Распознавание клеточной поверхности N4-подобными вирусами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Прохоров, Николай Сергеевич

• Прохоров, Николай Сергеевич
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Прохоров, Николай Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................10

1.0. Три семейства хвостатых фагов.................................................................................................10

1.1. Длинные хвосты Myoviridae и Siphoviridae.................................................................................12

1.1.1. Трубка...........................................................................................................................................12

1.1.2. Чехол.............................................................................................................................................14

1.1.3. Базальные пластинки T4 и других сократимых систем...........................................................15

1.1.4. Базальные пластинки сифовирусов...........................................................................................21

1.2. Короткие хвосты Podoviridae......................................................................................................24

1.3. Распознавание клетки хвостатыми вирусами............................................................................25

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...............................................................................................31

2.1. Фаги, бактерии и условия роста..................................................................................................31

2.2. Плазмиды и молекулярное клонирование.....................................................................................32

2.3. Экспрессия и очисткарекомбинантных белков..........................................................................34

2.4. Кристаллизация и определение структуры белков....................................................................36

2.5. Выделение и очистка липополисахаридов E. coli........................................................................36

2.6. ЯМР спектроскопия О-полисахаридов.........................................................................................37

2.7. Выделение фракции внешних мембран E. coli.............................................................................37

2.8. Тест на ингибирование фаговой адсорбции................................................................................37

2.9. Тест на инактивацию фага клеточным рецептором................................................................38

2.10. Тест на связывание клеточной поверхности рекомбинантными белками............................38

2.11. Взаимодействие gp63.1 и gp66 in vitro.......................................................................................39

2.12. Калориметрический анализ gp63.1.............................................................................................40

2.13. Получение нонсенс мутантов фага G7C по хвостовым шипам.............................................40

2.14. Криоэлектронная реконструкция фаговых частиц.................................................................41

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ......................................................................................42

3.1. Сравнение кластера структурных генов бактериофагов N4 и G7C........................................42

3.2. Pекомбинантные хвостовые шипы gp63.1 и gp66......................................................................44

3.3 Фонтанные мутанты E. coli 4s с устойчивостью к G7C........................................................47

3.4 Структура и активность gp63.1..................................................................................................55

3.5. Взаимодействие адгезинов gp63.1 и gp66 in vitro.......................................................................64

3.6. Cтруктура и активность gp66....................................................................................................67

3.7. Разработка протокола направленного мутагенеза фага G7C.................................................71

3.8. Организация адгезинов gp63.1 и gp66 в вирионе G7C.................................................................72

3.9. Консервативные элементы аппарата хвостовых шипов Ш-подобных вирусов.....................74

ВЫВОДЫ...............................................................................................................................................80

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...................................................................................................................81

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................................................82

ПРИЛОЖЕНИЕ 1..................................................................................................................................95

ПРИЛОЖЕНИЕ 2................................................................................................................................101

ПРИЛОЖЕНИЕ 3................................................................................................................................104

Вирусы бактерий - бактериофаги - сыграли исключительную роль в развитии молекулярной биологии, молекулярной генетики и структурной биологии в качестве удобного и благодарного объекта исследований (Salmond & Fineran, 2015). Сейчас, после появления первых адекватных оценок численности и генетического разнообразия бактериофагов, они вновь стали всерьёз рассматриваться в качестве потенциального средства борьбы с патогенными бактериями с множественной лекарственной устойчивостью (Bergh et al., 1989, Mann, 2005, Kazmierczak et al., 2014, Casjens & Grose, 2016).

Согласно установившимся к настоящему времени представлениям со сдержанным оптимизмом можно утверждать, что к любому штамму бактерий, в том числе патогенному, может быть подобран бактериофаг, способный узнавать и лизировать бактериальные клетки. Находить такой вирус для каждого нового патогена представляется существенно более простой задачей, чем разработка, получение и внедрение новых действенных антибиотиков (Stone, 2002, Abedon et al., 2017). Потенциальные преимущества стратегии поиска новых эффективных в медицинском и биотехнологическом контексте вирусов включают легкость стандартизации подходов и протоколов и относительную нетребовательность технологического процесса. Разработка антибактериальных препаратов на основе бактериофагов теоретически возможна в условиях, в которых поиск новых антибиотиков вряд ли может увенчаться успехом, что может иметь особое значение для населения и экономик развивающихся стран (Nagel et al., 2016).

Применение бактериофагов для борьбы с патогенными бактериями, как и применение антибиотиков, имеет естественные ограничения (Labrie et al., 2010). Устойчивость к бактериофагам предсуществует в природных популяциях бактерий. Устойчивые формы бактерий к любому вирусу могут быть отобраны в простейших экспериментах in vitro, и, вне всякого сомнения, непрерывно возникают в природных популяциях. Кроме того, по всей видимости, бактериофаги и их непростые взаимоотношения с хозяевами эволюционировали таким образом, чтобы оставить вирусам возможность сосуществовать с чувствительными клетками в естественных условиях. Нетрудно представить себе судьбу фага, лизировавшего последнюю чувствительную к нему клетку.

Существует несколько принципиальных подходов, позволяющих надеяться на повышение эффективности антибактериальных препаратов на основе вирусов. Один их них предполагает составление комплексных вирусных коктейлей, направленных на элиминирование не только чувствительных штаммов бактерий, но и возникающих в ходе применения препарата

устойчивых к вирусам клонов - ведь возникновение устойчивости к одним вирусам зачастую сопровождается возникновением сопутствующей чувствительности к другим. В этом случае природное разнообразие бактериофагов и особенно детерминант их специфичности - таких как хвостовые придатки Caudovirales - представляет собой один из ключей к решению проблемы (Chan et al., 2013). Другие подходы связаны с успехами генетической инженерии и синтетической биологии и подразумевают направленное изменение детально охарактеризованных вирусов на уровне геномов для получения более эффективных и предсказуемых вирусных противобактериальных препаратов (Lu & Collins, 2009, Braff et al., 2016, Pires et al., 2016a).

Несмотря на то, что использование вирусов в качестве терапевтических агентов имеет более продолжительную историю, чем применение антибиотиков (Stone, 2002), и так же несмотря на успехи биотехнологических компаний новейшего времени, разрабатывающих препараты для решения широкого круга проблем, связанных с бактериальными инфекциями и контаминациями, сейчас очевидно, что любое рациональное применение вирусов в качестве антибактериальных средств может быть основано только на глубоком понимании механизмов взаимодействия вирусов и их хозяев, определяющих специфический характер инфекции. В первую очередь, механизмов распознавания клеточной поверхности чувствительных штаммов (Labrie et al., 2010, Samson et al., 2013). Вопросы о том, как именно бактериофаги находят и связывают чувствительные клетки, и каким образом происходит принятие решения о введении вирусного генома, остаются до сих пор одними из самых загадочных аспектов биологии бактериофагов, и в контексте структуры и функционирования К4-подобных фагов являются предметом настоящего исследования.

