Радиационно индуцированное укорочение продолжительности жизни и естественное старение Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, Потапенко, Андрей Игоревич

• Потапенко, Андрей Игоревич
• 1984

Оглавление диссертации Потапенко, Андрей Игоревич

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Общие вопросы теории старения

П. Радиационно индуцированное укорочение жизни . 13 Ш. Действие БУДР на клетки.

IV. Радиосенсибилизирукяцее действие БУДР у. D. melanogaster как Объект бИОЛОГИИ СТарвНИЯ И радиобиологии.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ.г.

I. Характеристика кривых выживания ина^актных насекомых 46 П. Действие облучения на проложительность жизни

D. melanogaster

Ш. Влияние БУДР и ФУДР на развитие дрозофилы . 50 U. Действие БУДР и совместное действие БУДР и облучения на продолжительность жизни дрозофилы.

ОБСУЖДЕНИЕ.,.

I. ДНК - субстрат радиационно индуцированного укорочения ЖИЗНИ D. melanogaster.

П. Сходство и различие процессов естественного старения и радиационно индуцированного укорочения жизни. . . 70 Ш. Зависимость среднего времени жизни от дозы облучения 73 ЗУ. Этапность процесса старения.

V. Возможные причины вариации продолжительности жизни ^

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Радиационно индуцированное укорочение продолжительности жизни и естественное старение Drosophila melanogaster»

Идеи и методы радиобиологии оказываются весьма полезными для изучения многих фундаментальных свойств живой материи. Б этом отношении не составляет исключения феномен радиационно индуцированного укорочения жизни. В большинстве монографий или обзорных статей по героитолопш авторы рассматривают соотношение механизмов радиационно индуцированного укорочения жизни и естественного старения. В ряде случаев по многим параметрам эти два явления оказывались весьма сходными. Ценность феномена радиационно индуцированного укорочения жизни для биологии старения заключается в первую очередь в том, что он вызывается вполне определенным внешним фактором, ионизирующим излучением, повреждающий механизм которого в отношении ключевых макромолекул клетки достаточно хорошо изучен. Более того, методы современной радиобиологии можно использовать для определения субстратов радиационного повреждения, в том числе и радиационно индуцированного укорочения жизни. Однако предположение о том, что в основе естественного старения лежит повреждение тех же ключевых макромолекул клетки, до сих пор остается не более чем привлекательной гипотезой, прямую проверку которой пока трудно осуществить.В настоящее время никто уже не придерживается первоначальных наивных представлений (48) о том, что с'тарение есть результат постепенного действия на организм ионизирующего излучения.Большинство исследователей полагают, что в качестве повреждающих агентов при старении выступают эндогенные факторы. Из этого, казалось бы, следует, что даже при наличии одного и того же инициального субстрата радиационно индуцированное укороче- 4 ние жизни и естественное старение феноменологически не могут быть тождественны, так как спектры повреждений в том и в другом случае должны различаться. Речь в данном случае идет,однако, только о первичных повреждениях. В том случае, когда и индуцированные радиацией, и спонтанные повревдения не реализуются немедленно в признаки старения, а проходят в своем развитии ряд этапов, вполне возможно, что начиная с одного из этих этапов их молекулярная природа, а следовательно и дальнейшая судьба, могут оказаться достаточно сходными для того, чтобы определить сходные повреждения биохимической машины клетки, составляющие в совокупности старение. Тогда аналогия между радиационно индуцированным укорочением жизни и естественным старением уже не мож;вт считаться чисто поверхностной.Это будет означать, что механизм радиационно индуцированного укорочения жизни, его начальные этапы и конечные стадии реализации будут иметь самое непосредственное отношение к внутриклеточным событиям, протекающим при естественном старении.Первоочередную значимость в анализе этой проблемы приобретает вопрос о молекулярной природе ключевого субстрата радиационно индуцированного укорочения жизни. Поскольку за многие феномены, вызванные облучением, ответственны повреждения генетического материала и поскольку есть методы доказательства того, что именно ДНК является первичной мишенью радиобиологических эффектов, главной задачей настоящего исследования был поиск экспериментального доказательства .инициальной роли ДНК в радиационно индуцированном укорочении жизни. Для этого был использован хорошо известный метод радиосенсибилизации с помощью частичного заглещения тимина ДНК на 5-бромурацил, достигаемого при инкубации клеток с 5-бром-2-дезоксиуридином (БУДР). Специфичность включения БУДР в ДНК позволяет утвер- 5 ждать, что за эффекты радиосенсибилизации в такой модели ответственна именно ДНК (22).Эксперименты были проведены на o.meianogaster , классическом объекте радиаодонной генетики, а в последнее время и биологии старения. Организм взрослых насекомых состоит из постмитотических клеток и поэтому может рассматриваться в качестве адекватной модели постмиготических тканей млекопитаюпщх, критических для процесса старения.Актуальность проблемы Настоящая работа выполнена в рамках проблемы "Изучение кинетических закономерностей процесса старениями действие геропротекторов (в эксперименте и клинике)", Л гос. регистрации 76 095409 от 22.12.76. Исследование механизма радиационно индуцированного укорочения жизни позволяет проводить не только оценку влияния ионизирующего излучения на такой важный биологический показатель, как продолжительность жизни животных, но и анализировать связь этого явления с естественным старением.Причины естественного старения изучены пока недостаточно, и теория биологии старения заметно отстает от современного уровня молекулярной биологии. Особенно мало известно о природе иниодального субстрата старения. Моделирование при определенных условиях с помощью ионизирующего излучения ускоренного старения открывает возможность использовать методы радиобиологии для характеристики ключевого субстрата как радиаодонно инд]уцированного укорочения жизни, так и естественного старения.Цель и задачи исследования Основная цель исследования заключалась в экспериментальном определении ключевого субстрата радиационного укорочения жизни у D.melanogaster . БЫЛИ ИСПОЛЬЗОВаНЫ ДаННЫе раДИОбИОЛО- 6 гии, согласно которым частичное замещение тимина ДНК на 5бромурацил (5-БУ") специфически сенсибилизирует клетки к действию ионизирующего излучения. Поскольку 5-БУ помимо ДНК в другие макромолекулы клетки не включается, наличие радиосенсибилизации указывает на то, что в данном случае генетический материал слулсит основной молекулярной мишенью при радиационном поражении.Конкретные задачи исследования включали: 1. Определение наличия или отсутствия сенсибилизации по тесту радаационно индуцированного укорочения жизни дрозофилы при содержании личинок на среде с БУДР.

