Различия в морфологии и функциональной активности дермальных фибробластов в зависимости от их происхождения и условий культивирования тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат биологических наук Юдинцева, Наталия Михайловна

• Юдинцева, Наталия Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Юдинцева, Наталия Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Строение кожи человека.

2.2. Основные компоненты внеклеточного матрикса дермы.

2.3. Внеклеточный матрикс рубцовой соединительной ткани.

2.4. Функции фибробластов в процессе заживления раны.

2.5. Особенности дермальных фибробластов различного происхождения.

Цель и задачи исследования.

Положения, выносимые на защиту.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Выделение и культивирование фибробластов.

3.2. Трехмерное культивирование фибробластов.

3.3.Иммунофлуоресцентный анализ организации цитоскелета.

3.4.Иммунофлуоресцентный анализ белков ВКМ, синтезируемых фибробластами.

3.5. Получение белков ВКМ, синтезируемых фибробластами в двухмерных условиях культивирования.

3.6. 808-электрофорез и иммуноблотинг.

3.7. Выявление активности матриксных металлопротеиназ методом зимографии.

3.8. Гистологический анализ биоптатов кожи в процессе заживления ран.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Взаимодействие дермальных фибробластов различного происхождения с иммобилизованными белками ВКМ.

4.2. Морфология фибробластов различного происхождения в гелях. Синтез белков ВКМ в условиях двухмерного и трехмерного культивирования.

4.3.Электрофоретический анализ состава белков ВКМ, синтезируемых фибробластами различного происхождения в условиях двухмерного и трехмерного культивирования. Иммуноблотинг.

4.4. Выявление активности матриксных металлопротеиназ у фибробластов различного происхождения в условиях двухмерного и трехмерного культивтрования.

4.5. Гистологическое исследование биоптатов новообразованной дермы после внесения в рану фибринового и коллагенового гелей с нормальными фибробластами.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Различия в морфологии и функциональной активности дермальных фибробластов в зависимости от их происхождения и условий культивирования»

В настоящее время одной из актуальных проблем современной регенеративной медицины является разработка клеточных технологий, используемых для1 восстановления структурной и функциональной целостности поврежденных органов и тканей. Применение традиционных методов^ лечения, не всегда приводит к заживлению или полному восстановлению исходной структуры ткани. Заживление обширных и глубоких повреждений дермы заканчивается образованием рубца, который нарушает структуру и функции ткани. Исключение составляет заживление повреждений' эмбриональной ткани, при котором не образуются рубцы (Dang et al., 2003; Mackool1 et'al., 1998; Matthew et al., 2003). Причина образования рубцов, до ¡настоящего времени не выяснена.

Основными клетками, создающими структурную основу для формирования кожи в процессе морфогенеза и при регенерации после повреждения, являются-фибробласты. Интенсивно синтезируя белки' внеклеточного матрикса (ВКМ), ростовые факторы и матриксные метгалопротеиназы (ММП), они восстанавливают поврежденную дерму, на которой затем формируется эпидермис. Однако до настоящего времени точно неизвестно, какие именно фибробласты участвуют в процессе заживления раны, и каковы их свойства. Имеются данные, что фибробласты, находящиеся в ране, могут происходить из мононуклеаров крови, которые превращаются в месте повреждения в, так называемые, фиброциты (Abe et al., 2001; Bucala et al., 1994; Chesney et al., 1998). Кроме того, фибробласты из окружающей рану кожи также могут принимать участие в заживлении раны. При этом неизвестно, какие фибробласты остаются > в сформированном рубце после заживления ткани.

В настоящее время в ряде клиник для заживления повреждений кожи применяются клеточные продукты, разработанные также и в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН. Один из них - дермальный эквивалент (ДЭ), который представляет собой коллагеновый гель с внесенными в него дермальными фибробластами. Следует учитывать, что, несмотря на положительное воздействие ДЭ на заживление ран, коллаген может оказывать влияние на состав синтезируемых клетками белков ВКМ (Clark et al., 1995; Grinnell, 1994) и снижать скорость их продуцирования (МаисЬ а1., 1988; ТЫе е1 а1., 1991). При культивировании фибробластов в дермальном эквиваленте, приготовленном на основе фибрина, синтез клетками белков ВКМ может отличаться от условий культивирования их,в коллагеновом геле. В связи с тем, что на ранней стадии раневого заживления в организме образуется фибриновый сгусток, который активно перерабатывают и реорганизуют фибробласты, представляет интерес изучение функциональной активности клеток, культивируемых в фибриновом геле.

