова A.M., Румянцев В.М., Купцов Н.В. Штамм бактериий Bacillus subtilis продуцент осахаривающей амилазы, расщепляющей пуллулан. Патент 2034923, C1,RU, 1996, бюлл.13.

32. Максимов В.И. Реакции трансгликозилирования в ферментативном гидролизе полисахаридов и методы их исследования // в книге «Микробиология и биохимия разложения растительных материалов», М, Наука, 2000,181-230.

33. Номенклатура ферментов.//М: Изд-во ВИНИТИ, 1979-3 20с.

34. Павлова И.Н., Ночарова Н.А.,Захарова И.Я., Титиянова Н.З. Штамм бактерий B.lichenifor продуцент термофильных амилолитических ферментов.// Патент 5021951/13, опуб. 15.10.2001, бюл.37.

35. Павлова И.П.,Кочанова Н.А. и др. Штамм бактерий Вас. lichienifor -продуцент термостабильных амилолитических ферментов, патент 2001103, бюл.16,15.10.1993.

36. Полыгина Г.В.,Чередниченко B.C., Римарева Л.В. Определение активности ферментов.// ДеЛи принт,М,2003,372с.

37. Пучкова Е.О. Методы определения содержания жизнеспособных микроорганизмов.//Биотехнология, 1996, т.4.,№1,142.

38. Пучкова Т.С. Разработка технологии глюкозо-фруктозного сиропа из крахмала с применением глюкозоизомеризующих ферментных препаратов.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук, 1984,М,ВНИИК, 26с.

39. Соловьева С.Ю.,Ладур Т.А. Биоконверсия крахмала при производстве патоки заданного углеводного состава. // Пищепромиздат,М,2004,266-269.

40. Сторневая В.В. Влияние рН на термочувствительность глюкозных сиропов.// ЦНИИТЭИПищепром., 1978,вып.4, 5-6.

41. Сторневая В.В. Термическая устойчивость глюкозных сиропов при выпаривании и упаривании.// Сахарная промышленность, 1981 ,№ 1 .,52-53.

42. Рид. Д. Ферменты в пищевой промышленности. // Пищевая промышленность, М, 1971,342с.

43. Рухлядева П.П. , Полыггалина Г.В. методы определения гидролитических ферментов.//Легпищепром, 1981,290 с.

44. Трегубов Н.Н. , Костенко В.Г. Технохимический контроль крахмало -паточного производства.// Агропромиздат, 2-е изд., 1991,271 с.

45. Трегубов Н.Н.,Жаров Е.Я. и др. Технология крахмала и крахмалопродуктов. //Легкая и пищевая промышленность, М, 1981,472с.

46. Шапашников Г.П., Иванова Е.А. Совершенные способы производства патоки и глюкозы из крахмала и крахмалосодержащего сырья.// ЦИНТЭИПищепром., 1969,40 с.

47. Уистлер Р.Л., Пашаль Э.Ф. Химия и технология крахмала.// Пищевая промышленность, М, 1975,360с.

48. Яровенко В.Л.,Понамарева А.Н. «11»-комплекс растений и пуллуланаза Aerobacter aerugenes. //Пищевая промышленность, М, 1970, 243с.

49. Altschul S F, Gish W, Miller W, Myers E W, Lipman D L. Basic local alignment search tool.// J Mol Biol. 1990;215:403-410.

50. Anderson, S. & Weber, G. The reversible acid dissociation and hybridization of lactic dehydrogenase. //Arch. Biochem. Biophys. ,2002 ,116,207-223.

51. Antranikian, G. Microbial degradation of starch. In Microbial Degradation of Natural Products (Winkelmann, G., ed.), pp. 28-56. VCH, Weinheim, Germany.2002.

52. Ara K, Igarashi K, Saeki K, Ito S. An alkaline amylopullulanase from alkalophilic Bacillus sp. KSM-1378: kinetic evidence for two independent active sites for the a-1,4 and a-1,6 hydrolytic reactions. //Biosci Biotechnol Biochem. 1995;59:662-666.

53. Arnosti C.,Repeta D. Extracellular enzyme activity in anaerobial culture ".Evidence of pullulanase activity among mesophilic marine bacteria.//Appl.And Environ.Microbiol.,1994,v.60,3, 840-846.

54. Badal C.,Saha C., Saroj P., et al. Purification and characterization of ahydric thermostable pullulanase from Clostridium sp.// Microb. ,1998,453-478.

55. Badal C.,Saha C., et al. Novel highly thermostable pullulanase from thermophiles.//Trends Biotech., 1989,v7,1,56-64.

56. Bauer M.W.,Driskill L.E.,Kelly R.M. Glycosylgydrolases from hyperthermophilic microorganisms.//Curr. Opin. Biotechnol.,1998, 9,141-145.