2. Сравнивая детально формы кривых выживания при естественном старении и при радиационном укорочении жизни, мы должны были получить новые данные о сходстве или различии этих процессов.3. В нашу задачу также входила проверка предположения о том, что модификация ДНК БУДР может вызвать искажение процессов, протекающих при естественном старении. Критерием для оценки сходства радиационного укорочения жизни насекомых с 5-БУ ДНК и естественного старения также служил анализ формы кривых выживания. Мы полагали, что в качестве нового аргумента Б пользу того, что инициальным субстратом старения служит ДНК соматических клеток, можно рассматривать сочетание двух экспериментально полученных фактов. Во-первых, модификация ДНК 5-БУ усиливает эффект радиаодонного укорочения жизни, и во-вторых, действие облучения и модификация ДНК 5ЧБУ не вызывает существенных искажений процесса естественного старения, которые выражаются в изменении формы кривых выживания.Научная новизна С помощью радиосенсибилизации ДНК БУДР доказано, что клю- 7 чевЫМ субстратом радиационного укорочения жизни в. melanogaster является генетический глатериал. Разработан критерий дая сравнения динамики смертности при естественном старении и при различных воздействиях на этот процесс (по сопоставлению трех безразмерных параметров кривых выживания: коэффициентов вариации, асимметрии и эксцесса, а также по протяженности плато на кривых выживания). Определены условия, при которых облучение не вносит существенных искажений в процесс старения. Данные о радиосенсибилизирующем действии БУДР свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что общим инициальным субстратом естественного старения и радиационного укорочения жизни является ядерная ДНК. На основе анализа кривых выживания облученных насекомых сформулирована концепция о потенциальном характере генетических повреждений, ведущих к радиационно индуцированному укорочению жизни и об этапноети их проявления.Практическая значимость работы Проведенное исследование существенно конкретизирует наши знания о механизме радиационно инд1уцироБанного укорочения жизни. Данные работы могут быть использованы во всех случаях, когда проводится оценка влияния облучения на продолжительность жизни животных, в особенности если речь идет об облучении их постмитотических тканей. Полученные данные о ДНК как об инициальном субстрате радиационного укорочения жизни должны учитываться при разработке радиозащитных веществ, обладающих геропротекторными свойствами. - 8 О Б З О Р Л И Т Е Р А Т У Р Ы I . Общие вопросы теории старения В настоящее время существует огромное число гипотез о природе и механизмах старения, в 1970 году В.В.Фролькис (26) указывал примерно на 400 гипотез о причинах старения. Однако единой общепринятой концеподи, которая описывала бы процесс старения в целом или хотя бы его причины, до сих пор не существует. По выражению В.В.Фролькиса (26) "количество гипотез, как известно, обратно пропорционально ясности вопроса". Нас главным образом будут интересовать молекулярно-биологические аспекты старения, наиболее перспективные для изучения в настоящее время (4).Гипотезы о молекулярных механизмах старения условно можно разбить на два класса. К первому из них отнесем гипотезы, постулирующие, что первичной причиной старения являются изменения генетического аппарата соматических клеток. Ко второму рассматривающие изменения генома, как вторичные процессы в развитии старения. К крайним вариантам гипотез второго типа можно отнести мнение Bjorksten (35) о том, что к старению животных приводит возрастное накопление коллагена, затрудняющее функционирование тканевых клеток и приводящее их к гибели.Факты, противоречащие этой гипотезе, приведены в работе (5).Суть основного возражения заключается в том, что у многих организмов старение и гибель нейронов и мышечных клеток начинается до "созревания" соединительной ткани.Гипотезы первого класса в свою очередь можно разделить на три группы, к первой из них относятся гипотезы, утверждающие, - 9 что возрастные изменения генетического материала развиваются строго по заданной программе; при этом фактически игнорируются внешние по отношению к генетическому материалу воздействия.Ко второй группе относятся гипотезы, акцентирующие внимание на стохастических повреждениях генетического материала под действием внутриклеточных (свободные радикалы) и внешних (радиация, химические агенты) факторов, К третьей, пожалуй, наиболее обоснованной группе (4), относятся гипотезы, полагающие, что старение определяется совместным действием как генетической программы, так и стохастических факторов.Весьма определенно к первому классу можно отнести гипотезу маргинотомии, предложенную А.М.Оловниковым (23), основываясь на которой Good (63), впоследствии разработал математическую модель динамики митотической гибели клеток in vitro.Основное положение гипотезы маргинотомии заключается в том, что ДНК-полимераз соматических клеток в каждом цикле репликации недореплицируют теломерные районы хромосом. В конечном итоге через несколько митотических циклов должны теряться жизненно важные гены, расположенные вблизи концов хромосомы. В половых клетках функционирзгют другие ферменты, реплицирующие ДЕПС без потерь. Поэтому генетический материал половых клеток сохраняется неопределенно долгое время в ряду поколений.Изложенная гипотеза не опирается на достаточно надежные факты, однако очевидным достоинством ее является то, что автор не обходит наиболее трудный для биологии старения вопрос о причинах смертности соматических и бессмертия половых клеток.К первому классу можно отнести и гипотезу "ограничения кодонов", предложенную Стрелером (25, 103). В качестве ее основы выдвинуто предположение о том, что в процессе дифференцировки клеток осуществляется ряд последовательных изменений спектра - 10 тРНК-синтетаз и, следовательно, спектра транслируемых кодонов. В результате этих изменений в ходе дифференцировки необратимо выключается часть аппарата трансляции, что приводит к нарушениям в биохимической машине клетки и к старению.