Разработка биотехнологических процессов получения биологически активных соединений из медоносных пчел и исследование их свойств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат технических наук Зуева, Ольга Юрьевна

• Зуева, Ольга Юрьевна
• кандидат технических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат технических наук Зуева, Ольга Юрьевна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Природные полисахариды хитин и хитозан: строение, физико-химические свойства.

1.2. Области применения.

1.3. Основные источники хитина и хитозана.

1.3.1. Ракообразные (<Crustacea).

1.3.2. Грибы (Fungi).

1.3.3. Насекомые (Insecto).

1.3.4. Нетрадиционные источники.

1.4. Способы переработки хитинсодержащего панциря ракообразных.

1.4.1. Получение хитина с помощью химических и биотехнологических способов обработки.

1.4.2. Получение хитозана с использованием химических и ферментативных методов.

1.4.3. Способы гидролиза хитозана.

1.5. Получение хитина и хитозана из насекомых.

2. Экспериментальная часть.'.

2.1. Объекты исследований, исходные материалы и химические реагенты.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Технологические стадии.

2.2.2. Методы анализа.

2.2.3. Изучение некоторых свойств полученных веществ.

3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Разработка технологии получения биологически активных веществ из подмора пчел.

3.1.1. Водная экстракция.

3.1.2. Депротеинирование.

3.1.3. Обесцвечивание.

3.1.4. Деацетилирование.

3.1.5. Ферментативный гидролиз.

3.2. Технология переработки подмора пчел.

3.3. Физико-химические свойства полученных продуктов.

3.4. Биологические свойства полученных продуктов.

3.4.1. Антиоксидантные свойства.

3.4.2. Генопротекторные свойства.

3.4.3. Фотопротекторные свойства.

4. Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка биотехнологических процессов получения биологически активных соединений из медоносных пчел и исследование их свойств»

Полисахариды хитин и хитозан, а также их производные, считаются, перспективными биоматериалами будущего. По некоторым оценкам, предполагаемый объем производства изделий из этих биополимеров в 2005г. составит около 2 млрд. долларов, из которых — 75% будет использовано в пищевой, косметической и фармацевтической промышленностях, биотехнологии, сельском хозяйстве. Уникальная структура макромолекулы хитозана и наличие положительного заряда обусловливают проявление ряда полезных свойств (антиоксидантные, радиопротекторные, волокно- и пленкообразующие, иммуномодулирующие, противоопухолевые и др.), а также его низкую токсичность и способность к биодеградации.

Пигмент меланин представляет собой высокомолекулярный биополимер нерегулярной структуры, относящийся к классу конденсированных фенольных соединений, обусловливающих темную окраску покрова насекомых, волос человека, клеточной стенки грибов, растений и микроорганизмов. Наличие разнообразных функциональных групп, высокостабильных парамагнитных центров, сопряженной системы двойных связей в молекуле меланина обеспечивают разнообразное применение в качестве фото-, радиопротекторов и антиоксидантов в различных областях промышленности.

На сегодняшний день основным источником для получения хитина и хитозана являются панцири ракообразных (крабы, креветки, криль). Технология обработки включает постадийное удаление сопутствующих веществ с использованием химических и ферментативных способов обработки. Основными субстратами для выделения меланинов являются чернильная сумка каракатицы Sepia officinalis, микро- и макромицеты, грибы и дрожжи, темные сорта винограда, проявляющие сходные биозащитные свойства с меланинами животного происхождения.

Расширение областей применения; данных биополимеров обусловливает поиск новых перспективных источников хитина и меланина. Как известно, в покровах насекомых до 50% занимает полимер хитин, наряду с белками придающий прочность экзоскелету. Вместе с хитином и белком в кутикуле присутствуют эумеланины, ковалентно связанные с остальными компонентами, обусловливающие окраску насекомого и некоторые защитные свойства. Таким образом, кутикулу насекомых можно рассматривать как источник различных биологически активных веществ с возможностью выделения в отдельном виде или в виде комплексов. Благодаря традиционно развитому пчеловодству в нашей стране в качестве источника биологически активных веществ можно предложить подмор пчел - медоносные пчелы Ар1Б теШ/ега Ь., погибшие во время зимовки в улье. Согласно расчетам, сырьевая база подмора пчел может составить от 6 до 10 тыс. тонн в год.

Цель настоящей работы - разработка биотехнологических процессов получения хитина, хитозана, меланина и их комплексов из подмора пчел, изучение некоторых физико-химических и биологических свойств данных полимеров.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи исследования: разработать технологию переработки подмора пчел с учетом особенностей сырья и определить оптимальные параметры на каждой стадии обработки; согласно выбранным оптимальным параметрам осуществить комплексную переработку подмора пчел с получением интересующих биологически активных веществ; изучить основные физико-химические свойства промежуточных и основных продуктов, полученных на каждой стадии переработки; исследовать некоторые биологические свойства водорастворимого меланина и низкомолекулярного хитозан-меланинового комплекса.