Так как основными клетками, участвующими в формировании рубца являются фибробласты, то для понимания процесса организации ткани необходимо изучить морфологию фибробластов различного происхождения и синтез ими белков ВКМ в условиях двухмерного (монослой) и трехмерного (фибриновый или коллагеновый гель) культивирования: В настоящее время нет данных, характеризующих полный состав и организацию белков ВКМ, синтезируемых дермальными- фибробластами. Для того чтобы приблизиться к пониманию процесса образования рубцов, необходимо, прежде всего, установить, различаются ли фибробласты, выделенные из нормальной, рубцовой и эмбриональной кожи, между собой по свойствам и по способности формировать микроокружение.

Данное исследование посвящено выявлению особенностей морфологии и функциональной активности дермальных фибробластов разного происхождения, в частности, синтеза ими белков ВКМ и матриксных металлопротеиназ в условиях двухмерного и трехмерного культивирования. Возможно, что полученные знания позволят оптимизировать технологии создания клеточных продуктов, предназначенных для лечения кожных ран различной этиологии.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Клеточная биология, цитология, гистология», Юдинцева, Наталия Михайловна

6. выводы

1. Фибробласты, выделенные из нормальной, рубцовой и эмбриональной кожи человека, различаются по характеру организации актинового цитоскелета и степени взаимодействия с одними и теми же иммобилизованными белками внеклеточного матрикса.

2. Дермальные фибробласты разного происхождения различаются по количеству и соотношению синтезируемых мажорных белков ВКМ при всех условиях культивирования.

3. Выявляемые белки ВКМ представлены фрагментами полипептидных цепей, что может быть связано с различной степенью активности матриксных металл опротеиназ.

4. Условия культивирования и микроокружение специфически влияют на активность матриксных металл опротеиназ, синтезируемых фибробластами разного происхождения.

5. Наибольшую функциональную активность дермальные фибробласты, независимо от их происхождения, проявляют при культивировании их в фибриновом геле.

6. Трансплантация в экспериментальные раны крыс нормальных фибробластов в фибриновом геле способствует нормальному заживлению раны, о чем свидетельствуют отсутствие воспалительной реакции, интенсивный рост кровеносных капилляров и продуцирование клетками коллагена как структурной основы восстанавливаемой соединительной ткани.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Юдинцева, Наталия Михайловна, 2010 год

1. Автандилов Г.Г. 1998. Основы патологоанатомической практики. Руководство М.: РМАПО. 505 с.

2. Албертс Б., Брей Д., Льюис Д., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Д. 1994. Молекулярная биология клетки / под ред. Г.П:Георгиева и Ю.С.Ченцова. М. Мир. 2: 539с.

3. Арэ А.Ф. 2000. Взаимодействие поверхностных рецепторов клетки с различными иммобилизованными и свободными лигандами определяет структура актинового цитоскелета. Диссертация. СПб.

4. Калмыкова Н.В., Черепанова O.A., Горелик Ю.В., Воронкина И.В., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 2002. Различное влияние ламинина-1 и ламинина-2/4 на адгезию и миграцию культивируемых кератиноцитов человека. Цитология. 44(8): 792-797.

5. Калмыкова Н.В., Черепанова O.A., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 2003. Стабилизирующая роль интегрина a6ß4 в процессе миграции эпидермальных клеток на ламинине-2/4. Трансплантология, Киев. 4(1): 30-32.

6. Туроверова Л.В., Хотин М.Г., Юдинцева Н.М., К.-Э. Магнуссон, Блинова М.И., Пинаев Г.П., Тентлер Д.Г. 2009. Метод анализа белков внеклеточного матрикса, синтезируемого клетками в культуре. Цитология. 51 (8): 691-696.

7. Хэм А., Кормак Д. 1983. Гистология. Перевод с англ. под ред. Афанасьева Ю.И., Ченцова Ю.С. М. Мир. 4: 244.

8. Черепанова O.A., Калмыкова Н.В., Воронкина И.В., Аре А.Ф., Горелик Ю.В., Пинаев Г.П. 2002. Различия в характере взаимодействия нормальных итрансформированных кератиноцитов человека с изоформами ламинина. Цитология. 44 (2): 151-158.

9. Abe R., Donnelly S.C., Peng Т., Bucala R., Metz C.N. 200J. Peripheral blood fibrocytes: differentiation pathway and migrationto wound sites. J. Immunol. 166: 75567562.

10. Abraham D.J., Eckes В., Rajkumar V., Krieg T. 2007. New developments in fibroblast and myofibroblast biology: Implications for fibrosis and scleroderma. Current Rheumatology Reports. 9(2): 136-143.