Еще несколько менее разработанных гипотез, относящихся к первой группе, рассмотрены в обзоре (26). Однако все они не учитывают реальные факты, свидетельствующие в пользу существования стохастической компоненты старения. Речь идет прежде всего о данных по действию веществ, удлиняющих продолжительность жизни - геропротекторов типа антиоксидантов (17, 29), об опытах по радиационно индувдрованному укорочению жизни (48, 91), а также о данных по корреляции между продолжительностью жизни и эффективностью работы ферментов, репарирующих повреждения ДНК (67).Основой почти всех гипотез о старении, относящихся ко второй группе, является представление sziiard (Iu6). основные положения его состоят в следующем: I) описывается старение только диплоидных клеток; 2) в .тканях, ответственных за старение, клетки не делятся или, по крайней мере, отсутствует отбор дефектных клеток; 3) элементарным событием, согласно szilard, является "возрастной удар" - повреждение определенного локуса хромосомы. "Возрастные удары" распределены случайным образом во времени и в пространстве; 4) когда "возрастные удары" инактивируют жизненно важный локус в обеих гомологичных хромосомах,клетка перестает функодонировать нормально; 5) организм умирает, когда доля клеток, продолжающих функционировать нормально, снижается до критического уровня, постулированного гипотезой. Под "возрастным ударом" подразумевается локальное повреждение генетического материала, то есть фактически мутаодонное событие. - II в дальнейшем эти представления, не подвергаясь принодпиальному пересмотру, были модифицированы различными авторами (59, 100). В частности было высказано мнение, что повреждения генетического материала обусловлены, в основном, действием свободных радикалов, постоянно присутствующих в клетках (66).В пользу свободно-радикальной концешщи старения, как уже отмечено выше, были получены экспериментальные данные (28).Ко второй группе можно отнести и гипотезы, построенные на основе идеи "катастрофы ошибок" Оргеля (45, 88, 89). Он указывал на то, что случайные ошибки в ходе синтеза белков, участвующих в репликации, транскрипции и трансляции, ведут к увеличению числа дефектных белковых молекул. В метаболических цепях ДНК-полимераза - ДНК - ДНК-полимераза и РШ-полимераза РНК - РНК-полимераза возникает отрицательная обратная связь, что приводит к катастрофическому нарастанию числа ошибок в ДНК, РНК и белках, а это служит причиной старения и смерти клеток.Однако ни одна из гипотез второй группы не в состоянии объяснить многочисленные факты, указывающие на существование генетического контроля продолжительности жизни. К их числу относится видовая специфичность продолжительности жизни (96), данные о значительном совпадении продолжительности жизни у монозиготных близнецов в сравнении с дизиготными (48), быстрая эволюция продолжительности жизни у приматов (51, 52) с сохранением характерного спектра возрастных изменений, то есть путем регуляции скорости старения.В настоящее время наиболее распространен взгляд на старение как на результат взаимодействия двух альтернативных процессов - стохастического возникновения повреждений в генетическом материале и запрограммированного удаления этих поврежде- 12 НИИ или развития их и проявления в качестве признаков старения и смерти (I). Только гипотезы, построенные на основе такой точки зрения, могут дать объяснение данным, указывающим как на влияние внешних воздействий на скорость старения, так и фактам, свидетельствующим о наличии генетического контроля над скоростью старения, нами разработана математическая модель молекулярного механизма старения, учитывающего как стохастическую, так и генетически запрограммированную компоненты старения (I). Подробно она рассмотрена в приложении П. Все существующие на данный момент гипотезы о механизмах старения опираются лишь на косвенные данные, нет прямых доказательств даже для весьма распространенного мнения о том, что изменения именно генетического материала являются иниодальным событием старения. В такой ситуации особую ценность для биологии старения приобретает решение вопроса о степени общности процессов радиаодонно индуодрованного укорочения жизни и естественного старения. Известно, что за радиаодонное поражение клеток отвечают в первую очередь повреждения ядерной ДЩС (9, II, 22). Следовательно, сходство процессов радиаодонно индуодрованного укорочения жиэ.ни и естественного старения может служить дополнительным доказательством того, что повреждения ДНК играют важную роль в старении. Более того, сходство этих процессов опровергает те гипотезы о старении, которые игнорируют значение случайных повреждений, так как облучение по отношению к генетическому материалу может рассматриваться только в качестве стохастической повреждающей компоненты. Однако едва ли можно ожидать полной тождественности радиаодонно индуодрованного-укорочения жизни и естественного старения, хотя бы уже потому, что спектры естественных первичных молекулярных повреждений ДНК и повреждений, вызванных облучением, могут - 13 не быть полностью идентичными. Трудно также ожидать, что облучение может влиять на собственно генетическую компоненту старения.Таким образом, рассматривая старение как единый результат действия двух процессов - накопления стохастических повреждений в генетическом материале и их реализации через генетически запрограммированный процесс (см. приложение П ) , мы можем предположить, что облучение частично моделирует старение, ускоряя накопление стохастических повреждений.П. Радиацйонно индуцированное укорочение жизни Сходство процессов естественного старения и радиацйонно индуцированного укорочения жизни давно привлекает внимание исследователей, молекулярные аспекты радиационного поражения клеток и организмов изучены значительно глубже, чем механизм старения. Поэтому, если феноменологическое сходство этих процессов вызвано хотя бы частичным сходством запускающих их молекулярных изменений, то, можно надеяться, что дальнейший анализ событий, возникающих на молекулярном уровне при радиацйонно индуцированном укорочении жизни, прольет свет на механизм старения, на основании сходства этих процессов Kunze в 1933 г. (48) даже выдвинул гипотезу о том, что старение вызвано действием естественного радиационного фона. Впоследствии на основании экспериментальных данных эта гипотеза была отвергнута.