Распределение введенных в кровоток белковых препаратов при артериальной тромботической окклюзии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Матвеев, Максим Юрьевич

• Матвеев, Максим Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Матвеев, Максим Юрьевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Краткие физические характеристики кровеносной системы

2. Тромбообразование в артериях и венах

3. Структура и свойства артериального и венозного тромбов

4. Экспериментальные модели тромбозов. ,

4.1. Модели артериальных тромбов

4.2. Модели венозных тромбозов

5. Биохимические характеристики основных тромболитических агентов

6. Основные направления исследований, проводимых с целью повышения 21 эффективности тромболитической терапии.

7. Проницаемость фибринового геля и кровяного сгустка

8. Биофизические характеристики тромболизиса. > . ; . 29 Заключение ■. л ■ ■ J2

ГЛАВА П МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Реактивы

2. Растворы

3. Методы исследования 36 3.1 Выделение и очистка моно- и поликлональных антител и приготовле- 36 ние иммуносорбентов.

3.2. Синтез конъюгатов антител

3.3. Анализ эффективности применения химерных антител для лизиса 39 плазменного сгустка.

3.4. Иммуноферментная тест-система для количественного определения 40 урокиназы в плазме крови.

3.5. Определение скорости диффузии макромолекул в фибриновый гель и 41 в сгустки, образованные из плазмы и крови собаки.

3.6. Определение скорости фильтрации жидкости через обтурирующий 44 тромб сонной артерии кролика.

50

ГЛАВА Ш РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Направленная доставка тромболитического агента к сгустку плазмы с 51 помощью конъюгата моноклональных антител против урокиназы и фибрина.

2. Определение скорости диффузии макромолекул в фибриновый гель ив 56 сгустки, образованные из плазмы и крови собаки.

3. Определение скорости фильтрации жидкости через обтурирующий 59 тромб сонной артерии кролика.

4. Определение интенсивности перемешивания крови в закупоренном уча- 60 стке артериального сосуда.

4.1. Эксперименты In Vivo

4.2. Эксперименты In Vitro

5. Распределение рекомбинантной проурокиназы в закупоренной сонной 65 артерии кролика.

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Эффект направленной доставки тромболитика в сгусток плазмы

2. Накопление макромолекул в кровяном сгустке in vitro

3. Проницаемость артериального тромба in vivo

4. Интенсивность перемешивания крови в закупоренном участке артери- 75 ального сосуда.

5. Распределение рекомбинантной проурокиназы в закупоренной сонной 81 артерии кролика.

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

3.7. Определение интенсивности перемешивания в закупоренном участке артериального сосуда.

3.8. Распределение рекомбинантной проурокиназы в закупоренной сонной артерии кролика.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Распределение введенных в кровоток белковых препаратов при артериальной тромботической окклюзии»

ВВЕДЕНИЕ

Предотвращение кровопотери при нарушении целостности кровеносного русла является основной биологической функцией тромбообразующей системы крови. В разных участках кровеносной системы существуют различные физические и биохимические условия, что приводит к различиям в механизмах образования тромба - основного фактора прекращения кровотока.

При патологическом развитии процесса тромбообразования, в частности, при возникновении обтурирующего тромба, происходит изменение параметров микро- и макроциркуляции крови. При этом включаются компенсаторные механизмы организма, приводящие к функциональным изменениям тромбообразующей и тромбо-литической систем крови. Последняя несет ответственность за своевременную очистку кровеносного русла от выполнивших свою роль тромбов.

Возникновение тромба в магистральном сосуде может привести к ишемии участка органа, за который ответственен пораженный сосуд, и, в дальнейшем, к потере у органа способности выполнять физиологическую функцию (инфаркт миокарда и мозга), а также к гангрене.

На сегодняшний день одним из самых эффективных приемов при лечении подобных заболеваний является применение тромболитических агентов (в частности, активаторов плазминогена), которые представляют собой белки с молекулярной массой 50 - 90 кД. Для повышения эффективности тромболизиса используют комплексы активаторов плазминогена с антителами к компонентам тромба. Молекулярный вес подобных комплексов составляет 200-300 кД. Также для определения бассейна тромбированного сосуда методом иммуносцинтиграфии используются меченые радиоактивной меткой антитела к компонентам тромба (мол. вес 150-170 кД).

Эффективность применения диагностических и тромболитических препаратов связана со скоростью их накопления на поверхности и в глубине тромба. Поэтому понимание механизмов распределения макромолекул (в частности, белков с мол. весом 50-300 кД) в зоне обтурирующего тромба имеет большое значение для разработки методов диагностики и лечения заболеваний, вызванных тромбозом магистральных сосудов.

В последнее время растет число публикаций, посвященных проблеме доставки макромолекул в тромб. В то же время большинство описанных до настоящего времени экспериментов было проведено на образованных in vitro кровяных сгустках. Структура таких сгустков отличается от встречающихся в клинической практике тромбов. Неосвещённым остается такой важный вопрос, как эффективность доставки макромолекул из круга кровообращения к поверхности тромба.

Картина происходящего в зоне артериального тромба невозможна без знания физических аспектов, ответственных за доставку (и вывод) биологически активных соединений, в частности белков, в зону (и из зоны) тромбоза. Распределение макромолекул между кровью и тромбом определяется способностью макромолекул проникать вглубь гелевой структуры тромба. Доступность внутренних структур тромба для белков крови может зависеть от линейных размеров белков, их зарядов и гид-рофобности, от размеров пор в структуре тромба, зарядов и гидрофобности структурных компонентов тромба. Скорость проникновения белков вглубь тромба может быть обусловлена также скоростью фильтрации плазмы крови через тромб и характеристиками потока крови на поверхности тромба.

Распределение белков между кровью и тромбом обусловливается скоростью перемешивания крови в участке сосуда между слоем жидкости на поверхности

тромба и системным кровотоком. Интенсивность этого перемешивания может определяться механическими характеристиками пораженного сосуда.

Нам представляется, что данные о распределении макромолекул могут иметь значение не только для оптимизации применения тромболитических и визуализирующих тромб препаратов в зависимости от места расположения тромба и механических характеристик обтурированного сосуда, но и для понимания процессов роста и лизиса тромба в сосудистом русле.

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Краткие физические характеристики кровеносной системы.

Важнейшими факторами, определяющими механику течения крови по сосуду считаются:

1) реологические свойства крови (кинематическая вязкость и плотность),

2) скорость течения крови,

3) перепад давления на данном участке сосуда,

4) эластичность стенки сосуда и

5) геометрические характеристики сосуда (диаметр, длина, углы ветвлений)

[155].

1) Различие в значениях кинематической вязкости и плотности для венозной и артериальной крови обусловливается, в основном, различием в физических свойствах мембран эритроцитов, которые зависят от соотношения внутриклеточного кальция и магния, концентрации АТФ, рН и рС02 [188]. Агрегационный статус тромбоцитов и эритроцитов, а также значение гематокрита, считаются примерно равными для крови до и после оксигенации. Значение гематокрита в микроциркуляционном русле снижается до 3% при гематокрите в больших сосудах равном 45%, что естест-

венно уменьшает вязкость крови в микрососудах. Однако это, не имеющее пока удовлетворительного объяснения [73], явление характерно как для венозного так и для артериального русла [114]. При построении математической модели течения крови в сосудах большого диаметра считается корректным рассматривать кровь как ньютоновскую жидкость [157].

2) Емкость венозной системы значительно превышает емкость артериальной системы крови. Венозные сосуды содержат 60-70% объема всей крови [199, 40]. Средняя скорость кровотока в органных венах 1 см/сек, а в присердечных участках полых вен 20 см/сек, тогда как в соответствующих частях артериальной системы она значительно больше - 3-4 см/сек в органных артериях и 30 см/сек в аорте [103].

3) В венозной системе давление гораздо ниже, чем в артериальной. Среднее давление в аорте и больших артериях равно 100 (125/75) мм.рт.ст.. в капиллярах 30 мм.рт.ст., в органных венах 15 мм.рт.ст., в нижней полой вене 10 мм.рт.ст. [145, 3].

Пульсация, осуществляемая за счет сердечного выброса, с перидиочностью 5080 ударов в минуту создает в больших артериях перепад давления 40-60 мм.рт.ст. Амплитуда же перепада давления в венулах за счет пульсаци в 5 раз ниже, чем в ар-териолах [84].

4) По сравнению с артериальной, толщина венозной стенки относительно внутреннего диаметра сосуда, существенно меньше. Так, для животных весом более 60 кг толщина артериальной стенки практически не зависит от веса животного [198] и отношение толщина/диаметр приблизительно равно 0.1 на всем протяжении сосуда. Для артериол это отношение может достигать значения 0.4. Толщина стенки венозного сосуда неравномерна по его длине и варьирует в широких пределах в измерениях разных исследователей. Отношение толщина/диаметр для магистральных вен составляет 0.01-0.05. Причем это отношение зависит не только от внутреннего

диаметра сосуда (чем вена крупнее, тем больше отношение), но и от величины гидростатического давления в данном сосуде, которое определяется давлением кровяного столба, основание которого находится на уровне данной вены, а верхушка - на уровне правого предсердия сердца или так называемой флебостатической оси [3]. Модуль упругости артериальной стенки нелинейно растет с увеличением прилагаемого (в пределах физиологической нормы) давления от 0.5 до 1.2 мПа [150]. Величина напряжения сосудистой стенки вен определяется величиной трансмурального давления (величина давления в вене минус величина наружного давления). Поскольку величина наружного давления конкретной вены определяется в большой степени характером ее окружения (скелетные мышцы, кости и т.д.), то модуль упругости венозной стенки определить затруднительно. Можно только предположить, что этот модуль будет зависеть от количества мышечных слоев венозной стенки, число которых варьирует от 1 до 4 [3].

5) Согласно классификации Vadot [184] различают 9 порядков размеров сосудов от аорты до капилляров. Для взрослого человека весом 60 кг и сердечным выбросом 4.5 л/мин предложены уравнения для подсчета количества (Nz), диаметра (Dz) и длины (Lz) артериальных сосудов определенного порядка:

Nz= l*(15.4)z Dz= 2*(0.376)z Lz= 59*(0.475)z,

где z= 0,1,2,...8.

Ветвление кровеносных сосудов характеризуется эмпирически полученными правилами:

а) Если сосуд разделяется на два сосуда одинакового диаметра, то угол ветвления симметричен.

б) Если сосуд ветвится на два сосуда разного диаметра, то меньший сосуд имеет больший угол ветвления.

в) Очень маленькие (по отношению к исходному) сосуды отходят под прямым углом [53].

Характер ветвления сосудов во многом определяет распределение потоков в месте бифуркации. Описание потоков в подобных системах является предметом гидромеханики и в данном обзоре разумно ограничиться замечанием о важности этого параметра для распределения молекул в том или ином месте сосуда.

Наиболее опасными, с точки зрения сохранения жизненных функций, являются патологии, связанные с нарушением кровотока в магистральных сосудах (0-2 порядки). Поэтому при сравнении параметров потока в артериальном и венозном руслах, особое внимание будет обращено на магистральные сосуды этих отделов кровеносной системы.

2. Тромбообразование в артериях и венах.

Как видно из приведенного выше краткого сравнения параметров течения крови в артериальном и венозном русле, наиболее выражено их отличие в скоростях потока и перепаде давления. Стенки сосудов устроены таким образом, чтобы обеспечить сохранность данных параметров кровотока. Различия в параметрах течения крови ответственны за различие механизмов тромбообразования в магистральных артериях и венах. Так, определяющим, основным механизмом образования тромба в артериях является адгезия и активация тромбоцитов на экспонированный в просвет сосуда коллаген базальной мембраны IV типа (без образования агрегатов) [115], а также на коллагены медии и адвентиции I и III типов (с образованием агрегатов) [204,138,87]. Еще одним фактором активации тромбоцитов является наруше-

ние ламинарности потока. Считается, что образование завихрений в зоне атероскле-ротической бляшки провоцирует агрегацию тромбоцитов с последующим тромбо-образованием [68,57].

