Распределение высокоповторяющихся последовательностей ДНК разных типов на хромосомах Triticum и Aegilops тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Зощук, Святослав Анатольевич

• Зощук, Святослав Анатольевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Зощук, Святослав Анатольевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Организация генома растений.

1.1.1. Размер генома. Парадокс размера генома (C-value paradox).

1.1.2. Уникальные и малокопийные последовательности.

1.1.3. Повторяющиеся последовательности.

1.1.3.1. Повторяющиеся последовательности, организованные в тандемы.

1.1.3.1а. Макросателлиты, или сателлиты.

1.1.3.16. Минисателлиты.

1.1.3.1b. Микросателлиты.

1.1.4. Происхождение и эволюция тандемно организованных повторов.

1.1.5. Функциональная роль повторяющихся последовательностей в геноме.

1.1.6. Рассеянные по геному повторяющиеся последовательности.

1.1.6.1. Ретротранспозоны.

1.1.6.1а. LTR-содержащие ретротранспозоны.

1.1.6.16. LTR-несодержащие ретротранспозоны.

1.1.6.2. ДНК-транспозоны.

1.1.7. Роль мобильных элементов.

1.2. Векторные системы, используемые для клонирования ДНК.

1.2.1. Плазмидные векторы.

1.2.2. Векторы для клонирования крупных фрагментов ДНК.

1.2.2.1. Векторы на основе хромосомы фага Л.

1.2.2.2. Космидные векторы.

1.2.3. Искусственные хромосомы - сверхъемкие векторы.

1.2.3.1. Искусственные хромосомы дрожжей YAC.

1.2.3.2. Искусственные хромосомы бактерий ВАС.

1.2.3.3. Семейство векторов РАС.

1.2.3.4. Искусственные хромосомы животных и человека - MAC и НАС.

1.3. Пшеницы и Aegilops как модельные системы для изучения организации и эволюции генома растений.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Распределение высокоповторяющихся последовательностей ДНК разных типов на хромосомах Triticum и Aegilops»

Повторяющиеся последовательности ДНК являются основным компонентом генома растений. По разным данным, у злаков к ним может относиться до 90-95% ядерной ДНК (Flavell et al., 1974; Li et al., 2004; Paux et al., 2006). Повторяющиеся последовательности представляют собой высоко гетерогенную группу, представленную тысячами или даже десятками тысяч семейств, отличающихся по длине мотива, уровню копийности и организации в геноме (Flavell et al., 1974; Флейвел, 1986; Kubis et al., 1998; Heslop-Harrison, 2000). Секвенирование геномов модельных видов - риса и арабидопсиса (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000; Initiative, 2000; Sequencing Project International Rice, 2005), а также детальные исследования других важных сельскохозяйственных культур, включая пшеницу и ее сородичей, ячмень, сахарную свеклу и другие виды, показали, что наиболее обширным классом повторяющихся последовательностей растений являются LTR-ретротранспозоны, составляющие свыше 50% размера их геномов (Bennetzen, 2000b; Li et al., 2004; Sharma and Raina, 2005; Paux et al., 2006). От 5 до 11% ДНК пшеницы представлено транспозонами, а на долю остальных классов повторяющихся последовательностей приходится порядка 30% ядерной ДНК.

Причины поддержания столь значительного количества повторяющихся последовательностей, а также высокого разнообразия их состава до конца не изучены. Предполагают, что они играют важную роль в стабилизации и поддержании структуры хромосом, участвуют в «узнавании» и правильном расхождении хромосом во время митоза и мейоза (Vershinin et al., 1995; Kubis et al., 1998). Локусы некоторых семейств сателлитных ДНК выступают как точки рекомбинации хромосом в мейозе (Linares et al., 1998; Vershinin et al., 1995). Теломеро-ассоциированные повторы выполняют функцию защиты теломер и участвуют в регуляции генов, локализованных в субтеломерных районах (Sykorova et al., 2003). Показано, что видообразование у растений часто связано с быстрыми изменениями фракции повторяющихся последовательностей ДНК (Flavell et al., 1979; Cuadrado and Jouve, 2002; Dvorak, 1998).