Цели и задачи исследования

Цель работы - изучить устройство адсорбционного аппарата К4-подобных вирусов с коротким несократимым хвостом на примере бактериофага G7C, выявить механизмы функционирования компонентов адсорбционного аппарата, определяющие специфический характер инфекции. Кроме того, мы предполагали выявить консервативные элементы адсорбционного аппарата, общие для К4-подобных вирусов и вирусов бактерий из других групп порядка Caudovirales. Для достижения заявленных целей нами были сформулированы следующие задачи:

1. С помощью биоинформатических средств выявить в геноме бактериофага G7C гены, предположительно отвечающие за контакт с клеточной поверхностью чувствительного штамма Escherichia coli 4s.

2. Клонировать выявленные кандидатные гены в векторах для экспрессии в T7 системе в нативной конформации в виде гибридов с пептидными метками для аффинной хроматографии. Определить влияние рекомбинантных фаговых белков на связывание фаговых частиц с клетками.

3. Получить селекцией в присутствии фага в высокой концентрации спонтанные мутанты штамма E. coli 4s, устойчивые к инфекции G7C. Изучить природу клеточных рецепторов проникновения G7C путём анализа генетических и фенотипических изменений, накопленных в полученных мутантных клонах. Изучить влияние накопленных изменений на взаимодействие клеток с другими колифагами.

4. Получить в гомогенном состоянии и кристаллизовать выявленные в ходе биохимических и функциональных тестов компоненты адсорбционного аппарата фага G7C и изучить их структуру методом рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии. Охарактеризовать биохимические активности, связанные с этими структурами.

5. Разработать протокол направленного мутагенеза и отбора мутантов ^-подобных бактериофагов. Получить условных нонсенс-мутантов фага G7C по компонентам адсорбционного аппарата, изучить протеом и структуру мутантных фаговых частиц с нонсенс-фенотипом.

6. С помощью анализа геномных и структурных баз данных выявить элементы изученного адсорбционного аппарата в других представителях Caudovirales.

Практическая ценность и научная новизна работы

Серьёзной проблемой современных представлений о ранних этапах инфекции вирусов бактерий - распознавании клеточной поверхности и введении вирусного генома в клетку чувствительного штамма - представляется тот факт, что на сегодняшний день наиболее изученные системы фаг-бактерия имеют существенные нежелательные особенности (Bertozzi Silva et al., 2016). Многие бактериофаги, такие как T4, T7, N4 и другие, были выделены на

адаптированных к росту in vitro лабораторных штаммах бактерий, лишённых поверхностных полисахаридов - О- и К-антигенов, играющих исключительную роль в физиологии бактерий, их взаимодействии друг с другом, вирусами бактерий, иммунной системой человека, окружающей средой (Demerec & Fano, 1945, Schito, 1973). Исследования бактериофагов, инфицирующих полевые штаммы бактерий, адаптированные к существованию в естественной среде, в том числе настоящая работа, способствуют понимаю механизмов инфекции, релевантных происходящим в природе событиям.

В представленной работе с помощью комплексного структурного и функционального подхода детально охарактеризована система вирус - индигенный хозяин (№-подобный фаг G7C и E. coli 4s), изолированная из естественного микробного сообщества пищеварительной системы лошади. Показано, что адсорбционный аппарат вируса G7C включает продукты генов 63.1 и 66. Соответствующие белки получены в рекомбинантном виде и кристаллизованы, структуры белков определены методом рентгеноструктурного анализа. Для белка gp63.1 показана эстеразная активность, опосредующая специфический характер первичного взаимодействия вируса с чувствительным штаммом E. coli 4s. Существуют литературные данные о способности некоторых фагов деацетилировать углеводы клеточной поверхности бактерий (Taylor, 1965, Iwashita & Kanegasaki, 1976), однако вирусный белок с такой активностью идентифицирован и изучен впервые. О-антиген идентифицирован в качестве первичного клеточного рецептора. Методом ЯМР-определена его структура. О-антиген штамма E. coli 4s похож на О-антиген E. coli O22, но дополнительное гликозилирование повторяющегося звена делает установленную структуру уникальной. С помощью анализа взаимодействия рекомбинантных белков gp63.1 и gp66, а также делеционных мутантов gp66, in vitro выявлены домены, ответственные за образование разветвленного адсорбционного аппарата G7C. Полученные данные о характере взаимодействия белков подтверждены анализом протеома нонсенс-мутантов G7C по компонентам адсорбционного аппарата, полученных в непермиссивных условиях, а так же криоэлектронной реконструкцией вирионов G7C дикого типа и мутантов. Анализ баз данных вирусных и бактериальных геномных последовательностей позволил выявить консервативные элементы изученного адсорбционного аппарата и их присутствие во всех трёх семействах хвостатых вирусов - Podoviridae, Siphoviridae и Myoviridae. Определение структуры gp10 фага T4, содержащего домены, гомологичные gp66 G7C, в рамках проекта по изучению базальной пластинки T4 дополнило наши представления о структуре и возможностях функционирования адсорбционного аппарата G7C.

Результаты, полученные в ходе выполнения представленной работы позволяют сформулировать следующие утверждения об устройстве адсорбционного аппарата N4-подобного бактериофага 07С и молекулярных механизмах, лежащих в основе специфического узнавания клетки-хозяина этим вирусом (по форме совпадающие с выводами работы):

1. Фаг G7C в качестве первичного рецептора инфекции использует О-антиген E. coli 4s серотипа O22. Установлена структура повторяющегося звена этого О-антигена, повторяющая структуру антигена O22 с дополнительным гликозилированием второго остатка повторяющегося звена.

2. Структурные вирусные белки gp63.1 и gp66 участвуют в первичном распознавании клеточной поверхности чувствительного штамма E. coli 4s.

3. Белок gp63.1 образует хвостовой шип с эстеразной активностью. Установлена структура тримера gp63.1. Контакт с первичным рецептором и деацетилирование О-антигена необходимы для инфекции бактериальных клеток фагом G7C.

4. Белок gp66 образует хвостовой шип, участвующий во взаимодействии фага G7C с поверхностью клетки. Структура тримера белка gp66 установлена с помощью криоэлектронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа кристаллизованных фрагментов белка.

5. Белки gp63.1 и gp66 фага G7C образуют разветвленный аппарат хвостовых шипов, в котором gp66 опосредует присоединение gp63.1 к вириону. В составе этого аппарата можно выделить консервативные элементы, встречающиеся в различных группах порядка Caudovirales.

Личное участие автора в получении результатов

Совместно с руководителем проф. А.В. Летаровым соискатель определил цели и задачи исследования, дизайн экспериментов и подготовил экспериментальные данные к публикации. Автор подготовил образцы фагов, бактерий, рекомбинантных белков и липополисахаридов для структурных и функциональных исследований, получил экспрессионные рекомбинантные конструкции, провёл мутагенез gp63.1 и gp66, штамма E. coli 4s и №-подобных изолятов, в том числе фага G7C. Автором были проведены все функциональные и молекулярные исследования,

изложенные в диссертации. Белок gp63.1 был кристаллизован Кристианом Риччио в лаборатории биофизики и структурной биологии под руководством проф. Петра Г. Леймана (EPFL, Лозанна). Делеционные мутанты gp66 были кристаллизованы соискателем там же. Структуры белков gp63.1 и gp66 были решены проф. П.Г. Лейманом. Криоэлектронная реконструкция вирусных частиц G7C дикого типа и мутантов была проведена Сергеем Назаровым, структура белка gp10 фага T4, содержащего домены, гомологичные белку gp66 фага G7C, была определена Николасом М.И. Тэйлором и проф. П.Г. Лейманом в рамках проекта по реконструкции базальной пластинки фага T4 (EPFL, Лозанна). ЯМР-анализ образцов бактериальных липополисахадиров был проведён в лаборатории химии углеводов ИОХ РАН под руководством проф. Ю.А. Книреля.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Распознавание клеточной поверхности N4-подобными вирусами»