В то же время роль тромбоцитов в образовании тромба венозного сосуда является предметом оживленных дискуссий: считается, что тромбоциты определяют развитие тромба при повреждении эндотелия, в то время как при отсутствии повреждения более важными факторами являются статус коагуляционной системы крови и наличие стазиса крови. В образовании венозного тромба решающую роль приписывают все же стазису крови и нарушениям коагуляционной системы [169]. Стазис крови наиболее сильно выражен в клапанных карманах и венозных мешочках (saccules). Возможно, сам по себе стазис не включает механизм тромбообразования (за счет увеличения локальной концентрации АДФ, продуцируемой эритроцитами, тромбоцитами и лейкоцитами, а также других факторов свертывания крови, образовавшихся в ближайшем окружении места стазиса), но обеспечивает усиление этого процесса [56]. То есть в патогенезе венозного тромба могут сосуществовать оба механизма тромбообразования, несмотря на малое (относительно артериального тромба) количество тромбоцитов в венозном тромбе.

В последнее время появились работы, исследующие различия в патогенезе венозного и артериального тромбов на фоне измененного тромбофилического статуса [78]. Высказывается мнение, что при патологических изменениях этого статуса часто нельзя предположить, в каком отделе системы - артериальном или венозном -предпочтительно будет образовываться тромб (хотя самими авторами данной работы было замечено, что, например, дефицит антитромбина почти исключительно приводит к образованию венозного тромба). На этом основании говорится о схожести механизмов тромбогенеза в артерии и вене. Очевидно, что без рассмотрения

условий тромбообразования трудно предположить тот или иной механизм этого процесса, ибо этот механизм определяется в том числе и физическими параметрами процесса. Так, например, аспирин (известный ингибитор агрегации тромбоцитов) не влиял на коллаген-индуцируемое тромбообразование при скорости сдвига 650 с"1 (артерия средней величины), но снижал на 38 % интенсивность процесса при скорости сдвига 2600 с"1 (45 % стеноз средней артерии, сила сдвига 80 дин/см2). При скорости сдвига 10500 с"1 (80 % стеноз, сила сдвига 350 дин/см2) эффект ингибирования не проявлялся, как не проявлялся и при силе сдвига более 100 дин/см2.

Предполагается, что блокирование связи фактора фон Виллебранда с глико-протеином Ilb/IIIa может привести к снижению агрегации при больших скоростях сдвига [23]. Значение фактора фон Виллебранда для адгезии и агрегации тромбоцитов именно при больших скоростях сдвига подчеркивается во многих работах [160,82]. При изучении тонких механизмов активации тромбоцитов in vitro, использовали проточную систему (скорость сдвига 300 сек"1) и активировали тромбоциты на коллагене [172]

Таким образом, очевидна взаимосвязь между биохимией процесса тромбообразования и физическими условиями, в которых этот процесс осуществляется.

3. Структура и свойства артериального и венозного тромбов.

При кратком описании условий образования тромба в венозной и артериальной системах крови можно с некоторой долей условности пренебречь фактором локализации отдельно взятого сосуда (хотя, конечно, при построении модели тромбообразования в конкретном сосуде этот фактор имеет определенное значение).

Различия в биофизических условиях тромбообразования обусловливают различие в структуре и размерах образовавшегося тромба. В артериях чаще образуются

так называемые "белые" тромбы, а в венах "красные" [58,66]. Артериальные тромбы короче венозных - длина тромба коронарной артерии при инфаркте миокарда около 1 см [14], в то время как венозные тромбы могут достигать 30 см [188] В некоторых случаях наблюдали наличие "красных" тромбов и в артериях - при инфаркте миокарда ангиоскопическим методом в коронарной артерии определяли свежий "красный" тромб, образованный, как предполагается, в условиях стазиса крови [133]. Также из этой закономерности выпадают тромбоэмболы легочной артерии -они "розовые". Это обусловлено тем, что изначально "красные" венозные тромбы, попадая в условия интенсивного кровотока в легочной артерии, покрываются слоем тромбоцитов и фибрина вследствие локальной (на поверхности тромба) активации свертывающей системы крови [79].

Цвет тромбов обусловлен разным соотношением количества эритроцитов и тромбоцитов. Такое различие объясняется, в первую очередь, особенностями тром-богенеза в артериях и венах. При больших скоростях ламинарного потока клетки крови отделены от люминальной поверхности сосудистой стенки зоной, свободной от клеток крови (0.25-0.50 мкм) [13]. Наиболее крупные клетки (лейкоциты и эритроциты) вытесняют на периферию кровотока мелкие клетки (тромбоциты) и частицы [9]. Этот эффект выражен тем сильнее, чем выше скорость потока. При повреждении сосудистой стенки и образовании пристеночного тромба, относительная концентрация тромбоцитов в этом тромбе будет больше в случае большей скорости кровотока. В случае тромбообразования в условиях потока концентрация тромбоцитов в тромбе в 5-15 раз выше (ок. 3 млн/мкл ), чем в цельной крови (0.1-0.4 млн/мкл) [152,38,99]. Концентрация фибрина как в артериальном, так и в венозном тромбе примерно одинакова (30 % от общего веса и 85 % от сухого веса [152]), однако содержание эритроцитов в артериальном тромбе существенно ниже [25].

Большая концентрация тромбоцитов обеспечивает и большую способность тромба к ретракции - сокращению объема с выделением сыворотки. Считается, что ответственным за осуществление этого процесса является система цитоскелета тромбоцитов - микрофиламенты и микротрубочки [47]. Предполагается, что необходимым условием ретракции является "продолжающаяся контрактирущая активность", представляющая собой постоянное образование и контракцию псевдоподий тромбоцитов [124]. Данные экспериментов in vitro подтверждают влияние относительной концентрации тромбоцитов на степень ретракции тромба - обогащенная тромбоцитами плазма способна уменьшаться до 5-10 % изначального объема, тогда как сгусток цельной крови до 50 % (при атмосферном давлении дальнейшую ретракцию тормозит наличие эритроцитов) [14]. Степень ретракции тромба влияет на прочность образовавшейся структуры - чем она выше, тем тромб прочнее и, соответственно, тем выше его модуль упругости. Величина модуля упругости практически линейно зависит от концентрации тромбоцитов: в диапазоне от 0 до 0.17 млн тромбоцит/мкл модуль упругости изменяется от 4 до 19 тысяч дин/см2 [41]. Интересно отметить, что прочность тромба является одним из признаков, позволяющих патологоанатомам дифференцировать постмортальные тромбы от прижизненных. Постмортальные тромбы, образованные в отсутствие потока, всегда без ламинаций, существенно мягче и эластичнее [79].

Способность тромба образовывать структуру различной прочности в зависимости от условий кровотока имеет большое физиологическое значение - чем больше прилагаемое давление в месте образования тромба, тем более прочным должен быть тромб для того, чтобы предотвратить кровопотерю.

4. Экспериментальные модели тромбозов.

Понимание многими исследователями важности физических условий для процесса тромбообразования привело к тому, что при разработке моделей экспериментального тромбоза в венах и артериях использовались разные приемы инициации роста тромба.

4.1. Модели артериальных тромбов.

В работах нескольких исследовательских групп артериальные тромбы образовывали, воздействуя на ламинарность потока (используя вазоконстрикторы), на целостность эндотелия (используя для его повреждения факторы как химические, так и физические), на локальный статус коагуляционной системы. Наиболее распространенными моделями артериального тромбоза можно назвать следующие:

Модель Фольтса - коронарная артерия собаки (или обезьяны [50]) несколько раз пережималась зажимом (несильное механическое повреждение эндотелия) и затем на поврежденное место накладывали вазоконстриктор, обеспечивающий 70-75 % стеноз [69]. Данная модель часто используется для изучения явления "периодического тромбообразования" ("cyclic flow") - периодического прекращения и восстановления кровотока в зоне повреждения эндотелия. Цикличность процесса объясняется эффектами агрегации тромбоцитов и затем смыванием тромба кровотоком [18,104]. Подобный тромб образовывали и в брыжеечной артерии крысы при сдавливающем воздействии на стенку артерии 25-30 раз. Через 30-60 минут образовывался "белый" (состоящий в основном из тромбоцитов) тромб на 50-100 % перекрывающий просвет сосуда [17].

Модель тромба на бедренной артерии кролика (а также на коронарной артерии собаки [141]) - артерия перевязывалась и в участок между двумя лигатурами вводи-

ли тромбин (1 МЕ/мкл, 10 мкл). Через 30 минут лигатуры снимали и регистрировали образование тромба [170]. Описан этот же метод, дополненный механическим повреждением эндотелия - сдавливанием её 4 раза за 3-5 секунд. Тромб в этом случае был обогащен фибрином и тромбоцитами и плотно прилегал к стенке сосуда [203].

Тромб образовывали в артерии (коронарной или бедренной) собаки (или сонной артерии крысы [123]) путём травматического воздействия анодного тока (9 В, 100-300 мкА) на артериальную стенку в течение не менее 30 минут [159,143]. Такой тромб состоял в основном из тромбоцитов: соотношение тромбоциты/фибрин в центральной части тромба 95/5, в проксимальной части 50/50, в дистальной 40/60 [89].

Тромб образовывали в артерии (коронарной, сонной или бедренной) собаки путём введения в неё медной спирали. Не полностью обтурирующий тромб образовывался в течение 5-10 минут. Соотношение тромбоциты/фибрин в центральной части тромба 30/70, в проксимальной части 10/90, в дистальной 15/85 [89]. С течением времени (от 1 до 6 часов) происходило вымывание клеточных элементов из фибриновой сети, составляющей основу тромба. Активации тромбоцитов в этой модели не отмечено [181]. Модель удобна тем, что позволяет измерять вес тромба, однако тромб при этом не прикреплен к стенке сосуда.

Тромб образовывали в артерии (коронарной или бедренной) собаки путём температурного воздействия на эндотелий - введением солевого раствора с температурой 100°С и инкубацией в перевязанном участке артерии этого раствора в течение 5 минут (возможно также использование гипотонического раствора). Поскольку тромб образовывался в отсутствие потока, то его состав отличался от артериальных тромбов, наблюдаемых в клинике. Однако этот метод привлекает простотой и дешевизной [20].

Воздействие на наружную стенку сонной артерии крысы 50 % раствором БеСЬ [110] также приводило к повреждению эндотелия и образованию тромба в месте повреждения. Этот эффект (равно как и эффект образования тромба на медной спирали) вызван тем, что переходные металлы, такие как железо и медь, индуцируют окисление липидов [88]. Было показано, что применение в данной модели БеСЬ стимулирует образование более массивных тромбов, хотя в обоих случаях тромбы состояли в основном из тромбоцитов и фибрина [166]. Этот метод предполагает наложение на стенку артерии пропитанной раствором соли фильтровальной бумаги в течение 10 минут и обеспечивает 100 % -обтурирующий тромб через 60 минут после аппликации. Метод позволяет получать артериальные тромбы заданной величины и без нарушения целостности сосуда [165].

Артериальные тромбы, получаемые по описанным выше методикам, отличаются, в зависимости от скорости кровотока в месте тромбообразования, по содержанию фибрина, тромбоцитов и эритроцитов. Соответственно отличаются устойчивость таких тромбов к воздействию различных тромболитических агентов. Так, было показано, что тромбоцитарные "белые" тромбы более устойчивы к действию тканевого активатора плазминогена 0:РА) [98].

Отличаются также и механизмы образования экспериментальных тромбов в разных условиях кровотока - особенно показательны работы, посвященные воздействию различных агентов на процесс тромбообразования. При повреждении эндотелия, когда тромбоциты играют решающую роль в тромбообразовании, эффект применения антиагрегационных препаратов (аспирин, блокаторы рецептора ОР ПЬ/Ша и др.) существенно более выражен, чем при индукции тромбообразования с помощью локального нарушения коагуляционной системы крови (с помощью введения в кровоток медной спирали или добавления тромбина) [89]. Эти наблюдения способ-

ствовали развитию идеи применения антиагрегационных препаратов в клинике для лечении ишемической болезни сердца [189, 95]

4.2. Модели венозных тромбозов.