11. Agren M.S. 1994. Gelatinase activity during wound healing. Br. J. Dermatol. 131: 634-640.

12. Agren M.S. 1999. MMP are required for re-epithelisation of cutaneous wounds. Arch. Derm. Res. 291: 583-590.

13. Agrez M., Chen A., Cone R.I., Pytela R., Sheppard D. 1994. The alpha-v beta 6 integrin promotes proliferation of colon carcinoma cells through a unique region of the beta 6 cytoplasmic domain. J. Cell Biol. 127: 547-556.

14. Are A., Pinaev G., Lindberg U. 1995. The rapid actin cytoskeleton reorganization induced by EGF is different for A431 cells spread on various substrates . Abstr. of 10 European Cytoskeletal Forum, Stockholm, Sweden. 15.

15. Aumailley M., Ronsselle P. 1999. Laminins of the dermo-epidermal junction. Matrix Biol. 18: 19-28.

16. Aumailley M., A. Khal El., Knoss N., Tunggal L. 2003. Laminin 5 processing and its integration into the ECM. Matrix Biol. 22: 49-54.

17. Azzarone В., Macieira-Coelho A. 1982. Heterogeneity of the kinetics of proliferation within human skin fibroblastic cell populations. J. Cell Sci. 57: 177-187.

18. Babu M., Diegelmann Rl, Oliver N. 1989. Fibronectin is overproduced by keloid fibroblasts during abnormal wound healing. Mol. Cell Biol. 9: 1642-1650.

19. Beck K., Hunter I., Engel J. 1990. Structure and functions of laminin: anatomy of a multidomains glycoprotein' FASEB J. 4: 148-160.

20. Bell E., Ivarsson В., Merill C. 1979. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 1274-1278.

21. Betz P., Nerlich A., Wilske J., Tubel J., Penning R., Eisenmenger W. 1993. Immunohistochemical localization of collagen types I and VI in human skin wounds. Int. J. Leg. Med: 106(1): 31-34.

22. Birk D.E., Zycband E.I., Winkleman D.A. 1990. Collgen fibrillogenesis in situ. Acad Sci. NY. 580: 176-194.

23. Blitstein-Willinger E. 1991. The role of growth factors in wound healing. Skin Pharmacol. 4: 175-182.

24. Bressler R.S., Bressler C.H. 1989. Functional anatomy of the skin. Clin Podiatr. Med. Surg. 6: 229-246.

25. Bucala R., Spiegel L.A., Chesney J., Hogan M., Cerami A. 1994. Circulating fibrocytes define a new leukocyte subpopulation that mediates tissue repair. Mol. Med. 1:71-81.

26. Chandrakasan G., Torchia D.A., Piez K.A. 1967. Preparation of intact monomeric collagen from rat tail tendon and skin and the structure of the nonhelical ends in solution. J. Biol. Chem. 251: 6062-6067.

27. Chang H.Y., Chi J.T., Dudoit S., Bondre C., van de Rijn M., Botstein D:, Brown P.O. 2002. Diversity, topographic differentiation, and positional' memory in human fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99(20): 12877-82.

28. Chanoki M., Ishii M., Fukai K., Kobayashi H., Hamada T., Muragaki Y., Ooshima A. 1988. Immunohistochemical localization of type V collagen in normal human skin. Arch. Dermatol. Res. 280(3): 145-151.

29. Chesney J., Metz C., Stavitsky A.B., Backer M., Bucala R. 1998. Regulated production of type I collagen and inflammatory cytokines by peripheral blood fibrocytes. J. Immunol. 160: 419-425.

30. Clark R.A.F. 1996. The molecular and cellular biology of wound repair. British J. Plastic. Surgery. 49: 502-522.

31. Clark R.A.F., Lanigan J.M., DellaPelle P., Manseau E., Dvorak H.F., Colvin R.B. 1981. Fibronectin and fibrin provide a provisional matrix for epidermal cell migration during wound repair. J. Invest. Dermatol. 79: 264-269.

32. Clark R.A.F., Nielsen L.D., Welch M.P., McPherson J.M. 1995. Collagen matrices attenuate the collagen-synthetic response of cultured fibroblasts to TGF-beta. J. Cell Sci. 108(3): 1251-61.

33. Couchman J.R., Hook M., Rees D.A., Timpl R. 1983. Adhesion, growth and matrix production by fibroblasts on laminin substrates. Cell Biol. 96: 177-183.

34. Dale P.D., Sherratt J.A., Maini P.K. 1996. The role of fibroblast migration in collagen fibre formation during foetal and adalt dermal wound healing. Proc. R. Soc. London. 263:653-660.

35. Damsky C., Sutherland A., Fisher S. 1993. Extracellular matrix. 5: adhesive interaction in early mammalian embryogenesis, implantation, and placentation. FABES. 7: 1320-1329.