Научная новизна работы

Обосновано использование кутикулы пчелиных для получения различных соединений. Разработана комплексная технологическая схема переработки пчелиного подмора с получением таких биологически активных веществ, как водорастворимый меланин и низкомолекулярный хитозан-меланиновый комплекс. Определены основные оптимальные параметры переработки пчелиного подмора на каждой стадии обработки. Учитывая особенность сырья, обоснована необходимость включения стадии обесцвечивания в технологию переработки с целью более полного удаления пигмента. При исследовании ферментативного гидролиза показано, что хитозан-меланиновый комплекс может гидролизоваться с использованием специфических и неспецифических ферментов. Показано, что, варьируя условиями ферментативного гидролиза, существует возможность получения; хитозан-меланинового комплекса с различной молекулярной массой и степенью деацетилирования в зависимости от целей использования. Исследованы антиоксидантные, генопротекторные и фотопротекторные свойства хитозан-меланинового комплекса и меланинсодержащих продуктов из подмора пчел.

Впервые показана возможность использования кутикулы пчелы Apis mellifera L. для одновременного выделения меланиновых пигментов и комплекса хитозана с меланином с различной молекулярной массой и степенью деацетилирования.

Практическая значимость работы

Разработана комплексная схема переработки подмора пчел с получением таких биологически активных веществ, как водорастворимый меланин и хитозан-меланиновый комплекс. Предложены оптимальные параметры для осуществления каждой стадии. Разработана рецептура косметического крема на основе водорастворимого меланина и низкомолекулярного хитозана для обеспечения фотозащитных свойств.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, методической части, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и 25 рисунков, библиографию из 158 наименований.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Зуева, Ольга Юрьевна

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана технологическая схема комплексной переработки подмора из медоносных пчел {Apis mellifera) с получением водорастворимого меланина (до 35%) и хитозан-меланинового комплекса (до 4-6%) различной молекулярной массы. Оптимизирован технологический процесс и определены оптимальные условия для каждой стадии.

2. Обоснована возможность исключения из технологической схемы переработки стадии деминерализации из-за низкого содержания минеральных веществ в подморе пчел (3-4%), и показана необходимость включения стадии обесцвечивания меланиновых пигментов, влияющих на дальнейший процесс обработки и свойства полученных продуктов.

3. Показана возможность гидролиза высокомолекулярного ХзМК ферментными препаратами со специфической и неспецифической активностью. Гидролиз ХзМК промышленным препаратом Целловиридин Г20х в оптимальных условиях позволяет получать низкомолекулярные фрагменты (20-50кДа), хорошо растворимые в нейтральных водных растворах.

4. Установлено, что меланины и низкомолекулярный ХзМК обладают антиоксидантной активностью, проявляющейся в способности предотвращать перекисное окисление липидов и пероксидазное окисление аминобифенилов. Ингибирующая активность меланинов снижалась в ряду субстратов: БД- о-ДА - ТМБД.

5. Показана способность меланинов, полученных на стадии водной экстракции при температурах 20-80°С, предотвращать повреждение ДНК фага А, продуктами окисления бензидина. Защитное действие обусловлено способностью меланинов дезактивировать свободные радикалы и активные формы кислорода, образующиеся при окислении, за счет присутствия неспаренных электронов в молекуле.

6. Разработана рецептура крема с добавлением меланина отдельно и совместно с ХзМК (0,3%) в качестве биологически активных веществ, предотвращающих окисление кремовой основы под действием УФ-облучения. Фотопротекторное действие меланина проявлялось в снижении перекисного числа в 2,3 раза по сравнению с контролем. Использование в рецептуре крема меланина с ХзМк увеличивало этот эффект еще на 20%.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Зуева, Ольга Юрьевна, 2004 год

1. Muzzarelli R.A.A. Chitin. 1977. Oxford: Pergamon Press. P. 309.

2. Cauchie H-M. Chitin production by arthropods in the hydrosphere // Hydrobiologia. 2002. -V. 470. - N. 1/3.- P. 63-95.

3. Majeti N.V., Kumar R. A review of chitin and chitosan applications // Reactive & Functional Polymers.-2000.- V.46.- N.I.- P.l-27.

4. Tolaimate A., Desbrie'res J., Rhazi M., Alagui A., Vincendon M., Vottero P. On the influence of deacetylation process on the physicochemical characteristics of chitosan from squid chitin // Polymer.- 2001.-V.41.- N.7.- P. 2463-2469.

5. Zhang M., Haga A., Sekiguchi H., Hirano S. Structure of insect chitin isolated from beetle larva cuticle and silkworm (Bombyx mori ) pupa exuvia // Int. J. Biological Macromolecules.- 2000.-V.27.- N.l.-P. 99-105.

6. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов.- М.: Наука, 1983.- 248с.