Апробация работы

Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы были представлены на семинарах и конференциях ИНМИ РАН и ФИЦ Биотехнологии РАН, на 20-ой, 21-ой и 22-ой конференциях по биологии бактериофагов "Evergreen Phage Meeting" (Олимпия 2013, 2015, 2017), на 2-ой, 3-ей и 4-ой конференциях "Viruses of Microbes" Европейской Организации Молекулярной Биологии (Брюссель 2012, Цюрих 2014, Ливерпуль 2016), на 24-й и 25-й конференциях "Phage and Virus Assembly" (Ле Диаблере 2015, Элликотт 2017), на 1-ой, 2-ой и 3-ей конференциях "Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности" (Ульяновск 2012, Санкт-Петербург 2014, Москва 2016), на летней конференции по микробной гликобиологии Федерации Американских Обществ Экспериментальной Биологии (Итаска, 2014), на 18-м европейском углеводном симпозиуме EUROCARB 2015 (Москва, 2015).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 6 статей в рецензируемых научных изданиях, 14 тезисов устных и стендовых сообщений.

1.0. Три семейства хвостатых фагов

Вирусы вообще и вирусы бактерий в частности уже более ста лет поражают воображение исследователей разнообразием структур вирионов, форм организации и выражения генетического материала, и бесчисленными вариациями всех без исключения этапов инфекционного процесса (Calendar, 2006). Вирусы бактерий - бактериофаги - составляют значительную часть этого разнообразия (Рис. 1.1). Масштабы этого феномена хорошо иллюстрирует разница между самыми большими и самыми маленькими фагами. Представитель семейства Leviviridae бактериофаг MS2 в течение жизненного цикла ограничивается экспрессией четырех генов, уложенных в 3569 нуклеотидов одноцепочечной геномной РНК (Fiers et al., 1976). Другая крайность - инфицирующий Bacillus megaterium миовирус G несёт геном в 497 т.п.н. и кодирует около 700 белков (GenBank № JN638751) (Donelli et al., 1972, Donelli et al., 1975, Salmond & Fineran, 2015). Колоссальные различия в числе кодируемых функций не мешают фагам решать общие задачи паразитической репликации в клетках. Поразительно, что поиск подходящего для воспроизведения хозяина, распознавание и связывание характеристических молекул на клеточной поверхности, введение генома в клетку, подчинение клеточного метаболизма, репликация и выражение генетического материала, сборка вирусных частиц, упаковка генома, созревание вирусных частиц и выход вирусов из клетки могут быть осуществлены в полной мере такими разными объектами как фаги MS2 и G.

Большинство выделенных фагов, однако, устроено довольно консервативно, и на основании сходства молекулярных структурных блоков и общности процессов сборки и функционирования объединено в порядок Caudovirales - хвостатые фаги (96% ~6300 вирусов бактерий, исследованных с помощью электронной микроскопии к 2012 году (Ackermann & Prangishvili, 2012)). Все представители порядка несут единственную двуцепочечную линейную молекулу ДНК; геном упакован в изометрический икосаэдрический или вытянутый, но собранный по такому же принципу, капсид; одна из вершин капсида замещена специализированным многофункциональным молекулярным механизмом - хвостом (Fokine & Rossmann, 2014). По морфологическим характеристикам хвоста представители Caudovirales распределены в три семейства - Myoviridae, Siphoviridae и Podoviridae (Bradley, 1967).

Миовирусы - вирусы с длинным хвостом (130 нм у T4 и 135 нм у P2), образованным двумя полыми цилиндрическими структурами - чехлом и вложенной в него трубкой (Yap &

Рис. 1.1. Семейства вирусов прокариот. Взято из Ackermann & Prangishvili 2012.

Rossmann, 2014, Christie & Calendar, 2016). Во время инфекции чувствительной клетки чехол сокращается более чем вдвое, проталкивая трубку через бактериальную клеточную стенку. Трубка образует транспериплазмитеческий канал, по которому в клетку доставляется вирусный геном. Сокращение чехла является обязательным условием старта инфекции. Сифовирусы устоены несколько проще и имеют длинные тонкие гибкие несократимые хвосты (Davidson et al., 2012). Длина хвоста варьирует в широких пределах от 70 до ~800 нм (150 нм у фага X и 160 нм у T5). У всех подовирусов несократимые хвосты значительно короче диаметра капсида, однако, могут иметь принципиально различное устройство (Casjens & Molineux, 2012).

Все хвостатые фаги несут специализированные придатки - фибриллы и шипы, -отвечающие за распознавание и связывание рецепторов на клеточной поверхности. У миовирусов и сифовирусов придатки собраны на базальных пластинках, у подовирусов -обычно прикреплены в верхней части хвоста (Fokine & Rossmann, 2014).

Примечательно, что такое распределение хвостатых вирусов по трём семействам, будучи первоначально основанным исключительно на морфологических особенностях вирионов, наблюдаемых в электронный микроскоп, пережило наступление геномной эры.

Устройство длинного хвоста Myoviridae и Siphoviridae

Сходство миовирусов и сифовирусов выходит за пределы общности организации геномов и капсидов. Несмотря на очевидные видимые различия длинные миовирусные и сифовирусные хвосты устроены по общему плану (Таблица 1.1) (Davidson et al., 2012, Leiman & Shneider, 2012). Каждый хвост состоит из трубки и специализированных структур, находящихся на её концах - комплекса терминаторных белков, образующего интерфейс присоединения к капсиду, и базальной пластинки, ответственной за распознавание клеточной поверхности и старт инфекции. У миовирусов хвост дополнительно оснащен сократимым чехлом.

Трубка

У всех фагов с длинным хвостом трубка образуется за счёт полимеризации единственного белка трубки - TTP (tail tube protein). Белок трубки собирается в кольца-гексамеры (в

о о

псевдогексамеры у фага T5) с внешним диаметром в 90 А и внутренним в 30 А, кольца собираются в полые фибриллярные структуры. Белок трубки сифовирусов может состоять из более чем одного домена. N-концевой домен необходим и достаточен для полимеризации (Pell et al., 2009a). Несмотря на тот факт, что TTP некоторых фагов способен полимеризоваться спонтанно, процесс сборки трубки всех фагов in vivo проходит в тесной взаимосвязи с остальными структурами хвоста (Langlois et al., 2015). Платформой для инициации сборки трубки служит комплекс осевых элементов базальной пластинки (Katsura & Kuhl, 1975a, Katsura & Kuhl, 1975b). Контроль над процессом полимеризации, по всей видимости, осуществляется в результате взаимодействия двух вирионных белков - TMP (tape measure protein) и белка терминатора трубки TTrP (tube terminator protein). Накопленные к настоящему моменту данные позволяют отверждать, что шесть копий TMP связываются с базальной пластинкой и укладываются в виде протяжённых a-спиральных структур в канале трубки по мере полимеризации TTP. Функциональные исследования in vivo показали, что длина хвоста миовирусов и сифовирусов определяется длиной TMP (Katsura & Hendrix, 1984, Katsura, 1987, Abuladze et al., 1994). Сборка трубки заканчивается присоединением белка TTrP. TTrP имеет

Таблица 1.1. Гомологи белков хвоста общих для миовирусов и сифовирусов.