Однако многие исследователи уделяют большое внимание сопоставлению процессов индуцированного ионизирующей радиацией укорочения жизни и естественного старения как на морфологическом, так и на молекулярных уровнях.В исследовании ьать (76) проведен подробный анализ дейст- 14 ВИЯ различных факторов на продолжительность жизни при естественном старении и при радиаодонно индуцированном укорочении жизни. Показано, что при облучении дрозофил в возрасте 2-6 суток рентгеновскими лучами и J'-квантами ^ ^Со: а) продолжительность жизни самцов линейно сокращается с увеличением дозы облучения в диапазоне доз 0-680 Гр; б) при изменении условий содержания дрозофил - изменение температуры культивирования и частоты пересадок на свежую среду - средняя продолжительность жизни необлученных насекомых варьирует в пределах 15-100 суток, при этом во всех случаях относительное укорочение жизни после облучения остается постоянным; в) у самок, облученных в дозе до 170 Гр, продолжительность жизни несколько увеличивается. Этот эффект объясняется их стерилизацией под действием облучения. У генетически стерильных самок подобный эффект отсутствует; г) относительное укорочение жизни под действием облучения у самцов и у генетически стерильных самок одинаково; д) процент сокращения жизни у генетически стерильных диплоидных и триплоидных самок одинаков; е) многие мутантные линии дрозофилы имеют различную продолжительность жизни и, тем не менее, процент сокращения жизни на единицу дозы у них один и тот же; ж) самцы, облученные в возрасте 7-43 суток, показали одинаковое относительное укорочение продолжительности жизни после облучения. из перечисленных выше фактов автор делает вывод о том, что облучение вызывает ускорение естественного старения.Много внимания было уделено радиационно индуцированному укорочению жизни дрозофил, облученных в различном возрасте, а " 15 также при фраквдонированном облучении, В последнем случае последствия предварительного облучения сопоставлялись с возрастными изменениями радиочувствительности у насекомых» Однако данные, полученные по этим вопросам различными исследователями, противоречивы (32, 76). Baxter, Blair (32) ПРОВОДИЛИ исследование влияния облучения на продолжительность жизни в. melanogaster СО СредНСЙ Продолжительностыо жизни необлученных самок 51 сутки и самцов 44 суток. К насекомым различного возраста применяли однократное и фракционированное облучение ^ -квантами в дозах от 50 до 800 Гр. Авторы установили, что при облучении в сублетальных дозах продолжительность жизни не зависит от возраста облучаемых насекомых, и результаты воздействия фракционированной дозы ниже, чем однократной. Отсюда сделан вывод, что эффект (I) нелинейно зависит от дозы (о ) и может быть описан уравнением: I = аО + bD^ Из экспериментальных данных найдены коэффициенты а и ь, установлено, что облучение в дозе ниже 250 Гр на продолжительность жизни как самцов, так и самок не влияет. Из полученных данных сделан вывод о том, что облучение в сублетальных дозах приводит к преждевременному наступлению старения без его ускорения как такового (рис. I).По оси абсодсс - время в условных единицах, по оси ординат - доля выживших в популяции. - 17 К аналогичным результатам приводило облучение дрозофил и другими видами радиации. Davies, Mill at all (55) облучали D. meianogaster в ВОЗраСТС ОТ I ДО 8 СуТОК ЭЛеКТрОНаМИ С ЭНергией 14 Мев в дозах от 10 до 3200 Гр при различном содержании кислорода в атмосфере. Разницы в сокращении жизни по абсолютной величине при облучении в различных возрастах отмечено не было. Авторы нашли, что облучение в чистом кислороде увеличивает радиочувствительность дрозофилы.Во всех приведенных выше работах, исключая (76), основным критерием соответствия радиаодояно индуцированного укорочения жизни естественному старению была зависимость отношения S/E от возраста облучаемых насекомых: если оно оставалось постоянным, авторы принимали заключение о радиационно ускоренном старении (7, 77), если снижалось - о преждевременном старении (32). Увеличение этого отношения с возрастом говорит о возможном различии в механизмах радиационно индуцированного укорочения жизни и естественного старения.Нельзя не подчеркнуть, что лучевой синдром у дрозофилы имеет, вероятно, лишь весьма ограниченную аналогию с лучевой болезнью млекопитающих, обусловленной в первую очередь патологическими процессами в пролиферирующих тканях.В ряде работ по изучению радиационно индуцированного укорочения жизни у дрозофилы был отмечен интересный факт, который свидетельствует о некотором отличии изучаемого процесса от естественного старения. Продолжительность жизни самок после облучения в дозах до 300 Гр достоверно увеличивается. Обычно увеличение срока жизни самок после облучения объясняют их стерилизацией. Однако подобное увеличение отмечено не всеми исследователями. В работе неппеЬегу (68) было показано, что даже после облучения в небольших дозах (80 и 160 Гр) самок дрозофилы на стадии куколки или имаго, они не откладывают яйца, или откладывают их в весьма малом количестве.Подробно эффект увеличения продолжительности жизни самок дрозофилы после облучения был исследован в работе ьать (75).