Венозные тромбы образовывали путем введения в перевязанный кусок вены тромбопластина или гипотонического раствора, наружной аппликацией РеСЬ [165,93], простой перевязкой вены в течение 120 минут [62]. Также тромбозы вызывали введением тромбина в перевязанный участок вены или введением в просвет сосуда шерстяной нити (в последнем случае добивались тромба, не перекрывающего полностью просвет сосуда) [49]. Во всех указанных выше экспериментах получали "красные" тромбы с незначительным включением тромбоцитов.

Описана модель венозного тромбоза у крыс, в которой используются одновременно два тромбогенных фактора - стазис и несильное повреждение эндотелия [131]. В данной работе исследовали влияние гепарина и аспирина на вес образующегося тромба. Было выявлено, что аспирин не влияет на вес тромба, в то время как гепарин дозозависимо снижает этот вес. Было высказано предположение, что в вене в условиях стазиса активация тромбоцитов не является необходимым фактором тромбообразования.

В экспериментах на модели венозного тромба, вызванного заморозкой (до -20°С) куска ярёмной вены крысы в течение 5 минут было показано, что на начальном этапе тромбообразования (в течение первой минуты) тромбоциты играют решающую роль [135]. В дальнейшем образование тромба обусловливалось свертывающей системой крови и приводило к созданию "красного" тромба. В описанной модели в просвет сосуда экспонировались структуры медии, что и стимулировало адгезию тромбоцитов. Однако в работе, посвященной изучению структуры по-

стмортальных тромбов, было показано отсутствие нарушений эндотелия [169]. Так что роль тромбоцитов в образовании венозного тромба по-прежнему остаётся предметом дискуссии.

При сравнении моделей экспериментальных артериальных и венозных тромбозов важно обращать внимание на то, для какого исследования создавали тот или иной тромб. Если целью исследования было понимание механизма тромбообразо-вания, то использовали модель, обеспечивающую максимальное сходство с патологическим процессом, наблюдаемым в клинике - для артериального тромба это значит нарушение целостности эндотелия при сохранении параметров кровотока, а для венозных - локальное нарушение коагуляциооной системы при стазисе и незначительном нарушении эндотелия. В том же случае, если исследовалось действие тром-болитических препаратов, использовали модели, позволяющие измерять размер тромба; при этом структура экспериментального тромба могла существенно отличаться от таковой, наблюдаемой в клинике.

5. Некоторые биохимические характеристики проурокиназы.

В организме человека обнаружено два эндогенных активатора плазминогена: активатор плазминогена урокиназного типа (про-Ук) и активатор плазминогена тканевого типа (т-АП) [19].

Т-АП, в отличие от про-Ук, содержит пальцевидный домен и два крингл-домена. Их наличие обусловливает фибриноспецифичность действия т-АП, которое выражается в том, что фибрин за счет концентрирования и конформационного изменения молекул активатора и плазминогена ускоряет реакцию активации плазминогена [142].

Про-Ук - одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой, составляющей 46-55 кД [29,113,59]. Описано выделение про-Ук с молекулярной массой 100150 кД, которая возможно, является мультимолекудярной формой про-Ук [180]. Также описана низкомолекулярная форма про-Ук с Мв 32 кД [113]. Охарактеризована аминокислотная последовательность про-УК, содержащая 411 аминокислотных остатков. Углеводородная цепь соединена с белковой молекулой через остаток Asn 302 [59].

В структуре про-Ук можно различить 4 домена: (1) домен, подобный фактору роста; (2) крингл-домен; (3) пептид-связывающий домен (А-цепь); и (4) протеоли-тический домен (В-цепь). Эти домены во многом гомологичны доменам, обнаруженным в других сериновых протеазах и, возможно, являются эволюционно родственными [151].

В настоящее время известно, что в организме урокиназа синтезируется в почках в виде проактиватора (про-Ук) и секретируется в мочу, где основная масса фермента содержится уже в виде двухцепочечной формы (Ук) [29]. Разработаны различные методы выделения и очистки про-урокиназы [96,200,195,113,106]. Была она получена и генно-инженерным способом [29].

Ген, кодирующий последовательность про-Ук, расположен на хромосоме 10, Протяжённость его составляет 6.4 тыс. пар оснований. Ген состоит из 11 экзонов. Экспрессирующаяся с него про-Ук представляет собой одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой около 50 кД [29]. Протеолиз связи Lys 158-Ile 159 приводит к образованию активного фермента, состоящего из двух цепей, соединенных одной S-S связью [113].

Активация про-урокиназы происходит под действием трипсина, плазмина и плазменного калликреина. Ряд других ферментов, таких как катепсин G в присутст-

вии гепарина или неизвестный пока активатор, присутствующий в раковых клетках, также способны превращать одноцепочечную урокиназу в двухцепочечную. Описаны следующие ингибиторы активаторов плазминогена: ингибитор активаторов плазминогена - 1 (ИАП-1) - гликопротеин с молекулярной массой 51 кД - содержится в тромбоцитах в концентрации около 100-200 нг/мл крови (или 4-8 тыс. молекул/клетку). Меньшие концентрации ИАП-1 обнаружены и в плазме (ок. 10 нг/мл). Синтез ИАП-1 осуществляется эндотелиальными клетками кровеносных сосудов [109];

ингибитор активаторов плазминогена - 2 (ИАП-2), выделенный из экстракта плаценты и из моноцитов и существующий в гликозилированной (60 кД) и неглико-зилированной (47 кД) формах [29,64];

нексин-протеаза, обнаруженный в фибробластах и способный инактивировать также плазмин, трипсин и тромбин.

Про-Ук, в отличие от Ук и т-АП, не образует стабильных комплексов с плазменными ингибиторами [59]. В результате этого про-Ук относительно стабильна в плазме крови, в то время как Ук быстро теряет свою активность в плазме.

Открытие рецепторов урокиназы на поверхности некоторых клеток позволило выявить новые функции Ук (и про-Ук) в организме человека. Было обнаружено, что Ук (и про-Ук) участвуют в процессах деградации белков внеклеточного матрикса при реконструкции тканей в нормальных или патологических условиях. Возможно именно это свойство является основной физиологической функцией Ук в организме.

Рецептор активатора плазминогена урокиназного типа (уАПР) - гликопротеин (55-60 кД), содержащий 311 аминокислотных остатков. Его молекула содержит три

гомологичных последовательных повтора. За связывание рецептора с доменом фактора роста У к отвечает его аминотерминальный фрагмент [187].

Реакция между связанной с рецептором Ук и ингибиторами протекает быстро. Связанная с рецептором Ук ингибируется ИАП-1, ИАП-2 и нексин-протеазой. Предварительно образованные комплексы Ук с ингибиторами также связываются с рецепторами урокиназы, хотя и характеризуются чуть более низким сродством, чем в случае свободной урокиназы. В отличие от свободного фермента, который способен оставаться на поверхности клеток в течение многих часов, комплексы фермент-ингибитор подвержены быстрой интернализации и деградации. Последний процесс требует поперечного связывания комплексов уАПР:Ук-ИАП с ещё одним рецептором: так называемым рецептором аг-макроглобулина. Это многофункциональный рецептор, который отвечает за связывание и эндоцитоз различных молекул [28].

Обычно концентрирование обеих форм урокиназы (Ук и про-Ук) на поверхности клеток сопровождается захватом плазминогена специфичными к нему рецепторами, строение и свойства которых пока изучены недостаточно. При этом превращение плазминогена в плазмин на поверхности клеток характеризуется более низкой Км (0.1-0.7 мкМ), чем в гомогенной среде (20 мкМ). Активация плазмином про-Ук, связанной с рецептором, также происходит в 20-50 раз эффективнее, чем в растворе [54]. Поэтому поверхности клеток, экспрессирующих рецепторы урокиназы и плазминогена, являются участками, благоприятствующими образованию плазмина. Связанный с мембраной плазмин, в отличие от плазмина, находящегося в растворе, оказывается защищенным от действия его специфического ингибитора а2-антиплазмина [187].

Активаторы плазминогена используются в качестве тромболитических агентов с конца пятидесятых годов. В качестве первых тромболитиков применяли кроме двухцепочечной урокиназы (Ук) и стрептокиназу [27].

Стрептокиназа (Ск) - белок (47 кД), получаемый из Р-гемолитических стрептококков активирует плазминоген непрямым путём. Ск связывается с плазминогеном с образованием комплекса, в котором плазминоген быстро претерпевает конформа-ционные изменения и экспонирует свой активный центр. Этот комплекс превращает другие молекулы плазминогена в плазмин.

Ко второму поколению тромболитических агентов относятся т-АП, про-Ук и анизоилированный плазминоген-стрептокиназный комплекс (АПСАК) [19]. Все они фибринспецифичны и считаются более эффективными тромболитическими агентами.

Тромболитические агенты третьего поколения представляют собой разработки мутантных и химерных форм активаторов плазминогена. Такие формы, обладающие повышенным сродством к фибрину, не привели к радикальному повышению эффективности тромболизиса в in vivo экспериментах [5]. В последнее время испытывают-ся мутантные формы тромболитиков с существенно большим временем полужизни в кровотоке (30 минут и более), действующая доза которых в опытах in vivo была существенно ниже, чем необходимая доза нативных ферментов [105].

6. Основные направления исследований, проводимых с целью повышения эффективности тромболитической терапии.

Подробное и полное описание проблематики можно прочитать в соответствующих обзорах [6,7,37], здесь более уместно кратко указать на самые главные направления исследований.

При выборе стратегии тромболитической терапии учитываются, кроме жизненных показателей пациента, следующие свойства тромболитического препарата: время жизни в кровотоке, удельная активность препарата, его иммуногенность, сродство препарата к компонентам тромба, уровень воздействия на системы тром-богенеза и тромболизиса в кровотоке. Считается, что идеальный тромболитик должен иметь сравнительно долгое время жизни в кровотоке, иметь высокую удельную активность (что важно для снижения стоимости лечения), не вызывать иммунный ответ и локально воздействовать на патогенный тромб (что должно обеспечиваться сродством препарата к компонентам тромба).

В настоящее время в лабораториях исследуются химерные молекулы, образованные генно-инженерным методом и обладающие свойствами исходных белков. К этим формам тромболитических препаратов можно отнести гибридные молекулы, состоящие из тромболитического фермента (или его части) и из белка (или части белка), имеющего аффинитет к компонентам тромба - фибрину и маркерам активированных тромбоцитов. В опытах на крысах, кроликах и собаках была показана перспективность использования подобных гибридных молекул для локализации действия фермента с соответствующим эффектом снижения дозы вещества и уменьшения побочных эффектов. Примером подобных гибридных молекул являются гибриды ТАП-УК, УК-фибриноген, ТАП-моноклональные антитела к фибрину.

Перспективными считаются также химические конъюгаты антител к тромбо-литическому ферменту и к компоненту тромба, которые расчитывают использовать в клинике для накопления в зоне тромба эндогенных активаторов плазминогена. Формой тромболитического препарата можно считать совмещение тромболитического фермента и бифункциональных антител, полученных против этого фермента и компонента тромба. Причем бифункциональные антитела могут состоять как из це-

лых молекул иммуноглобулинов, так и из их фрагментов. Методы получения таких комплексов постоянно расширяются и основной задачей исследований является уменьшение их размера, так как это ведет к уменьшению иммуногенности и к удешевлению самого препарата. Подобные комплексные препараты исследовались на моделях тромбоза у животных и были продемонстрированы определенные успехи при их использовании.

Наиболее разработанными тромболитическими препаратами являются мутант-ные рекомбинантные белки, в которых заменой одной или нескольких аминокислот добиваются существенного изменения биохимических свойств. «Золотым» стандартом для исследования терапевтического действия новых препаратов служит стреп-токиназа.

