Разработка биотехнологического процесса ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы с целью получения биологически активных добавок тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.07, кандидат технических наук Серба, Елена Михайловна

• Серба, Елена Михайловна
• кандидат технических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат технических наук Серба, Елена Михайловна

Введение.

1 Обзор литературы.

2. Экспериментальная часть.

2.1 Материалы и методы исследований.

2.1.1 Объекты исследований.

2.1.2 Методы исследований.

2.1.2.1 Культивирование микроорганизмов.

2.1.2.2 Определение ферментативной активности.

2.1.2.3 Изучение зависимости протеолитической и амилолитической активностей от рН и температуры.

2.1.2.4 Изучение степени гидролиза белковых субстратов.

2.2 Результаты экспериментов и их обсуждение.

2.2.1. Скрининг эффективной ферментативной системы для гидролиза дрожжевой биомассы.

2.2.1.1 Сравнительная характеристика микробных протеаз различного происхождения по степени гидролиза белковых субстратов.

2.2.1.2 Скрининг активных продуцентов комплекса ферментов протеолитического и р-глюканазного действия.

2.2.1.3 Получение комплексного ферментного препарата КФПА протеолитического и Р-глюканазного действия.

2.2.2 Влияние ферментативного комплекса Aspergillus oryzae 387-4на степень гидролиза биополимеров дрожжевой биомассы.

2.2.2.1 Влияние индивидуальных ферментов грибного протеолитического комплекса на степень гидролиза дрожжевого белка.

2.2.2.2 Исследование оптимальных условий ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы ферментами гриба Aspergillus oryzae.

2.2.2.3 Подбор оптимальной мультиэнзимной композиции для эффективного гидролиза дрожжевой биомассы.

2.2.2.4 Гидролиз дрожжевой биомассы различного происхождения побранным ферментативным комплексом.

2.2.3 Исследование процесса и разработка технологических параметров энзиматического гидролиза дрожжевой биомассы амилопротооризином КФПА.

2.2.3.1 Исследование влияния физико-химических методов обработки дрожжевой биомассы на эффективность процесса гидролиза полимеров клетки.

2.2.3.2 Разработка технологического процесса гидролиза дрожжевой биомассы подобранным ферментативным комплексом

2.2.3.3 Производственные испытания разработанного процесса ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы.

2.2.4 Получение получение пищевой добавки «Протамина» - белково-аминокислотного обогатителя и БАД «Суперпротамин» на основе регулируемого процесса биокатализа дрожжевой биомассы.

2.2.4.1 Биохимические и санитарно-гигиенические исследования белково-аминокислотного обогатителя - ферментолизата дрожжевой биомассы «Протамина» пищевого.

2.2.4.2 Клинические испытания БАД «Суперпротамин».

2.2.5 Исследования и испытания эффективности применения ферментолизатов дрожжевой биомассы в различных производствах.

2.2.5.1 Применение пищевой добавки - гидролизата дрожжевого

ПРОТАМИН» в хлебопечении.

2.2.5.2.Использование ПРОТАМИНА в ликероводочном производстве.

2.2.5.3 Использование ПРОТАМИНА при производстве сухих завтраков.

2.2.5.4 Применение Протамина в косметологии.

2.2.5.5 Использование Протамина для генерации дрожжей в спиртовом производстве.

2.2.5.6 Применение Протамина для повышения биологической полноценности сухого корма для собак с нормальной активностью.

3.Вывод ы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка биотехнологического процесса ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы с целью получения биологически активных добавок»

В настоящее время в структуре питания населения России преобладает углеводная пища при остром дефиците белка, пищевых волокон, незаменимых аминокислот, витаминов, микроэлементов и других биологически важных нутриентов. Только половина населения России обеспечена минимально необходимой нормой потребления белков (49 г/сутки). Мировой дефицит белка составляет около 15 млн тонн. Особенно остро ощущается недостаток животного белка, отличающегося высокой биологической ценностью. В результате неправильного питания понижается резистентность населения к неблагоприятным факторам, развиваются заболевания, сокращается продолжительность жизни.

Поэтому одним из актуальных и перспективных направлений в решении проблемы коррекции питания для поддержания адаптивно-компенсаторных механизмов организма человека является использование пищевых белково-аминокислотных добавок, способствующих повышению биологической полноценности продуктов питания, созданию сбалансированных продуктов и напитков функционального назначения.

Дрожжевая биомасса является полноценным источником белковых веществ, аминокислотный скор которых приближается к животному белку, особенно по содержанию лизина. Кроме того, наличие витаминов, ценных полисахаридов и микроэлементов позволяет рассматривать микроорганизмы, как перспективные субстраты для получения биологически активных добавок.

Питательная ценность дрожжевой биомассы ограничена низкой доступностью внутриклеточных биополимеров для действия пищеварительных ферментов. Для полноценного усвоения этого субстрата необходимо разрушить клеточные стенки дрожжей и перевести все содержащиеся в них биологически ценные высокомолекулярные полимеры в растворимые легко усвояемые соединения.

Одним из наиболее применяемых способов переработки клеточной биомассы является метод автолиза. Однако этот метод недостаточно эффективен, энергоемок, так как требует проведения длительного процесса. Состав автолизатов полностью зависит от качества и физиологической активности используемых дрожжевых клеток. Вместе с тем известно о способности различных ферментативных систем разрушать клеточные стенки микроорганизмов.

В связи с этим, проблема подбора активной мультиэнзимной системы, обеспечивающей интенсивный и глубокий гидролиз высокомолекулярных полимеров микробной биомассы, и создание эффективного биотехнологического процесса получения конкурентоспособных пищевых белково-аминокислотных добавок, весьма актуальна и перспективна. Реализация этого направления исследований позволит повысить удельный вес наукоемкой отечественной продукции на мировом рынке, произвести импортозамещение на отечественном рынке, т.к. высокая цена биопрепаратов и добавок ограничивает их широкое применение в пищевой промышленности России.

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы состояла в разработке научных основ биотехнологии белково-аминокислотных обогатителей и биологически активных добавок (БАД) на основе энзиматического гидролиза высокомолекулярных полимеров дрожжевой биомассы, теоретическом и экспериментальном обосновании целесообразности использования полученных препаратов для повышения качества питания.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• провести анализ и исследовать биохимическую характеристику и гидролитическую способность ферментных препаратов различного спектра действия по отношению к структурным полимерам дрожжевой клетки;

• обосновать необходимость использования комплекса ферментов и осуществить скрининг эффективной ферментативной системы, гидролизующей белковые вещества и полисахариды дрожжевых клеток;

• исследовать влияние ферментативного комплекса на процессы гидролиза биополимеров дрожжевой биомассы;

• исследовать влияние индивидуальных ферментов протеолитического комплекса на степень гидролиза дрожжевого белка;

• разработать оптимальные условия и мультиэнзимную систему для направленного ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы;

• разработать и испытать в производственных условиях биотехнологический процесс ферментолиза дрожжевой биомассы с получением биологически активных добавок со специальными свойствами.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология пищевых продуктов (по отраслям)», Серба, Елена Михайловна

Основные результаты клинических испытаний БАД «Суперпротамина» приведены на рис. 16.

Хирургическая косметология

• Нормализация белкового обмена

• Повышение усвояемости пищи

• Общеукрепляющее действие

• Улучшение структуры волос и ногтей

Клиническая иммунология

• Хорошая переносимость

• Отсутствие побочных эффектов

• Повышение сопротивляемости организма к вирусным и бактериальным инфекциям

• Улучшение показателей крови, повышение содержания гемоглобина

Фтизиопульмонология

• Повышение иммунного статуса и функциональной выносливости

• Улучшение обменных процессов

• Улучшение показателей печени

• Выраженный терапевтический эффект

• Снижение доз антибиотиков

Онкология

• Нетоксичный иммуномодулятор

• Повышение функциональной выносливости организма

• Улучшение обменных процессов

• Улучшение работы ЖКТ

Рисунок 16 - Медико-биологическая эффективность БАД - Суперпротамин в лечебно-профилактическом питании

2.2.5 Исследования и испытания эффективности применения ферментолизатов дрожжевой биомассы в различных производствах

Подтверждена эффективность рационального использования полупродуктов и отходов бродильных производств в биотехнологии получения ценных пищевых добавок широкого спектра действия:

• на основе энзиматического гидролиза остаточных пивных дрожжей разработана биотехнологическая схема получения аминокислотных и витаминных добавок иммуномодулирующего действия;

• разработаны условия и технологические параметры получения ферментализатов дрожжевой биомассы в качестве пищевых добавок для повышения питательной ценности и усвояемости продуктов питания и напитков;

• с использованием экструзионных технологий разработан способ получения лечебно-профилактических продуктов - сухих завтраков для укрепления и очищения организма;

• на основе ферментолиза хлебопекарных дрожжей получены пищевые добавки для ликероводочного производства с целью повышения и разнообразия органолептических достоинств напитков;

• на основе «мягкого» ферментативного гидролиза микробной биомассы разработаны новые лечебно-профилактические средства в косметологии.