57. Bentley I.S., Williams E.C. Starch conversion. In: Industrial enzymology.//L.Macmilliam Press, 1996,337-357

58. Bers, D.M., Patton, C.W. & Nuccitelli, R. A practical guide'to the preparation of Ca2+ buffers.// Methods Cell Biol. ,2004 ,40,3-29.

59. Bergmeyer, H.U. & Grassl, M. Methods for Enzymatic Analysis, Vol. 2, 3rd edn. (Bergmeyer, H.U., ed.), pp. 151-152. Verlag Chemie, Weinheim.,2001.

60. Bibel M.,Bretti C.,Gosslar U. Et al. Isolation and analysis of genes from amylolitic enzymes of the hyperthermophilic bacterium.//FEMS Microbiol.Lett., 1998,158 ,9-15.

61. Bisgard-Frantzen H., Svendsen A. Amylase variants. Patent application WO 96/23873, 2004.

62. Bradford M M. A rapid sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.// Anal Biochem. 1999;72:248-254.

63. Brown S H, Kelly R M.Characterization of amylolytic enzymes having both a-1,4 and a-1,6 hydrolytic activity from the thermophilic archaea Pyrococcus furiosus and Thermococcus litoralis.//Appl Environ Microbiol. 1999;59:2614-2621.

64. Brown, S.H., Kelly. R.M. Characterization of amylolytic enzymes from the thermophilic archaea Pyrococcus furiosus and Thermococcus litoralis.// Appl. Environ. Microbiol,.2003 63, 2616-2628.

65. Bryant, D.T. Quin 2: the dissociation constants of its Ca2+ and Mg2+ complexes and its use in a fluorimetric method for determining the dissociation of Ca2+-protein complexes. //Biochem. J. ,2005,226, 613-616.

66. Canganella F., Andrade C, Antranikian G. Characterisation of amylolytic and pullulytic enzymes from thermophilic archaea and from a new Fervidobacterium species. //Appl Microbiol Biotechnol. 1994;42:239-245.

67. Cha H J. ,Yoon H G, Kim Y W, Lee H S, Kim J W, Kweon К S, Oh В H, Park К H. Molecular and enzymatic characterization of a maltogenic amylase that hydrolyzes and transglycosylates acarbose. Eur J Biochem. 1998;253:251-262.

68. Cheoral K., Chung Y.C. et al. Enzymes involved in the processing of starch to sugars.//Appl.Environ. Microboil. ,1994,57,123-128. ,

69. Chung H.,Yoon S, Lee M, Kim M, Kweon K, Lee I, Kim J, Oh B, Lee H-S. Characterization of a thermostable cyclodextrin glucanotransferase isolated from Bacillus stearothermophilus ET1// J. Agric Food Chem. 1998;3:952-959.

70. Coleman, R.D., Yang, S.-S. & McAlister, M.P. Cloning of the debranching-enzyme gene from Thermoanaerobium brockii into Escherichia coli and Bacillus subtilis.// J. Bacterid., 1998,169,4302-4307.

71. Crabb W D, Mitchinson C.Enzymes involved in the processing of starch to sugars. //Trends Biotechnol. 2004;15:349-352.

72. Costanzo B.,Garabed A. Starch-hydrolyzing enzymes from thermophilic archaea and bacterua,// Chemical Biplogy, 2002, 6,151-160.

73. Diderichsen B, Christiansen L. Cloning of a maltogenic a-amylase from Bacillus stearothermophilus.// FEMS Microbiol Lett. 2000;56:53-60.

74. Diderichsen B, Wedsted U, Hedegaard L, Jensen В R, Sjiuholm C. Cloning of aldB, which encodes a-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J Bacterid. 1990; 172:4315-4321

75. Dong G., Vieille C, Zeikus J G. Cloning, sequencing, and expression of the gene encoding amylopullulanase from Pyrococcus furiosus and biochemical characterization of the recombinant enzyme. //Appl Environ Microbiol,2000,34-78.

76. Duffner F., Bertoldo C. A new thermoactive pullulanase from Desulfiirococcus mucosus: cloning, sequencing and characterization of the recombinant enzyme after expression in B.subtilis.//J.Bacteriol.,2000,182,6331-6338.

77. Freer S. Purification and characterization of an extracellular a-amylase from Streptococcus bovis YB.II Appl Environ Microbiol. 2000;59:1398-1402.

78. Furegon L, Curioni A, Peruffo DBA. Direct detection of pullulanase activity in electrophoretic polyacrylamide gels.// Anal Biochem. 2001 ;221 ;200-201,

79. Gantelet H, Duchiron F. Purification and properties of a thermoactive and thermostable pullulanase from Thermococcus hydrothermalis, a hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea hydrothermal vent.// Appl Microbiol Biotechnol. 2003;49:770-777.