Один из таких белков - ретеплаза - по сравнению с нативным белком - ТАП -обладает большими временем жизни в кровотоке (Тщ = 36 мин) и сохраняет аффинитет к фибрину. В экспериментах in vitro мутантный белок был в 6.4 раз менее эффективен, чем ТАП. Но за счет большего времени жизни в кровотоке ретеплаза показала большую эффективность, чем ТАП в опытах in vivo, на модели венозного тромбоза кролика в 5.3 раза, а на модели коронарного тромбоза у собаки в 11.6 раз. В клинических исследованиях применение ретеплазы не привело к снижению краткосрочной (до 35 дней) смертности и к снижению уровня побочных эффектов. Интересно, что в клинике ретеплаза сравнивалась не только с ТАП, но и со стрептоки-щрой, и существенных отличий в эффективности, уровне смертности и побочных эффектов для этих препаратов обнаружено не было.

Стафилокиназа обладает, по сравнению со стрептокиназой, большей активностью и фибрин-специфичностью. Механизм действия этого белка позволяет локализовать фибринолитическую активность эндогенного плазмина, что приводит в кли-

нике к быстрому эффекту реканализации сосуда без существенных побочных эффектов. Недостатком этого препарата является его выраженная иммуногенность и короткое время жизни в кровотоке. Но с помощью методов генной инженерии предполагается усовершенствование этого препарата.

Десмодеин является наименее исследованным белком, хотя были уже проведены испытания на крысах, обезьянах и здоровых добровольцах. Приблизительно 80% препарата имеет время полувыведения 2,5 часа. Препарат не обнаружил выраженных побочных эффектов и, подобно стафилокиназе, не вызывает парадоксальную тромбогенную реакцию, наблюдаемую при применении «обычных» тромболитиков (УК, ТАП, СК). Парадоксальная реакция связана, как полагают, с системной активацией тромболитических ферментов. Очевидным недостатком этого препарата является его выраженная иммуногенность.

Наименее подробно в научной прессе обсуждается идея сочетанного применения уже производящихся тромболитических препаратов. Возможность использования положительных свойств разных препаратов с уменьшением дозы каждого из веществ и, соответственно, с уменьшением их побочных эффектов, не является коммерчески выгодным для фирм - производителей тромболитических лекарств. Хотя некоторые исследования как на экспериментальных животных, так и (в редких случаях) в клинике позволяют надеяться на возникновение интереса именно к таким формам тромболитической терапии.

Последнее направление тесно связано с такой возможностью повышения эффективности тромболитической терапии, как оптимизация способа введения вещества. В литературе показано несколько схем введения, каждая из которых признается авторами более действенной. Однако исследователи, обращая внимание на спе-

цифику биохимических свойств, часто уделяют меньше внимания различию в характере тромботического поражения сосуда.

Таким образом, можно постулировать, что в некоторых случаях масштабное исследование и поиск веществ, отвечающих требованиям, сформулированным без понимания биофизических и биохимических условий, в которых находится конкретный тромбированный сосуд, приводят в итоге к рождению еще одного препарата, который, при наличии плюсов в экспериментальных моделях, в клинических испытаниях не проявляет ожидаемого качественного улучшения терапии (ретеплаза, ТАП, про-УК по сравнению со стрептокиназой).

7. Проницаемость фибринового геля и кровяного сгустка.

В 70-х годах были начаты работы по изучению структуры фибринового сгустка с точки зрения его проницаемости для макромолекул [46]. Подобные работы проводились и раньше [67], но актуальность проницаемости фибринового геля для макромолекул возросла после открытия тромболитических препаратов [156], когда стало ясно, что качество тромболитической терапии будет зависеть от количества доставленного в тромб препарата [86]. Появились также методы визуализации тромба, основанные на доставке внутрь него визуализирующего агента [101,100,92]. Было выявлено, что величина светорассеяния фибринового сгустка зависит от его структуры: чем больше светорассеяние, тем больше отношение массы фибриллы к её длине [42]. Эта зависимость определяется формулой:

т=((88/15) * 7г3п * (с! п/с! с)2С * ¡д.)ЛЧ * Я,3

где т- величина светорассеяния, п- индекс преломления раствора, с1п/с1с- прирост индекса преломления при сканировании геля от 800 до 450 нм, Х- длина волны, С- концентрация фибриногена в г/мл, И- число Авогадро, (л,- отношение массы фиб-

риллы к её длине [Сагг М. Е., 1980.]. Для прозрачных гелей ц определяли по наклону кривой графика зависимости т от 1/А,3. Для более мутных гелей использовали формулу:

(С/т^^А^-'+В^Г/ц)*^2

где А=((88/15)713п(ёп/ас)2)/^т)"1, В=(92л:2п2/77)А, г- радиус фибриллы. Значение [I получали из пересечения графика зависимости С/т л3 от X2. Плотность фибриллы получали умножением ц, на 1 /тег3 [44].

Было показано, что увеличение концентрации кальция, уменьшение ионной силы, уменьшение концентрации тромбина вызывают увеличение размера фибрилл; кроме того, гель, образованный в плазме, состоит из фибрилл, которые в 2-4 раза массивней фибрилл, образованных из чистого фибриногена [45]. Увеличение концентрации иммуноглобулинов, альбумина, тромбоспондина, внутриклеточных белков и сурфактантов приводило к уменьшению толщины фибрилл [75,85,108,122]. Увеличение вязкости исходного раствора (например, с помощью глицерина или высоких концентраций ^О) с 1.4 до 1.9 сПз также приводило к уменьшению толщины фибрилл - отношение масса/длина изменялась с 7*1012 Д/см на 2*1012 Д/см [74]. Соответствие величины светорассеяния геля и его структуры было подтверждено с помощью электронной микроскопии [190].

Структура фибринового геля определяется количеством протофибрилл в фибрилле, которое, в свою очередь, определяется количеством связей между молекулами фибрин-мономера по принципу конец-к-концу или бок-к-боку. Считается, что при отщеплении тромбином фибринопептида А происходит ассоциация молекул по принципу конец-к-концу, а при отщеплении фибринопептида В, которое происходит гораздо медленнее, молекулы ассоциируют бок-к-боку [171]. Соответственно, факторы, влияющие на толщину фибрилл, смещают равновесие конкурирующих

реакций либо в сторону латеральной, либо в сторону концевой ассоциации прото-фибрилл [190].

Отношение массы фибриллы к её длине определяет и размеры пор в фибрино-вом геле. Чем массивней фибриллы, тем более крупные поры при одинаковой концентрации фибрина. Прямое измерение проницаемости фибринового геля - измерение количества жидкости протекшей через гель, позволило определить для этого геля коэффициент проницаемости (коэффициент Дарси) и теоретический размер пор. Коэффициент Дарси (Кб, в см2) рассчитывали по формуле:

Кв= 0*Ь*г|/1*А*ДР где О - объём жидкости (см3) с вязкостью г) (Пз), протекший через столб геля высотой Ь (см) и площадь А (см2) за время 1 (сек) при перепаде давления АР (дин/см2) [117].

Размер пор (г, в см) высчитывали, предполагая наличие цилиндрической капиллярной системы, капилляры которой параллельны течению жидкости:

г=(8*Кл/е)ш где е - доля исключенного объёма геля [192]

Было показано, что значение Кэ (1-3*10"9 см2) прямо пропорционально величине светорассеяния и обратно пропорционально времени свертывания. Эффективный размер пор фибринового геля определяли экспериментально, пропуская через гель латексные частицы определенного размера - их размер варьировал от 30 до 250 нм. Экспериментально определённый размер пор был в несколько раз меньше теоретически рассчитанного и было высказано предположение, что поры фибринового геля не соответствуют понятию Пуазейлевской поры (пора по Пуазейлю представляет собой расположенную вдоль течения жидкости круглую трубку одинакового по всей длине диаметра) [36]. Полученные данные свидетельствовали, с одной сторо-

ны, о проницаемости сгустка практически для всех макромолекул, встречающихся в организме (линейный размер, например, молекулы фибриногена 4x45 нм [204], а это одна из самых крупных белковых молекул), а с другой - о сложности структуры геля и изменчивости её под воздействием различных факторов.

Вследствие невозможности прогнозирования проницаемости in vivo тромбов были проведены работы по определению проницаемости сгустков, полученных из цельной крови человека. Определения проводились в системе подобной той, в которой проводились эксперименты на фибриновых гелях: через слой сгустка определенной высоты пропускали под давлением плазму крови и измеряли объём протекшей сквозь сгусток жидкости за единицу времени. Через сгусток длиной 2 см, диаметром 4 мм и при перепаде давления 3 кПа плазма просачивалась со скоростью 8 мкл/мин в первые 5 минут и 5 мкл/мин через 20 минут после начала эксперимента (Ks= 1.2*10"9 см2) [33]. При перепаде давления 3.7 кПа скорость протока через сгусток крови длиной 3 см и диаметром 4 мм составляла 50 + 24 мкл/мин (Ks= 9.2* 10"9 см2) [35]. Через ретрактированный сгусток крови такой же формы эта скорость была 1 мкл/мин при перепаде давления 6 кПа (Ks= 0.11*10"9 см2) [32]. Коэффициент Дарси (Ks) для каждого из сгустков был посчитан исходя из того, что 1 Па =10 дин /см2 и вязкость плазмы « 1.7*10"2 Пз.

Зависимость проницаемости сгустка от концентрации форменных элементов была продемонстрирована в опытах с эритроцитами, обработанными поливинил-пирролидоном. Сгустки, в которые были включены такие клетки, обладали большей проницамостью (за счет увеличенной агрегационной способности эритроцитов), чем сгустки с нормальными клетками. Включённые в сгусток эритроциты с пониженной способностью к деформации (обработка глютаровым альдегидом, диамидом

или нагреванием) уменьшали проницаемость, так как образовывали меньшее количество агрегатов и, соответственно, перекрывали большее число пор [186].

8. Биофизические характеристики тромболизиса.

Работы, посвященные изучению проницаемости сгустков проводились с целью повышения эффективности тромболитической терапии, основными показаниями к которой являются тромбозы глубоких вен, тромбоэмболы легочной артерии и тромбозы коронарных артерий [174,48]. Тромбозы глубоких вен часто приводят к различным органным заболеваниям (тромбофлебиты, нефротический синдром, синдромы нижней и верхней полых вен и т. д.), а также являются причиной тромбоэмболии лёгочной артерии [56]. В случае полного перекрытия тромбом просвета сосуда (в острых случаях) чаще прибегают к хирургическому вмешательству, а не к тромболитической терапии, несмотря на развитие методологии последней [188]. Это обусловлено тем, что венозные тромбы обладают большой массой и время, необходимое для их лизиса, может превышать лимит жизни пациента при данной патологии. Поэтому чаще терапевтическое вмешательство происходит на фоне относительно стабильного состояния больного - когда патология выражена, но есть необходимое для лизиса тромба время [94,80].

Иное дело обтурирующие артериальные тромбы: возникновение тромба в коронарной артерии приводит к острому инфаркту миокарда и, часто, к смерти пациента [140]. Для предотвращения фатальных последствий инфаркта необходимо восстановить кровоток в кратчайшие сроки, что не может быть обеспечено оперативным путем вследствие сложности подобной операции (баллонная катетеризация эффективна лишь при предварительно определенном ангиографическим методом месторасположении тромба). Поэтому применение тромболитических агентов при

инфаркте миокарда нашло широкое применение в технически развитых странах [164,83]. Тромбоз коронарной артерии часто служит причиной стабильной и нестабильной форм стенокардии и тромболитическкая терапия показана в некоторых случаях данного заболевания [112].