Перспективы и области применения ферментолизата дрожжевой биомассы представлены на рисунке 17.

Использование аминокислотных добавок в пищевой промышленности позволяет повысить питательную ценность и усвояемость пищевых продуктов и напитков, улучшить их вкус и аромат, создать новые лечебно-профилактические средства.

Гидролизат дрожжевой ПРОТАМИН - натуральная вкусо-ароматическая добавка, полученная на основе мягкого ферментативного

Рис. 17 Перспективы применения ферментолизатов дрожжевой биомассы гидролиза хлебопекарных дрожжей, содержит полный набор заменимых и незаменимых аминокислот, комплекс витаминов группы В, легкоусвояемые углеводы и белковые вещества.

ПРОТАМИН в качестве вкусо-ароматической добавки предназначен для пищевой промышленности при производстве хлебобулочных изделий, сухих завтраков, супов, соусов, ликероводочных изделий, а также в качестве вспомогательного средства ПРОТАМИН может быть использован в дрожжевом и бродильном производствах для стимуляции жизнедеятельности дрожжей, интенсификации биотехнологических процессов. Использование ПРОТАМИНА в пищевой промышленности позволяет повысить питательную ценность и усвояемость пищевых продуктов, улучшить их вкус и аромат.

Приведем основные перспективные направления применения аминокислотных и витаминных добавок - ферментолизата дрожжей «Протамин» в пищевой промышленности, показавшие целесообразность их использования в качестве пищевой добавки, положительно влияющей на физико-химические, органолептические и биохимические свойства целевых продуктов.

2.2.5.1 Применение пищевой добавки - гидролизата дрожжевого «ПРОТАМИН» в хлебопечении

При производстве хлебобулочных изделий ПРОТАМИН дозировали в количестве от 1 до 5% в зависимости от вида. При добавлении ПРОТАМИНА в замес сокращается процесс созревания теста, отмечается повышение подъемной силы дрожжей, которая составляла 35-38 минут против 40-45 минут в контроле (без добавления ПРОТАМИНА). В процессе созревания теста наблюдается более интенсивный газообмен, при этом изменяется показатель газообразующей способности дрожжей, который составил 1750-2000 мл С02 /г СВ в опытных вариантах, в то время как в контрольном он был равен 1000-1300 мл С02 /г СВ.

Использование ПРОТАМИНА при замесе теста позволяет уменьшить расход дрожжей на 30-50% , сократить длительность процесса созревания теста, улучшить органолептические и физико-механические свойства готовой продукции: повышается равномерная пористость изделий, увеличивается удельный объем хлеба и улучшаются физико-механические свойства мякиша. Введение ПРОТАМИНА способствует образованию более интенсивной окраски корки хлеба, создает более приятный вкус и аромат, ведет к уменьшению скорости черствения хлеба.

2.2.5.2 Использование ПРОТАМИНА в ликероводочном производстве

Использование ПРОТАМИНА осуществляют с целью повышения и разнообразия органолептических достоинств напитков. Введение

ПРОТАМИНА в водно-спиртовые растворы при купажировании ликероводочных изделий осуществляли в виде вкусо-ароматической добавки в количестве от 0,01 до 2% в зависимости от рецептуры изделия. Использование ПРОТАМИНА, содержащего растворимые углеводы, пептиды, аминокислоты, микро- и макроэлементы, позволяет смягчить вкус водок, бальзамов, придавая им большую насыщенность и тем самым повышая качество изделий. Это было подтверждено результатами дегустационных комиссий ВНИИПБТ.

ПРОТАМИН используется при приготовлении таких видов ликероводочных изделий, как: «Новэре», «Сибирская элитная люкс» /Ишимский винно-водочный завод/, «Солнечный камень» /ЛВЗ «Икалто»/, «Франт крепкая» /ЛВЗ «Фаюр-Союз»/, «Алеша», «Сергей» /Калужский ЛВЗ/, «Штрафная рота» /Калининградский завод шампанских вин/, «Тагайская легенда», «Боярин» /Уссурийский ЛВЗ/ и другие. Ликероводочные изделия, приготовленные по рецептурам, в состав которых входит ПРОТАМИН, пользуются повышенным спросом у покупателей.

2.2.5.3 Использование ПРОТАМИНА при производстве сухих завтраков

ПРОТАМИН рекомендуется к использованию в качестве вкусо-ароматической добавки в составе сухих экструзионных завтраков из зернобобовых, сухих концентратов для супов и соусов. Рекомендуемая доза от 5 до 20% в зависимости от рецептуры. Введение ПРОТАМИНА в состав экструзионных продуктов улучшает их вкусовые качества, сокращает расход или полностью исключает из рецептуры натриевую соль, улучшает ароматику готового продукта, придает ему грибной запах и вкус.

2.2.5.4 Применение ПРОТАМИНА в косметологии

Биологически активный аминокислотный препарат Протамин может быть использован в парфюмерно-косметической отрасли в составе косметических изделий для ухода за кожей и волосами.

Предварительная апробация этого препарата была проведена в клинических условиях; он использовался при приготовлении лечебно-профилактических лосьонов. При этом имел место положительный эффект: улучшалось питание кожного покрова головы и корневой системы волос.

Парфюмерно-косметической фирмой «Квадрига» разработан лосьон для волос Neotonus лечебно-профилактического действия. Его биологически активной основой является ферментолизат пивных дрожжей Протамин пищевой. Кроме того, в состав рекондиционера для волос вводят экстракты крапивы, хмеля, женьшеня и лаванды.

2.2.5.5 Использование ПРОТАМИНА в генерации дрожжей в спиртовом производстве

Введение ПРОТАМИНА, содержащего легко ассимилируемые дрожжами аминокислоты, углеводы и витамины, использовали в качестве вспомогательного средства для питания спиртовых дрожжей. Применение ПРОТАМИНА осуществляли в количестве 0,01-0,05% при приготовлении дрожжевого сусла. При этом отмечена интенсификация процессов размножения и развития дрожжевых клеток (увеличение дрожжевой биомассы в 1,5-2,0 раза по сравнению с контрольными вариантами), увеличение бродильной активности и продуктивности дрожжей в опытных вариантах на 20-25%. Все это способствовало сокращению длительности брожения на 30%.

2.2.5.6 Применение ПРОТАМИНА для повышения биологической полноценности сухого корма для собак с нормальной активностью

Разработанный нами совместно с сотрудниками отдела оборудования пищевой промышленности ВНИИПБТ сухой корм представляет собой сбалансированный продукт, приготовленный на основе натуральных природных компонентов с взаимодополняющими характеристиками. Содержит высококачественные белки, легкоусвояемые жиры и углеводы, незаменимые аминокислоты, необходимые витамины и минеральные вещества, что обуславливает высокую биологическую ценность этого натурального корма (табл.23).

Биохимический состав сухого корма для собак

Показатели Состав, %

1 2

Сырой протеин 16,1

Жир 6,3

Углеводы 47,6

Клетчатка 2,0

Зола 8,2

Минеральные вещества

Кальций 0,5

Калий 1,23

Фосфор 0,43

Натрий 0,83

Железо 0,06

Селен, мг % 0,2

Витамины, мг/кг

Бета-каротин 12,2

Тиамин (В 1) 6,2

Рибофлавин (В 2) 4,3

Пиридоксин (В 6) 5,8

Пантотеновая кислота (В 3) 17,2

Фолиевая кислота (В 9) 73,8

Никотиновая кислота РР 2,7

Биотин 27,4

Инозит 0,2

Эргостерин 21,5

Парааминобензойная кислота (Н 1) 4,9

Энергетическая ценность пищевая энергия, кДж/ЮОг 1524

Корм - продукт с широким спектром воздействия на организм собак, обладающий стимулирующим и общеукрепляющим действием. Способствует нормализации обменных процессов, выведению из организма шлаков и токсинов с одновременным подпитыванием клеток, активизирует имунную систему, повышая иммунитет и устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды.

Корм содержит льняное масло с ненасыщенными жирными кислотами, которые благоприятно влияют на общее состояние животного, придают шерсти шелковистость и глянец, предупреждают воспалительные заболевания кожи, защищают слизистую оболочку желудка.

Биологически активной основой корма является Протамин биодобавка, полученная на основе остаточных пивных дрожжей, содержащая богатый набор легкоусвояемых аминокислот, в том числе незаменимых, которые повышают биологическую ценность и усвояемость белка корма, способствуют кальцификации костной ткани, поддержанию здоровой густой шерсти. Комплекс витаминов этой биодобавки (группы В, витамин РР, биотин, эргостерин, инозит и другие) благотворно влияет на рост и развитие животных, участвует в углеводном и белковом обмене, способствует развитию мышечной ткани и укреплению костей, оказывает влияние на кожный покров и центральную нервную систему. Содержащиеся в биодобавке олигосахариды — маннаны играют важную роль для поддержания здоровой микрофлоры кишечника, предупреждают нарушения пищеварения.