Она облучала в дозах от 80 до 630 Гр как нормальных самок и самцов, так и генетически стерильных самок. После облучения насекомые содержались на стандартной среде с частотой пересадок на свежую среду один раз в четыре дня и через день, а также на обогащенной среде. При содержании нормальных самок после облучения на нормальной среде с частотой пересадок один раз в четыре дня у них отмечалось увеличение продолжительности жизни после облучения, максимальное - при дозе 170 Гр до 112,5 су- 2 1 ток при продолжительности жизни контроля 69,5 суток. Во всех остальных случаях наблюдалось линейное сокращение продолжительности жизни с увеличением дозы облучения. Продолжительность жизни генетически стерильных необлученных самок (118 суток) и нормальных необлученных самок при смене среды через день (121,8 суток) была выше, чем максимальная для облученных самок при смене среды один раз в четыре дня (112,5 суток). Количество яиц, откладываемых облученными самками, было значительно ниже, чем у необлученных. Эти результаты ьашь объясняет следующим образом: в среде содержится ограниченное количество некоего гипотетического субстрата, необходимого дрозофиле для кладки яиц и положительно влияющего на продолжительность жизни. При пересадках через четыре дня этот субстрат исчерпывается еще до каждой следующей пересадки, что приводит к сокращению жизни необлученных насекомых. Облученные и генетически стерильные насекомые на кладку яиц его расходуют меньше или не используют вовсе и благодаря этому живут дольше. При пересадках через день этот субстрат не исчерпывается даже у нормальных необлученных насекомых. Таким образом, эффект увеличения продолжительности жизни самок после облучения проявляется только при содержании дрозофил в физиологически субоптимальных условиях и не проявляется в условиях оптимальных.Более информативными, чем наблюдения за средней продолжительностью жизни, по нашему мнению, могли бы быть сопоставления изменений на клеточном и на молекулярном уровнях при естественном старении и после облучения. К сожалению, таких работ в литературе не много. Одна из них проведена Gartner (61). Она изучала с помощью электронной микроскопии через.определенные промежутки времени клетки средней кишки дрозофил, облученных в дозе 990 Гр ^ -квантами ^ С о . Установлено, что - 22 все возрастные изменения в клетках: изменения митохондрий, появление и нарастание числа липидоподоОных включений в цитоплазме, наличие в ядре, а затем и в цитоплазме вирусоподобных частиц, иные, связанные с мембраной, включения в ядре, агрегация в некоторых клетках липидоподобных включений - ускоряются в клетках облученных насекомых, но не появляются непосредственно после облучения. Кроме этих изменений в клетках облученных мух появились к концу жизни и другие: гигантские уродливые митохондрии и скопления вирусоподобных частиц в цитоплазме .Так как изменения клеточных структур не появляются непосредственно после облучения, а накапливаются постепенно, эти данные, пожалуй, противоречат гипотезе о преждевременном старении после облучения (32). Наличие изменений, отсутствующих при естественном старении, свидетельствует о том, что облучение, помимо ускорения естественного старения (61), вносит определенные искажения в его механизм. Несомненно однако, что, хотя междог естественным старением и радиационно инд1уцированным укорочением жизни есть некоторые различия, эти процессы тесно связаны.У млекопитающих наиболее подробное сопоставление естественного старения и радиационно индуцированного укорочения жизни было проведено на мышах. Нири (21) показал, что при хроническом нейтронном облучении продолжительность жизни мышей сокращается. При этом среди облученных мышей резко возрастает смертность от различного рода опухолей. На основании последнего факта автор делает вывод о том, что радиационно индуцированное укорочение продолжительности жизни не является аналогом естественного старения. Однако у мышей вероятность возниконовения опухолей под действием облучения сильно зависит от выбора 23 линии экспериментальных животных. Так, в работе (115) показано, что при хроническом облучении ^ -квантами (мощность дозы 0,00062 Гр/сутки) у мышей линии Rap лейкозы возникают у 55% животных, а в контроле - у 7%, В то же время у линии fl/Jax лейкозы отсутствуют как в контроле, так и у облученных животных. Кроме того, укорочение времени жизни, вызванное радиацией, оказалось примерно одинаковым у обеих линий.Большой интерес представляют результаты недавних опытов ordy с соавторами (87). Они облучали фокусированным пучком дейтронов с энергией 20 Мев мозг мышей в дозах от 5 до 500 Гр.Выбор облучаемого органа авторы обосновали следующими аргументами. Мозг, по их мнению, может оказаться критическим органом при старении, так как продолжительность жизни многих млекопитающих определяется относительными размерами мозга; клетки мозга не замещаются; к тому же старческие изменения психики, а также функционирования многих органов можно объяснить первоначальными изменениями в нервной системе. Показано, что с увеличением дозы облучения срок жизни животных снижается. Авторы отмечают, что облучение вызывает физиологические и биохимические изменения в нервных клетках, а также изменения высшей нервной деятельности, подобные старческим. Однако существуют и отличия, которые необходимо дополнительно изучать.Изучению изменений в ДНК нейронов после облучения и при естественном старении посвящена работа (117). Авторы облучали мозг крыс рентгеновским излучением в дозе 20 Гр и исследовали в различных возрастах сидементационными методами вторичную структуру ДНК нейронов облученных и необлученных животных. Через четыре недели после облучения различий как во внешнем виде животных, так и в ДНК их нейронов не было. Через 7 недель после облучения начали появляться первые различия, через Ю не- 2 4 дель началось быстрое накопление повреждений вторичной структуры ДНК, которое сопровождалось гибелью крыс. У необлученяых животных накопление аналогичных повреждений началось несколько позже, и продолжительность жизни была выше, чем у облученных. Авторы полагают, что накопление повреждений вторичной структуры ДНК нервных клеток отражает либо даже инициирует изменения, ведущие к смерти, как при естественном старении, так и после облучения в сублетальных дозах.