He удивительно, что повторяющиеся ДНК привлекают все большее внимание исследователей. За последние годы было выделено и охарактеризовано множество новых семейств повторов растений, а для анализа сателлитных последовательностей была создана специализированная компьютерная база данных (http://w31amc.umbr.cas.cz/PlantSat) (Macas et al., 2002). Значительных успехов в выявлении новых вариантов повторов злаков удалось достигнуть с появлением новых векторов для клонирования ДНК - искусственных бактериальных хромосом (Jiang et al., 1995; Li et al., 2004; Zhang et al., 2000; Stein, 2007; Charles et al., 2008). Тем не менее, число идентифицированных семейств повторов все еще крайне мало, а в практической цитогенетике, как маркеры для флуоресцентной гибридизации in situ, применяется еще меньшее их количество. Поэтому важной задачей является поиск новых генетических маркеров, которые могли бы использоваться в изучении процессов, сопровождающих дивергенцию и становление видов.

У трибы Triticeae наиболее полно исследована повторяющаяся ДНК ржи (Bedbrook et al., 1980; Jones and Flavell, 1982a, b; Vershinin et al., 1995; Contento et al., 2005) и Ae. tauschii - донора D-генома мягкой пшеницы (Rayburn and Gill, 1986; Nagaki et al., 1995, 1998, 1999; Badaeva et al., 1996, 2002; Taketa et al., 2000). Сравнительно недавно при секвенировании концевых последовательностей ВАС клонов библиотеки хромосомы ЗВ мягкой пшеницы была идентифицирована новая, ранее не известная, тандемно организованная последовательность длиной 500 п.н., представленная в хромосоме ЗВ свыше 1200 копий (Paux et al., 2006). Новый повтор содержал множество сайтов рестрикции эндонуклеазы Fat-1 и был назван Fat. В то же время, не существовало данных о наличии и уровне копийности Fat элемента в геномах других видов Triticeae. Оставалось неизвестным и то, как он распределен на хромосомах.

Семейства сателлитных ДНК - Spelt-1 и Spelt-52 были выделены в Институте цитологии и генетики СО РАН из генома Ae. speltoides (Салина et al., 1997; Pestsova et al., 1998; Salina et al., 1998, 2004a). Авторы показали, что они относятся к высокоповторяющимся, тандемно организованным последовательностям, локализованным в субтеломерных районах хромосом (Anamthawat-Jonsson and Heslop-Harrison, 1993; Salina et al., 1998, 2004a). Spelt-1 был обнаружен только у одного вида Aegilops - Ae. speltoides, а также полиплоидных видах пшеницы, тогда как Spelt-52 присутствовал в геномах трех видов Aegilops секции Sitopsis - Ae. speltoides, Ae. longissima и Ae. sharonensis. Уровень копийности обоих повторов внутри видов значительно варьировал (Salina et al., 2004а). Помимо этого, было показано, что образование полиплоидных пшениц сопровождалось снижением уровня копийности Spelt-1 повтора в сравнении с Ae. speltoides (Pestsova et al., 1998; Salina et al., 2004b). Тем не менее, хромосомные механизмы, лежащие в основе этого процесса, оставались до конца не выясненными.

Целью настоящей работы стало изучение структуры и эволюции геномов злаков на основе локализации трех семейств тандемно организованных, высокоповторяющихся, некодирующих последовательностей ДНК методом флуоресцентной гибридизации in situ. Для ее выполнения были поставлены следующие задачи:

• Оценить популяционный полиморфизм сателлитных повторов Spelt-1 и Spelt-52. Изучить преобразования этих повторов в линиях пшеницы эммер и Timopheevi.

• Исследовать распределение нового, ранее не известного семейства повторяющихся последовательностей Fat на хромосомах злаков методом FISH. Определить возможное время его возникновения в процессе эволюции.