1.6. Заключение

Анализ научно-технической и патентной литературы показывает острую потребность человечества в биологически полноценной пищевой продукции и, несмотря на уже выявленные закономерности в области получения и применения белковых и аминокислотных обогатителей пищи растительного, животного и микробного происхождения, многочисленные исследования не дали окончательных решений, которые необходимы для создания эффективных технологий получения биологически активных добавок, содержащих легкоусвояемые пептиды и незаменимые аминокислоты. Специалистами многих стран ведутся интенсивные разработки по получению высокоактивных ферментных препаратов, содержащих богатый комплекс гидролитических ферментов, а также по созданию эффективных методов гидролиза белковых субстратов для повышения качества и биологической полноценности продуктов питания, для создания новых видов биологически активных добавок и лечебно-профилактических средств.

Изложенное подтверждает актуальность и перспективность данного направления исследований по разработке биотехнологических основ применения гидролитических ферментных препаратов в процессах получения белковых гидролизатов.

Обобщение литературных данных позволяет сделать следующие выводы:

• Подробно изучено структура и биохимический состав дрожжевой клетки; представленные данные свидетельствуют о перспективе использования биомодифицированной дрожжевой биомассы как источника полноценного белка, незаменимых аминокислот, ценных полисахаридов и витаминов для получения белково-аминокислотных обогатителей пищи.

• Существуют различные пути биотрансформации дрожжевой биомассы, из них наиболее изучен автолиз - энзиматический гидролиз под действием собственной ферментативной системы дрожжевой клетки, скорость которого, однако низка, длительность автолиза достигает 2448 часов.

• Проводятся исследования по ферментативному гидролизу дрожжевой биомассы, в основном бактериальными ферментными препаратами протеолитического действия, однако нет четких данных по влиянию различных дозировок ферментов, не достигнута высокая степень конверсии дрожжевой биомассы, полученный уровень не превышает и даже ниже, чем при автолизе клетки.

• Данные по изучению роли протеолитических ферментов и других гидролаз в процессах гидролиза клеточных стенок и белков протоплазмы дрожжей практически отсутствуют.

• В связи с многокомпонентной структурой дрожжевой клетки для эффективного гидролиза дрожжевой биомассы необходимы, в первую очередь, ферменты, расщепляющие полисахариды клеточных стенок и белковые вещества протоплазмы. • Перспективны исследования по скринингу и применению комплекса протеолитических, глюкано- и целлюлолитических ферментов микробного происхождения для глубокого гидролиза дрожжевой биомассы с целью получения аминокислотных смесей. В связи с этим основная цель настоящей работы состояла в теоретическом и экспериментальном обосновании энзиматического способа гидролиза дрожжевой биомассы под действием комплексных ферментных препаратов с заданными свойствами для создания нового биотехнологического процесса получения биологическиактивных добавок функционального назначения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы и методы исследований

Исследования проводили в лабораторных и опытно-экспериментальных и промышленных условиях на базе ГНУ ВНИИПБТ, Мичуринского экспериментального завода, Бердского завода биопрепаратов.

2.1.1. Объекты исследований Ферментные препараты

В работе использовали ферментные препараты протеолитического и целлюлолитического действия различного микробного происхождения, полученные осаждением этанолом или ультрафильтрацией из культурных жидкостей, а также готовые товарные формы ферментов различных производителей.

Ферментные препараты - источники протеаз: Bacillus subtilis (протосубтилин - Бердского завода биопрепаратов), В. mesentericus (протомезентерин - ВНИИПБТ), Aspergillus flavus (протофлавин -ВНИИПБТ), A. terricola (прототерризин), Rhisopus pygmauis (протопигмаусин), Acremonium chrizogenum (протеаза С), Humicola lutea Б (кислая протеаза БАН), A.oryzae 251-90 (протооризин), A.oryzae 387 (амилопротооризин Г10х), а так же из поверхностных культур: Asp.oryzae 740-А2 (амилоризин), A.oryzae 387 (амилопротооризин ШОх), Bacillus licheniformis 103 (протолихетерм); а также препараты зарубежных производителей: нейтраза и алкалаза - Novozymes, БНЗ - Enmex.

Ферментные препараты - источники р-глюканаз: Целловиридин -Бердский завод биопрепаратов, Зимафилт - Enmex, Брюзайм - DSM. Микроорганизмы -продуценты протеаз и 0-глюканаз

Объектами исследований служили штаммы микромицетов, полученные из музея чистых культур ГНУ ВНИИПБТ, а также собственной селекции отдела биотехнологии ферментных препаратов ГНУ ВНИИПБТ. На этапе селекционных работ исследовано 29 штаммов: 22 штамма - Aspergillus oryzae, 2 штамма - A. terricola, 4 штамма - A. flavus, 1 штамм - A. foetidus. Дрожжевая биомасса

Объектами исследований служили хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae в виде водно-дрожжевой суспензии (после культивирования и сепарации), в пастообразной форме и сухие, а также дрожжи рода S. carlsbergensis, Candida utilis и Rodotorula sp.

2.1.2. Методы исследований

В работе применены общепринятые и специальные физические, физико-химические, химические, биохимические, микробиологические, хроматографические и спектрофотометрические методы анализа.

2.1.2.1 Культивирование микроорганизмов

Продуценты культивировали глубинным способом на натуральных средах, в состав которых входили различные виды муки и минеральные соли. Количество и состав компонентов зависел от условий экспериментов. Концентрация сухих веществ питательных сред составляла 4,5 - 6,0 %. Состав основной питательной среды: ячменная мука - 3%, пшеничные отруби - 3 %, КН2Р04 - 1,5%.

Твердофазное культивирование проводили поверхностным способом на средах содержащих пшеничные отруби, минеральные соли и воду. Массовая доля влаги составляла 60-62%.

Культивирование продуцентов проводили в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с 50 мл среды; в полупроизводственных условиях - в ферментаторах объемом 15 л (Кириши) при степени заполнения 0,5; в

•5 производственных условиях - в ферментаторах объемом 20 и 32 м с коэффициентами заполнения 0,5 и 0,7 в течение 42 - 56 часов.

Для споруляции и хранения штаммов использовали агаризованную среду, приготовленную на солодовом сусле с концентрацией сухих веществ

11-12% (СА). Инкубацию штаммов для спороношения проводили на скошенном СА в течение 5-ти суток при 30°С.

2.1.2.2 Определение ферментативной активности

Важной характеристикой любой ферментной системы является уровень активности отдельных ферментов комплекса. В настоящем исследовании проводилось определение различных ферментативных активностей, позволяющих составить представление о качественном и количественном составе того или иного комплекса, а также направленности его действия.

Амилолитическая активность

Амилолитическую активность определяли общепринятым методом гидролиза крахмала по ГОСТу РФ 20264.4-89.

Общая протеолитическая активность

Протеолитическая активность характеризует способность фермента катализировать расщепление белков до аминокислот или пептидов. Протеолитическую активность (ПС) определяли модифицированным методом Ансона по гидролизу гемоглобина препаратам фермента с последующей его инактивацией и осаждением непрогидролизованного белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ). За единицу активности принимали такое количество фермента, которое за 1 мин при 30°С способствовало образованию 1 мкм тирозина при гидролизе белка (Полыгалина Г.В. и др., 2003).

Активность индивидуальных протеолитических ферментов

Активности сериновой, карбоксильной и металлопротеиназ, лейцинамино- и карбоксипептидаз измеряли по специфическим субстратам. Для обнаружения возможного вклада в гидролиз субстратов других протеаз комплекса применяли специфические ингибиторы. За единицу активности во всех случаях принимали такое количество фермента, которое в стандартных условиях за 1 мин расщепляло 1 мкм субстрата.

Активность сериновой протеиназы определяли по специфическому субстрату n-нитроанилид бензол-оксикарбонил-Ь-аланил-Ь-аланил-Ь-лей-цину (Z-Ala-Ala-Leu-pNa, завод химреактивов "Олайне"). При определении вклада в гидролиз субстрата других протеолитических ферментов комплекса применяли специфический ингибитор сериновой протеиназы фенилметилсульфонилфторид (PMSF, фирмы "Serva", Германия) [Епремян А.С.идр., 1981].

Об активности нейтральной металлопротеиназы судили по гидролизу специфического субстрата динитрофенил-Ь-глицил-Ь-глицил-Ь-изолей- цил-Ь-аргинина (DNP-Gly-Gly-Ile-Arg), синтезирован Л.А.Люблинской). Активность металлопротеиназы подавляли атилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) [Люблинская и др., 1976].