Артериальные тромбозы верхней и нижней конечностей могут привести к гангрене и поэтому также требуют срочного врачебного вмешательства. Применение тромболитических препаратов существенно снизило риск ампутации пораженной конечности [128]. Тромбы верхних конечностей чаще обусловлены миграцией пристеночных тромбов, возникших в гипокиничном (вследствие инфаркта миокарда) левом вентрикулярном сегменте сердца. Тромбоз, возникший вследствие поражения периферических артерий атеросклерозом, встречается существенно реже [193]. Артериальные тромбы нижних конечностей наоборот чаще вызваны атеросклеротиче-ским поражением, чем эмболизацией [55]. Однако тромболитическая терапия применялась с одинаковым успехом для лечения тромбов разной этиологии [193].

Применение тромболитических агентов часто приводит к осложнениям, связанным с системной активацией тромболитической системы крови. Геморрагическое поражение мозга приводит к смертельному исходу в 6-8% случаев применения тромболитиков при лечении инфаркта миокарда [183]. Одним из факторов снижения риска применения тромболитиков является оптимизация схемы их введения. Например, введение двух доз по 35 мг tPA с интервалом 30 минут обеспечивало при лечении инфаркта миокарда эффект не меньший, чем введение 100 или 150 мг того же препарата в других режимах (разовое введение 100 мг или введение 10 мг разово и затем введение 140 мг в течение 3 часов) [77].

С целью разработки оптимального режима рядом исследовательских групп были проведены работы по построению математических моделей, количественно

описывающих процесс лизиса артериального тромба. Эти модели основывались на следующих экспериментально полученных данных:

- фибриновая сеть занимает около 1 % объёма фибринового или плазменного сгустка, фибрин-связанная вода (которая потенциально может препятствовать диффузии макромолекул) составляет не более 2% от общего объёма воды в подобных гелях [34];

- размеры пор кровяного сгустка достаточно велики ( 0.3-5 мкм - в 10-100 раз больше диаметра активатора плазминогена) и не создают препятствий для проникновения макромолекул в том случае, если эти молекулы не обладают способностью связываться со структурными компонентами сгустка [60,43];

- эффективность лизиса тромба существенно увеличивается (приблизительно в 50 раз) при перфузии тромболитического агента под давлением. Эксперименты проводились in vitro на ретрактированных и неретрактированных кровяных сгустках, в качестве тромболитика использовали урокиназу и tPA [32,35,202]. В in vivo экспериментах повышение артериального давления также вызывало ускорение тромболи-зиса при введении t РА пациентам с инфарктом миокарда, причем данный эффект не зависел от величины сердечного выброса [153,154,76];

- лизис сгустка при перфузии тромболитика под давлением проходит неравномерно по фронту сгустка: образуется «пальцеобразная» (finger-like) зона лизиса по центру фронта; это явление объясняется неравномерностью структуры сгустка - наличием клеточных агрегатов, препятствующих проникновению тромболитика [33,202]; возможно, что это явление может быть объяснено локальным повышением концентрации плазминогена и плазмина в зоне фибринолизиса [161,162], причем показано, что фибринолиз протекает при наличии плазминогена хотя бы в одной из фаз (геле или жидкости) [97].;

- концентрация фибринолитического агента на поверхности зависит только от скорости его элиминации из кровотока - считается, что поверхность сгустка экспонирована непосредственно в кровоток; это обусловливается недостаточностью знаний о скорости доставки агента из системного кровотока к месту закупорки сосуда [14,15,16];

- эффективность применения тромболитических агентов увеличивается при доставке препарата в обтурированную артерию или непосредственно в тромб in vivo [179,63,90,24,185,102,128]

- использование механического воздействия на тромб (ультразвук (1 Мгц, < 8 Вт/см2) [70] или введение тромбо логического агента методом "пульсирующей струи" ("pulsed-spray") [148]) также уменьшает время тромболизиса;

Приведённые выше наблюдения касаются только физических параметров такого сложного процесса как тромболизис. Если добавить к ним ещё и биохимические факторы, такие как концентрации ферментов и ингибиторов, скорости реакций их взаимодействия и т.д., то получается очень громоздкая система уравнений, которая решается только численными методами с использованием современной вычислительной техники [167,14,16,32,35,202]. Несмотря на некоторые успехи в математическом описании тромболизиса, пока - даже предварительно - не были выработаны рекомендации по оптимизации схемы введения тромболитического препарата для минимизации побочных эффектов [15,31].

Заключение

В качестве заключения можно сказать, что условия образования тромба обусловливают особенности его структуры, которая определяет скорость распределения макромолекул между кровью и структурой тромба. В случае обтурирующего артери-

ального тромба возникает ситуация, при которой важную роль играет скорость мас-сообмена между поверхностью тромба и системным кровотоком.

Данные о распределении макромолекул могут иметь значение не только для оптимизации применения тромболитических и визуализирующих тромб препаратов в зависимости от места расположения тромба и механических характеристик обту-рированного сосуда, но и для понимания процессов роста и лизиса тромба в сосудистом русле.

Целью нашей работы было изучение массообмена в зоне закупоривающего сосуд артериального тромба.

Были поставлены следующие задачи:

1. Выявить связь между количеством доставленного в тромб тром-болитического агента и скоростью лизиса сгустка in vitro с помощью использования бифункциональных антител к фибрину и к урокиназе.

2. Определить значимость физических ограничений для процесса проникновения макромолекул внутрь ретрактированного кровяного сгустка.

3. Выяснить проницаемость для макромолекул структуры артериального тромба in vivo в условиях пульсирующего давления и значимость явления фильтрации в данном процессе.

4. Определить скорость движения макромолекул из системного кровотока к поверхности обтурирующего артериального тромба, т.е. оценить интенсивность перемешивания крови в участке от устья закупоренного сосуда до места его закупорки.

5. Определить особенности доставки проурокиназы к месту пережатия артериального сосуда in vivo.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Матвеев, Максим Юрьевич

ВЫВОДЫ

1 .Использование конъюгата моноклональных антител к фибрину и к урокина-зе обеспечивало снижение действующей дозы урокиназы в 30 раз при лизисе сгустка плазмы in vitro.

2.В опытах in vitro включение в плазменный сгусток форменных элементов крови не создает существенных дополнительных ограничений для диффузии в таком сгустке макромолекул.

3.Показано in vivo практически полное отсутствие фильтрации через обтури-рующий тромб сонной артерии кролика при перепадах давления 60 - 120 мм рт ст.

4.Интенсивность массообмена жидкости в закупоренном участке артерии на 45 порядков выше скорости диффузии и обеспечивается, в основном, эластичностью стенки сосуда и пульсовым характером давления.

5.Через 10-30 минут после внутривенного введения концентрация рекомби-нантной проурокиназы в некоторых участках закупоренной сонной артерии кролика превышает концентрацию этого фермента в кровотоке на соответствующих временах.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Матвеев, Максим Юрьевич, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Балуда В. П., Сушкевич Г. Н., Лукоянова Т. И. Роль простагландинов, тромьоксанов и простациклина в регуляции процесса агрегации и реакции освобождения тромбоцитов в норме и при патологии. - Патол. Физиол. Экспер. Терапия, 4, 80-85, 1980.

2. Бышевский А. Ш., Терсенов О. А., Галян С. Л. и др. Биохимические компоненты свертывания крови. - Свердловск: из-во Свердловского ун-та, с. 212, 1990.

3. Банков В. Н. Строение вен. Москва. Медицина. 1974.

4. Зубаиров Д. М. Биохимия свертывания крови. - М.: Медицина, с. 176,

1978.

5. Максименко А. В. Молекулярные взаимодействия при фибринолизе. Поиск новых активаторов плазминогена. Молек. биол., 1, 38-60, 1995.

6. Максименко А. В. Мутантные и гибридные белковые производные для экспериментальной терапии активаторами плазминогена. Хим.-фарм. журнал, 28, N5, 4-11, 1994;

7. Максименко A.B. Стратегия тромболизиса: сочетанное действие активаторов плазминогена. Тромболитические композиции. Хим.-фарм. журнал, 32, N 4, 12-16, 1998.

8. Матвеев М. Ю., Боровиков Д. В., Голубых В. Л., Домогатский С. П. Исследование массопереноса в закупоренной артерии кролика in vivo. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 125 : 388-391. 1998.

9. Регирер С. А. Реология крови. М. 1980.].

Ю.Сахаров Д. В., Матвеев М. Ю., Домогатский С. П. Связывание аффинного лиганда с объёмной мишенью: роль дифузионных ограничений. Биофизика, 36, 49-55, 1991.

П.Степанова В.В., Гончарова Е.А., Бибилашвили Р.Ш., Ткачук В.А. Роль "ростового" домена урокиназы в миграции гладкомышечных клеток. Физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 83 (11-12) : 158-167. 1997.

12.Черняк Н. Б. Биохимические аспекты функциональных свойств тромбоцитов в системе PACK, в кн.: Проблемы и гипотезы в учении о свертывании крови. Под ред. Гаврилова О. К.,- М., Медицина, с.38-57, 1981.

13.Altura B. M, Brooklyn N. Y., (Edrs) In: Vascular Endothelium and Basement Membranes. Basel-Munchen-Paris-London-New York-Sydney, V.9, p. 119-128. 1980.

14.Anand S., Diamond S. L. Computer Simulation of Systemic Circulation and Clot Lysis Dynamics During Thrombolytic Therapy That Account for Inner Clot Transport and Reaction. Circulation. 94;763-774. 1996.

15.Anand S., Kudallur V., Pitman E.B., Diamond S. L. Mechanisms by which thrombolytic therapy results in nonuniform lysis and residual thrombus after reperfusion. Ann. Biomed. Engineering, 25, 964-974, 1997.

16.Anand S., Wu J-H., Diamond S. L. Enzyme-mediated fibrinolysis of fibrous biopolymers: dissolution front movement in fibrin and collagen under conditions of diffusive or convective transport. Biotecnology and Bioengineering., 48, 89-107, 1995.

17.Araki H., Nishi K., Jougasaki M. Effects of thrombosis on vascular tone in rat mesentric arteries with endothelium in vitro. Circ. Res., 67, 312-318, 1990.

18.Ashton J. H., Benedict C. R., Fitzgerald C., et al. Serotonin as a mediator of cyclic floww variations in stenosed canine coronary arteries. Circulation. 73,572-578. 1986.

19.BachmannF. Fibrinolytic agents. Fibrinolysis, 9(1), 9-15. 1995

20.Badylak S. F., Poehlman E., Williams C., Klabunde R. E., Turek J., Schoenlein W. Simple canine model of arterial thrombosis with endothelial injury suitable for investigation of thrombolytic agents. J. Pharmac. Meth., 19, 293-304, 1988.

21.Barbenel J. C. The Arterial Wall in: Arteries and Arterial Blood Flow., ed.: Rodkiewicz. Springer Verlag, Wien - New York. p. 145-146. 1983.

22.Barnhart M. I. Platelet responses in health and desease. Mol. Cell. Biochem., 22, 113-137, 1978.

23.Barstad R. M., Orvim U., Hamers M. J., Tjonnfjord G. E., Brosstad F. R., Sakariassen K. S. Reduced Effect of Aspirin on Thrombus Formation at High Shear and Disturbed Laminar Blood Flow. Thromb. Haemost.75 (5):827-832. 1996.

24.Berridge D. C., Gregson R. H. S., Hopkinson B. R., makin G. S. Randomized trial of intra-arterial recombinant tissue plasminogen activator, intravenous recombinant tissue plasminogen activator aaand intra-arterial streptokinase in peripheral arterial thrombolysis. Br. J. Surg.. 78, 988-995; 1991.

25.Bevilacqua C., Finesso M., Prosdocimi M. Acute Carotid Artery Occlusive Thrombosis and its Pharmacological Prevention in the Rabbit. Thromb. Res., 62, 263273, 1991.

26.Bevilacqua C., Finesso M., Prosdocimi M. Acute Carotid Artery Occlusive Thrombosis and its Pharmacological Prevention in the Rabbit. Thromb. Res. 62 : 263273. 1991.

27.Binder B.R. Physiology and pathophysiology of the fibrin system. Fibrinolysis, 9(1), 3-8, 1995.