36. Dang C., Ting K., Soo C., Longaker M. T., Lorenz H.P. 2003. Fetal wound healing current perspectives. Clin. Plast .Surg. 30(1): 13-23.

37. Diegelmann R.F., Evans M.C. 2004. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing. Frontiers in Bioscience. 9: 283-289.

38. Doolittle R.F. 1984. Fibrinogen and fibrin. Annu. Rev. Biochem. 53: 195-229:

39. Ehri K., Leivo I., Argraves W. S., Ruoslahti E., Engvall E. 1990. Merosin, a tissue-specific basement membrane protein, is a laminin-like protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 3264-3268.

40. Elices M.J., Urry L.A., Hemler M.E. 1991. Receptor functions for the integrin VLA-3: fibronectin, collagen, and laminin binding are differentially influenced by arg-gly-asp peptide and by divalent cations. J. Cell Biol. 112: 169-181.

41. Elsdale T., Bard J. 1972. Collagen substrata for studies on cell behavior. J. Cell Biol. 54(3): 626-637.

42. Fleischmajer R., PerlishJ.S., Duncan M. 1983. Scleroderma. A modeltfor fibrosis. Arch. Dermatol. 119: 957-962.

43. Folbnan J., Klagsbrun M. 1987. Angiogenic factors. Science. 235(4787): 442447.

44. Friedman D. W., Boyd C.D., Mackenzie J. W. 1993. Regulation of collagen gene expression in keloids and hypertrophic scars. J. Surg. Res. 55: 214-22.

45. Gailit J., Clark R. A. F. 1996. Studies in vitro on the role of av and plintegrins in the adhesion of human dermal fibroblasts to provisional matrix proteins fibronectin, vitronectin, and fibrinogen. J. Invest. Dermatol. 106: 102-108.

46. Gailit J., Clarke C., Newman D., Tonnesen M.G., Mosesson M.W., Clark R.A.F. 1997. Human fibroblasts bind directly to fibrinogen at RGD sites through integrin aVa3. Exp. Cell Res. 232: 118-126.

47. Gailit J., Pierschbacher M. and Clark R. A. F. 1993. Expression of functional a4pl by human dermal fibroblasts. J. Invest. Dermatol. 100: 323-328.

48. Garner W.L., Karmiol S., Rodriguez J.L., Smith DJ. Jr, Phan S.H. 1993. Phenotypic differences in cytokine responsiveness of hypertrophic scar versus normal dermal fibroblasts. J. Invest. Dermatol. 101(6): 875-879.

49. Gioia M., Monaco S., Van Den Steen P.E., Sbardella D., Grasso G., Marini S., Overall C.M., Opdenakker G., Coletta M. 2009. The Collagen binding domain of gelatinase a modulates degradation of collagen IV by gelatinase B. J. Mol. Biol. 386(2): 419-434.

50. Gorelik J. V., Cherepanova O.A., Voronkina I. V., Diakonov L.A., Blinova M.I., Pinaev G.P. 2001. Laminin-2/4 from human placenta is a better adhesion agent for primary keratinocytes than laminin-1 from EHS sarcoma. Cell Bioli Intern. 25: 395-402.

51. Graf J., Iwamoto Y., Sasaki M., Martin G.R., Kleinman H.K., Robey F.A., Yamada Y. 1987. Identification of an amino acid sequence in laminin mediating cell attachment, chemotaxis, and receptor binding. Cell. 48: 989-996.

52. Grassl E.D., Oegema T.R., Tranquillo R.T. 2002. Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for fabrication of a media equivalent. J. Biomed. Mater. Res. 60: 607-612.

53. Greiling D., Clark R.A.F. 1997. Fibronectin provides a conduit for fibroblast transmigration from a collagen gel into a fibrin gel. J. Cell Sci. 110: 861-870.

54. Grinnell F. 1978. Cellular adhesiveness and extracellular, substrata. Int. Rev. Cytol. 53: 65-144.

55. Grinnell F. 1994. Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction. J. Cell Biol. 124:401-404.

56. Grinnell F. Ho C., Tamariz E., Lee D.J., Skuta G. 2003. Denritic fibroblasts in three-dimentional collagen matrix. Mol. Biol. Cell. 14: 384-395.

57. Grunert M., Dombrowski C., Sadasivam M., Manton K., Cool S. M., Nurcombe V. 2007. Isolation of a native osteoblast matrix with aspecific affinity for BMP2. J. Mol. Histol. 38: 393-404.