Наличие активности карбоксильной протеиназы подтверждали с помощью специфического ингибитора пепсина Н-диазоацетил-Н'-2,4-динитрофенил-этилендиамина (ДДЭ). Активность нейтральной протеиназы, которая также могла гидролизовать субстрат, подавляли CuCl . Остаточную активность определяли по методу Ансона с гемоглобином [Ковалева и др., 1977].

Ч-нитроанилид-Ь-лейцин служил специфическим субстратом при определении активности лейцинаминопептидазы [Иванова и др., 1977].

Активность карбоксипептидазы определяли по специфическому субстрату динитрофенил-Ь-глицил-Ь-глицил-Ь-аргинину (DNP-Gly-Gly-Arg) [Азаренкова и др. 1976].

Экзо-Р-глюканазная активность

Метод основан на определении восстанавливающих Сахаров, образующихся при действии фермента на ячменный р-глюкан [Полыгалина и др., 2003 г.].

Ксиланазная активность

Определение ксиланазной активности основано на способности фермента расщеплять ксилан с образованием восстанавливающих Сахаров [Полыгалина и др., 2003 г.]

Целлюлазная активность

Активность комплекса целлюлаз определялась по гидролизу карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) [Полыгалина и др., 2003 г.].

2.1.2.3 Изучение зависимости протеолитической и амилолитической активностей от рН и температуры

Влияние температуры и рН на общую протеолитическую активность ферментного препарата определяли по результатам его воздействия на 2%-ный раствор гемоглобина при различных температурах и рН.

Аналогично определяли оптимум рН и температуры действия а-амилазы. В качестве субстрата использовали 1%-ный раствор крахмала.

2.1.2.4 Изучение степени гидролиза белковых субстратов

При изучении степени гидролиза микробного белка объектом исследований являлись сухие дрожжи Saccharomyces cerevisiae, из которых готовили 30%-ную водную суспензию. Ферментолиз осуществляли исследуемыми протеолитическими препаратами при 50° С в течение 5 ч из расчета 5 - 25 ед ПА/г сухих дрожжей в зависимости от условий эксперимента. Процесс гидролиза дрожжевой биомассы оценивали по нарастанию в получаемых ферментолизатах концентрации растворимых сухих веществ (по рефрактометру), аминного азота, растворимого белка. В качестве контроля служила дрожжевая суспензия, не обработанная протеазами и подвергнутая автолизу в условиях, аналогичных опыту.

Концентрацию аминного азота определяли медным способом в отсутствие аммонийных солей [Белозерский, Проскуряков, 1951]. Массовую долю абсолютно сухих веществ дрожжевой суспензии устанавливали методом высушивания до постоянной величины при 105°С [Рухлядева А.П., 1986]. Концентрацию общих белковых веществ суспензии и растворимого белка в супернатантах получаемых гидролизатов определяли по содержанию азота методом Кьельдаля [[Белозерский, Проскуряков, 1951]]. Степень гидролиза дрожжевого белка рассчитывали по количеству переведенного в растворимую форму белка в процентах от общего содержания белковых веществ в исходной суспензии.

Концентрацию общих аминокислот определяли после гидролиза анализируемых образцов с 6 н НС1 на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 6 ч и последующим автоклавированием в течение 2 ч при 120°С. Содержание свободных аминокислот, образующихся в результате гидролиза дрожжевой суспензии, определяли после осаждения белков и пептидов ТХУ (Дэвени Т., Гергей Я., 1976). Затем полученные пробы центрифугировали 15 мин при 6000g. Надосадочную жидкость использовали для количественного и качественного анализа общих и свободных аминокислот, который проводили по методу Мура и Штейна на аминокислотном анализаторе LC 200 фирмы "Вю1хошк"(Германия); просчет аминограмм осуществляли методом сравнения площадей стандарта и образца [Росляков В.Я., Тарасенко И.С., 1990].

2.2 Результаты экспериментов и их обсуэвдение

2.2.1. Скрининг эффективной ферментативной системы для гидролиза дрожжевой биомассы

В настоящее время для повышения биологической полноценности питания широко используются белковые и аминокислотные обогатители, полученные на основе гидролиза дрожжевой биомассы. Существуют различные методы расщепления белковых веществ микроорганизмов. Одним из наиболее изученных способов переработки клеточной биомассы с целью получения аминокислотных смесей является автолиз. Однако этот метод недостаточно эффективен, энергоемок, так как требует проведения длительного процесса. Состав автолизата полностью зависит от качества и физиологической активности используемых дрожжевых клеток. Поэтому при автолизе, как правило, не достигается достаточно глубокого гидролиза белков и других высокомолекулярных компонентов дрожжевой биомассы.

Вместе с тем известно о способности различных ферментных систем разрушать клеточные стенки микроорганизмов. Некоторые исследователи предлагают применять ферментные препараты протеолитического действия, синтезируемые различными продуцентами [Коновалов с соав., 1975; Римарева с соав., 1998]. В связи с необходимостью повышения эффективности трансформации микробной клетки в легкодоступные для пищеварительных ферментов компоненты скрининг новых биокатализаторов, осуществляющих глубокий гидролиз высокомолекулярных полимеров дрожжевой клетки, продолжает оставаться актуальным.

2.2.1.1 Сравнительная характеристика микробных протеаз различного происхождения по степени гидролиза белковых субстратов

Особую актуальность приобретает поиск новых биокатализаторов протеолитического действия, осуществляющих глубокий протеолиз микробных белков при рН 4,5 - 5,5. Данная область рН соответствует естественным значениям рН дрожжевой суспензии, а также оптимальным условиям действия внутриклеточных ферментов дрожжей.

Целью данного этапа работы являлось проведение сравнительных исследований гидролизующей способности ряда протеолитических ферментных препаратов микробного происхождения в кислой и слабокислой зонах рН и выбор наиболее эффективного при гидролизе белковых компонентов протоплазмы клетки.

В таблице 3. представлены данные по сравнительной характеристике общей протеолитической активности ферментных препаратов, действующих на гемоглобин при рН 5,5 и 4,0. Наибольшую активность из всех исследуемых препаратов проявляли протосубтилин, протолихетерм, протомезентерин, прототерризин, протофлавин и ферментные препараты из Aspergillus oryzae. Однако для бактериальных препаратов отмечено резкое снижение протеолитической способности при изменении рН инкубационной смеси в сторону кислых значений.

При изучении степени гидролиза микробного белка объектом исследований являлись сухие дрожжи Saccharomyces cerevisiae, из которых готовили 30%-ную водную суспензию. Ферментолиз осуществляли исследуемыми протеолитическими препаратами при 50°С в течение 5 часов из расчета 10 ед. ПС/г сухих дрожжей. Процесс гидролиза дрожжевой биомассы оценивали по нарастанию в получаемых ферментолизатах концентрации растворимых сухих веществ (по рефрактометру), аминного азота, растворимого белка. В качестве контроля служила дрожжевая суспензия, не обработанная микробными протеазами и подвергнутая автолизу в условиях, аналогичных опыту (50°С, 5ч).

При гидролизе дрожжевого белка выявилось четкое различие между исследуемыми препаратами. Ферментные препараты грибного происхождения, содержащие комплекс протеиназ и пептидаз, более эффективно гидролизовали микробный белок, чем бактериальные препараты.

Характеристика препаратов протеолитических ферментов микробного происхождения

Препараты/продуцент Протеолитическая активность по гемоглобину, ед./г рН 4,0 рН5,5

Протолихетерм/ Bacillus licheniformis 120,2 670,5

Протосубтилин/В. subtilis 199,7 920,2

Протомезентерин/В. mesentericus 179,5 590,3

Протофлавин/ Aspergillus flavus 364,8 304,7

Прототерризин/А. terricola 310,3 315,6

Протопигмаусин/ Rhisopus pygmauis 219,6 160,3

Протеаза С/ Acremonium chrizogenum 109,8 200,4

Кислая протеаза БАН/ Humicola lutea 733,1 601,7

Протооризин Г10х/ A.oryzae 251-90 319,6 365,2

Амилопротооризин Г10х/ A.oryzae 387 806,5 949,7

Амилопротооризин П10х/ A.oryzae 387 540,1 589,6

Амилоризин ШОх/ Asp.oryzae 740-А2 119,8 250,3

БНЗ/ В. subtilius 210,5 650,0

Нейтраза/В. subtilius 50,3 120,0

Алкалаза/ В. subtilius 160,0 420,0

В процессе гидролиза дрожжевой биомассы концентрация растворимых сухих веществ в ферментолизатах, полученных в результате действия грибных протеиназ, возрастала до 21,1-24,6%, растворимого белка - до 31,533,7%; при использовании препаратов протеиназ бактериального происхождения эти показатели были несколько ниже: 18,0-18,2 и 26,5-27,1% соответственно (табл.4).