• Оценить эффективность использования Fat повтора как маркера для идентификации хромосом в гибридизации in situ и изучении эволюции растений.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Зощук, Святослав Анатольевич

выводы

1. С помощью флуоресцентной гибридизации in situ на хромосомах разных злаков впервые исследовано распределение нового семейства высокоповторяющихся последовательностей ДНК Fat, выделенного из ВАС библиотеки хромосомы ЗВ мягкой пшеницы. Показано, что она относится к ранее неизвестному классу высокоповторяющихся, тандемно организованных последовательностей ДНК с дисперсно-кластерным характером распределения в геноме.

2. Содержание Fat элемента в геномах разных видов злаков значительно варьирует. Наиболее высокая интенсивность гибридизации выявлена в D-геноме пшениц и эгилопсов и N-геноме пырея Agropyron intermedium, тогда как у овса и культурного ячменя Н. vulgare данная последовательность не обнаружена, однако она присутствовала в минимальных количествах у других представителей рода Hordeum. На основании этого сделано заключение, что в процессе эволюции злаков Fat элемент мог впервые появиться после дивергенции овсов, во время обособления ячменей от общего предка.

3. Наиболее интенсивная гибридизация Fat повтора с формированием крупных кластерных сигналов характеризует хромосомы 4-й гомеологичной группы пшениц и Aegilops, и может являться ее маркером. Специфичность распределения этой последовательности на хромосомах D-генома пшениц и эгилопсов позволяет использовать ее в гибридизации in situ как молекулярно-цитогенетический маркер для идентификации хромосом и исследования эволюционных процессов на хромосомном уровне.

4. С помощью гибридизации in situ выявлен высокий внутривидовой полиморфизм полиплоидных пшениц по распределению, числу и размерам локусов семейств теломеро-ассоциированных тандемных повторов Spelt-1 и Spelt-52. Показано, что снижение уровня копийности Spelt-1 повтора у полиплоидных пшениц происходит за счет уменьшения числа сайтов гибридизации и уменьшения их размеров в сравнении с предковой формой. Различия в содержании повтора между двумя родственными группами пшениц -Timopheevi и Emmer, могут быть связаны с «эффектом основателя» или с тем, что в процессе эволюции происходила постепенная элиминация повтора, сильнее выраженная у филогенетически более древней группы Emmer.

5. Показано наличие локусов B/G-геномно-специфичного повтора Spelt-1 на двух хромосомах А/А1 геномов полиплоидных пшениц. Их появление обусловлено переносом фрагмента хромосомы G-генома на хромосому А1-генома (6AlS) в результате видоспецифической транслокации Т6А':Ю:4С - у видов группы Timopheevi, и возможной амплификацией последовательности, исходно присутствовавшей у диплоидного предка - в обеих группах полиплоидных пшениц (2 А/2 А').

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Высокое генетическое разнообразие пшениц и эгилопсов, существование большого числа полиплоидных форм с разнообразным геномным составом делает их чрезвычайно привлекательными моделями для исследования эволюции разных типов повторяющихся последовательностей ДНК, особенностях их организации в разных геномах. С другой стороны, с помощью молекулярных методов была доказана важная роль некодирующихся высокоповторяющихся последовательностей в дивергенции разных видов пшениц Aegilops (Dvorak and Appels, 1982; Dvorak and Zhang, 1992 a, b; Dvorak et al., 1998; Badaeva et al., 2002). Таким образом, информация о распределении разных классов повторов на хромосомах разных диплоидных и полиплоидных видов злаков, полученная с помощью гибридизации in situ, может оказаться полезной не только для изучения организации хромосом, изучения эволюции семейств повторов и их взаимодействия в геноме, но и для уточнения филогенетического родства разных видов и семейств злаков, определения механизмов, сопровождавших их дивергенцию.

Несмотря на важную роль повторяющихся последовательностей в организации и эволюции геномов растений, лишь незначительное их число было детально охарактеризовано и используется в их анализе методом гибридизации in situ. С этой точки зрения огромный интерес представляет применение как известных, традиционно используемых типов повторов, так привлечение новых последовательностей, выделенных из геномных библиотек и клонированных в ВАС векторах.