58. Gunsilius E., Petzer A.L., Stockhammer G., Christian M.K., Gastl G. 2001. Serial measurement of vascular endothelial growth factor and transforming growth factor-B 1 in serum of patients with acute ischemic. Stroke. 32: 275-278.

59. Halfter W., Schurer B., Yip J., Yip L., Tsen G., Lee J.A., Cole G.J. 1997. Distribution and substrate properties of agrin, a heparan sulfate proteoglycan' of developing axonal pathways. J. Comp. Neurol. 383: 1-17.

60. Harper R.A., Grove G. 1979. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular, dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204: 526-527.

61. Hedman K., Kurkinen M., Alitalo K., Vaheri A., Johansson S., Hook M. 1979. Isolation of the pericellular matrix of human fibroblast cultures. J. Cell Biol. 81: 83-91.

62. Huo Y., Ley K. 2004. Role of platelets in atherosclerosis (review). Trends in Cardiovascular Medicine. 14: 18-22.

63. Hynes R.O., Yamada KM. 1982. Fibronectins: Multifunctional modular glycoproteins. J. Cell Biol. 95: 369-377.

64. Jesior J.C., Miller A., Berthet-Colominas C. 1980. Crystalline three-dimensional packing is general characteristic of type I collagen fibrils. FEBS. Lett. 113(2): 238-40.

65. Kaizuka M, Yamabe H., Osawa H., Okumura K. Fujimoto N. 1999. Thrombin stimulates synthesis of type IV collagen and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 by cultured human mesangial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 10: 1516-1523.

66. Kirsner R.S, Eaglstein W.H. 1993. The wound healing process. Dermatol. Clinics. 11(4): 629-640.

67. Kleinman H.K. 1994. Isolation of laminin-1 and type IV collagen from the EHS sarcoma. J.Tissue Culture Metods. 16: 231-233.

68. Knapp T.R., Daniels J.R., Kaplan E.N. 1977. Patologic scar formation. Morphologic and biochemical correlated. Am. J. Pathology. 86(1): 47-63.

69. Krane S.M. 1995. Is collagenase (matrix metalloproteinase-1) necessary for bone and other connective tissue remodeling? Clin. Orthop. Relat. Res. 313: 47-53.

70. Krotzsch-Gomez F.E., Furuzawa-Carballeda J., Reyes-Marques R., Quiroz-Hernandez E., Dias de Lion L. 1998. Cytokine expression is downregulated by collagen-polyvinylpyrrolidone in hypertrophic scars. J. Invest. Dermatol. 111(5): 828-836.

71. Kuhn K., Eble J. 1994. .The structural bases of integrin-ligand interactions. Trends in Cell Biology. 4: 256-261.

72. Mackay A.R., Hartzler J.L., Pelina M.D., Thorgeirsson U.P. 1990. The amino-terminal 29- and 72 kDa tumor cell gelatinases to degrade type IV collagen. J. Biol. Chem. 265:21929-34.

73. Mackool R.J., Gittes G.K., Longaker M.T. 1998. Scarless healing. The fetal wound. Clin. Plast. Surg. 25(3): 357-365.

74. Marchant J.K., Zhang G., Birk D.E. 2002. Association of type XII collagen with regions of increased stability and keratocyte density in the cornea. Exp. Eye. Res. 75(6): 683-694.

75. Martin P. 1996. Mechanisms of Wound healing in the embryo and fetus. Current Topics in Developmental Biol. 32: 175-203.

76. Matthew M., Kita H.M., Anthony A., Lonergan M.D., Koch R. 2003. Autocrine growth factor production by fetal, keloid, and normal dermal fibroblasts. Arch. Facial. Plast. Surg. 5: 26-30.

77. Mauch C., Hatamochi A., Scharffetter K., Krieg T. 1988. Regulation of collagen synthesis within a three-dimensional collagen gel. Exp. Cell Res. 493-503.

78. McKeown S.T., Barnes J.J., Hyland P.L., Lundy F.T., Fray M.J., Irwin C.R. 2007. Matrix metalloproteinase-3 differences in oral and» skin fibroblasts. J. Dent. Res. 86(5): 457-62.

79. McNicol A., Israels S.J. 2003. Platelets and anti-platelet therapy. J. Pharmacol. Sci. 93(4): 381-96.

80. Mercandetti M., Cohen A.J. 2005. Wound Healing: Healing and Repair. Emedicine.com.

81. Monical P.L., Kefalides N.A. 1994. Coculture modulates laminin synthesis and mRNA levels in epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts. Exp. Cell Res. 210(2): 154-159.