7. Muzzarelli R.A.A. The discovery of chitin a > 570 Megayear old polymer // In: Chitosan in pharmacy and chemistry / Ed. R.A.A Muzzarelli, C. Muzzarelli. Atec, Italy, 2002.-P. 1-8.

8. Chatelet C., Damour O., Domard A. Influence of the degree of acetylation on some biological properties of chitosan films // Biomaterials.- 2001.-V.22.- N.3. P. 261-268.

9. Domard A. Some physicochemical and structural basis for applicability of chitin and chitosan. // Proc. 2nd. Asia Pacific Symposium "Chitin and chitosan" / Ed. F. Stevens, M.S. Rao, S. Chandrkrchang. Bangkok, Thailand, 1996.- P. 1-12.

10. Kumara G., Bristowa J.F., Smith P.J., Payne G.F. Enzymatic gelation of the natural polymer chitosan // Polymer.- 2000.- V.41.-N.6.-P.2157-2168.

11. Juang R-S., Shao H-J. A simplified equilibrium model for sorption of heavy metal ions from aqueous solutions on chitosan // Water Research.- 2002.-V.36.-N.12.- P.2999-3008.

12. Сафронова Т.М. Применение хитозана в производстве пищевых продуктов приведено в "Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение" / Под. ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова М: Наука, 2002.-С. 346-359.

13. Rhoades J., Roller S. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods // Applied and environmental microbiology.-2000.- V.66.- N.l.-P. 80-86.

14. Албулов А.И., Самуйленко А.Я., Фролова M.А. Хитозан в косметике приведено в "Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение"/ Под.ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова.- М: Наука, 2002.-С. 360-363.

15. Gain В. Natural products gain flavor// Chemical week.-1996. .-V.158.- N.48.-P.35-36.

16. Cho Y-W., Cho Y-N., Chung S-H., Yoo G., Ко S-W. Water-soluble chitin as a wound healing accelerator // Biomaterials.- 1999.- V.20.-N.22.-P. 2139-2145.

17. Jagur-Grodzinski J. Biomedical application of functional polymers // Reactive & Functional Polymers.- 1999.-V.39.-N.2.- P.99-138.

18. Khora E., Lim L. Implantable applications of chitin and chitosan // Biomaterials. 2003.- V.24.-N.13.- P.2339-2349.

19. Варламов В.П., Ильина A.B., Банникова Г.Е., Немцев С.В., Ильин JI.A., Чертков К.С., Андиранова И.Е., Платонов Ю.В., Скрябин К.Г. Способ получения низкомолекулярного хитозана для противолучевых препаратов. Патент РФ № 2188829. Россия. 10.09. 2002.

20. Vongchan P., Sajomsang W., Subyen D., Kongtawelerta P. Anticoagulant activity of a sulfated chitosan // Carbohydrate Research.- 2002.- V.337.- N.13.-P.1233-1236.

21. Ilium L. Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient // Pharmaceutical Pesearch.-1998.-V. 15 .-N.9.-P. 1326-1331.

22. Zechendorf B. Sustainable development: how can biotechnology contribute? // Trends in Biotechnology.- 1999.- V.17.- N.6.-P.219-225

23. Красавцев B.E. Технико-экономические перспективы производства хитина и хитозана из антарктического криля // Мат. VII Международной конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО, 2003.-С. 7-9.

24. Vincent J.V. Arthropod cuticle: a natural composite shell system // Composites: Part A.- 2002.-V.33.- N.10.- P.1311-1315.

25. Stankiewicz В., Mastalerz M., Hof C. J., Bierstedt A., Flannery M.B., Derek E. G., Evershed B. Biodégradation of the chitin-protein complex in crustacean cuticle//Org. Geochem.-1998.-V.28.-N.l/2.-P. 67-76.

26. Быкова B.M., Немцев C.B. Сырьевые источники и способы получения хитина и хитозана приведено в "Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение" / Под. ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова.- М: Наука, 2002.-С.7-23.

27. Мезенова О.Я., Лысова А.С., Григорьева Е.В. Гаммарус балтийский -потенциальный источник получения хитина и хитозана // Мат. VII Международной конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО, 2003 .-С. 32-33.

28. Антарктический криль: Справочник. / Под. ред. В.М. Быковой. М: ВНИРО, 2001.-207с.

29. Lipke P. N., Ovalle R. Cell Wall Architecture in Yeast: New Structure and New Challenges //Journal of Bacteriology.- 1998.- V.180.- N.15.-P.3735-3740.

30. Унрод В.И., Солодовник Т.В. Хитин- и хитозансодержащие комплексы из мицелиальных грибов: получение, свойства, применение // Биополимеры и клетка.-2001.-Т. 17.- № 6.-С.526 533.

31. Тесленко А.Я., Воеводина И.Н., Галкин А.В., Львова Е.Б., Никифорова Т.А., Николаев С.В., Михайлов Б.В., Козлов В.П. Способ получения глюкан-хитозанового комплекса Патент № 2043995. Россия. 1995.