Myoviridae Siphoviridae

T4 P2 X T5

TCP gp15 gpR gpZ p143

TTrP gp3 gpS gpU p142

TTP gp19 gpFII gpV pb6

TMP gp29 gpT gpH pb2

DTP gp48/54 gpU gpM bp9

BHP gp27 gpD gpL bp3a

PDB №№

установленных структур

4HUD 3FZB

1Y12, 2GJV, 2K4Q, 3J9Q, 5IV5

4JMQ, 5IV5 1K28, 1WRU, 2P5Z, 3CDD, 3D37, 3GS9, 5IV5

a Представляет собой гибрид BHP и центральной фибриллы.

сходную с TTP структуру, в растворе существует в виде мономеров, но способен связываться с внешним гексамерным кольцом полимеризующиейся трубки, собираться в гексамеры сходного устройства и предотвращать дальнейший рост трубки (Katsura & Tsugita, 1977, Pell et al., 2009b). Так как было обнаружено, что у фага X TTrP в ходе инфекции экспрессируется в избытке относительно TTP, представляется вероятным, что регуляторная роль TMP состоит в блокировании преждевременного связывания TTrP с концом трубки (Murialdo & Siminovitch, 1972, Katsura, 1976). Механизм, лежащий в основе этого процесса, остается неизвестным.

Сборка длинного фагового хвоста у миовирусов и сифовирусов заканчивается присоединением поверх TrTP белка терминатора сборки хвоста - TCP (tail completion protein). Он же участвует в образовании интерфейса присоединения капсида (Fokine et al., 2013).

Поиск гомологов фаговых белков даже внутри одного семейства осложнён низким сходством на уровне аминокислотных последовательностей. Стандартные средства - алгоритмы Blast - и менее тривиальные - такие как HHpred - зачастую оказываются бессильны. Однако, накопление рентгеноструктурных данных и данных электронной микроскопии высокого разрешения фаговых белков и надмолекулярных структур постепенно расширяет предсказательные возможности биоинформатического анализа. Примечательно, что полученные к настоящему моменту структурные данные однозначно свидетельствую в пользу родства белков, участвующих в образовании трубки хвоста миовирусов и сифовирусов - TCP, TrP, TTP, а также DTP и BHP (см. ниже) (Таблица 1.1).

Extended sheath

Ridge ABC

in

n

г

Contracted sheath

A

Former ridge В

С

Рис. 1.2. Схематическое изображение топологии чехла пиоцина Я в исходном и сокращенном состоянии. Домен 1 каждой субъединицы чехла собран из четырёх полипептидных цепей, три из которых образуют единый Р-лист, а четвёртая сложена в а-спираль (остальные элементы вторичной структуры и домены на схеме не показаны). При сокращении чехла субъединицы изменяют своё относительное положение и характер взаимодействия друг с другом, однако, ковалентные связи между ними предсказуемо сохраняются. Взято из Ge at я!. 2015.

Уникальная для миовирусных хвостов и родственных им сократимых систем структура -чехол - остаётся предметом интенсивных исследований на протяжении нескольких десятилетий (Karam & Drake, 1994). Основной объём данных о структуре, функционировании и сборке чехла был получен в ходе исследований фага T4 и родственных миовирусам клеточных структур -пиоцинов R-типа и систем секреции шестого типа (CC6T) (Leiman et al., 2004, Kostyuchenko et al., 2005, Ge et al., 2015, Kudryashev et al., 2015, Bock et al., 2017). Чехол фага T4 состоит из 138 субъедниц белка gp18, организованных в шесть спиралей, свёрнутых вокруг трубки на всём её протяжении. Субъединицы gp18 образуют обширные контакты друг с другом внутри спирали, в то время как расположенные рядом субъединицы соседних спиралей взаимодействуют существенно слабее (Kostyuchenko et al., 2005). Примечательна структура белка чехла. Каждый мономер состоит из четырех доменов, ориентированных приблизительно вдоль линии, перпендикулярной оси фагового хвоста. Домен 1 контактирует с трубкой. Устойчивые к действию протеаз домены 3 и 4 образуют внешнюю поверхность чехла. Белок имеет необычную топологию. Каждый из доменов 2, 3 и 4 образуется как выпетливание предыдущего домена (Aksyuk et al., 2009). Взаимодействие субъединиц и нетривиальный ход полипептидных

Чехол

цепей в чехле был установлен путём реконструкции чехла пиоцина R-типа из P. aeruginosa на основании данных криоэлектронной микроскопии (Ge et al., 2015). Оказалось, что одна полипептидная цепь проходит через четыре субъединицы, принадлежащие двум соседним спиралям чехла, участвуя в образовании домена 1 каждой из этих субъединиц. Таким образом, каждая субъединица посредством шести пептидных ликеров оказывается связанной с соседними субъединицами в единую сеть (Рис. 1.2). Нет сомнений, что таким же образом организованы чехлы во всех родственных сократимых системах, включая фага T4.

При распознавании клетки в ходе инфекции чехол T4 претерпевает масштабную трасформацию. Его линейные параметры меняются драматически - длина сокращается более

о о

чем в два раза с 925 до 420 А, а диаметр увеличивается с 240 до 330 А. Аксиальная компрессия сопровождается скольжением спиралей чехла на одну субъединицу относительно друг друга,

о

при этом происходит поворот субъединиц на ~45° и выдвижение на 50 А по линии радиуса чехла. Возникают новые контакты между субъединицами соседних спиралей, но сохраняется исходная структура субъединиц - они движутся без деформаций, - и непрерывность спиралей. Обширная сеть линкеров, связывающих домены 1 соседних субъединиц, вероятно, играет существенную роль в поддержании единства структуры в ходе сокращения чехла (Leiman et al., 2004, Kostyuchenko et al., 2005, Aksyuk et al., 2009, Ge et al., 2015).

Базальные пластинки T4 и других сократимых систем

Базальная пластинка - сложный молекулярный механизм, ответственный за поиск и распознавание чувствительных к фаговой инфекции клеток, позиционирование фаговой частицы на клеточной поверхности и принятие решения о запуске инфекции (Fokine & Rossmann, 2014, Yap & Rossmann, 2014, Arisaka et al., 2016). Подобно чехлам миовирусов в ходе инфекции базальные пластинки претерпевают значительное конформационное преобразование (в случае миовирусов называемое сокращением базальной пластинки), ассоциированное с необратимой адсорбцией вириона на клеточной поверхности, образованием транспереплазматического канала и старта транслокации фагового генома. Кроме того, в ходе морфогенеза базальные пластинки инициируют сборку чехла и трубки миовирусов и трубки сифовирусов - осевых элементов длинного фагового хвоста. Базальные пластинки миовирусов и сифовирусов имеют общие элементы, но, в целом, значительно отличаются размером, числом структурных элементов и сложностью организации. К настоящему времени, базальная пластинка фага T4, несмотря на выдающуюся среди вирусных молекулярных машин

Рис. 1.3. Сборка базальной пластинки фага T4. Сборка осевой части базальной пластинки и клиньев начинается независимо. После объединения шести клиньев (gp103-gp7-gp82-gp62) и втулки (gp53-gp273), происходит присоединение коротких фибрилл (gp1l3-gp123), посадка инициаторного комплекса трубки (gp486-gp546), инициатора чехла gp25, и начинается сборка осевых элементов хвоста - трубки и чехла. Длинные хвостовые фибриллы присоединяются на заключительном этапе морфогенеза вириона T4. Взято из Yap at al. 2016.