82. Nagase H., Woessner J.F. 1999. Matrix Metalloproteinases. J. Biol. Chem. 274: 21491-21494.

83. Neidert M.R., Lee E.S., Oegema T.R., Tranquillo R.T. 2002. Enhanced fibrin remodeling in vitro with TGF-P 1, insulin and plasmin for improved tissue-equivalents. Biomaterials. 23(17): 3717-3731.

84. Niesler C. U., Ferguson M. W.J. 2001. TGF-beta superfamily cytokines in wound healing" in TGF-beta and related cytokines in inflammation (Breit S.N., Wahl S.M., ed., Birkhauser), Basel. 173-198.

85. Nishida T., Yasumoto, K., Otori T., Desaki J. 1988. The network structure of corneal fibroblasts in the rat as revealed by scanning electron microscopy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29: 1887-1890.

86. Nishizawa Y., Fukai F., Natori Y., Kato R., Tanuma S., Katayama T. 1998. Mesangial cell apoptosis induced by a fibronectin fragment. Apoptosis. 3: 407-412.

87. Nnsgens B., Merrill C., Lapiere C., Bell E. 1984. Collagen biosynthesis by cells in a tissue equivalent matrix in vitro. Coll. Relat. Res. 4: 351-363.

88. Odermatt B.F., Lang A.B., Ruttner JR., Winterhalter K.H., Trueb B. 1984. Monoclonal antibodies to human type IV collagen: useful reagents to demonstrate the heterotrimeric nature of the molecule. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7343-7347.

89. Oliver N., Babu M., Diegelmann R. 1992. Fibronectin gene transcription is enhanced in abnormal wound healing. J. Invest. Dermatol. 99: 579-86.

90. O'Toole E. A., Marinkovich M.P., Peavey C.L., Amieva M.R., Furthmayr H., Mustoe T.A. and Woodley D.T. 1997. Hypoxia increases human keratinocyte motility on connective tissue. J. Clin. Invest. 100(11): 2881-2891.

91. O'Toole E.A. 2001. Extracellular matrix and keratinocyte migration. Clin. Exp. Dermatol. 26(6): 525-30.

92. Parks W.C. 1999. Matrix metalloproteinases in repair. Wound Rep. Reg 7: 423432.

93. Pepper M. 2001. Role of the matrix metalloproteinase and plasminogen activatorplasmin systems in angiogenesis. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 21: 1104-1117.

94. PfaffM., Gohring W., Brown J.C., Timpl R. 1994. Binding of purified collagenreceptors (aipi, a2pi) and rgd-dependent integrins to laminins and laminin fragments.

95. Eur. J. Biochem. 225(3): 975-984.

96. Pinnell S.R. 1982. Regulation of collagen synthesis. J. Invest. Dermatol. 79(1): 7376.

97. Postlethwaite A.E, Shigemitsu H., Kanangat S. 2004. Cellular origins of fibroblasts: possible implications for organ fibrosis in systemic sclerosis. Current Opinion in Rheumatol. 16: 733-738.

98. Pulm S.L., Furcht L.T. 1983. Production of laminin and fibronectin by Schwannoma cells: cell- protein interactions in vitro and protein localization in peripheral nerve in vivo. J. Cell. Biol. 96: 1218-1226.

99. Rappolee D.A., MarkD., Bansa M.J., Werb Z. 1988. Wound macrophages express TGF-a and other growth factors in vivo: analysis by mRNA phenotyping. Science. 241: 708-712.

100. Rawlins J.M., Lam W.L., Karoo R.O., Naylor I.L., Sharpe D.T. 2006. Quantifying collagen type in mature burn scars: a novel approach using histology and digital image analysis. J. Burn Care Res. 27(1): 60-65.

101. Rinn J.L., Bondre C., Gladstone H.B., Brown P.O., Chang H.Y. 2006. Anatomic demarcation by positional variation in fibroblast gene expression programs. PLoS Genetics. 2(7): 1084-1096.

102. Ross R., Raines E.W., Bowen-Pope D.F. 1986. The biology of platelet-derived growth factor. Cell. 46: 155-169.

103. Ruoslanti E., Hayman E.G., Pirschbacher M., Engvall E. 1982. Fibronectin: purification, immunochemical properties and biological activities. Methods in Enzimol. 82: 803-830.

104. Russell S.B., Trupin K.M., Rodriguez-Eaton S., Russell J.D., Trupin J.S. 1988. Reduced growth-factor requirement of keloid-derived fibroblasts may account for tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.: 85(2): 587-591.

105. Ryan J. W., Dorer F.E., Stewart J.M. 1974. Hydrolysis of Bradykinin and its higher homologues by angiotensin-converting enzyme. Biochem. J. 141: 915-17.