28.Blasi F., Conese M., Moller L.B. et al. The urokinase receptor: structure, regulation and inhibitor-mediated internalisation. Fibrinolysis, 8(1), 182-188, 1994.

29.Blast F., Vassah J.-D., Dano K. Urokinase-type plasminogen activator: proenzyme, receptor and inhibitors. J, Cell. BioL, 104, 801-804, 1987.

30.Blinc A., Francis C. W. Transport processes in fibrinolysis and fibrinolytic therapy. Thromb. Haemos., 76, 481-491, 1996.

31.Blinc A., Francis C. W. Transport processes in fibrinolysis and fibrinolytic therapy. Thromb. Haemost. 76 (4) : 481-491. 1996.

32.Blinc A., Keber D., Lahajnar G., Stegnar M., Zidansek A., Demsar F. Lysing patterns of retracted blood clots with diffusion or bulk flow transport of plasma with urokinase into clots - a magnetic resonance imaging study in vitro. Thromb. Haemost., 68, 667-671, 1992.

33.Blinc A., Kennedy S. D., Bryant R. G., Marder V. J.„ Francis C. W. Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis. Thromb. Haemost., 71, 230235, 1994.

34.Blinc A., Lahajnar G., Blinc R., Zidansek A., Sepe A. Proton NMR study of the state of water in fibrin gels, plasma and blood clots. Magn. Res. Med., 14, 105-122, 1990.

35.Blinc A., Planinsic G., Keber D., Jarh O., Lahajnar G., Zidansek A., Demsar F. Dependence of blood clot lysis on the mode of transport of urokinase into the clot - a magnetic resonance imaging study in vitro. Thromb. Haemost., 65, 549-552, 1991.

36.Blomback B., Okada M. Fibrin gel structure and clotting time. Thromb. Res., 25, 51-70, 1982.

37.Bode C , Nordt T.K., Peter K„ Ruef J., Runge M.S., Kubler W. Targeting of thrombolytic and antithrombotic agents. Fibrinolysis and Proteolysis, 11, Suppl.2, 67-70, 1997;

38.Brommer E. J. P., Potter van Loon B. J., Rijken D. C., Van Bockel J. H. Composition and Susceptibility to Thrombolysis of Pathological Human Arterial Thrombi. Ann. N. Y. Acad. Sci., 667, 283-285, 1992.

39.Brommer E. J. P., Potter van Loon B. J., Rijken D. C., Van Bockel J. H. Composition and Susceptibility to Thrombolysis of Pathological Human Arterial Thrombi. Ann. N. Y. Acad. Sci. 667 : 283-285. 1992.

40.Burton A. C. Physiology and Biophysics of the Circulation. Chicago, 1965.

41.Carr M. E., Carr S. L. Fibrin Structure and Concentration Alter Clot Elastic Modulus but do not Alter Platelet Mediated Force Development. Blood Coagulation and Fibrinolysis, V. 6, 79-86, 1995.

42.Carr M. E., Gabriel D. A. Dextran-induced changes in fibrin fiber sixe and density based on wavelength dependence of gel turbidity. Macromolecules, 13,14731477,1980.

43.Carr M. E., Hardin C. L. Fibrin has larger pores when formed in the presence of erythrocytes. Am. J. Physiol., 253, H1069-H1073, 1987.

44.Carr M. E., Hermans J. Size and density of fibrin fibers from turbidity. Macromolecules, 11, 46-50, 1978.

45.Carr M. Fibrin formed in plasma is composed of fibers more massive than those formed from purified fibrinogen. Thromb. Haemost., 59(3), 535-539, 1988.

46.Carr M. Jr., Shen L. 1., Hermans J. Mass-length ratio of fibrin fibers from gel permeation and light scattering. Biopolymers,16, 1-15, 1977.

47.Cohen I. Contrctile Platelet Proteins. In: Hemostasis and Thrombosis - Basic Principles and Clinical Practice. Colman R. W., Hirsh J., Marder V. J., Salzman E. W. (Eds.) Lippincott, Philadelphia-Toronto, p. 459-471. 1982.

48.Collen D. C., Gold H. K. New developments in thrombolytic therapy. Thromb. Res., Suppl. X, 105-131, 1990.

49.Collen D., Stassen J. M., Verstraete M. Thrombolysis with human extrinsic (tissue-type) plasminogeh activator in rabbits with experimental jugular vein thrombosis. J. Clin. Invest., 71, 368-376, 1983.

50.Coller B. S., Folts J. D., Smith S. R., Scudder L. E., Jordan R. Abolition of in vivo thrombus formation in primates with monoclonal antibodies to the platelet GP Ilb/IIIa receptor. Circulation, 80, 1766-1774, 1989.

51.Collins R. And Hu W.C., Dynamic Deformation Experiments on Aortic Tissue, J. Biochem. 5, 333-337, 1972.

52.Cubellis, M. V., T-Ch. Wun, F. Blasi. Receptor-Mediated Internalization and Degradation of Urokinase is Caused by its Specific Inhibitor PAI - 1. EMBO. 9 (4), 1079-1085, 1990.

53.d'Arcy, Thompson W. On Growth and Form. MacMillan, London. 1945.

54.Dano KL., Behrendt N., Brunner N. et al. The urokinase receptor. Proteins structure and role in plasminogen activation and cancer. Fibrinolysis, 8(1), 189-203, 1994.

55.Dardik H., Sussman B. C., Kahn M. Lysis of arterial clot by intravenous or intra-arterial administration of streptokinase. Surg. Gynecol. Obstet., 158, 137-140, 1984.

56.Davies G. C., Salzman E. W. The Pathogenesis of Deep Vein Thrombosis, in Venous and Arterial Thrombosis, eds Joist J. H., Sherman L. A., Grune and Stratton, Inc., New York, 1979.

57.Davies M. J. The role of piaque pathology on coronary thrombosis. Clin. Cardiol. Suppl I.,I-l-I-7, 1997.

58.Day T. K., Cowper S. V., Kakkar V. V., Clark K. G. A. Early venous thrombosis. A scanning electron microscopy study. Thromb. Haematol. (Stuttg), 37, 477-483, 1977.

59.de Munk G. A.W., Rijken D.C. Fibrinolytic properties of single-chain urokinase-type plasminogen activator (pro-urokinase). Fibrinolysis., 4, 1-9, 1990.

óO.Diamond S., Anand S. Inner clot diffusion and permeation during fibrinolysis. Biophys. J., 65, 2622-2643, 1993.

61.Dotter C. T., Rosch J., Seaman A. J. Selective clot lysis with low-dose streptokinase. Radiol., Ill, 31-37, 1974.

62.Doutremepuich C., Gestreau J. L., Doutremepuich F., Lalnne M. C., Kuttler M. C., Toulemonde F. Is there an optimal therapeutical range for low molecular weight heparine? An experimental study. Thromb. Res., 50, 575-581, 1988.

63.Duetch E., Ehringer H. Thrombolytic therapy in chronic arterial occlusions. J. Clin. Pathol., 25, 644, 1972.

64.Duffy M.G. Urokinase-type plasminogen activator and malignancy. Fibrinolysis, 7, 295-302, 1993.

65.Duncan R. J. S., Weston P. D., Wrigglesworth R.) A new reagent which may be used to introduce sulfhydryl groups into proteins and its use for preparation of conjugates for immunoassay. Anal Biochem 132, 68-73, 1983.

66.Falk E. Unstable angina with fatal outcome dynamic coronary thrombosis leading to infarction and/or sudden death: autopsy evudence of recurrent mural thrombosis with peripheral embolization culminating in total vascular occlusion. Circulation,71, 699-708, 1985.

67.Ferry J. D., Morrison P. R. Preparation and properties of serum and plasma proteins. VIII. The conversion of human fibrinogen to fibrin under various conditions. J. Am. Chem. Soc., 69, 388-400, 1947.

68.Folts J. D., Crowell E. B., Rowe G. G. Platelet aggregation in partially obstructed vessels and its elimination with aspirin. Circulation, 54, 365-370. 1976.

69.Folts J. D., Rowe G. G. Cyclic reduction in coronary blood flow in coronary arteries with partial obstruction and their inhibition with aspirin (abs). Fed. Proc. 33. 413. 1974.

70.Francis C. W., Onundarson P. T., Carstensen E. L., Blinc A., Meltzer R. S., Schwarz K., Marder V. J. Enhancement of fibrinolysis in vitro by ultrasound. J. Clin. Invest., 90, 2063-2068, 1992.

71.Frieman D. G., The structure of thrombi. In: Hemostasis and Thrombosis: Basic principles and clinical practice, 2nd ed. Colman R. W., Hirsh J., Marder V. J., Salzman E. W., eds. J. B. Lippincott Company, Philadelphia, 1123-1135, 1987.

72.Fukami M. H., Salganicoff L. Human platelet storage organelles., Thromb. Haemost., 38, 963-970, 1977.

73.Fung Y. C. Biomechanics, Mechanical Properties of Living Tissues. Springerverlag, New-York - Heidelberg T E^rlin. 1981.

74.Gabriel D. A., Smith L. A., Folds J. D., Davis L., Cancelot S. E. The influence of immunoglobulin (IgG) on the assembly of fibrin gels. J. Lab. Clin. Med., 1, 545-552, 1983.

75.Galanakis D. K., Lane B. P., Simon S. R. Albumin modulates lateral assembly of fibrin polymers: evidence of enhanced fine fibril formation and of unique synergism with fibrinogen. Biochemistry, 26, 2389-2400, 1989.

76.Garber P. J., Mathieson A. L., Ducas J., Patton J. N., Geddes J. S., Prewitt R. M. Thrombolytic therapy in cardiogenic schock: effect of increased aortic pressure and rapid tPA administration. Can. J. Cardiol., 11, 30-36, 1995.

77.Gemmili J. D.„ Hogg K. J., Maclntyre P. D., Bootth N., Rae A. P., Dunn F. G., Hillis W. S. A pilot study of the efficacy and safety of bolus administration of alteplase in acute myocardial infarcttion. Br. Heart J., 66,134-138,1991.

78.Girolami A., Simioni P., Scarano L., Girolami B. Venous and Arterial Thrombophilia. Haematologica. 82(1):96-100. 1997.

79.Godleski J. J. Pathology of Deep Venous Thrombosis and Pulmonary Embolism, in Pulmonary Embolism and Deep Venous Thrombosis. Ed. Goldhaber S. Z. W. B. Saunders Company. London-Tokyo. 1985.

80.Goldhaber S. Z. Strategies for management, in Pulmonary Embolism and Deep Venous Thrombosis. Ed. Goldhaber S. Z. W. B. Saunders Company. London-Tokyo. 1985.

81.Gordon J. L., Milner A. J. Blood platelets as multifunctional cells. - In: Platelet in biology and pathology. Gordon (ed ), Elsevier/North- Holland Biomedical Press, 3-22, 1976.

82.Goto S., Ikeda Y., Murata M., Handa M., Takahashi E., Yoshioka A., et al. Epinephrine Augments von Willebrand Factor-Dependent Shear-Induced Platelet Aggregation. Circulation, 86 (6):320-329. 1992.

83.Gotsman M.S., Rozenman Y., Admon D., Mosseri M., Lotan C., Zahger D., Weiss A T. Changing paradigms in thrombolysis in acute myocardial infarction. Int. J. Cardiol. 59(3), 227-42,1997.

84.Gross J. F. The Significance of Pulsatile Hemodynamics, p. 365. from G. Kaley, B. M. Altura (eds.) Microcirculation Vol. 1, University Parrk Press, Baltimore. 1977.

85.Gunther A., Kalinowsky M., Rosseau S., Seeger W. Surfactant markedly alters mechanical properties of a fibrin clot. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 13, 712-718, 1995.

86.Haber E., Runge M., Bode C.„ Branscomb B., Schnee J., Quertermous T., MatsuedaG. Antibody targeted thrombolysis. Thromb. Haemost.,57,253, 1987.