80. Gastro G.Purification and properties of a thermoactive and thermostable pullulanase from Thermococcus hydrothermalis.// Appl. Microbiol.Biotechnol.,1992, 49,770-777

81. Jakovljevic D.,Vrvic M. et al. Fine structural analysis oh the fungal polysaccharide pullulan elaborated by Aureobasidium pullulans CH-1 st.// J.Serb.Chem Soc.,2001,66,6,377-383/

82. Henry, E.R. & Hofrichter, J. Singular value decomposition: application to analysis of experimental data.// Methods Enzymol. 2000 ,210,129-192.

83. Hyun, H.H. & Zeikus, J.G. General biochemical characterization of thermostable pullulanase and glucoamylase from Clostridium thermohydrosulfuricum.// Appl. Environ. Microbiol.2000,49,1168-1173.

84. Kamburova A. Amylolytic enzymes and production derived from starch: a review. // Crit. Rev. Food Sci. Nutr.1986,35,373-403.

85. Kashiwabara S, Ogawa S, Myyoshi N, Oda M, Suzuki Y. Three domains comprised in thermostable molecular weight 54,000 pullulanase of type I from Bacillus flavocaldarius KP 1228.//Biosci Biotechnol Biochem. 2000;63:1736-1748. „

86. Kelkar H.S.,Despande M. Purification and kinetic studies of wheat bran J3-amylase and pullulan-hydrolysing glucoamylase from Selerotium rolfsii.// Starch., 1993,45, 361-368.

87. Koch, R., Zablowski, P., Spreinat, A. & Antranikian, G. Extremely thermostable amylolytic enzyme from the archaebacterium Pyrococcus furiosus. //FEMS Microbiol. Lett.,1990, 71,21-26.

88. Koch, R., Spreinat, A., Lemke, K. & Antranikian, G. Purification and properties of a hyperthermoactive a-amylase from the archaebacterium Pyrococcus woesei.// Arch. Microbiol., 2000,155, 572-578.

89. Johnson, W.C. Jr Analysis of circular dichroism spectra.// Methods Enzymol. 2003 , 210,426-447.

90. Lehrer, S.S. Solute perturbation of protein fluorescence. The quenching of the tryptophyl fluorescence of model compounds and of lysozyme by iodide ion.// Biochemistry , 2001 ,10,3254-3263.

91. Leuschner, C. & Antranikian, G. Heat-stable enzymes from extremely thermophilic and hyperthermophilic microorganisms.// World J. Microbiol. Biotechnol. 1999,11, 95-114.

92. Linse, S., Johansson, C., Brodin, P., Grundstroem, Т., Drakenberg, T. & Forsen, S. Electrostatic contributions to the binding of Ca2+ in calbindin D9k.// Biochemistry, 2001, 30, 154-162.

93. Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L. & Randall, J.R. Protein measurement with the Folin phenol reagent. //J. Biol. Chem. ,1951,193, 265-275 .

94. Madi, E. & Antranikian, G. Identification of a starch degrading anaerobic thermophile producing thermostable a-amylase and pullulanase.// Appl. Microbiol. Biotechnol., 1999,30,422-425.

95. Marc J. Van der Maarel et al. Properties and applications of starch-converting enzymes of the a-amylase family.//J. Biotechnol.,2002,94,137-155.

96. Mathupala, S.P. & Zeikus, J.G. Improved purification and biochemical characterization of extracellular amylopullulanase from Thermoanaerobacter ethanolicus 39E. //Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003,39,487-493.

97. Melasniemi H. Effect of carbon source on production of thermostable a-amylase,pyllulanase and a-glucosidase by clost thermohydrosuturicum.// J.Ben Microb.,1997,133,4,883-890.

98. Melasniemi, H. Purification and some properties of the extracellular alpha-amylase-pullulanase produced by Clostridium thermohydrosulfuricum. //Biochem. J. ,2001,250,813-818.

99. Myers, J.K., Pace, N.C. & Scholtz, M.J. Denaturant m values and heat capacity changes: relation to changes in accessible surface areas of protein unfolding. // Protein Sci. ,2005, 4, 2138-2148.

100. Myers, J.K., James M.G. et al Recent progress towards under-standing biosynthesis of the amylopectin crystal.// Plant Physiol.,2000,122,1989-1997.

101. Nakamura, N., Sashihara, N., Nagayama, H. & Horikoshi, K. Characterization of pullulanase and a-amylase activities of a Thermus sp. AMD33.// Starch/Starke,2000,41,112-117.

102. H.Pace, C.N. & McGrath, T. Substrate stabilization of lysozyme to thermal and guanidine hydrochloride denaturation.// J. Biol. Chem, 2000,. 255,3862-3865.