106. Ryan M.C., Tizard R., VanDevanter D.R., Carter W.G. 1994. Cloning of the LamA3 gene encoding the a3 chain of the adhesive ligand epiligrin. Expression in wound repair. J. Biol. Chem. 269: 22779-22787.

107. Savage K., Swann D.A. 1985. A comparison of glycosaminoglycan synthesis by human fibroblasts from normal skin, normal scar, and hypertrophic scar. J. Invest. Dermatol. 84: 521-526.

108. Schafer I.A., Pandy M., Ferguson R. 1985. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mech. Ageing Dev. 31: 275-293.

109. Scott P.G. Dodd C.M., Tredget E.E. 1996. Chemical characterization and quantification of proteoglycans in human post-burn hypertrophic and mature scars. Clin. Sci. 90: 417-425.

110. Scott P.G., Ghahary A., Wang J.F. 2007. Molecular and Cellular Hypertrophic Scarring. Saunders Elsevier Inc., Philadelphia. 596-607.

111. Sechler J.L., Takada Y., Schwarzbauer J.E. 1996. Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats. J. Cell Biol. 134: 2573-583.

112. Senior R.M., Griffin G.L., Huang J.S., Walz D.A., Deuel T. 1983. Chemotactic activity of platelet a-granule proteins for fibroblasts. J. Cell Biol. 96: 382-385.

113. Seppa H., Grotendorst G., Seppa S., Schiffmann E. and Martin G.R. Platelet-derived growth factor in chemotactic for fibroblasts. J. Cell Biol. 92: 2584-588.

114. Sewry C.A., Dalessandro M., Wilson L.A., Sorokin L.M., Naom I., Bruno S. 1996. Expression of laminin chains in skin in merosin deficient congenital muscular dystrophy. Neuropediatrics. 28: 217- 222.

115. Shapiro S.D. 1998. Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix: biological consequences. Curr. Opin. Cell Biol. 10: 602-608.

116. Shimokado K., Raines E.W., Madtes D.K., Barrett T.B., Benditt E.P., Ross R. 1985. A significant part of macrophage-derived growth factor consists of two forms of PGDF. Cell1. 43: 277-286.

117. Soder S., Posch E. 2004.The NCI domain of human collagen IV is necessary to initiate triple helix formation. Bioch. Bioph. Res. Communic. 325(1): 276-280.

118. Siler U., Seiffert M., Puch S., Richards A., Torok-Storb B., Muller C.A., Sorokin L., Klein G. 2000. Characterization and functional analysis of laminin isoforms in human bone marrow. Blood. 96: 4194-203.

119. Smith L T., Holbrook K A., MadriJ.A. 1986. Collagen types I, III, and V in human embryonic and fetal skin. Am. J. Anat. 175(4): 507-21.

120. Smith J.W., Ruggeri Z.M., Kunicki T.J., Cheresh D.A. 1990. Interaction of integrins avp3 and glycoprotein Ilb-IIIa with fibrinogen: differential peptide recognition accounts for distinct binding sites. J. Biol. Chem. 265: 12267-12271.

121. Smola H., Stark H.J., Thiekotter G., Mirancea N., Krieg T., Fusenig N.E. 1998. Dynamics of basement membrane formation by keratinocyte-fibroblast interactions in organotypic skin culture. Exp. Cell Res. 239: 399-410.

122. Sorrell J.M., Caplan A.I. 2004. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. J. Cell Science. 117: 667-675.

123. Stricklin G.P., Nanney L.B. 1994. Immunolocalization of collagenase and TIMP in healing human burn wounds. J. Invest. Dermatol. 103(4): 488-492.

124. Stupack D. G. 2005. Integrins as a distinct subtype of dependence receptors. Cell Death Differ. 12: 1021-1030.

125. StupackD.G., Cheresh D.A. 2002. Get a ligand, get a life: integrins, signaling and, cell survival. J. Cell Sci. 115: 3729-3738.

126. Tani T., Lehto V.-P., Virtanen I. 1999. Expression of laminins 1 and 10 in carcinoma cells, and comparison of their role in cell adhesion. Exp. Cell Res. 248: 11'5-121.

127. Thie M., Schlumberger W., Semich R., Rautrerberg J., Robenek H. 1991. Aortic smooth muscle cells in collagen lattice culture: effects on ultrasructure, proliferation and collagen synthesis. Eur. J. Cell Biol. 55:295-304.

128. Timpl R., Tisi D., Talts J.F., Andac Z., Sasaki T., Hohenester E. 2000. Structure and function of laminin LG modules. Matrix Biol. 19: 309-317.

129. Timpl R., Wiedemann H., Van Delden V., Furthmayr H., Kiihn K. 1981. A network model for, the organization of Type IV collagen molecules in basement membrane. Eur. J. Biochem. 120:203-211.