Из изложенных фактов можно сделать вывод о том, что облучение приводит как к ускорению старения, так и к иным, побочным эффектам. Возможно, оно изменяет естественное соотношение скоростей старения различных систем организма. Относительным увеличением скорости старения иммунной системы можно объяснить увеличение процента смертности от различных опухолей в опытах Нири (21). Аналогичным эффектом можно объяснить и результаты Gartner (61). Допустим, ЧТО средняя кишка не является критическим в старении дрозофилы органом, а ее старение ускоряется облучением в большей степени, чем старение критических тканей.В этом случае Gartner фактически наблюдала у облученных насекомых клетки средней кишки большего биологического возраста, чем это возможно у необлученных, так как необлученные мухи гибнут вследствие изменений в критических тканях раньше, чем клетки их средней кишки достигнут такого возраста. Тогда все дополнительные изменения в упомянутых клетках представляют собой лишь следствие развития возрастных изменений.Наличие различных побочных эффектов при радиационно индуцированном укорочении жизни не позволяет в настоящее время определить.какие из фундаментальных процессов радиационного поражения наиболее близки к инициальным механизмам старения.Однако сходство этих процессов служит дополнительным, хотя мо- 2 5 жет быть и косвенным аргументом в пользу того, что старение вызывается изменением именно генетического материала основной мишени радиационного поражения. Тем не менее, сопоставляя протекание этих процессов у дрозофилы, не cлe^ Iyeт забывать, что ответственность ДЩК за основные радиационные эффекты показана на митотических клетках в диапазоне доз 1-50 Гр. В то же время, радиационно индуцированное укорочение жизни на дрозофиле описано при облучении в дозах 100-1000 Гр, и ведущая роль повреждений ДНК в радиобиологических эффектах в этом диапазоне доз нуждается в дополнительном обосновании.Особый интерес представляют опыты по облучению in vivo отдельных критических при старении тканей - например, нервной ткани (117). При облучении организма клетки с коротким митотическим циклом в целом более радиочувствительны, чем постмитотические. Они повреждаются в большей степени, чем последние.Однако, по мнению многих авторов (41), именно постмитотические клетки являются критическими при естественном старении. В таких условиях облучение, даже если оно на клеточном уровне увеличивает темп старения без дополнительных эффектов, на уровне организма вызывает искажение картины старения вследствие более сильного повреждения делящихся клеток, в норме не ответственных за старение. Локальное облучение критических при старении.постмитотических тканей поможет избежать побочных эффектов, вызываемых более сильным поражением делящихся тканей.Возможно, дополнительную информацию о старении можно получить, специфически модифицируя первичные радиационные повреждения ДНК, увеличивая их суммарный выход, изменяя выход различных мутаций и сопоставляя изменения спектра первичных повреждений с модификацией эффекта радиационно индуцированно-26 го укорочения жизни.Ш. Действие БУДР на клетки 5-бром-2-"Дезоксиуридин (БУДР) является специфическим аналогом тимидина, способным включаться вместо него в хромосомную ДНК. Следует подчеркнуть, что БУДР, в отличие от других аналогов, не включается в какие-либо иные макромолекулы клетки, в том числе в Р Ш . Процент замещения тимина на 5-бромурацил (5-БУ) в ядерной ДНК в большой степени зависит от условий культивирования клеток in vivo , а также от исследуемых линий. Известны мутантные линии клеток (33), которые способны нормально пролифирировать при почти 100%-ном замещении тш.шна на 5-БУ. В большинстве случаев в культивируемых клетках млекопитающих степень замещения тимина на 5-БУ может изменяться от Ъ% до 50% (97). Эта величина может достигать своих макисмальных значений только при добавлении в культуральную среду совместно с БУДР ингибитора эндогенного синтеза тимидиловой кислоты - 5-фтор"-2-дезоксиуридина (ФУДР) и снижается при добавлении в среду с БУДР дезоксицититина (95, 109).Установлено, что 5-БУ изменяет некоторые физико-химические свойства ДНК. Так 5-БУ модифицированная ДНК имеет более высокую температуру плавления, чем нативная, причем с увеличением степени замещения тимидина на 5-БУ возрастает и температура плавления (50). По ряду тестов отмечена большая связь 5-БУ модифицированной ДНК с некоторыми гистонами (34, 79, 83).Известно, что ДНК эукариот состоит из уникальных и повторяющихся последовательностей. Последние различаются по степени повторяемости (3). При исследовании методами ренатурации (скорость ренатуравди различных последовательностей дениатуриро- 27 ванной ДНК при заданных условиях определяется степенью повторяемости этих последовательностей в геноме) выделяют четыре фракции последовательностей ДНК, различающихся по степени повторяемости: высокочастотные, среднечастотные, низкочастотные (умеренные) повторы и уникальную ДНК (3). Повторяющшлся последовательностям (кроме сателлитных, относящихся к высокочастотной фракции) приписывается важная роль в системах генетической регуляции эукариотйческих клеток (54, 69). Singer И соавторы (99) исследовали методом кинетики репа турации распределение '^Н-б-БУ по различным фракциям ДНК. Они показали, что в линиях трансформированных клеток 5-БУ распределен равномерно по всем типам последовательностей (99).В исследованиях 5-БУ модифицированной ДНК эмбриональных клеток мыпш (97) также показано, что при высокой степени замещения тимидина на 5--БУ (до 45^), он равномерно распределен по всему геному» Однако при низкой степени замещения (до 5%) в этих клетках, а также в хрящевых эмбриональных клетках ципленка при высокой степени замещения (50^) БУДР включается преимущественно в низкочастотные повторы (98, 105). Об этом же косвенно свидетельствуют и данные работы (58). Авторы установили, что в синхронной культуре клеток зародышевой мезодермы щшленка интенсивность включения ^Н-БУДР в начале s-фазы значител1гно выше, чем в асинхронных культурах. Так как известно, что Б начале s-фазы идет синтез в основном среднечастотных и низкочастотных повторов (49, 108), авторы заключают, что БУДР особенно интенсивно включается именно в эту часть генома. К сожалению на дрозофиле, объекте наших исследований, обладающей несколько иной структурой генома (116), подобные исследования пока не проведены.