103. PattT. Microbiology degradation of chemical pullulans.// Appl.Biochem. Biotechnol., 1993,43, 6, 567-575.

104. Permyakov, E.A., Yarmolenko, V.V., Emelyanenko, V.I., Burstein, E.A., Closset, J. & Gerday, C. Fluorescence studies of the calcium binding to whiting (Gadus merlangus) parvalbumin. //Eur. J. Biochem.2001,109,307-315.

105. Royer, C.A., Mann, C.J. & Matthews, C.R. Resolution of the fluorescence equilibrium unfolding profile of trp aporepressor using single tryptophan mutants.// Protein Sci., 2002 ,2,1844-1852.

106. Saha B.,Leikus J. Biotechnology of maltose syrup production.// Process Biochem., 1989,22,3,78-81.

107. Salva G.,Iracema.O. Effect of the carbon source of a-amylase production by B.subtilis.// Rev.Microbiol.,2001,26,1,46-51.

108. Santoro, M.M. & Bolen, D.W. Unfolding free energy changes determined by the linear extrapolation method. 1. Unfolding of phenylmethanesulfonyl alpha-chymotrypsin using different denaturants. //Biochemistry, 2000, 27, 8063-8068.

109. Schultes, V. & Jaenicke, R. Folding intermediates of hyperthermophilic D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Thermotoga maritima are trapped at low temperature.// FEBS Lett.2002,290,235-238.

110. Spreinat, A. & Antranikian, G. Analysis of the amylolytic enzyme system of Clostridium thermosulfurogenes EMI.// Starch, 2002, 8,305-312.

111. Sunna, A., Moracci, M., Rossi, M. & Antranikian, G. Glycosyl hydrolases from hyperthermophiles.// Extremophiles ,2002,1,2-13.

112. Takasaki J. Production and utilization of P-amylasa and pullulanase. // Agricult.and Biolog.Chem., 1976,v40, 8,1551-1522.

113. Takasaki J. Production of pullulanase. // Biolog.Chem., 1993 , 5,8, 551-522.

114. Tanford, C. Physical Chemistry of Macromolecules. -John Wiley, New York.,2000,672 p.

115. Tomimura E. Action of neopullulanase.Neopullulanase catalyzes both hydrolysis and transglycosilation at a-1-4 and a-1-6 glucosidic linkages. // J. Biol.Chem., 1991, 267,18447-18452.

116. TeggeG. Action of pullulanase.//J. Biol.Chem,1980, 128, 786-897.

117. Tegge G. Pullulanase.//J. Biol.Chem,1986, 228,186-197.

118. Tsou, C.L. Conformational flexibility of enzyme active sites. //Science,2003, 262,380-381.

119. Директор МентраН'Бйа^нженёрия" РАН академик.ГРА'СХН Скряби!! К.Г. Ч:' ''' "2$Йшваря 2006 г.1. АКТ

120. Опытно-промышленных испытаний ферментного препарата пуллуланазы, полученного из фильтрата культуральной жидкости Micrococcus amylofaciens.

121. Процесс осахаривания крахмала осуществляли с использованием амилазы из B.polymyxa и препарата пуллуланазы из Micrococcus amylofaciens, без инактивации а-амилазы.

122. Разжиженный продукт без изменения рН охлаждали до температуры 57°С и в него задавали ферментные препараты в количестве 1,5 ед/г крахмала каждого. Процесс осахаривания осуществлялся в течение'60 часов.

123. Затем осахаренный сироп подвергали механической фильтрации на лабораторном вакуум-фильтре и обесцвечиванию с использованием в качестве адсорбента порошкообразного активного угля в количестве 0,5% к СВ сиропа.

124. Далее сироп уваривали на вакуум-аппарате до содержания СВ 47%.

125. В результате получили высокомальтозный сироп в количестве 9,5 кг с содержанием сухих веществ 47%, редуцирующих веществ 98,5%, мальтозы 79,4%, глюкозы 10,2%, золы 0,45%.1. Заключение.

126. Сокращается также продолжительность осахаривания до 60 часов вместо 72 часов для получения высокомальтозного сиропа при использовании пуллуланазы вместо традиционных ферментных препаратов.

127. Подписи членов комиссии: зав. лабораторией инженерии ферментов Центра "Биоинженерия" РАН, jIri —Jд.х.н., профессор ^ Варламов В.П.старший научный сотрудник1. Лопатин С.А.

128. Центра "Биоинженерия" РАН, к.х.н. ^у/ профессор кафедры "Биотехнология" МГУПП,д.б.н., профессор Бутова С.Н.соискатель кафедры "Биотехнология" МГУПП- Кривова И.А.