130. Tonnesen M.G., Feng X., Clark R.A. 2000. Angiogenesis in wound healing. .T. Invest. Dermatol. Symp. Proc. 5(1): 40-6.

131. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins-from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.76: 4350-4.

132. Tuan T.L., Song A., Chang S., Younai S., Nimni M.E. 1996. In vitro fibroplasia: matrix contraction, gel growth, and collagen production of fibroblast cultured in fibrin gels. Exp. Cell Res. 223: 127-134.

133. Tuan T.L., Zhu J.Y., Sunl B., Nichter L.S., Nimni Marcel E., Laug WE. 1996. Elevated levels of plasminogen activator inhibitor-1 may account for the altered fibrinolysis by keloid fibroblasts. J. Invest. Dermatol. 106: 1007-101.

134. Unemori E.N., Werb Z. 1986. Reorganization of polymerized actin: a possible trigger for induction of procollagenase in fibroblasts cultured in and on collagen gels. J. Cell Biol. 103: 1021-1031.

135. Vartio T. 1989. Regular fragmentation of hidrogen peroxide-treated fibronectin. J. Biol. Chem. 264(8): 4471-4475.

136. Version K.A., Reichardt L.F. 1993. Extracellular matrix. 2: Role of extracellular matrix molecules and'their receptors in the nervous system. FABES. 7: 996-1003.

137. Wahl S.M. 1999. Transforming growth factor beta. In Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, Third Edition, Gallin J., Snyderinan R., eds., Lippincott-Raven Publishcrs, Philadelphia. 883-892.

138. Wang J.F., Dodd C., Shankowsky H.A., Scott P.G., Tredget E.E. 2008. Deep dermal fibroblasts contribute to hypertrophic scarring. Laboratory Invest. 88 1278-1290.

139. Weber L., Meigel W.N., Spier W. 1978. Collagen polymorphism in pathologic human scars. Arch. Dermatol. Res. 261: 63-71.

140. Welch M.P., Odland, G.F., Clark R.A.F. 1990. Temporal relationships of F-actin bundle formation, collagen and fibronectin matrix assembly, and fibronectin receptor expression to wound contraction. J. Cell Biol. 110: 133-145.

141. Wenstrup R.J., Florer J.B, Brunskill E. W., Bell S.M., Chervoneva I, Birk D.E. 2004. Type V collagen controls the initiation of collagen fibril assembly. J. Biol. Chem. 279(51): 53331-7.

142. Werb Z. 1997. ECM and cell surface proteolysis: regulating cellular ecology. Cell. 91: 431-442.

143. Whitby D.J., Ferguson M. W.J. 1991. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neofetal and adult mice. Development. 112: 651-668.

144. Woodley D.T., Bachmann P.B., O'Keefe E.J. 1988. Laminin inhibits human keratinocyte migration. J. Cell Physiol. 136:140-146.

145. Wu C., Bauer J., Juliano R., McDonald J. 1993. The alpha 5 beta 1 integrin fibronectin receptor, but not the alpha 5 cytoplasmic domain, functions in an early and essential step in fibronectin matrix assembly. J. Biol. Chem. 268: 21883-21888.

146. Xu J., Clark R.A.F. 1997. A Three-dimensional collagen lattice induces protein kinase C-C, activity: role in a2 integrin and collagenase mRNA expression. J. Cell Biol. 136: 2473-483.

147. Yang J.F., Olson M.E., Ball D.K., Brigstock D.R., Hart D.A. 2003. Recombinant connective tissue growth factor modulates porcine skin fibroblast geneexpression. Wound Rep. Reg. 11: 411-418.

148. Yamada K.M., Clark R.A.F. 1996. Cellular biology of wound. Plenum Press NY. 611.

149. Yurchenco P.D., Cheng Y.S., Colognato H. 1992. Laminin forms an independent network in basement membranes. J. Cell Biol. 117(5): 1119-1133.

150. Yurchenko R., Furthmayr H. 1984. Self-assembly of basement membrane collagen. Biochem. 23: 1839-1850.

151. Zhang K, Kramer R.H. 1996. Laminin 5 deposition promotes keratinocyte motility. Exp. Cell. Res. 227: 309-322.

152. Zhang D., Pier T., McNeel D.G., Wilding G., Friedl A. 2007. Effects of a monoclonal anti-avp3 integrin antibody on blood vessels — A pharmacodynamic study Investigational New Drugs. 25(1): 49-55.

153. Zillikens D. 1999. Acquired skin desease of hemidesmosomes. J. Dermatol. Sci. 20: 134-154.