многокомпонентность, изучена существенно лучше других родственных структур (Kostyuchenko et al., 2003, Yap et al., 2010, Taylor et al., 2016, Yap et al., 2016).

Базальная пластинка имеет симметрию шестого порядка и у всех миовирусов состоит из центральной осевой части, несущей характеристический для миовирусов хвостовой шип, и шести периферических белковых комплексов - клиньев, - замыкающихся в кольцо и образующих платформу для прикрепления рецептор-узнающих белков. Центральная осевая часть базальной пластинки - втулка - представляет собой продолжение трубки; её основная часть образована белками сходной с TTP структуры (Taylor et al., 2016). Исходно базальная пластинка собирается в конформации, которую называют гексагональной.

Клинья базальной пластинки и центральная втулка собираются независимо (Рис. 1.3). Тример gp27 - BHP (baseplate hub protein) - с одной стороны присоединяет тример gp5, ß-спиральный шип, которым фаг протыкает клеточную стенку E. coli в ходе инфекции, c другой -образует платформу для сборки инициаторного комплекса трубки - тандема гексамерных колец белков gp48 (DTP - distal tail protein) и gp54 (Таблица 1.1, Рис. 1.4) (Kanamaru et al., 2002). ß-спираль gp5 заканчивается плоской гидрофобной поверхностью, на которую садится

Рис. 1.4. Структура консервативной части базальной пластинки фага T4. A. Консервативная центральная часть базальной пластинки T4 - втулка - образована паралогами TTP - gp54, gp48, gp27 - и белком центрального хвостового шипа gp5. К белкам gp48 и gp27 примыкает консервативная внутренняя часть клиньев, образованная белками gp7, gp6, gp25 и gp53. Накопленные к настоящему времени структурные и функциональные данные позволяют предполагать наличие соответствующих структур во всех известных сократимых системах. Б. Структура внутренней часть клина базальной пластинки T4. Белки gp6 и gp7 показаны частично. Взято из Taylor at al. 2016.

пирамидальный белок gp5.4, заостряющий хвостовой шип (Shneider et al., 2013). Интересно, что несмотря на тот факт, что 5.4 - один из самых консервативных на уровне аминокислотной последовательности миовирусных белков (хотя и присутствующий не у всех миовирусов), нонсенс-мутанты T4 по 5.4 сохраняют жизнеспособность. Центральная часть базальной пластинки консервативна (Leiman & Shneider, 2012, Taylor et al., 2016). В базальной пластинке отдалённого родственника T4, миовируса P2, осевая часть устроена по тому же плану, но несколько проще, и представлена тремя белками - gpV, gpD и gpU (гомологи gp5, gp27 и gp48/54, соответственно) (Christie & Calendar, 2016).

Тример gp27 и гексамер gp48 фага T4 образуют контакт элементов хвоста с разной симметрией - третьего и шестого порядка, соответственно. Такая возможность заложена в структуре gp27, два N-концевых домена которого образуют в тримере псевдогексамерное кольцо, взаимодействующее с гексамером gp48, а C-концевой домен, тримеризуясь, связывает шип gp5 (Kanamaru et al., 2002, Taylor et al., 2016). Гомологи gp27 и gp48 - BHP и DTP - и

Таблица 1.2. Гомологи консервативных элементов базальной пластинки миовирусов и СС6Т.

T4 P2 /пиоцин R Mu CC6T PDB №№ установленных структур

gp54 5IV5

gp48 gpU Mup43a 5IV5

gp27 gpD Mup44 VgrGb 1K28, 2P5Z, 5IV5

gp5 gpV Mup45 VgrGb 1K28, 2P5Z, 3QR8, 5IV5

gp6 gpJ Mup47 tssG 5HX2, 5IV5, 5IV7

gp7 gpI Mup48 tssF 5HX2, 5IV5, 5IV7

gp25 gpW Mup46 tssE 5IV5, 5IV7, 5IW9

gp53 gpX Mup43a 2LTF, 5HX2, 5IV5, 5IV7

a Содержит домены гомологичные белкам gp48 и gp53 фага T4. b Представляет собой гибрид DTP и центрального хвостового шипа.

соответсвующий переход симметрии, по-видимому, присутствуют у всех фагов с длинным хвостом (Рис. 1.4, Таблица 1.1).

Клинья базальной пластинки образованы консервативными и вариабельными элементами. Консервативная часть клиньев образует внутреннюю часть базальной пластинки, примыкающую к осевым компонентам. Она состоит из белков §рб, §р7, §р25 и §р53 в соотношении 2:1 : 1 : 1 (Рис 1.4). Двенадцать копий §рб образует кольцо вокруг втулки. Половина молекул §рб лежит ближе к оси симметрии шестого порядка, образуя внутреннюю поверхность кольца, половина образует внешнюю поверхность. Каждая молекула §рб взаимодействует с двумя соседними, образуя димер К-концевых доменов §рб с одной молекулой и димер С-концевых доменов с другой. Димер К-концевых доменов §рб участвует в формировании гетеротримерного комплекса с §р7, шесть копий которого связывают периферические части клиньев с кольцом §рб. В структуре гетеротримерного комплекса §рб2-§р7 можно выделить а-спиральный пучок, возвышающийся над кольцом §рб в каждом клине. С этим пучком связаны два других консервативных белка клина - §р25 и §р53. Белок §р25 имеет структуру, сходную с таковой домена 1 §р18 - белка чехла, - и служит инициатором полимеризации чехла во время сборки фагового хвоста. Белок §р25, примыкая к §р48 -компоненту инициаторного комплекса сборки трубки, - образует основную часть контакта клиньев с осевой частью базальной пластинки. Это взаимодействие представляется существенным для поддержания хвоста Т4 в исходном несокращённом состоянии в период поиска чувствительной для инфекции клетки. Функция §р53, по-видимому, состоит в

Таблица 1.3. Белки периферической части базальной пластинки и фибрилл фага Т4.

PDB №№

установленных структур

gp8 1N7Z, 5HX2, 5IV5, 5IV7

gp9 наружная часть 1QEX, 5IV5, 5IV7

gp10 клина 2FKK, 5HX2, 5IV5, 5IV7

gp11 1EL6, 5IV5, 5IV7

gp12 короткая фибрилла 1OCY, 5IV5, 5IV7

gp34 4UXG

gp35 длинная фибрилла

gp36

gp37 2XGF

увеличении поверхности взаимодействия консервативных элементов клина (Taylor et al., 2016, Yap et al., 2016). Гомологи gp53 присутствуют в миовирусах, пиоцинах R типа, но отсутствуют в CC6T (Рис. 1.4, Таблица 1.2) (Buttner et al., 2016).