32. Pochanavanich P., Suntornsuk W. Fungal chitosan production and its characterization // Letters in Applied Microbiology.-2002.-V.35.- N.1.-P.17-21.

33. Тыщенко В.П. Физиология насекомых. Уч. Пособие.-М: Высш.шк, 1986.-303с.

34. Chapman R.F. The insects. Structure and function. London: The English universities press. 1969.-P. 600.

35. Giraud-Guille M-M. Chitin-protein supramolecular order in arthropod cuticles: analogies with liquid crystals // In: Chitin in life science / Ed. Giraud-Guille M-M. France, 1996.- P. 1-10.

36. Hamodrakas S.J., Willis J.H., Iconomidou V.A. A structural model of the chitin-binding domain of cuticle proteins // Insect biochemistry and molecular biology.-2002.-V.32.- N.l 1.-P.1577-1583.

37. Tellam R.L., Eisemann G. Chitin is only a minor component of the peritrophic matrix from larvae of Lucilia cuprina // Insect biochemistry and molecular biology.-2000.-V.30.- N. 12.-P. 1189-1201.

38. Шовен P. Физиология насекомых. Перевод с фран. В.В. Хвостовой / Под. ред. Е.Н. Павловского.-М: Ин. Лит-ры, 1953.-494с.

39. Харсун А.И. Биохимия насекомых. Кишинев: Карта, 1976.-С.170-181.

40. Курченко В.П., Кукулянская Т.А.,Новиков Д.А. Физико-химические и биологические свойства меланиновых пигментов // Мат. VII Международной конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО, 2003 .-С. 23- 31.

41. Барабой В.А. Меланин: структура, биосинтез биологические функции // Украинский биохимический журнал.-1999.-Т.71.-№4.-С. 5-13.

42. Бриттон Г. Биохимия природных пигментов. М: Мир, 1986.-436с.

43. Riley Р.А. Melanin // Int. Biochem.Cell Biol.-1997.-V.29.-N.1 l'.-P. 12351239.

44. Бышнева Л.Н., Сенчук В.В. Влияние меланинов на перекисное окисление липидов // Прикладная биохимия и микpoбиoлoгия.-2001.-T.37.-N^l.-C.105-109.

45. Борщевская М.И., Васильева С.М. Развитие представлений о биохимии и фармакологии меланиновых пигментов // Вопросы медицинской химии.-1999.- Т.45 .-№ 1 .-С.7-15

46. Барабой В.А. Структура, биосинтез меланинов, их биологическая роль и перспективы применения//Успехи современной биологии.-2001.-Т.121.-№1.-С.36-46.

47. Феофилова Е.П. Ключевая роль хитина в образовании клеточной стенки грибов приведено в "Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение" /

48. Под. ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова,- М: Наука, 2002.-С.91-99.

49. Горбунова Н.П. Альгология: Уч. пособие для вузов по спец. «Ботаника» -М.: Высш.шк., 1991. 256с.

50. Николаев В.А., Харвуд Д.М. Морфология, таксономия и система классификации центрических диатомовых водорослей. — СПб.: Наука, 2002. -118с.

51. Ерофеев Н.С. Основы биологии дробянок, водорослей, грибов и лишайников: Уч. пособие. — Саранск: Из-во Мордов. ун-та, 2001.-172с.

52. Place A.R. The biochemical basis and ecological significance of chitin digestion // In: Chitin Enzymology / Ed. R.A.A. Muzzarelli. Atec, Italy, 1996.-V.2.- P. 39-54.

53. No H.K., Meyers S.P. Preparation of chitin and chitosan. // In: Chitin handbook / Ed. R.A.A. Muzzarell, M.G Peter. Atec, Italy, 1997.-P.475-489.

54. Tolaimate A., Desbrieres J, Rhazi M., Alagui A. Contribution to the preparation of chitins and chitosans with controlled physico-chemical properties // Polymer.- 2003.- V.44.- N.26.-P.7939-7952.

55. Вахтер P., Тесманн X., Свеннинг P., Ользен P., Стенберг Э. Катионные полимеры биологического происхождения. Патент № 2159253. Россия. 1995.

56. Percot A., Viton С., Domard A. Optimiztion of chitin extraction from shrimp shells // Biomacromolecules. 2003.-V.4.- N.1.-P.12-18.

57. Куприна Е.Э., Водолажская C.B. Способы получения и активации хитина и хитозана приведено в "Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение" / Под. ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова.- М: Наука, 2002.-С.44-63.

58. Банников В.В., Львович Ф.И., Фрайман Д.Б. Способ получения хитозана. Патент №2073017. Россия. 1997.

59. Teng W-L., Khor E., Tan Т., Lim L-Y., Tan S-C. Concurrent production of chitin from shrimp shells and fungi // Carbohydrate Research.-2002.-V.332.- N.3.-P.305-316.