Высокую активность проявили все ферментные препараты, синтезированные Aspergillus oryzae. Однако наибольшей гидролитической способностью по отношению к белковым полимерам дрожжевой клетки обладали препараты из A. oryzae 387. В результате ферментолиза клеточной биомассы амилопротооризином концентрация аминного азота в гидролизате возрастала более чем в 6 раз по сравнению с вариантом, где не использовались ферменты извне, а гидролиз осуществлялся под действием собственных ферментов клетки (автолиз). Концентрация аминного азота в ферментолизатах с грибными протеазами составляла 549-644 мг %, в то время как при воздействии бактериальных препаратов эти показатели были значительно ниже: 279-291 мг %.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Серба, Елена Михайловна, 2005 год

1. Авакянц С.П., Шакарова Ф.И., Сергеева A.M. Действие нагревания и охлаждения вина с дрожжами на структуру и свойства дрожжевой клетки. // Прикладная биохимия и микробиология., 1969, т.5, в.1, с. 7277.

2. Аникеева Н.В. Научные основы новых технологий белковых препаратов и диетических продуктов с использованием нута// Автореферат диссертации на соиск. уч.степени доктора техн.наук. -М. -2003.-25 с.

3. Антипова Л.В., Осминин О.С., Шамханов Ч.Ю., Струкова Т.Н. Получение белковой пищевой добавки из вторичных продуктов птицеперерабатывающей промышленности. //Хранение и переработка сельхозсырья. 2003, №2, с.62-64.

4. Антонов В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран. //М.: Наука. 1982.

5. Бабаян Т.Л., Латов В.К. Выделение физиологически активного маннана и других полисахаридов из автолизатов пекарских дрожжей.// Биотехнология, 1992, №2, с.23-26.

6. Байрамов Р.Б. Перспективы использования микроводрослей.//Ашгабат: Издательство Туркмен НИИНТИ, 1992, с. 19.

7. Безрукова М.Г., Градова Н.Б. Использование биомассы микроорганизмов для пищевых целей // Сб. науч. трудов/ Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АНСССР. Пущино, 1985, с. 119.

8. Беликов В.М., Латов В.К., Цыряпкин В.А., Сергеев В.А. Биомасса дрожжей как источник аминокислот.// Микробиол. пр-сть, 1976, т.З (134), с. 6.

9. Беликов В.М., Бабаян Т.Л., Латов В.К., Князькова А.В. Способ автолиза дрожжевой биомассы. Авт. свид. СССР № 667194 // Б.И. 1979, №22, с.7.

10. Ю.Беликов В.М., Бабаян Т.Л., Харатьян С.Г., Латов В.К., Князькова

11. A.В. Способ автолиза дрожжевой биомассы. Авт. свид. СССР № 554854 // Б.И. 1977, №15, с.12.

12. П.Беликов В. М., Гололобов М. ЮЛ Die Nahrung. 1986. V. 26. № 3-4. Р.427-433.

13. Беликов В.М., Гордиенко С.В., Латов В.К., Харатьян С.Г., Сергеев

14. B.А., Коган А.С., Андрианов В.В. Способ получения аминокислот из низших пептидов. Авт. свид. СССР № 602543 // Б.И. 1978, №14, с.92.

15. Беликов В.М., Гордиенко С.В., Латов В.К., Цыряпкин В.А., Андрианов В.В., Бернова Г.И.,Неклюдов А.Д. Аминокислотный состав препаратов из автолизатов пекарских дрожжей. //Прикл. биохим. и микробиол. 1978, 14, №1,с.60.

16. Белозерский А.Н., Проскуряков Н.И. Практическое руководство по биохимии растений. М.; Совнаука, 1951.

17. Белоусова Н.И., Гордиенко С.В., Ерошин В.К., Ильченко В .Я. Получение смесей аминокислот на основе автолизатов дрожжей Saccharomyces, выращенных на этаноле или сахарах.// Биотехнология. 1990, №3, с.6

18. Берри Д. Биология дрожжей. //М.: Мир. 1985, с.95

19. Бирюзова В.И. Ультраструктурная организация дрожжевой клетки. -М.: Наука, 1993.-146 с.

20. Буяк Л.И., Ландау Н.С., Колесников М.П., Егоров Н.С. Выделение и изучение биологических свойств фактора, стимулирующего биосинтез протеаз в ассоциативной культуре грибов.// Микробиология. 1983, 52, №5, с.750.

21. Васильев П.С. Проблемы парентерального питания // Сб. научных трудов. М.: Минздрав СССР, 1981,с.119.

22. Войнарский И.Н., Яровенко В.Л. // Прикл. биохимия и микробиология. 1975, Т. 11. №6. С. 834-838.

23. Высоцкий В.Г., Тутельян В.А. Методические проблемы исследования качества новых источников пищевых белков // Гигиена: Обзор информации. М.: ВНИИ мед. тех. информ. 1987, №1, с.64.

24. Гаврилова Н.Н., Грачева И.М. Исследование возможности получения аминокислотных смесей на основе спиртовых дрожжей. // Тезисы доклада III Всес. совещание по аминокислотам. Ереван. 1984, с.44.

25. Герасименко Д.В. Ферментативное получение низкомолекулярного хитозана и изучение его антибактериальных свойств// Автореферат диссертации на соиск. уч.степени канд.биол.наук. -М. 2005. - 25 с.

26. Гордиенко С.В., Беликов В.М., Латов В.К., Цыряпкин В.А., Коган А.С., Андрианов В.В. Способ автолиза хлебопекарных дрожжей. Авт. свид. СССР № 843339 //Б.И. 1981, №24, с.332.

27. Грачева И.М., Иванова JI.A., Кантере В.М. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия.// М.: Колос, 1992, с.384.

28. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов.// М.: Изд-во «Элевар». 2000. - 512 с.

29. Джафаров А.Ф., Коршунов Б.А., Могилевская С.П. Способ получения аминокислотного концентрата.// №93021411/13; Заявл. 23.4.93; Опубл. 27.9.93, Бюл.27.

30. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты, (в 3-х т)//М.: Мир. 1982.

31. Долгов В. А. Повышение биологической ценности кормовой микробной биомассы методами деструкции. //Автореф. (канд. биол. наук) Львов. 1981, с.26.

32. Доценко О.Н., Садова В.В. Функционально-технологические характеристики белкового продукта дрожжевой биомассы.// Изв. вузов. Пищ. технол. 2002,№ 2-3, с.25.

33. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. М.: Мир. -1976.-364 с.

34. Ерофеев П.Ю. Разработка технологии дрожжевых лечебно-профилактических продуктов на базе растительного сырья //Автореф. Дисс. к.т.н. МГУПП. 1999. - с. 24.

35. Епремян А.С.,Честухина Г.Г., Азизбекян P.P. //Биохимия. 1981, т. 46, №5. - С.920-929.

36. Зб.Залашко М.В., Солохина Г.А., Шамгина Т.В. Влияние NaCl на метаболизм дрожжей R. Glutinis.// Микробиология, 1984, т.53, №1, с. 16-20.

37. Иванова Л.А., Иванова И.С., Лабутина Н.В. Применение БАД полученных из дрожжевой биомассы в х/п пром-ти.// Хранение и переработка с/х сырья. 2003,№ 2, с.38-40.

38. Иванова Н.И., Индуцированный автолиз дрожжей.//Диссертация. М.-1998, с. 142.

39. Иванова Н.Г. Индуцированный автолиз дрожжей.//Диссертация на соиск. уч.степени канд.биол.наук. -М.-1998, с.142.

40. Иванова М.М., Ваганова Т.И., Стронгин А .Я., Степенов В.М. Биохимия. 1977. т. 42, №5, с.843-849.

41. Иванова И.С. Разработка технологии биологически активной добавки к пище в виде белково-углеводного концентрата из биомассы хлебопекарных дрожжей// Автореферат диссертации на соиск. уч.степени канд.техн.наук. -М. 2003. - 28 с.

42. Иоффе М.Л., Безруков М.Г. Биологическая ценность изолятов белков микробного синтеза // Биотехнология. 1986, № 5, с.73.

43. Использование дрожжевого белка. // АгроНИИТЭИПП, «Пищ. промышленность», экспресс/инф., зарубежный опыт, 1988, №5, с.З.

44. Использование полноценных вкусовых качеств дрожжей //Prepared Foods. 1989, 158, №9, с.128.

45. Калашников Е.Я., Николаева Н.М. //Сб.: Вопросы биохимии и технологии пищевого производства. Харьков. 1967, №5, с.29.

46. Карпенкина Т.А. Ауторегуляция автолитических процессов и интенсификация автолиза дрожжей.//Автореферат диссертации на соиск. уч.степени канд.биол.наук. -М. 2003. - 25 с.

47. Кислухина О. В. Ферменты в производстве пищи и кормов. //М.ДеЛи принт, 2002, с. 336.

48. Кислухина О.В., Кузнецова Т.А., Бандоян А.К. Гидролизаты казеина как регуляторы автолиза микроорганизмов.// В кн. Получение и применение регуляторов роста. Л. 1986, с.83-86.