Периферическая часть клина базальной пластинки T4 состоит из N-концевых и С-концевого доменов gp7, димера gp8, тримеров gp9, gp10 и gp11. Она существенно менее консервативна. Соответсвующие элементы можно найти в литических миовирусах с большим геномом (например, у Т-чётных фагов), но они отсутствую в отдалённо родственных умеренных миовирусах с небольшим геномом, таких как P2 и Mu (Buttner et al., 2016, Christie & Calendar, 2016). Роль периферической части базальной пластинки состоит в прикреплении и координации работы рецептор-узнающих комплексов фага Т4 - длинных и коротких хвостовых фибрилл (Taylor et al., 2016).

Ключевое положение на периферии клина занимает массивный тримерный четырёхдоменный белок gp10. Домены 1 и 4 взаимодействуют с N-концевым и С-концевым доменами gp7, соответственно (в то время как средняя часть gp7 образует гетеротример с gp6). Домены 2 и 3, гомологичные друг другу, образуют поверхности для присоединения gp11 и gp12 (Taylor et al., 2016). Тримеры gp12 - короткие фибриллы фага - в исходном состоянии оказываются согнуты в середине и поджаты вдоль периферии базальной пластинки (van Raaij et al., 2001). Оставаться в таком положении им помогает стабилизирующий контакт с тримером gp11 соседного клина (Рис. 1.5) (Leiman et al., 2000). Комплекс белков длинной фибриллы -gp343-gp35-gp363-gp373 - присоединяется к базальной пластинке на заключительном этапе сборки фаговой частицы посредством тримера gp9 (Kostyuchenko et al., 1999). Gp9 связан с N-

А

„

□ дрбА □ дрбВ □ др53 □ др25 □ др7 Пдр8

□ др9 ПдрЮ □ др11 □ др12~

□ др27 Пдр5 Щдр5.4 □ др48 Пдр54 Пдр19

□ Intermediate baseplate

□ Tail fibre network

□ Central spike

Б

Рис. 1.5. Структура базальной пластинки фага T4 в гексагональном (А) и сокращенном (Б) состоянии. Взято из Taylor at al. 2016.

концевым доменом gp7 в области примыкания последнего к домену 1 gp10. В каждом клине тример gp10 оказывается связанным с двумя рецептор-узнающими комплексами фага: с короткими фибриллами - за счёт непосредственного контакта через домен 2 и опосредованно через gp11, с длинными - через gp9 и gp7. Такое положение, нетривиальная четырёхдоменная организация и способность к изменению взаимного положения доменов в ходе сокращения базальной пластинки, по-видимому, играют ключевую роль при переходе вируса от первичного

взаимодействия с клеточной поверхностью к первой необратимой фазе инфекции (Рис. 1.5) (Taylor et al., 2016).

Не все миофаги могут похвастаться такой выдающейся организацией периферической части базальной пластинки. Для умеренных миовирусов P2 и Mu структурные данные высокого разрешения в настоящий момент отсутствуют, однако установлено, что их фибриллы прикрепляются к гомологам белка gp7 T4 - белкам gpI и Mup48, соответственно, то есть непосредственно к консервативной (внутренней для T4) части клина (Таблица 1.2) (Buttner et al., 2016, Christie & Calendar, 2016). Можно с уверенность утверждать, что так же лаконично организованы базальные пластинки пиоцинов R типа и CC6T (Basler, 2015, Brunet et al., 2015, Bock et al., 2017).

Базальные пластинки сифовирусов

К настоящему времени сделаны реконструкции разной степени детализации нескольких сифовирусов граммположительных бактерий - фагов Lactococcus lactis p2, TP901-1, Tuc2009, 1358, фага Listeria monocytogenes A118, фага Staphylococcus aureus ф11 (Рис. 1.6) (Sciara et al., 2010, Veesler et al., 2012, Spinelli et al., 2014a, Bielmann et al., 2015, Cambillau, 2015, Koc et al., 2016, Legrand et al., 2016). Значительный массив структурных и функциональных данных накоплен для ряда других модельных сифовирусов - фага Bacillus subtilis SPP1, фагов E. coli X и T5 (Sayers, 2006, Goulet et al., 2011, Casjens & Hendrix, 2015). Уже сейчас понятно, что базальные пластинки сифовирусов демонстрируют выдающееся разнообразие форм, типов и принципов организации ассоциированных с ними рецептор-узнающих структур. Весьма вероятно, за этим структурным разнообразием скрывается не менее впечатляющее разнообразие принципов их функционирования. Однако, можно выделить некоторые компоненты и закономерности, общие для изученных сифовирусов.

Базальные пластинки сифовирусов устроены заметно проще, чем базальные пластинки T-чётных миофагов. Центральная консервативная часть комплекса состоит из двух белков, характерных, вероятно, для всех фагов с длинными хвостами - двухдоменный белок DTP и BHP (Таблица 1.1). Гексамер консервативных N-концевых доменов DTP образуют продолжение трубки, в то время как С-концевые домены лежат за пределами трубки, участвуя в организации рецептор-связывающего аппарата. Тример BHP трубку замыкает. Остальные компоненты базальных пластинок сифовирусов, по всей видимости, отвечают за специфическое взаимодействие с клеточной поверхностью, и довольно разнообразны. В большинстве

320

Рис. 1.6. Реконструкции вирионов фагов L. lactis TP901-1 (А) и p2 (Б). Изображения получены путём объединения отдельных реконструкций капсидов, коннекторов и базальных пластинок в картах электронной плотности целых фаговых частиц с низким разрешением. Взято из Spinelli at al. 2014.

известных случаев, BHP несёт расположенный вдоль оси хвоста специализированный придаток - тримерную центральную фибриллу (Davidson et al., 2012, Spinelli et al., 2014b). В ряде фагов центральная фибрилла и BHP кодируется одним геном и экспрессируются в виде единого белка, однако в ходе морфогенеза хвоста такие гибриды подвергаются протеолизу. Роль центральной фибриллы в связывании вторичного рецептора была показана для фагов X, T5, BF23 и SPP1 -они связывают белки LamB, FhuA, BtuB и YueB, соответственно (Thirion & Hofnung, 1972, Decker et al., 1994, Bonhivers et al., 1996, Mondigler et al., 2006, Meyer et al., 2012, Vinga et al., 2012). Заметным исключением является фаг p2, у которого подобной структуры найдено не было (Рис. 1.6) (Sciara et al., 2010).

Рис. 1.7. Структура базальной пластинки фага L. lactis p2. A. Поверхность базальной пластинки в направлении, перпендикулярном оси хвоста. Рецептор-связывающий белок показан синим, DTP -зелёным, BHP - красным. Б. Поверхность базальной пластинки со стороны трубки. В. Взаимное расположение шесть тримеров рецептор-связывающего белка в базальной пластинке. Г и Д. Гексамер DTP. Е. Мономер DTP. Ж и З. Тример белка BHP. И. Мономер BHP. К. Тример рецептор-связывающего белка. Взято из Sciara at al. 2010.