60. Tsai G-J., Su W-H., Chen H-C., Pan C-L. Antimicrobial activity of shrimp chitin and chitosan from different treatments and applications of fish preservation // Fisheries science.-2002.- V.68.- N.1.-P.170-177.

61. Wang S-L., Chio S-H. Deproteinization of shrimp and crab shell with the protease of Pseudomonas aeruginosa K-187 V/ Enzyme and microbial technology. -1998.-V.22.- N.7.-P.629-633.

62. Yang J-K., Shih I-L., Tzeng Y-M., Wang S-L. Production and purification of protease from a Bacillus subtilis that can deproteinize crustacean wastes // Enzyme and microbial technology.-2000.-V.26.- N.5/6.-P. 406-413.

63. Ежова E.A. Модификация "холодного способа" деацетилирования хитина // Мат. VII конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО, 2003. С. 17-19.

64. Chang К. L. В., Tsai G., Lee J., Fu W.-R. Heterogeneous N-deacetylation of chitin in alkaline solution // Carbohydrate Research.- 1997.-V.303.-№ 3.-P.327-332.

65. Rege P.R., Block L.H. Chitosan processing: influence of process parameters during acidic and alkaline hydrolysis and effect of the processing sequence on the resultant chitosan's properties // Carbohydrate Research.-1999.-V.321.- N.3-4.-P.235-245.

66. Tsigos I., Martinou A., Varum K.l M., Boutiotis V. Enzymatic deacetylation of chitinous substrates employing chitin deacetylases // In: Advan.Chitin Sci. / Ed. A. Domard, C. Jeuniaux, R. Muzzarelli. G. Roberts. France, 1995.-V.1.-P. 59 69.

67. Tsigos I., Martinou A., Kafetzopoulos D., Bouriotis V. Chitin deacetylases: new, versatile tools in biotechnology // Trends in biotechnology.-2000.-V.18.- N.7. P.305-312.

68. Martinou A., Tsigos I., Koutsioulis D., Bouriotis V. Chitin deacetylases: from basic research to biotechnological applications // In: Chitin Enzymology / Ed. R.A.A. Muzzarelli. Atec, Italy, 2001.- P. 503-510

69. Martinou A., Kafetzopoulos D., Bouriotis V. Chitin deacetylation by enzymatic means: monitoring of deacetylation processes / Carbohydrate Research.-1995.-V.273.- N.2.-P.235-242.

70. Win N-N., Stevens W.F. Enzymatic deacetylation of chitin // In: Chitin Enzymology / Ed. R.A.A. Muzzarelli. Atec, Italy, 2001.- P.553-563.

71. Pettersen H., Sannes A., Holme H.K., Kristensen A.H., Dornish M., Smidsrod.O. Thermal depolymerization of chitosan salts // In: Advan.Chitin Sci. / Ed M. G.Peter, A.Domard, R.A.A.Muzzarelli. Potsdam. Germany,-1999.- V4.-P.422-428.

72. Немцев C.B., Ильина C.M., Шинкарев C.M., Албулов А.И., Варламов В.П. Получение низкомолекулярного водорастворимого хитозана // Биотехнология.-2001 .-№ 6.-С. 37-42.

73. Tommeraas К., Va°rum К. М., Christensen В.Е, Smidsrod О. Preparation and characterisation of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerisation of chitosans // Carbohydrate Research. -2001. -V. 333.- N.2.-P. 137-144.

74. Allan G.G., Peyron M. Molecular weight manipulation of chitosan II: prediction and control of extent of depolymerization by nitrous acid // Carbohydrate research. -1995.-V.277.-N.2.- P.273-282.

75. Kubota N., Tatsumoto N., Sano Т., Toya K. A simple preparation of half N-acetylated chitosan highly soluble in water and aqueous organic solvents // Carbohydrate Research.-2000.-V.324.- N.4.-P.268-274.

76. Sato K., Kishimoto Т., Morimoto M., Saimoto H., Shigemasa Y. Hydrolysis of acetals in water under hydrothermal conditions // Tetrahedron Letters.-2003.-V.44.- N.47.-P.8623-8625.

77. Hai L., Diep Т., Nagasawa N., Yoshii F., Kume T. Radiation depolymerization of chitosan to prepare oligomers // Nuclear instruments and methods in physics research B.-2003.-V.208.-P.466-470.

78. Yoksan R., Biramontri S., Chirachanchai S. Structural characterization of y-ray irradiated chitosan // In: Advan. Chitin Sci. / Ed. K.Suchiva, S. Chandrkrachang, P. Methacanon, M.G. Peter. MTEC. Thailand, 2002.-V.5, P. 180-184.

79. Kardos N., Luche J-L. Sonochemistry of carbohydrate compounds // Carbohydrate Research.- 2001.-V.332.-N.2.- P. 115-131.