Включившись в клеточную ДНК, БУДР оказывает селективное и - 28 обратимое действие на ряд специфических функций клетки. БУДР ингибирует процесс дифференцировки и в то же время слабо действует на скорость роста и жизнеспособность клеток (46, 97).Другими словами, по этотлу тесту БУДР подавляет активность так называемых генов "роскоши" ( luxury genes ) и не влияет на гены "домашнего хозяйства"(house keeping genes).В работе (90) показано, что БУДР в клетках меланомы сирийского хомячка обратимо подавляет синтез меланина и даже онкогеННЫе свойства этих клеток. Kasupskl, Mukkerjee (72, 73) установили, что БУДР селективно снижает активность ферментов.Из семи изученных энзимов; лактатдегидрогеназа, фосфоглюконатдегидрогеназа, изоцитратдегидрогеназа, щелочная фосфотаза, гл1>козо-€-фосфо-дегидрогеназа, алкогольдегидрогеназа и кислая фосфотаза, БУДР действовал только на три последних. Авторы этой работы исследовали влияние БУДР, добавляемого в среду к синхронной культуре в течении ограниченных отрезков s-фазы. Активность каждого из трех ферментов подавляется включением БУДР в ДНК в строго определенные отрезки фазы.Очень интересные результаты получены в недавней работе (81).Авторы показали, что в клетках Эритролеикимии Френда включение БУДР в начале s-фазы ингибирует экспрессию в-глобияового гена, в то время, как сам этот ген реплицируется в последней трети s-фазы.Данные зонного электрофореза и иммунологического анализа также показывают, что БУДР не вызывает, как правило, изменения структуры белков, активность работы которых он снижает. В работе (72) показано, что активность ферментов под действием БУДР снижается вследствие замедления их синтеза.На основании приведенных выше фактов, а также того, что эффект БУДР купируется добавлением в среду тимидина (95) (иног- 29 да в таких количествах, которые не оказывают существенного влияния на содержание 5-БУ в ДВК (92)) делается вывод о том, что действие БУДР зависит от его распределения в ДНК и проявляется не через мутавди, а посредством искажения процессов регуляции, поддерживающих транскрипцию в тканеспецифических локусах (72).Однако существуют данные и о том, что БУДР может вызывать мутации в клетках эукариот. В работе (30) показано, что добавление БУДР в среду к культивируемым клеткам китайского хомячка существенно повышает выход колоний, устойчивых к 6-тиогуанину. Устойчивость сохраняется у клеток, происходящих из этих колоний, в течение трех месяцев инкубации без БУДР. Авторы указывают, что и по этому тесту клетки наиболее чувствительны к БУДР в начале s-фазы. Репликативный мутагенез под действием 5-БУ у прокариотизвестен уже довольно давно.Появление фенотипических отклонений на уровне организма под действием БУДР отмечено в серии работ Rizky и соавторы (93, 94, 95). Они помещали личинок дрозофилы в физиологический раствор, содержащий до I мг/мл БУДР и 0,5 мг/мл ФУДР на четыре часа. Обработку проводили на различных стадиях развития личинок. изучали морфологические изменения у взрослых насекомых, главным образом изменения крыльев. Оказалось, что обработка на ранних этапах развития приводит к более редким и крупным нарушениям, чем на поздних (95). При прочих равных условиях нарушений тем больше, чем больше предполагаемая степень замещения тимидина на 5-БУ в ДНК личинок. На основании того, что изменяются как тканевые клетки, содержащие БУДР, так и их потомки, не содержащие 5-БУ ДНК, авторы сделали вывод, что последствия включения БУДР проявляются в виде соматических мутаций (93). Однако, вероятнее всего, что итальянские авторы име- з о ли дело не с истинными соматическими мутациями, а с морфозами.Уникальную мозможносгь исследования влияния каких-либо факторов на работу совокупности генов предоставляют хромосомы слюнных желез дрозофилы. Экспрессия некоторых локусов, наблюдаемая в оптическом микроскопе в виде пуффов, в некоторых случаях соответствует работе единичных генов (2). Исследование влияния БУДР на спектр пуффов хромосом слюнных желез личинок дрозофилы было проведено в работе (16). Авторы помещали на среду, содержащую до 1,2 мг/мл БУДР, личинок первого возраста и выращивали их на этой среде до стадии пупария. Взрослые насекомые в таких условиях не появляются. Спектр пуффов хромосом личинок, выращенных на среде с БУДР, существенно отличался от контрольного. Появились шесть новых пуффов, отсутствовали несколько пуффов, присутствующих в контроле, сместились сроки формирования пуффов, вариация экспрессии пуффов была выше, чем в контроле. Авторы подчеркивают, что различия в спектрах пуффов личинок, выращенных на среде с добавлением БУДР и контрольных личинок, были только в стадии специфических пуффах, и отсутствовали в постоянно существующих. Это согласуется с представлением И.Ф.Жимулева и соавторов (118) в том, что постоянно существующие пуффы и междиски отражают транскрипционную активность общеклеточных генов, которые, как было отмечено выше, нечувствительны к БУДР. Некоторые стороны действия относительно небольших количеств БУДР на развитие дрозофилы исследованы в работе (III).Авторы помещали на среду, содержащую от 100 до 800 мкг/мл БУДР, личинок третьего возраста. Установлено, что у личинок, растущих на среде, содержащей до 150 мкг/мл БУДР, не увеличивается выход спонтанных хромосомных аберраций в клетках нервных ганглиев и не изменяется продолжительность митотического - 31 цикла этих клеток» Включение БУДР в хромосомную ДНК при этих условиях было установлено по дифференциальной окраске хроматид.Авторы показали также, что содержание БУДР в среде до 400 мкг/мл не снижает существенно процент окуклившихся личинок.Однако БУДР значительно уменьшает вылет взрослых насекомых.При концентрации БУДР в среде 100 мкг/мл вылет взрослых насекомых уменьшается вдвое по сравнению с контролем, а при 400 мкг/мл прекращается совсем.