У всех изученный сифовирусов в составе базальных пластинок были найдены латеральные рецептор-связывающие структуры различного устройства, но весьма сходной локализации. Так у p2 С-концевые галектин-подобные домены гексамера DTP расположены примерно перпендикулярно оси хвоста фага и несут шесть тримеров преимущественно глобулярного рецептор-узнающего белка (Рис. 1.6 и 1.7) (Sciara et al., 2010). В то же время у фага SPP1 гомологичные галектин-подобные домены участвуют в связывании рецептора непосредственно (Veesler et al., 2010, Goulet et al., 2011).

Базальные пластинки TP901-1 и Tuc2009 более массивны. У TP901-1 6 тримеров специализированного белка BppU расходятся в радиальном направлении от DTP и каждый из них несёт кластер из 9 копий рецептор-связывающих белков, организованных в три тримера (всего получается 54 копии рецептор-узнающего белка в одной базальной пластинке) (Veesler et al., 2012, Mahony et al., 2016). Базальная пластинка Tuc2009 организована сходным образом с тем существенным отличием, что в её состав входит 12 копий дополнительного рецептор-связывающего белка BppA (Legrand et al., 2016).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Прохоров, Николай Сергеевич, 2017 год

Название Релевантные свойства Источник

Escherichia coli

DH5a штамм для молекулярного клонирования Hanahan

HST08 штамм для молекулярного клонирования Takara

BL21(DE3) штамм для экспрессии в T7 системе Novagen

B834(DE3) штамм для экспрессии в T7 системе, ауксотроф по метионину Novagen

4s O22 серотип, чувствителен к G7C Knirel et al.

4sI производный 4s, устойчив к G7C, wclK::ISEic1, лишён О-ацетилирования О-антигена Knirel et al.

4sR производный 4s, устойчив к G7C, wclH::IS1A, лишён О-антигена Knirel et al.

C600 E. coli K12, лишён О-антигена, чувствителен к Т5-подобным фагам Appleyard

HS1/2 O87 серотип, чувствителен к DT571/2 Golomidova et al.

HS3-104 O81 серотип, чувствителен к DT57C и DT571/2 Golomidova et al.

Бактериофаги

G7C №-подобный бактериофаг; инфицирует E. coli 4s Kulikov et al.

63.1S23Am G7C мутант: S23Amber в гене 63.1 эта работа

66S481Am G7C мутант: S481Amber в гене 66 эта работа

51S26Am G7C мутант: S481Amber в гене 51 эта работа

Плазмиды

рЕТ23а экспрессионный вектор, промотор Т7, С-концевая бхИБ метка рЕТ19Ь экспрессионный вектор, К-концевая ЮхИб метка

р2363.1 получен из рЕТ23а, промотор Т7, §р63.1 07С

p2363.1HT

получен из pET23a, промотор T7, gp63.1 G7C, C-концевая 6xHis метка

Novagen Novagen Kulikov et al.

эта работа

pS307A

pG345A

pW381C

pN382A

pD470A

pH473A p1966 pTSL

pS66

pS66C137

pS66C294

pS66C375

pS66C460

pS66C653

pS66N293

pS66N375

pS66N460

pS66N537

pS66N650

получен из рЕТ23а, промотор Т7, §р63.1 07С, Б307А, С-концевая 6хН1б метка

получен из рЕТ23а, промотор Т7, §р63.1 07С, 0345А, С-концевая 6хН1б метка

получен из рЕТ23а, промотор Т7, §р63.1 07С, W381C, С-концевая 6хН1б метка

получен из рЕТ23а, промотор Т7, §р63.1 07С, К382А С-концевая 6хН1б метка

получен из рЕТ23а, промотор Т7, §р63.1 07С, Б470А С-концевая 6хН1б метка

получен из рЕТ23а, промотор Т7, §р63.1 07С, Н473А С-концевая 6хН1б метка

получен из рЕТ19Ь, промотор Т7, §р66 07С

экспрессионный вектор, К-концевая 6хН1б метка, 81уБ, сайт узнавания протеазы ТЕУ

получен из рТБЬ, промотор Т7, К-концевая 6хН1б метка, 81уБ, сайт узнавания протеазы ТЕУ, §р66 07С

получен из рТБЬ, промотор Т7, К-концевая 6хН1б метка, 81уБ, сайт узнавания протеазы ТЕУ, §р66 07С остатки 137-1063

получен из рТБЬ, промотор Т7, К-концевая 6хН1б метка, 81уБ, сайт узнавания протеазы ТЕУ, §р66 07С остатки 294-1063

получен из рТБЬ, промотор Т7, К-концевая 6хН1б метка, 81уБ, сайт узнавания протеазы ТЕУ, §р66 07С остатки 375-1063

получен из рТБЬ, промотор Т7, К-концевая 6хН1б метка, 81уБ, сайт узнавания протеазы ТЕУ, §р66 07С остатки 460-1063

получен из рТБЬ, промотор Т7, К-концевая 6хН1б метка, 81уБ, сайт узнавания протеазы ТЕУ, §р66 07С остатки 653-1063

получен из рТБЬ, промотор Т7, К-концевая 6хН1б метка, 81уБ, сайт узнавания протеазы ТЕУ, §р66 07С остатки 1-293

получен из рТБЬ, промотор Т7, К-концевая 6хН1б метка, 81уБ, сайт узнавания протеазы ТЕУ, §р66 07С остатки 1-375

получен из рТБЬ, промотор Т7, К-концевая 6хН1б метка, 81уБ, сайт узнавания протеазы ТЕУ, §р66 07С остатки 1-460

получен из рТБЬ, промотор Т7, К-концевая 6хН1б метка, 81уБ, сайт узнавания протеазы ТЕУ, §р66 07С остатки 1-537

получен из рТБЬ, промотор Т7, К-концевая 6хН1б метка, 81уБ, сайт узнавания протеазы ТЕУ, §р66 07С остатки 1-650

эта работа

эта работа

эта работа

эта работа

эта работа

эта работа Kulikov et al. Taylor et al.

эта работа

эта работа

эта работа

эта работа

эта работа

эта работа

эта работа

эта работа

эта работа

эта работа

эта работа

pDS3 pACBSR pAcBSD pGem-T pWclK

pG63.1S12Am pG66S481Am pG51S26Am

получен из pBR322, промотор pL фага X, SupD, репрессор cI857

получен из pACYC184, промотор PBAD, gam-beta-exo фага X

получен из pACBSR, промотор PBAD, SupD

многокопийный вектор для AT-клонирования

получен из pGem-T, промотор Lac, ген wclK

получен из pGem-T, фрагмент генома G7C в 1 т.п.н., S12Amber в гене 63.1

получен из pGem-T, фрагмент генома G7C в 1 т.п.н., S481Amber в гене 66

получен из pGem-T, фрагмент генома G7C в 1 т.п.н., S51Amber в гене 51

Steege & Horabin Herring et al. эта работа Promega эта работа

эта работа эта работа эта работа

Таблица П1.2. Праймеры.