80. Chen R.H., Chang J.R., Shyur J.S. Effect of ultrasonic conditions and storage in acidic solutions on changes in molecular weight and polydispersity of treated' chitosan // Carbohydrate Research.- 1997.-V.299.- N.4.-P.287-294.

81. Kasaai M.R., Chin S.L., Arul J. Kinetic aspects of chitosan fragmentation by femtosecond laser // Journal of photochemistry and photobiology A: Chemistry.-2003.-V.159.- N.3.-P.207—211.

82. Kasaai M.R., Arul J., Chin S.L., Charle G. The use of intense femtosecond laser pulses for the fragmentation of chitosan // Journal of photochemistry and photobiology A: Chemistry.-1999.-V. 120.- N.3.-P. 201-205.

83. Вольфсон C.A., Никольский В.Г. Твердофазное деформационное разрушение и измельчение полимерных материалов. Порошковые технологии // Высокомол. соед. Серия Б.-1994.-Т.36.-№6.- С.1040-1056.

84. Роговина С.З., Акопова Т.А. Модификация полисахаридов в условиях сдвиговых деформаций // Высокомол. соед.-1994.-Т.36.-№ 4. С. 593-600.

85. Вихорева Г.А., Роговина С.З., Акопова Т.А., Зеленецкий С.Н., Гальбрайх JI.C. Изучение фракционного состава хитозана, полученного твердофазным и суспензионным методами // Высокомол. соед.-1996.-Т.38.-№ 10.-С.1781-1785.

86. Meens J., Schreiber С., Hain М. Screening of marine fungi for new chitin deacetylase enzymes // In: Chitin Enzymology / Ed. R.A.A. Muzzarelli. Atec, Italy, 2001.- P. 533-539.

87. Howard M.B., Ekborg N.A., Weiner R.M., Hutcheson S.W. Detection and characterization of chitinases and other chitin-modifying enzymes // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.-2003.-V.30.- N.l 1.-P.627-635.

88. Koga D. Biological functions and properties of chitinase isozymes from yam // In: Advan.Chitin Sci. / Ed. A.Domard, C.Jeuniaux, R.Muzzarelli. G.Roberts. France, 1995.-V.1.-P. 70 77.

89. Reetarani S. P., Ghormade V., Deshpande M. V. Chitinolytic enzymes: an exploration // Enzyme and Microbial Technology.-2000.-V.26.-№ 7.- P.473^83.

90. Schrempf H. The chitinolytic system of Streptomysetes // In: Advan.Chitin Sci. / Ed. A. Domard, C. Jeuniaux, R. Muzzarelli. G.Roberts. France, 1995.-V.1.-P. 123 128.

91. Ilyina A.V., Tatarinova N.Yu., Varlamov V.P. The preparation of low-molecular-weight chitosan using chitinolytic complex from Streptomyces kurssanovii И Process Biochemistry.-1999.- V.34.- N.9.-P.875-878.

92. Ильина A.B., Варламов В.П., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Е. Деполимеризация хитозана хитинолитическим комплексом бактерии рода Bacillus sp. 739 // Прикладная биохимия и микробиология.-2001.-Т. 37.-№2.-С. 160-163.

93. Новиков В.Ю., Мухин В.А. Деполимеризация хитозана под действием ферментов гепатопакреаса камчатского краба Paralithodes camtschaticus // Прикладная биохимия и микробиология.-2003.-Т.39.- №5.-С.530-535.

94. Ильина А.В., Ткачева Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом Целловиридин Г20х // Прикладная биохимия и микробиология.-2002.-Т.38.-№ 2.-С.132-135.

95. Kittur F.S., Kumar A.B.V., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosans preparation by depolymerization with Aspergillus niger pectinase, and characterization // Carbohydrate Research.-2003.-V.338.-№ 12.-P.1283 -1290.

96. Kumar A.B.V., Gowda L.R., Tharanathan R.N. Non-specific depolymerization of chitosan by pronase and characterization of the resultant products // Eur. J. Biochem.-2004.-V.271.-N.4.-P.713-723.

97. Kumar A.B.V., Varadaraj M.C., Lalitha R.G., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosans: preparation with the aid of papain and characterization // Biochimica et Biophysica Acta.-2004.-V.1670.-N.2.- P. 137- 146.

98. Muzzarelli R.A.A., Xia W., Tomasetti M., Ilari P. Depolymerization of chitosan and substituted chitosan with the aid of a wheat germ lipase preparation // Enzyme and microbial technology.- 1995.-V.17. N.6. P. 541-545.

99. Zhang H., Du Y., Yu X., Mitsutomi M., Aiba S. Preparation of chitooligosaccharides from chitosan by a complex enzyme // Carbohydrate Research.-1999.-V.320.-N.3/4. -P. 257-260.

100. Лопатин C.A., Папков B.A., Варламов В.П. Гидролиз хитозана иммобилизированными ферментными препаратами // Мат. VII конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана". М.: ВНИРО, 2003.-С 398-402.