87.Hagberg I. A., Roald H. E., Lyberg T. Platelet Activation in Flowing Blood Passing Growing Arterial Thrombi. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 17 (7): 13311336. 1997.

88.Halliwell B. Free radicals, reactive oxygen species and human desease: a crirical evaluation with special reference to atherosclerosis. Br. J. Exp. Pathol. 70,737-757,

1989.

89.Haskel E. J., Adams S.P., Feigen L. P., Saffitz J. E., Gorczynsky R. J., Sobel B. E., Abendschein D. R. Prevention of reoccluding platelet-rich thrombi in canine femoral arteries with a novel peptide antagonist of platelet glycoprotein Ilb/IIIa receptors. Circulation, 80, 1775-1782, 1989.

90.Hess H., Ingrish H., Mietaschk A., Rath H. Local low-dose thrombolytic therapy of peripheral arterial occlusions. New Engl. J. Med., 307, 1627-1630, 1982.

91.Hicks M. E., Picus D. Darcy M. D., Kleinhofer M. A. Multilevel infusion catheter for use with thrombolytic agents. JVIR, 1, 73-75, 1991.

92.Hlghman J. H., O'Sallivan E., Thomas E. Isotope venography. Br. J. Surg., 60, 52-60, 1973.

93.Hladovec J. A sensitive model of venous thrombosis in rats. Thromb. Res., 43, 539-544, 1986.

94.Hoagland P. M., Massive pulmonary embolism, in Pulmonary Embolism and Deep Venous Thrombosis. Ed. Goldhaber S. Z. W. B. Saunders Company. LondonTokyo. 1985.

95.Hsia J., Hamilton W. P., KleimanN., Roberts R., Chaitman B. R., Ross A. M. A comparision between heparin and low-dose aspirin as adjunctive therapy with tissue-plasminogen activator for acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med., 323, 1433-1437,

1990.

96.Husain S., Gurevich V., Lipinski B. Purification and partial characterisation of a single-chain high-molecular weight form of urokinase from human urine. Arch. Biochem. Biophys., 220, 31-38, 1983.

97.1ga Y., Stella S R., Chandler A.B. Kinetics of urokinase-indused thrombolysis in a biphasic in vitro system. Haemost., 15, 189-197, 1985.

98.Jang I-K., Gold H. k., Ziskind A. A., Fallon J. T., Holt R. E., Leinbach R. C , May J. W., Collen D. Differential sensitivity of erythricyte-rich and platelet-rich arterial

thrombi to lysis with recombinant tissue-type plasminogen activator. Circulation. 79,920928, 1989.

99 Jen C. J., Mclntire L. V. Platelet Microtubules in Clot Structure Formation and Contractile Force Generation: Investigation of a Contrversy. Thromb. Haemost., 56(1), 23-27, 1986.

100.Johnson W. C., Patten D. H., Widrich W. C., et al. Technetium 99m isotope venography. Am. J. Surg., 127, 424-428, 1974.

101.Kakkar V. V. The diagnosis of deep vein thrombosis using the 1251-fibrinogen test. Arch. Surg., 104, 152-159, 1977.

102.Kandarpa K., Chopra P. S., Aruny J. E., Polak J. F., Donaldson M. C., Whit-temore A. D., Mannick J. A., Goldhaber S. Z., Meyerovitz M. F. Intraarterial thrombolysis of lower extremity occlusions: prospective, randomized comparison of forced periodic infusion and conventional slow continuos infusion. Radiology, 188, 861-867, 1993.

103.Kappert A., Etat actuel de la phlebologie. Ciba symposium, 15, 113, 1967.

104.Keller J. W., Folts J. D. Combined inhibitory effects of aspirin and ethanol on adrenaline exacerbation of acute platelet thrombus formation in stenosed canine coronary arteries. Circ. Res., 24, 191-197, 1990.

105.Keyt B. A., N. F. Paoni, C. J. Refino, L. Berleau, H. Nguyen, A. Chow, J. Lai, L. Pena, C. Pater, J. Ogez, T. Etcheverry, D. Botstein, W. F. Bennett. A faster-acting and more potent form of tissue plasminogen activator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3670-3674, 1994.

106.Kielberg V., Andreasen P.A., Grondahl-Hansen J., Nielsen L.S., Scriver L., Dano K. Proenzyme to urokinase-type plasminogen activator in the mouse in vivo. FEBS Lett, 182(2), 441-445, 1985.

107.Kinlough-Rathbone R. E., Packman M. A., Mustard J. F. Vessel injury, platelet adherence and platelet survival. Arteriosclerosis, 3, 529-546, 1983.

108.Kruithof E.K.O., Ransijn A., Bachmann F. Influence of detergents on the measurement of the fibrinolytic activity of plasminogen activators. Thromb. Res., , 28; 251-260. 1982.

109.Kruithof E. K., Tran-Trang C., Bachmann F. The fast-acting inhibitor in plasma is also the primary plasma inhibitor of urokinase. Thromb.and Haemost., 55, 6569, 1986

1 lO.Kurz K. D., Main B. W., Sandusky G. I. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb. Res. 60, 269-280, 1990.

111 .Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature., 227, 680-685, 1970.

112.Leschke M., Schoebel F. C., Schannwell C. M., Peters A. J., Jax T. W., Mecklenbeck W., Strauer B. E. Chronic intermittent urokinase therapy: anti-ischemic and hemodynamic effects. Z. Kardiol, 86 Suppl 1, 85-94, 1997.

113.Lijnen H.R., Stump D.C., Collen D.C. Single-chain urokinase-type plasminogen activator: mechanism of action and thrombolytic properties. Seminars in Thromb. andHaemost., 13(2). 152-159, 1987.

114.Lipowsky H. H., Usami S., Chien S. In vivo Measurements of "appearent viscosity" and Microvascular Hematocrit in the Mesentery of the Cat. Mcrovasc. Res. 19, 297, 1980.

115.Lusher E. F. Stimulation of calcium uptake in platelet mambrane vesicles by adenosine 3',5'-cyclic monophosphate and protein kinase. Biochem. Biophys. Act., 466479, 1977.

llô.Madras P. N., Morton W. A., Petschek H. E. Dynamics of thrombus formation. Fed. Proceedings, 30, 1665-1676, 1971.

117.Madras S., Mcintosh R. L., Mason S. C. A preliminary study of the permeability of cellophane to liquids. Can. J. Res. Sect. B., 27B, 764-779, 1949.

118.Mann K. L. Membrane-bound enzyme complexes in blood coagulation. Prog. Hemost. Thromb., 7, 1-23, 1984.

119.Marchesi V. T. Disturbances of body water and circulation of blood. In Pathology . W. A. D. Anderson and J. M. Kissane, eds. The CV Mosby Company, Saint Louis, MO. 148, 1977.

120.Marder, V. J., C. W. Francis. Thrombolytic Therapy for Acute Transmural Myocardial Infarction. Intracoronary versus Intravenous. Am. J. Med. 77, 921-928, 1984.

121.Marsi M.A., Marsi S.A., Boyd N.D. Isolation of human fibrinogen of high purity and in high yield using polyethyllene 1000. Thromb. Haemostasis 49, 116-119, 1983

122.Marx G., Harari N. Albumin indirectly modulates fibrin and protofibrin ultrastructure. Biochemistry, 28, 8242-8248, 1989.

123.Massad L., Plotkine M., Capdeville C., Boulu R. G. Electrically induced arterial thrombosis model in conscious rat. Thromb. Res., 48, 1-10, 1987.

124.Massini P., Na U., Lusher E. F. Clot Retraction does not Requuires Ca++ Ions and Depends on Continuous Contractile Activity. Thromb. Res., 27, 751-756, 1982.

125.Mattsson, C., S. Nilsson, L. Haggroth. Human Extrinsic Plasminogen Activator. Fibrinolytic Properties and Neutralization in vivo. Thromb. Res. 30, 91-100, 1983.

126.Mc Gregor R. Diffusion and sorption in fibers and films. Vol.1, Ch.2,: The Brownian motion and the continuum approximation. Academic Press, London and NY, pp. 12-18, 1974,

127.McNamara T. O. The use of lytic therapy with endovascular «repair» for the failed infrainguinal graft. Sem. Vase. Surg., 3, 56-65, 1990.

128.McNamara T. O., Fisher J. R. Thrombolysis of peripheral arterial and graft occlusions: Improved results using high-dose urokinase. A. J. R., 144, 769-775, 1985.

129.Mewissen M. W., Minor P. L., Beyer G. A., Lipchick E. O. Symptomatic native arterial occlusions: early experience with «over-thewire» thrombolysis. JVIR, 1, 4347, 1990.

130.Meyerovitz M. F., Goldhaber S. Z., Reagan K., Polak J. F., Kandarpa K., Grassi C. J., Donovan B. C., Bettmann M. A., Harrington D. P. Recombinant tissue-type plasminogen activator versus urokinase in peripheral arterial and graft occlusions: a randomized trial. Radiology, 175, 75-78, 1990.

131.Millet J., Theveniaux J., Pascal M. A new experimental model of venous thrombosis in rats involving partial stasis and slight entothelium alterations. Thromb. Res., 45, 123-133, 1987.

132.Milnor W. R. Capillaries and lymphatic vessels. In: Medical Physiology, Vol. II, 13th ed. Mountcastle V. B., ed. The C. V. Mosby Co., St Louis, pp 984-992, 1974

133.Mizuno K., Satomura K., Miyamoto A., Arakawa K., Shibuya T., Arai T., Kurita A., Nakamura H., Ambrose J. A. Angioscopic Evaluation of Coronary-Artery Thrombi in Acute Coronary Syndromes. N. Engl. J. Med. 326;287-291. 1992.

134.Moncada S., Vane J. R. Arachidonic acid metabolites and the interaction between platelets and blood-vessel walles. N. Engl. J. Med., 300, 1142-1147, 1979.

135.Morishita K., Wada M., Kumada T., Tanaka T., Tomikawa M., Iwamoto M. Effect of ticlopidine and other antithrombotics on the venous thrombosis induced by endothelium damage of jugular vein in rats. Thromb. Res., 63, 373-384, 1991.

136.Moschos C. B., Olderwutrel H. A., Haider B., Regan T. J. Effect of coronary thrombus age on fibrinogen uptake. Circulation, 54, 653-656, 1976.

137.Mueller B. M., Wrasidlo W. A., Reisfeld R. A. Determination of the number of e-aminogroups avalable for conjugation of effector molecules to monoclonal antibodies. Hibridoma, 7, 453-456, 1988.

138.Mustard J. F. Thrombosis and Arterial Desease, in Venous and Arterial Thrombosis, eds Joist J. H., Sherman L. A., Grune and Stratton, Inc., New York, 1979.

139.Myers D. E., Uckun F. M., Swaim S. E., Vallera D. A. The effect of aromatic and aliphatic maleimide crosslinkers on anti-CD5 ricin immunotoxins. Immunol. Meth., 121, 129-142, 1989.

140.Neuhaus K. L. Coronary thrombosis - defining the goals, improving the outcome. Clin. Cardiol. SupplL, I-8-I-13, 1997.

141.Nguen P. D., O'Rear E. A., Johnson A. E., Patterson E., Wnitsett T. L., Bhakta R. Accelerated thrombolysis and reperfusion in a canine model of miocardial infarction by liposomal encapsulation of streptokinase. Circl. Res., 66, 875-878, 1990.

142.Nguyen G., Fretault J., Samama M.. Coursaget J. Thrombolytic properties of tissue plasminogen activator and single chain urokinase plasminogen activator in vitro: absence of synergy as demonstrated by two quantitave analytical methods. Fibrinolysis, 3(23), 23-26, 1989.

143.Nickols W. W., Nicolini F. A., Saldeen T. G. P., Mehta J. L. Combined thrombolytic effects of tissue-plasminogen activator and a fibrinogen-degradation product peptide 6A or Iloprost. J. Cardiovasc. Pharmacol.., 18, 231-236, 1991.