Название Последовательность 5'-3' ЭНР

Праймеры для получения экспрессионных конструкций с вариантами §р63.1

63.1Б1 лслтастАасллллслллолоотттлтлталлс №е1

63.1Я1 лтлс сгсаАаласааааслтллттттлат хио1

63.1Б2 лтлт с^г^галлсалллтаттстсла Ше1

63.1Я2 лтлт сгсаАаосоаааслтллттттлат хьот

Праймеры для получения экспрессионных конструкций с вариантами §р66

66Б1 лтлт тсгАОЛоллсллсолоолтоосвлто ХЬа1

66Ю лтлт сгсаАастллалллссссассаллас ХИО1

66Б5 тлтттсслааасласааАгсслталлсаслслтлсссссттс БашН1

66Я6 ттатсалсааластссААггастллалллссссассаллас Мип1

660 37Б2 тл ааАгсстлслтсссстаалтттлтллттста БашН1

66с294Б2 тл ааАгссалластллаатлстталллтллслалссл БашН1

66с375Б2 тл ааАгссстаалттсстлссллсласалллт БашН1

66с460Б2 тл ааАгсслссллслтлсслтслаатттттлсаа БашН1

66с653Б2 тл ааАгссттаслаааааслтааллсл БашН1

66Ш93Я ттатсалсааластссААггаттлсссасссллсталлсллтл Мип1

66Ш75Я ттатсалсааластссААггаттлслалатллслатллтлтттссааа Мип1

66К460Я татсалсааластссААггаттлаатаатллллстлттатлттстлсссл Мип1

66Ш37Я ттатсалсааластссААггаттллаталтслсттсатталлаллса Мип1

66№50Я ттатсалсааластссААггаттлссслаллластслласатлсс Мип1

Праймеры для направленного мутагенеза активного сайта §р63.1

8307лмю лтслт§стттлтстоооЬ

0345лмя1 атлтстаетллаллат

Ш82лмю ттаа§еталслатлат

8аот1 стлсттаслстлатс

тсстсллсалслааласлсалтслт

Праймеры для направленного мутагенеза активного сайта §р63.1 (продолжение)

Б470АМБ1 ОАОТАОТА§СССАООТТ

Н473АМБ1 ТОТООО§сАОТАОТАТ

БШЛ ТТОООАССАААТСТОА

БОТ2 ААСААТОСТТТОСССАСАООАОАСТ

Праймеры для направленного мутагенеза фага О7С

812АшБ ОАТТТТАССООООАААОСАТААОСА

812АшЯМ ООТААОООТТа§АСАОа^ГССТААССААТ

812АшБМ ТА ССЛТЬССТОТ^ААСССТТАССОССТ

812АшЯ ОААСОТОСОТАТТОТТООТОСАТТТ

8481АшБ ТТТОСААОСОСССАТСТТССАТААТ

8481АшМК ААААТААССОаа^ТГОТавОТСООТОАТОТ

8481АшМБ АСАТСАССОАШАСА^СООТТАТТТТ

8481АшЯ ТТСАООААОТООСТСОТОСАОСТАА

БашН1 БашН1

НтёШ НтёШ

Праймеры для получения рАсБ8Б

8ирББ ТТТТааИССССАОАТООАТОСАСАААСАС Крп1

8ирБЯ ТТТТА4аС77ТТСТТОСОСТСААТАСОТТО НтёШ

Праймеры для получения экспрессионной конструкции с wclK

АТ8ОБ ТООТААТСТСТТТТОООССААОТ

АТ8ОЯ ТООСААТАТААААСАТСААСТТСАТОС

Праймеры для картирования мутаций в E.coli 4б

ОТ8ОБ ТТССАОАОСООАТТООТААО

ОТБОЯ ТСАААОТСААТСОССАСТТТТ

482 САСТОССАТАССОАСОАСОССОАТСТОТТОСТТОО

412 АТТООТАОСТОТААОССААОООСООТАОСОТ

М13Б ОТААААСОАСООССАОТ

М13Я САООАААСАОСТАТОАС

Т7Р ОТААТАСОАСТСАСТАТАООО

Т7Т ОСТАОТТАТТОСТСАОСОО

а Сайты узнавания ЭНР показаны курсивом. Ь Вносимые целевые мутации отмечены строчными буквами.

8еМег

Сбор данных

Пространственная группа Параметры ячейки а, Ь, с (А) а, Ь, с (°) Длина волны (А) Разрешение (А) Ятвси' (%)

сс 1/2

Ж

Полнота данных (%) Повторяемость данных Аномальный сигнал#

Уточнение модели

Разрешение (А) Уникальные отражения Км>вгк / Я/гвв Число атомов Белок Лиганд Вода Б фактор Белок (А2) Лиганд (А2) Вода (А2) КМ8Б

Длина связи (А) Углы связи (°) Карта Рамачандрана Оптимальные (%) Допустимые (%) Критические(%)

Н32

92.773, 92.772, 551.926 90.0, 90.0, 120.0 0.9797 100.0 - 2.41 7.5 (72.0)* 99.9 (79.3) 15.92 (2.04) 99.1 (94.4) 5.04 (4.40) 1.55 (0.67)

100.0 - 2.41

67728 0.159 / 0.221

6552 39 330

51.8 79.2 53.6

0.004 0.801

96 4 0

* В скобках указаны параметры для данных наибольшего разрешения.

# Посчитано в программе ХБ8 (КаЬБсИ 2010).

SeMet

Сбор данных

Пространственная группа Параметры ячейки а, Ь, с (А) а, Ь, с (°) Длина волны (А) Разрешение (А) Rmeas (%) СС 1/2 Ж

Полнота данных (%) Повторяемость данных Аномальный сигнал#

Р65

267.504, 267.504, 84.424 90.0, 90.0, 120.0 0.9785

50.00 - 2.69

17.1 (58.5)* 99.7 (53.1) 13.83 (3.82) 99.4 (96.4)

10.5 (9.6) 1.15 (0.75)

Уточнение модели

Разрешение (А) Уникальные отражения Rwork / Rfree Число атомов Белок Лиганд Вода ЯМ8Б

Длина связи (А) Углы связи (°) Карта Рамачандрана Оптимальные (%) Допустимые (%) Критические(%)

47.69 - 2.69

185773 0.238 / 0.270

17229 4 0

0.020 1.328

88.32 9.14 2.54

* В скобках указаны параметры для данных наибольшего разрешения.

# Посчитано в программе ХБ8 (КаЬБсИ 2010).

Нативный белок

SeMet

Сбор данных

Пространственная группа Параметры ячейки а, Ь, с (А) а, Ь, с (°) Длина волны (А) Разрешение (А) Rmeas (%) СС 1/2 Ж

Полнота данных (%) Повторяемость данных Аномальный сигнал#

Уточнение

Разрешение (А) Уникальные отражения Rwork / Rfree Число атомов Белок Лиганд Вода ЯМ8Б

Длина связи (А) Углы связи (°) Карта Рамачандрана Оптимальные (%) Допустимые (%) Критические (%)

Р312

109.183, 109.183, 406.577 90.0, 90.0, 120.0 0.9787 50.00 - 2.85 12.9 (89.9)*

99.6 (80.6) 12.12 (2.12)

99.7 (98.5) 5.76 (5.19)

К/А

49.06 - 2.85

65520 0.227 / 0.277

14252 2 0

0.012

I.691

86.51

II.09 2.39

Р312

108.672, 108.672, 406.132 90.0, 90.0, 120.0 0.9787 50.00 - 3.30 15.2 (74.8)

99.6 (86.2) 12.49 (2.69)

99.7 (98.7) 5.87 (5.81) 1.03 (0.73)

* В скобках указаны параметры для данных наибольшего разрешения.

# Посчитано в программе ХБ8 (Ка^сИ 2010).