101. Быков В.П., Быкова В.М., Головкова Г. Н. Хитин и хитозан из биомассы личинок мух. // Тез. 4-ой Всерос. конф. "Производство и применение хитина и хитозана". М: ВНИРО, 1995.- С. 10-12

102. Шыш С.И., Винокурова Г.В. Способ получения хитина и способ получения хитозана. Патент № 2139887. Россия. 1996.

103. Немцев С.В., Зуева О.Ю., Исмаилов В .Я., Варламов В.П. Кутикула жуков станет новым источником хитина и хитозана // Мат. VII конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО, 2003.-С. 36-42.

104. Кузин Б.А., Бабиевский К.К., Прохоренко Г.К., Кузин А.Б. Способ получения хитозана. Патент № 2067588. Россия. 1996.

105. Struszczyk М.Н., Hahlweg R., Peter M.G. Comparative analysis of chitosans from Insects and Crustacean // In: Advan.Chitin Sci. / Ed. M.G. Peter, A. Domard, R.A.A. Muzzarelli. Potsdam. Germany, 2000.-V 4.-P 40-49.

106. Немцев C.B., Зуева О.Ю., Хисматуллин Р.Г., Хисматуллин M.P., Лариков В.В., Варламов В.П. Хитозан из подмора пчел новый продукт пчел // Пчеловодство.-2001.-№5.-С. 50-51.

107. ГОСТ 7636-85 Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. 116 с.

108. Lim S., Hattori К., Hudson S.M. Preparation of a fiber-reactive chitosan derivative with enhanced antimicrobial activity / In: Advan.Chitin Sci. / Ed. M.G. Peter, A. Domard, R.A.A. Muzzarelli. Potsdam, Germany, 2000.-V 4.-P 454-459.

109. Твердохлебова И.И. Конформация макромолекул (визкозиметрический метод оценки). -М.: Химия, 1981.- 281с.

110. Wang W., Во S., Li S., Qin W. Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degree of deacetylation // Int. J. Biol. Macromol.-1991 .-V. 13 .-N.5 .-P.281-285.

111. Spektor T. //Anal. Biohem.-1978.-V.86.-P. 141 -146.

112. Westall F., Hesser H. Fifteen-minute acid hydrolysis of peptides //Anal Biochem.- 1974.- V.61.-N.2.- P.610-613.

113. Miller G.L. //Anal.Biochem.-1957.-V.31.-N.3.-P.426-428.

114. Климова В. А. Основные микрометоды анализа органических соединений.-М.: Химия, 1967.-207с.

115. Лях С.П., Рубан E.JL Микробные меланины.-М.: Наука, 1972.-185с.

116. Уэндландт У. Термические методы анализа / пер. с англ. Под ред. Степанова В.А., Берштейна В.А. .-М.: Мир, 1978. 526с.

117. ГОСТ. Р 50457-92. Жиры и масла животные и растительные. Определение кислотного числа и кислотности.

118. ГОСТ 17362-71 Изделия косметические. Метод определения числа омыления.

119. ГОСТ Р 51487-99. Изделия косметические. Метод определения перекисного числа.

120. Ионная имплантация полимеров / Под. ред. В.Б. Оджаева, И.П. Козлова, В.Н. Попок, Д.В. Свиридова. Минск: Изд-во БГУ, 1998. - 197 с.

121. Курченко В.П., Гавриленко Н.В., Исмаил И., Пикулев А.Т. Кинетика окисления бензидина и его производных с участием различных гемопротеинов // Вестник БГУ. 1991. - № 2. - С. 28-31.

122. O'Brien P. Multiple mechanisms of metabolic activation of arilamone cancerogens // Free Radicals in Biology / Ed. W. Pry or. 1984. -Vol. 6.-314 p.

123. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981.-260 с.

124. Кукулянская Т.А., Курченко Н.В., Курченко В.П., Бабицкая В.Г. Физико-химические свойства меланинов, образуемых чагой в природных условиях и при культивировании // Прикладная биохимия и микробиолоия. -2002.- Т.38.- №1.-С. 68-72.

125. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Свойства и применение белковых гидролизатов // Прикладная биохимия и микробиология.-2000.-Т.36.-№5-С. 525-534.

126. Лях С.П. Микробный меланиногенез и его функции. М.: Наука. 1981. 274с.

127. Slokar Y.M., Majcen Le Marechal A. Methods of decoloration of textile wastewaters // Dyes and Pigments.-1998.- V.37.-N.4.- P. 335-356.

128. Brooks R.E., Moore S.B. Alkaline hydrogen peroxide bleaching of cellulose // Cellulose.-2000.-V.7. N.3. -P. 263-286.

129. Bartkowiak A. Binary polyelectrolyte microcapsules based on natural polysaccharides. Dissertation. Szczecin. 2001. P. 102.