Целью настоящего исследования были характеристика и изучение распределения нового семейства повторяющихся последовательностей ДНК -Fat, на хромосомах разных видов и родов злаков. Помимо этого, для дальнейшего анализа дивергенции видов, представляющих две эволюционные линии пшеницы, выявления сопровождающих ее механизмов, планировалось провести исследование широкой выборки разных видов пшениц и диплоидного Aegilops speltoides, донора B/G-геномов, с помощью Spelt-1 и Spelt-52 последовательностей, выделенных и охарактеризованных в Институте цитологии и генетики СО РАН (Салина и др., 1997; Salina etal., 2004b).

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Растительный материал

С помощью гибридизации in situ были исследованы 54 образца 13 видов пшеницы, представляющих четыре диплоидных, шесть тетраплоидных и три гексаплоидных вида с различным геномным составом (табл. 9), 43 образца 24 видов Aegilops с разным числом хромосом и геномным составом (табл. 10), а также несколько видов, представляющих другие рода злаков: ячмень (Hordeum vulgare, Н. spontaneum, Н. chilense и Н. geniculata), рожь (Secale cereale), овес (Avena magna) и пырей (Agropyron intermedium) (табл. 11). Для каждого вида анализировали от одного до 10 образцов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Зощук, Святослав Анатольевич, 2009 год

1. Апиханян С.И., Акифьев А.П., Чернин Л.С. Общая генетика. Москва. Высшая школа. 1985. СС.446.

2. Беридзе Т.Г. Сателлитная ДНК растений. В кн.: Геном растений (под ред. К.М.Сытника), Киев. Наукова Думка. 1988. С.62-72.

3. Бадаева Е.Д. Эволюция геномов пшениц и их дикорастущих сородичей: молекулярно-цитогенетическое исследование. Российская академия наук. ИМБ РАН. Москва. 2000. СС. 481.

4. Бадаева Е.Д. Хромосомный анализ при исследовании происхождения B-(G-) геномов полиплоидных пшениц // Биологические мембраны. 2001. Т. 18. С.216-229.

5. Восток К., Самнер Э. Хромосома эукариотической клетки. М.: Мир. 1981. СС.600.

6. Вавилов Н.И. Научные основы селекции пшеницы // В кн.: Теоретические основы селекции растений. М.; Л. Сельхозгиз. 1935. Т.2. С.3-244.

7. Вершинин А.В., Салина Е.А., Толстых В.А., Потапов В.А., Шумный В.К. Изучение рейтерирующихпоследовательностей ДНК некоторыхвидов злаков // Известия СО АН СССР, Серия Биол. Науки, Вып.2. 1984. №. 13. С. 47-52.

8. Газарян К.Г., Тарантул В.З. Геном эукариот. М.: Изд-во Моск. Ун-та. 1983. С. 7-36.

9. Гончаров Н.П. Сравнительная генетика пшениц и их сородичей // Новосибирск: Сиб. унив. изд-во. 2002. СС.252.

10. Дорофеев В.Ф., Филатенко А.А., Мигушова Э.Ф., Удачин Р.А., Якубцинер М.М. Пшеница // В кн. Культурная флора СССР. Л.: Колос. 1979. Т.1. С.7-31.

11. Доувер Д., Браун С., Коэн Э., Даллас Дж., Стрэчен Т., Трик М. Динамика эволюции генома и дифференцировка видов. В кн.: Эволюция генома. М.: Мир, 1986. С.329-356.

12. Животовский Л.А. Микросателлитная изменчивость в популяциях человека и методы ее изучения // Вестник ВОГиС. 2006. Т. 10. С.74-96.

13. Жимулев И.Ф. Гетерохроматин и эффект положения гена. Новосибирск. Наука. 1993.

14. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2003. СС.479.15,16,17,1819,2021,22