144.Nieurarowsky S., Thomas D P. Platelet aggregation by ADP and thrombin. Nature, 212, 1544-1547, 1966.

145 Novo S., Scaglione R., Abrignani M. G., Liquori M., Sanguini V., Licata G., Strano A. Arterial Compliance and its Relationship with the Severity of the Hypertehsive State, in Advances in Vascular Pathology, eds. Strano A. and Novo S., v.2 p. 875-880. 1989.

146.0" Shannessy D. J., Quarles R. H. Labeling of the oligosac- charide moieties of immunoglobulins. J. Immunol. Meth., 99, 153-161, 1987.

147.0'Rourke M. F., Arterial Function in Health and Disease. Edinburg, Churchill-Livingstone., 185-243, 1982

148.0uriel K„ Shortell C. K., Azodo M. Y. U., Guilterrez O. H., Marder V. J. Acute peripheral arterial occlusion: Predictors of success in catheter-directed thrombolytic therapy. Radiology, 193, 561-566, 1994.

149.Pannell R. Gurewich V. Pro-urokinase: a study of its stability in plasma and of a mechanism for ts selective fibrinolytic effect. Blood 67, 1215-1223, 1986

150.Patel D. J., Fry D. L. The Elastic Symmetry of Arterial Segments in Dogs. Circulation Res. 24 : 1-8. 1969.

151.Patthy L. Evolution of the proteases of blood coagulation and fibrinolysis by assembly of modules. Cell., 41, 657-663, 1985.

152.Potter van Loon B. J., Rijken D. C., Brommer E. J. P., van der Maas A. P. C. The Amount of Plasminogen, Tissue-Type Plasminogen Activator, and Plasminogen Activator Ibnhibitor Type I in Human Thrombi and the Relation to Ex-vivo Lysibility. Thromb. Haemost., 67, 101-105, 1992.

153.Prewitt R. M. Thrombolytic therapy in patients where hypotension or cardiogenic shock complicate acute myocardial infarction. Can. J. Cardiol., 9, 155-157, 1993.

154.Prewitt R. M., Gu S., Garber P. J., Ducas J. Marked systemic hypotension depresses coronary thrombolysis induced by intracoronary administration of recombinant tissue-type plasminogen activator. JACC, 20,1626-1633, 1992.

155.Quemada D. Blood Rheology and its Implication in Flow of Blood, in Arteries and Arterial Blood Flow. Ed. Rodkiewicz C. M. Springer-Verlag. Wien- New-York. 1983.

156.Rentrop K. P. Thrombolytic therapy in patients with acute myocardial infarction. Circulation.,71, 627-631, 1985.

157.Rodkiewicz C. M. Flow in Large Arteries, in Arteries and Arterial Blood Flow. Ed. Rodkiewicz C. M. Springer-Verlag. Wien-New-York. 1983.

158.Rodkiewicz, C.M. and Roussel, C. L. (1973), Fluid mechanics in a large arterial bifurcation, J Fluids Eng, Trans ASME, 95, 108

159.Romson J. 1.., Haack D. W., Lucchesi B. R. Electrical induction of coronary artery thrombosis in the ambulatory canine: A model for in vivo evaluation of antithrombotic agents. Thromb. Res., 17, 841-853, 1980.

160.Ruggeri Z. M. Mechanism Initiating Platelet Thrombus Formation. Thromb. Haemost. 78 (1):611-616. 1997.

161.Sakharov D. V., Nagelkerke J. F., Rijken D. C. Rearrangements of the fibrin network and spatial distribution of fibrinolytic components during plasma clot lysis. J. Biol. Chem., 271, 2133-2138, 1996.

162.Sakharov D. V., Rijken D. C. Superficial accumulation of plasminogen during plasma clot lysis. Circulation, 92,1883-1890, 1995.

163.Sakharov D.V., Sinitsyn V.V., Kratasjuk G.A., Popov N.V., Domogatsky S.P. Two-step targeting of urokinase to plasma clot provides efficient fibrinolysis. Thromb. Res. 49, 481-488, 1988

164.Sasaki O., Takeuchi S., Koizumi T., Koike T., Tanaka R. Complete recanalization via fibrinolytic therapy can reduce the number of ischemic territories that progress to infarction. Am. J. Neuroradiol., 17(9), 1661-8, 1996.

165.Schumacher W. A., Heran C. L., Steinbacher T. E. Low-molecular -weight heparin (fragmin) and thrombin active-site inhibitor (argatroban) compared in experimental arterial and venous thrombosis and bleeding time. J. Crdiovasc. Pharmacol. 28, 19-25, 1996.

166.Schumacher W. A., Heran C. L., Steinbacher T. E., Youssef S., Ogletree M. L. Superior activity of a thromboxane receptor antagonist as compared with aspirin in rat models of arterial and venous thrombosis. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, 526-533, 1993.

167.Senf L. A special case of diffusion with a moving boundary considered as a propagating wave. Int. J. Heat Mass Transfer, 26, 301-302, 1983.

168.Senf L. In vitro messungen der fibrinolyse durch streptokinase. Folia Haematol, Leipzig, 108, 819-821, 1981.

169.Sevitt S. The structure and growth of valve pocket thrombi in femoral veins. J. Clin. Pathol., 27, 517-528, 1974.

170.Shebuski R. J., Storer B. L., Fujita T. Effect of thromboxane synthetase inhibition on the thrombolytic action of tissue-type plasminogen activator in a rabbit model of peripheral arterial thrombosis. Thomb. Res.,52,381-392,1988.

171.Shen L.L., Hermans J., McDonagh J., McDonagh R. P. Role of fibrinopeptide B release: comparision of fibrins produced by thrombin and ancrod. Am. J. Physiol., 232, 639, 1977.

172.Siljander P., Carpen O., Lassila R. Platelet-derived microparticles associate with fibrin during thrombosis. Blood,87, 4651-4663, 1996.

173.Sprengler, E.D., C. Kluft. Plasminogen Activator Inhibitors. Blood. 69 (2), 381-387, 1987.

174. Stead R. B. Clinical pharmacology, in: Pulmonary embolism and deep venous thrombosis. Ed. Goldhaber S. Z. W. B. Saunders Company. London-Tokyo. 1985.

175.Stenberg M., Werthen M., Theander S., Nygren H. A diffusion limited reaction theory for a microtiter plate assay. J. Immunol. Methods, 112, 23-29, 1988.

176.Stepanova V., Mukhina S., Koehler E., Resink T.J., Erne P., Tkachuk V. Urokinase plasminogen activator induces human smooth muscle cell migration and proliferation via distinct receptor-dependent and proteolysis-dependent mechanisms. Mol. Cell. Biochem. 1998 - in press.

177.Stepanova V., Bobik A., R. Bibilashvily, A. Belogurov, I. Rybalkin, S. Domogatsky, P.J. Little, E. Goncharova, V. Tkachuk. Urokinase plasminogen activator induces smooth muscle cell migration: key role of growth factor-like domain. FEBS Lett. 414 (2) : 471-474. 1997.

178.Stewart U. A., Bradley M. S., Johnson C. S., Gabriel D. A. Transport of probe molecules through fibrin gels as observed by means of holographic relaxation methods. Biopolymers, 27, 173-185, 1988.

179.Sullivan K. L., Gardiner G. A., Shapiro M. J., Bonn J., Levin D. C. Acceleration of thrombolysis with a high-dose transtgrombus bolus technique. Radiology, 173, 805-808, 1989.

180.Sumi H, Tsushima H., Maruyama M., Mihara H. Fibrin-binding urokinase (or precursore form of urokinase) with a molecular weight of about. 100 kD in fresh human urine. Enzyme., 34, 201-211, 1985.

181.Suzuki S., Saito M., Suzuki N., Kato H., Nagaoka N., Yoshitake S., Mizuo H., Yuzuriha T., Yui Y., Kawai C. Thrombolytic properties of a novel modified human tissue-type plasminogen activator (E6010): a bolus injection of E6010 has equivalent potency of lysing young and aged canine coronary thrombi. J. Cardiovasc. Pharmacol., 17, 738-746, 1991.

182.Terros P., Ibba G. V., Contini G. M, Franceschino V. Angiographic features of the coronary arteries during intracoronary thrombolysis. Br. Heart J. 52 : 154-163. 1984.

183.The GUSTO Investigators: An international randomized trial comparing four thrombolytic strategies for acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med., 329, 673-682, 1993.

184.Vadot L. Mecanique du coeur et des arteres. L'expansion scientifique Franc., Paris. 1967.

185.Valji K., Roberts A. C., David G. B., Bookstein J. J. Pulsed-spray thrombolysis of arterial and bypass graft occlusions. A. J. R., 156, 617-621, 1991.

186.van-Gelder J. M., Nair C. H., Dhall D. P. Erythrocyte aggregation and erythrocyte deformability modify the permeability of erythrocyte enriched fibrin network. Thromb. Res., 82, 33-42, 1996.

187.Vassali J.D. The urokinase receptor. Fibrinolysis, 8(1), 172-181, 1996.

188.Verstraete M., Vermylen J. Thrombosis. University of Leuven, Belgium, 1984.

189.Vogel J. H. K. Management of acute myocardial infarction: a perspective. Clin. Cardiol., 14, 5-9, 1991.

190.Weisel J. W., Nagaswami C. Computer modeling of fibrin polymerization kinatics correlated with electron mocroscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophys. J., 63, 111-128, 1992.

191.White J. C. Current concepts of platelet structure. Am. J. Clin. Pathol., 71, 363, 1979.

192.White M. L. The permeability of an acrylamide polymer gel. J. Phys. Chem., 64,1563-1565, 1960.

193.Widlus, D. M., A. C. Venbrux, J. F. Benenati, S. E. Mitchell, A. Lynch-Nyhan, F. P. Cassidy Jr, F. A. Osterman Jr. Fibrinolytic therapy for upper-extremity arterial occlusions. Radiology. 175: 393-399,1990.

194.Wierdelheim, C. A., Distensibility Characteristics of Small Blood Vessels. Fed. Proc. 24, 1075-1084, 1964

195.Wijngaards G., Rijken D.C., Van Wczel A.L., Grienfield E., Van der Velden C.A.M. Characterisation and fibrin properties of pro-urokinase from a monkey kidney cell culture. Thromb. Res., 42. 749-760, 1986.

196.Wildus D. M., Venbrux A. C., Benenati J. F., Mitchell S. E., Lynch-Nyhan A., Cassidy F. P., Osterman F. A. Fibrinolytic therapy for upper-extremity arterial occlusions. Radiology, 175, 393-399, 1990.

197.Wolinsky H., Gladov S. A lammmelar unit of aortic medial structure and function in mammals. Circulation Res.20, 90-111, 1967.

198.Wolinsky H., Gladov S. A lammmelar unit of aortic medial structure and function in mammals. Circulation Res. 20 : 90-111. 1967.

199.Wood J. E. The Viens, Normal and Abnormal Function. Boston, 1965.

200.Wun T. C., Scheuning W. D., Reich E. Isolation and chsracterisation of urokinase from human plasma. J. Biol. Chem., 257, 3276-3283, 1982.

201.Zidansek A., Blinc A. The influence of transport parameters and enzyme kinetics of the fibrinolytic system on thrombolysis: mathematical modelling of two idealised cases. Thromb. Haemost., 65, 553-559, 1991.

202.Zidansek A., Blinc A., Lahajnar G.„ Keber D., Blinc R. Finger-like lysing patterns of blood clots. Biophys. J., 69, 803-809, 1995.

203.Ziskind A. A., Gold H. K., Yasuda T., Kanke M., Guerrero J. L., Fallon J. T., Saito T., Collen D. Synergistic combinations of recombinant human tissue-type plasminogen activator and human single-chain urokinase-type plasminogen activator. Circulation, 79, 393-399, 1989.

204.Zyenah L. S., Morton L. F. and Barnes M. J. Platelet adhesion to collagen. Biochem. J., 268, 481-486, 1990.