49. Кислухина О.В., Калунянц К.А., Аленова Д.Ж. Ферментативный лизис микроорганизмов.//Алма-Ата: Рауан. 1990, с.200.

50. Ковалева А., Иванова Т., Люцканов Н. Получение, характеристика и применение автолизатов пивных дрожжей. Y. Применение кислой протеиназы для получения гидролизатов пивных дрожжей. // Висш. инт хранит, и вкус, пром., Пловдив. 1990, 37, №3, с.159.

51. Ковалева Г.Г., Юсупов М.П., Лысогорская Е.Н. Биохимия. 1977, т. 42, № 3, с.534-539.

52. Коновалов С.А. Биохимия дрожжей. //М.: Пищевая промышленность. 1980, с.271.

53. Коновалов С. А., Воротило С.П., Соколова JL Б. Ферментативный метод разрушения клеточных стенок дрожжей. // Прикл. биохимия и микробиология. 1975. Т. 11. № 4. С. 620-622.

54. Кораблин Р.В. Разработка и применение обогатителя из пивной дробины и остаточных дрожжей// Автореферат диссертации на соиск. уч.степени канд.техн.наук. -М. 2003. - 20 с.

55. Котык А., Яначек К. Мембранный транспорт.// М.: Мир. 1980, с.342.

56. Кретович B.JI. Основы биохимии растений. //М.: Высшая школа. 1971, с.464.

57. Латов В.К., Бабаян Т.Д., Гордиенко С.В., Коган А.С., Цыряпкин В.А., Беликов В.М. Комплексная переработка дрожжевой биомассы.// Биотехнология. 1990, №3, с.14-18.

58. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир, 1976,с.957.

59. Люблинская Л.А., Ластовецкая Л.В., Шехватова Г.В. Химия природных соединений. 1976. - № 1 , с. 75-80.

60. Майер Г. Быть вформе + быть в норме.// Пищевая промышленность, 2002, №11, с.66.

61. Максимова Г.Н. Интенсификация биотехнологических процессов получения дрожжевой биомассы повышенного качества. // Диссерт. на соиск. уч. ст. д.б.н. М. 1994, с.523.

62. Матвеева И.В., Белявская И.Г. Биотехнологические основы приготовления хлеба.// М.: ДеЛи принт. 2001, с.150.

63. Матвеев М.В., Грядунов Г.В. Применение биотехнологии для решения экологических проблем. //10 международные Плехановские чтения. Тезисы докладов. М.: Изд-во РЭА им. Г.В. Плеханова. 1997,с. 123-124.

64. Матвеев М.В., Плессер Л.М. Биотехнологические продукты для адаптации человека к неблагоприятным экологическим условиям.// Тез. докладов 4-ой Международной Научно-технической конференции «Пища, экология, человек». М.: МГУПБ, 2001, с.124.

65. Маюрникова JI.A., Поздняковский В.М., Гореликова Г.А. Научно-практические аспекты обогащения продуктов питания. //Пиво и напитки. 2002, №3, с.30-32.

66. Микеладзе Г.Г. Нетрадиционные пути получения пищевых белков.// Пищевая и перерабатывающая промышленность. 1987, №10, с.42

67. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Получение и очистка белковых гидролизатов (обзор).// Прикладная биохимия и микробиология. 2000, т.36, №4, с.371-379.

68. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Свойства и применение белковых гидролизатов (обзор).// Прикладная биохимия и микробиология. 2000, т.36, №5, с.525-534.

69. Неклюдов А. Д., Навашин С.М.// Прикл. биохимия и микробиология. 1985, т. 21, №1, с. 3-17.

70. Несмеянов А.Н., Беликов В.М. Пища будущего.// М.: Педагогика, 1979, с.128.

71. Новаковская С.С., Шишацкий Ю.И. Производство хлебопекарных дрожжей.//М.: Агропромиздат. 1990, с.336.

72. Номенклатура ферментов. Рекомендации международного биохимического союза.// М. 1974. - 321 с.

73. Патент ФРГ №3904194. Способ получения белковых гидролизатов с низким содержанием горьких веществ //Кл. С12Р 21/06. 1990.

74. Петрова Н.Т. Разработка технологии получения препарата литических ферментов, расщепляющих клеточные стенки дрожжей и микроскопических грибов, с использованием мутантного штамма//

75. Автореферат диссертации на соиск. уч.степени канд.техн.наук. -М. -2005.- 18 с.

76. ПивненкоТ.Н., Эпштейн JI. М., Позднякова Ю.Н., Давидович В.В. // Вопросы питания. 1997, № 5, с.34-38.

77. Подобедов А.В. О дефиците белка в России и его устранении за счет производства и переработки сои //Пищевая промышленность. 1998, №8.

78. Полыгалина Г.С., Чередничено B.C., Римарева JI.B. Справочник. Методы определения ферментативных активностей. М., Изд.Пищепром. 2003. - 230.

79. Поляков В.А., Оверченко М.Б., Серба Е.М., Римарева JI.B. Влияние ферментативного комплекса A. oryzae 387 на степень гидролиза дрожжевой биомассы //Хранение и переработка сельхозсырья. 2001, №8. с.32.

80. Поляков В.А., Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Трифонова В.В.// Прикл. биохимия и микробиология. 2000. Т. 36. № 3.

81. Попов Г., Владимиров Г., Павлова К. Получение гидролизатов из отходных пивных дрожжей, предназначенных для производства колера-красителя // Науч.тр. Висш. ин-т хран. и вкус, пром-ти. Пловдив. 1990, 37, №2, с.221.

82. Прянишников В.В., Микляшевски П. и др. Функциональные добавки направленного действия для пищевой пром-ти.// Пищевая промышленность 1999, №1.

83. Ракитин В.Ю. Технологические аспекты дезинтеграции микроорганизмов.// Обзор. -М.: НИИТЭХИМ 1980, Вып.15 (100), с.36.

84. Римарева JI.B., Оверченко М.Б., Трифонова В.И., Устинников В.А. Получение пищевых добавок лечебно-профилактического действия.// Сб.: «Пища. Экология. Человек». Межд. науч.-техн. конф. М., 1995, с.25.

85. Римарева Л.В. // Хранение и переработка сельхозсырья. 1996. № 2, с.39-40.

86. Римарева Л.В. Перспективы использования протеолитических ферментных препаратов // Пищевая промышленность. 1996. № 3. С. 44-45.

87. Римарева Л.В., Яровенко В.Л., Милюкова Т.Б., Устинников Б.А. // Прикл. биохимия и микробиология. 1993. Т. 29. № 6.

88. Римарева Л.В. Эффективный ферментный препарат для протеолиза растительного сырья // Хранение и переработка сельхозсырья. 1995, № 6.-С. 40.

89. Римарева Л.В., Милюкова Т.Б., Оверченко М.Б., Трифонова В.В., Устинников Б.А. Штамм гриба Aspergillus oryzae продуцент комплекса кислых и слабокислых протеаз, амилолитических и цитолитических ферментов: Патент РФ № 2070921// БИ. 1996, № 36.

90. Римарева Л.В., Оверченко М. Б., Серба Е.М., Трифонова В. В.// Прикл. биохимия и микробиология. 1997, Т. 33, № 1, с. 43-48.

91. Римарева Л.В., Оверченко М. Б., Трифонова В. В. Способ получения белкового гидролизата дрожжевой биомассы: Патент РФ № 2104300 // Б. И. 1998, №4, с. 151.

92. Родионова Н.А., Безбородов A.M. О локализации систем ферментов, катализирующих расщепление полисахаридов растительных клеточных стенок у высших растений (обзор). // Прикладная биохимия и микробиология. 1997, с.467-487.

93. Росляков В.Я., Тарасенко И.С. Способ получения гидролизатов казеина: А.С. СССР №1587720. 1990. Б.И. №31, С.272.

94. Рошкова 3. Получение и применение дрожжевых белковых продуктов пищевого назначения //Хранительная промышленность. 1986, №1, с.25

95. Руденко А.Н., Конев С.В. О влиянии моно- и дивалентных катионов на термоустойчивость дрожжевых клеток. //В сб. Микроорганизмы -продуценты биологически активных веществ. — Минск. Наука и техника. 1973, с. 168-172.

96. Руденская Г.Н. Глутамил эндопептидаза микроорганизмов новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ.// Биоорг. химия. - 1998. -24, №4.-С. 256-261.

97. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизинов.// Биоорг. химия. -1994. 20, №5. - С. 475 - 484.

98. Рухлядева А.П. Инструкция по техно-химическому и микробиологическому контролю спиртового производства.// М.: Агропромиздат. 1986, с.397.

99. Семихатова Н.М. Хлебопекарные дрожжи. //М.: Пищевая промышленность. 1980, с. 199.

100. Скрябин Г.К. Микробиологический белок для нужд животноводства.// Вестник с/х наук, 1979, №3, с. 31-32.