130. Vachoud L., Zydowicz N., Domard A. Physicochemical behaviour of chitin gels // Carbohydrate Research.-2000.-V.326. N.4.- P.295-304.

131. Yang B.Y., Montgomery R. Degree of acetylation of heteropolysaccharides // Carbohydrate Research.-2000.-V.323.- N.l-4. -P. 156-162.

132. Стояченко И.А., Варламов В.П. Очистка и некоторые свойства хитиназ из Streptomyces kurssanovii II Биотехнология.-1993.- №2.- С. 29-36.

133. Azarkan М., Moussaoui A., Wuytswinkel D., Dehon G., Looze Y. Fractionation and purification of the enzymes stored in the latex of Carica papaya И Journal of Chromatography B. 2003 . V.790.-N.1/2.-P. 229-238:

134. Rubin B.R., Talent J.M., Kongtawelert P., Pertusi R.M., Forman M.D., Gracy R.W. Oral polymeric N-acetyl-D-glucosamine and osteoarthritis // J. Am. Osteopath. Assoc. -2001. V. 101. N.6. - P; 339-344.

135. Новиков Д.А., Курченко В.П., Азарко И.И. Фотопротекторные свойства меланинов из винограда (Vitis vinifera) и черного чая (Thea sinensis) // Радиационная биология. Радиоэкология.-2001.-Т.41.-№6. С. 664-670.

136. Бабицкая В.Г., Щерба В.В. Природа меланиновых пигментов некоторых микро- и макромицетов // Прикладная биохимия и микробиология. -2002.-Т.38.-№.3. С. 286-291.

137. Жеребин ЮЛ., Сава В.М., Богатский A.B. Исследование природы парамагнетизма эномеланинов. 1. Индуцированный анаон-радикал семихинона// Журн. общ. химии. 1983. - Т.53. - № 1. - С. 164-172.

138. Жеребин lO.JL, Сава BJVL, Богатский A.B. Исследование природы парамагнетизма эномеланинов. II. Феноксильный радикал // Журн. общ. химии. 1983. - Т. 53; - №2. - С. 272-276.

139. Жеребин ЮЛ., Сава В.М., Богатский A.B. Исследование природы парамагнетизма эномеланинов. III. Донорно-акцепторные взаимодействия // Журн. общ. химии. 1984. - Т. 54. - № 6. - С. 1340-1348.

140. Грасси Н., Скотт Дж. Деструкция и стабилизация полимеров.-М.: Мир, 1988.- 246 с.

141. Новиков Д.А. Биохимические свойства меланинов из винограда (Vitis vinifera) и черного чая (Thea sinensis).: Автореф. .дис.кан.биол.наук.-Минск, 2002.-21с.

142. Урьяш В.Ф. Термодинамика хитина и хитозана приведено в "Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение" / Под.ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М: Наука, 2002.-С. 119-129.

143. Щерба В.В., Бабицкая В.Г., Курченко В.П:, Иконникова Н.В., Кукулянская Т.А. Антиокислительные свойства меланиновых пигментов грибного происхождения // Прикладная биохимия и микробиология.-2000.-Т.36.-Ж5.- С. 569-574.

144. Александрова В.А., Обухова Г.В., Домнина Н.С., Кондакова Н.В., Топчиев Д. А. Конъюгаты хитозана с некоторыми природнымиантиоксидантами // Мат. 7-ой конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".М.: ВНИРО,- С. 218-220.

145. Курченко В.П., Сенчук В.В. Современные подходы для экспресс-анализа генотоксичности ксенобиотиков // Мат. Международной научной конф. "Ксенобиотики и живые системы". Минск, 2000 - С. 273-276.

146. Курченко В.П., Новиков Д.А., Желдакова Р.А. Антимутагенные свойства эномеланина // Мат. V Международного съезда "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения" СПб., 2001г. - С.74-78.

147. Naml K-S., Choi Y-R., Shonl Y-H. Evaluation of the antimutagenic potential of chitosan oligosaccharide: Rec, Ames and Umu tests // Biotechnology Letters.-2001.-V.23.-N.12.- P. 971-975.

148. Yevdokimov Yu. M., Salyanov V.I. Liquid crystalline dispersions of complexes formed by chitosan with double-stranded nucleic acids // Liquid crystals.-2003.- V.30.-N.9.-P. 1057-1074.

149. Je J-Y., Park P-J., Kim S-K. Radical scavenging activity of hetero-chitooligosaccharides // Eur. Food Res. Technol.-2004.-V.219.- N.I.- P.60-65.

150. Xie W., Xu P., Liu Q. Antioxidant activity of water-soluble chitosan derivatives // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. -2001.-V.11.-N.13.-P. 1699-1701.

151. Schulz P.C., Rodriguez M.S., Del Blanco L.F., Pistonesi M., Agullo' E. Emulsification properties of chitosan // Colloid and Polymer Science.- 1998,-V.276. N.12.- P. 1159-1165.