101. Спиричев В.Б. Дефицит микронутриентов и отечественные продукты лечебно-профилактического питания для его коррекции. //М.,1998.

102. Суханов В.П., Керимова М.Г., Игнатьев А.Д. Об эффективности использования комплексов аминокислот для повышения биологической ценности пищевых продуктов. //Тезисы докл. III Всес. совещания по аминокислотам. Ереван. 1984, с. 187.

103. Тихомирова Н.А. Технология продуктов функционального питагния. М.: ООО «Франтера». - 2002. - 134 с.

104. Фараджаева Е.Д., Кораблин Р.В. Получение и применение БАД на основе вторичных ресурсов пивоварения.// Пища. Экология.

105. Качество.: Сб.матер. 2 Межд. науч.-практ. конфер. Новосибирск: Издательство СО РАСХН, 2002, с.38-39.

106. Фихте Б. А. Дезинтеграция микроорганизмов.//Задачи и перспективы. Пущено-на-Оке. 1972, с.5-14.

107. Химический состав пищевых продуктов. //М.: Легкая и пищевая прмышленность. 1984, с.305.

108. Черкасов И.А., Кравченко Н.А., Павловский П.Е., Брагина Л.П. О некоторых особенностях бактериолитического действия лизоцима.// Биохимия. 1974, т.З, в.6, с.1308-1310.

109. Шальнова Н.Д. Использование профилактических продуктов питания в экстремальных условиях. //Пищевая промышленность. 2002, №11, с.55-57.

110. Шимилин Л.(перевод с англ.) Химия и обеспечение человечества пищей.// М. Мир. 1986, с. 616.

111. Шкляр Б.Х. Ферментативный лизис дрожжей.//Минск. 1977, с.147.

112. Шлокене А.П., Гуреева М.П., Ужкуренас А.П., Гричишкис С.Л., Валиляускас Ю.Ф., Малей С.М., Хагендорф А.А. Способ получения белкового гидролизата из биомассы дрожжей. Авт. свид. СССР № 947988 //Б.И. 1982, №28, с.255.

113. Щелкунов Л.Ф., Дудкин М.С., Корзун В.Н. Пища и экология. Одесса: Оптимум. -2000. С. 23.

114. Эль-Регистан Г.И., Бабаян Т. Л. Явление автолиза у микроорганизмов. Обзор. информ.//М.: ЦБНТИ Медбиопрома СССР, 1987, вып.2, с.52.

115. Achstetter Т., Emter О., Ehmann С., Wolf D.H., Proteolytic system of yeast.№New developments.// Horre-seyer's Z. Physiol. Chem., 1983, v.364, № 9, p. 1089.

116. Achstetter Т., Emter O., Ehmann C., Wolf D.H. Proteolysis in eucariotyc cell: aminopeptidases and dipeptidylaminopeptidases of yeast revisited. //Arch. Biochem Biophys., 1983, v.226, № 1, p.292-305.

117. Achstetter Т., Emter O., Ehmann C., Wolf D.H. Proteolysis in eucariotic cell: aminopeptidases and dipeptidylaminopeptidases of yeast revisited. //Arch.Biochem. Biophys., 1983, v.226, N1, p. 292-305.

118. Agboola S.O., Dalgleish D.G. // J. Agr. Food Chem. 1996. V. 44. N11. P.3631-3636.

119. Agboola S.O., Singh H., Munro P.A., Dalgleish D.G., Singh A.M. // J/ Agr. Food Chem. 1998 V. 46. N1. p. 84-90.

120. Alemohammad M.M., Knowless C.J. Osmotically induced volume and turbidity changes of E. coli due salts, sucrose and glycerol, with particular reference to the rapid permeation of glycerolin to the cell.// J. Gen. Microbiol., 1974, v. №1, p. 125-142.

121. Alvarez R., Enriquez A. Nucleic acid reduction in yest. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988, v.29, № 2-36 p. 208-210.

122. Andreas Cal.//Food Processes (USA). 1986. - 47 , N7. - P .37.

123. Atsushi I., Takashi I. possible involvement of membrane damage in the inactivation by broad-band near-UV. //Protochem. Photobiol. 1983, v.37, №4, p.395-401.

124. Arnold W.N. In " Yeast Cell Envelopes" CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, 1981, p.97.

125. Aubes-Dufau I., Combes D. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. V.67.N 1-2. P. 127-138.

126. Baldwin C., Robinson C. Increased disruption resistence of Candida utilis grown for survivors of enzymatic lysis combined with high pressure homogenization.// Letters in Applied Microbiology. 1992, vol.15, p.59-62.

127. Bomar M.T.,Yakubick V., Schmidt S. Autosysis of yeast induced by elevated temperature, ultraviolet and electron radiation. // Alimenta. 1977, v.16, p.53-57.

128. Babayan T.L., Bezrukov M.G., Latov V. K., Belikov B.M., Belatseva E.M., Titova E.F. Curr. Microbiol. 1981, v.5, p. 161.

129. Barett A.J. Proteolytic enzymes: aspartic and metallopeptidases.// Methods Enzymol., 1995, V. 248, P. 183.

130. Behalova В., Sillinger V.,Machek F. Баланс эргостерина при получении дрожжевого экстракта из клеток S. cerevisiae и C.utilis. // Kvasny Prum., 1996, v.32, №11, p.279-280.

131. Beck R.H.F., De Sadelur J.W.G.C. Pat. Europa. 1998. N 834537

132. Berthelsen J.H., Frokajaer S., Saltin B. Int.Pat. 1997 WO 39641.

133. Bohni P.C., Daum G., Schatz G. Import of protein into mitohondria. // J.Biol. Chem, 1983, v.258 №8, p. 4937-4943.

134. ChangW. Т., Douglas K.T., Mechanistic studies of carboxypeptidase Y from Saccharomyces cerevisiae.// Biochem.J. 1980, v. 187, № 3, p.843-849.

135. Chobert J.- M., Bertrand- Harb C., Dalgalarrando M., Nicolas M.-G. // J.Food Biochem. 1989. V. 13. N 2. P. 335-352.

136. Chrenova N.M., Bezrukov M.G., Kogan A.S., Sergeev W.A. Autolysis der H-hefe Saccharomyces cerevisiae induziert durch metallkationen. //Nahrung, 1981, B. 25, S. 837 -844.

137. Company "Provesta" marketing of new Yeast production // Bioprocessing Technology. - 1990. - 12, N7. - P.7.

138. Czapinska R., Otlenski J. Structural and energetic determinants of the SI-site specifity in serine proteases// Eur. J. Bioch., 1999-V.260. -P.571-595.

139. Diniz F.M., Martin A.M. // Food Sci. Technol. ( London). 1997. V. 30. N3. P. 266-272.

140. Duran A., Cabib E., Solubilization and partial purificato of yeast syntethase.//J. Biol Chem.1978, v.253, №12 , p.4419-4425

141. Dworzak E., Ors E. //Elelmiszen virsgalati Kozlemenyek. 1978 24, №3-4,1. 104.

142. Elango N., Correa J.U., Cabib E. Secretory of yeast chitinase.// J.Biol.Chem., 1982, v.257,№3, p. 1398-1400. bei treatment with enzymes.// J. Gen. Microbiol., 1980, v.l 17, p.383-391.

143. Emter O., Wolf D.H. Vacuoles are not the role compartments of proteolytic enzymes in yeast. FEBS Lett., 1984, 166, N2, p 321-325.

144. Flaczyk E. // Przem. Spozyw. 1997. V.51. N4. P. 43-45

145. Fleet G. In " Microbial cell Wall Synthesis and Autolysis", Elsevier, Amsterdam, 1984, p. 227.

146. Frokjaer S. // Food Technol. 1994. V. 48. N10. P. 86-88.

147. Gale E.F., Ingram J., Kerridge D., Notario V., Waymann F. Reduction of amphotericin resistance in stationary phase cultures of Candida albicans.

148. Gies A., Stasinska В., Skupin J. // Proc. 4th Eur. Congr. Biotechnol. , Amsterdam, June 14-19. 1987. - V.2.-P.146.

149. Hagi Т., Hatta H., Kobayashi M., Yoshikawa K., Pat. Japan. 1997. N 09-121814.

150. Halasz'A^Barath A., Matrai В., // Acta alim. 1988. - 17, N4 - 374.

151. Haque Z.U., Mozaffar Z. // Food Hydrocolloids. 1992. N5. P. 559571.

152. Hemmings B.A., Zubenko G.S., Halsilik A., Jones E.W. Mutant defective in processing of an enzyme located in the lysosome-like vacuole of Saccharomyces cerevisiae.// Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1981 v.78, №1, p 435-439.

153. Hetz G., Rohm K.H. Biol. Chem., 1987, v.363, p.63.

154. Hien N.H., Fleet G.H. Separation und characterization of six (l-3)-(3-glucanases from S.cerevisae.// J. Bacteriol., 1983,v.l56, №3, p.1204-1213.

155. Hilt W., Wolf D.H. Stress-induced proteolysis in yeast.// Mol. Microbiol., 1992, v.6, №17, p. 2437-2442.

156. Holzer H., Heinrich P.C. -Ann.Rev.Biochem., 1980, v.49, №63.

157. Johnson J.C. Food Additives. // Recent Developments, Noyes Data Corp., Park Ridge, 1983,s.526.

158. Ju H.-P., Okumiya M., Nishizono S., Ki M., Sugano M., Imaizumi K. // Food Chem. Toxicol. 1997. V. 35. N7. p. 663-668.

159. Klimova O.A., Borukhov S.I., Solovyeva N.I., Balaevskaya Т.О., Strongin A. Ya. The isolation and properties of coolagenolytic proteases from crab hepatopancreas.// Biochem. Biophys. Res. Com., 1990; 166(3), P. 1411 1420.

160. Kollar R., Sturdir E. Indukovana autolyza kvasinick. // Biologia, 1989, v.44, №12, p.1211-1223.

161. Kollar R., Petrakova E., Ashwell G., et.al.//J. Biol. Chem 1995 - v. 270.- P.l 170-1178.

162. Kovach В., Deak P., Haidu D., Vealand A.// Szeszipar. Januar -Vfrcius. 1988, p.36.

163. Lahl W.J., Braun S.D. // Food Technol. 1994. V. 48. N10. P. 68-71.

164. Leduc M., van Heijenoort J. Autolysis of E.coli. J. Bacteriol., 1980,v. 142,№ 16 p.52-59.

165. Lesk A.M., Fordman W.D. Conservation and variability inn the structure of serine proteinases of the chymotrypsin family// J. Mol. Biol. -1996, V. 258,-P 501 -537.

166. LexueZ.X. //Food Sci. 1996. V. 17. N5. P. 3-6.

167. Magni G., Drewniak M., Santarelli I., Huang C. Reexamination of the activation of yeast proteinase В on pH 5 : loss of inhibition effect of proteinase В inhibitors.// Biochem Int., 1986, v. 12, № 4 p.557-565

168. Mahmoud M.I., Malone W.T., Cordle C.T. // J. Food Sci. 1992. V. 57. N5. P. 1223-1229.

169. Mahmoud M.I. // Food Technol. 1994. V. 48. N 10. P. 89-95.

170. Makinen KK, Makinen PL. Purification and properties of an extracellular collagenolytic protease produced by the human oral bacterium Bacillus cereus (strain Soc 67)JI J Biol. Chem., 1987; 262(26), P. 12488 -12495.

171. Mala B. Rao, Aparna M. Tanksale, Mohini S. Ghatge, Vasanti V. Deshpande. Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases// Microbiol, and Mol. Biol. Rev., 1998, 62(3), P. 597 635.

172. Marcilla A., Valentin E., Sentandreu R.//Internal Microbiol. 1998. -V. 1. -P. 107-116.

173. Masters P.M., Friedmon M. //J. Agr. Food Chem. 1979 27, 3, p.507.

174. Nielsen P.M. // Food Sci. Technol. ( N.Y.) . 1997. V. 80. N2 . P. 443-472.

175. Nagano H., To KA. Purification of collagenase and specificity of its related enzyme from Bacillus subtilis FS-2.11 Biosci. Biotechnol. Biochem., 2000; 64(1), P. 181-183.

176. Nombela C. In " Microbiol Cell Wall Synthesis and Autolysis", Elsivier, Amsterdam, 1984, p327.

177. Notario V. (3-glucanases from Candida albicans: purification, characterization and the nature of their attachment to cell wall components.// J. Gen. Mikrobiol., 1982, v. 128, №4, p. 747-759.

178. Otero M.A., Wagner J.R. Thermal behaviour and hydration properties of yeast proteins from Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces fragilis. //Food Chemistry. -2000.№69. pp. 161-165.

179. PAG. Revised PAG Guidelines. PAG/UNU Guideline № 6; Preclinical testing of novel sources of food // Food and Nutr. Bull. 1983, 5, №1, p.60

180. Parente A.M., Silva M.T. Ultrastruktural aspects of autolysis of Ps. Fluorescens induced by osmotic shock. // J. Gen. Microbiol., 1984, v. 130, №6, p.1459-1470.

181. Patching J.W., Rose A.N., Cold osmotic shock in S. serevisiae.//j. Bacterid., 1971, v. 108, p. 451-458.

182. Pedersen B. // Food Technol. 1994. V. 48. N10. P. 96-98.

183. Pntremoli S., Melloni E., Salamino F., Sparatore В., Michetti M., Horecker B.L.// Endogenous inhibitors of lysosomal proteinases.//Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v.80, №5, p. 1261-1264.

184. Production of Yeasts avtolyser in USA // Chemical Marketing Reporter. 1990. - 1237, N13. - p.5, 25.

185. Reyea F., Lahoz R., val Moreno A. J. Gen. Microbiol. // 1980, v.26, p.1120.

186. Riemay K.-H., Troger R. Autolyse bei Pilzen: Autolytischer Abbau von Kohlenhydraten, Proteinen, und Nucleinsaueren.// Z. Allg. Mikrobiol., 1978(8), B. 18,S.617-625.

187. Riemay R.-H., Wiese M. Verlauf und Beeinflussung der Analyse von Hypomyces ochraceus m. 359.// Z. Allg. Microbiologic, 1979, B. 19, № 4 , s. 269-276.

188. Rosales F. H. Yeast as protein source for human nutrition (a review).//Acta Microbiol. Hung., 1984, v.31, p. 159-172.

189. Roth F. Mikroorganismen als Proteinquelle in der Tierernaeehrung.// Kraftlutter, 1979, b.62, № 3, s. 122-128.

190. Ruggieri S., Magni G. // Phys.Chem.Phys., 1982, v. 14, р.315.

191. Saheki Т., Holzer H. Proteolytic activities in yeast. // Biochim. Biophys. Acta 1975, v.384, №1, p. 203- 214.

192. Saheki Т., Holzen H. Comparisons of the tryptophan synthase inactivating enzymes with proteinases from yeast. // Eur. J. Biochem., 1974, v. 42, p.621-626.

193. Schmidt G. //Food Flavor, Ingred., Process, and Packag. 1987. -9, N5. - C.25, 27, 29-30.

194. Shanidi F., Synowiecky // J. Food Chem. 1997. v. 60. N1. P.29-32.

195. Sergeev V.A., Solosenko U.M., Berzucov M.G.// Acta Biotechnol. 1984, №4,1. 105.

196. Sielecki A.R., Fujinaga M., Read R.J., James N.G. Refined structure of porcine pepsinogen at 1,8A resolution.// J. Mol. Biol., 1991, V. 219, P. 671 -692.

197. Sommer R., Yeast autolysates production, properties and applications// Product information "Only", 1989.

198. Suares R.M.P., Schwencke J., Garcia A.N., Garcon S. A new X-propyl-dipeptidyl aminopeptidase from yeast associated with a particulate fraction.//FEBS Lett, 1981,v. 131, № 2, p. 296-300.

199. Taylor S.L. // J Food Protect. 1986. v. 49. N2. p. 239-250.

200. US Patent 5.741.693. Alkalophilic Bacillus sp. AC13 and protease, xylanase, cellulase obtainable therefrom. 1998.

201. US Patent 5.801.038. Modified subtilisins having amino acid alterations. 1998.

202. US Patent 5.811.112. Oil-in-water cosmetic emultions containing a stabilized protease. 1998.

203. US Patent 5.837.516. Subtilisin variants capable of cleaving substrates containing basic residues. 1998.

204. Villa T.G., Notario V, Villanueva J.R. Occurrence of an endo-1,3- (3-glycanase in culture fluids of the yeast C.utilis.// Biochem.J, 1979, v. 177, p.107-114.

205. Villan G. J., Enriquez M.A., Lopez S.P. Reina C.R., Permeabilization cellular de C. utillis.// Rev. cienc.biol. 1983, v. 14, №1, p.35-47.

206. Vioque Javier, Clemente Alfonso, Pedroche Justo.//Instituto de la Grasa. Avda. Grasas у aceites. Espana., 2001, t.52, № 2, p. 132-136.

207. Wagner J.C., Escher C., Wolf D.H.//FEBS Lett., 1987, v.218, p.31.

208. Yeast protein en hances flavour and nutrition. //Food Process. 1986 -55, №10, p.13.

209. Watson R.R. Substrate specificities of aminopeptidases: a specific method for microbial differentiation.// Methods Microbiol., 1976, V. 9, P. 1-14.

210. Yumi Y.,Dao Thi D., Xing X., Kanji M., Characteristics of baker's yeast destruction by means of homogenezator working with high pressure.//J.Soc.Pwder Technol. -1999.-vol. 36.№7. -p.534-541.