Заключение диссертации по теме «Другие cпециальности», Потапенко, Андрей Игоревич

ВЫВОДЫ

В настоящей работе исследовано радиационно индуцированное укорочение ЖИЗНИ (РИУЖ) D. melanogaster.

I* Установлено, что модификация ДНК самцов дрозофилы 5-бромурацилом (при содержании личинок на среде, содержащей от 10 до 50 мкг/мл БУДР) приводит к радиосенсибилизации по тесту РИУЖ. Отсюда в соответствии с постулатами радиобиологии о механизме сенсибилизирующего действия 5-БУ (22) можно заключить, что ключевым субстратом, ответственным за РИУЖ, является ядерная ДНК.

2. Предложен новый метод для сравнительной характеристики РИУЖ и естественного старения путем изучения динамики смертности по набору безразмерных параметров кривых выживания: коэффициентов вариации, асимметрии и эксцесса. В условиях настоящей работы стабильность первых двух параметров достаточна для строгой характеристики кривых. Эксцесс является наименее стабильным параметром, и его изменения от опыта к опыту не были достоверны.

3. Анализ кривых выживания дрозофил позволил заключить, что облучение самцов в дозах до 250 Гр и самок до 500 Гр не вызывает существенных отклонений по принятым критериям РИУЖ от естественного старения. Этот факт свидетельствует в пользу представления о том, что при определенных условиях РИУЖ может рассматриваться в качестве адекватной модели ускоренного естественного старения насекомых.

4. На основании вывода о том, что ключевым субстратом РИУЖ является ДНК, а также наших и литературных данных о сходстве РИУЖ и естественного старения, мы пришли к заключению,

- 108 чю наши данные являются аргументом в пользу того, что ядерная ДНК служит субстратом старения постмитотических клеток.

5. Установлено, что при облучении одно-двух-суточных взрослых насекомых ^ -квантами ®°Со зависимость сокращения продолжительности жизни от дозы облучения в выбранных условиях содержания мух для самцов была линейной, а для самок - квадратичной.

6» Характерной чертой кривых выживания насекомых, облученных в дозах до 1000 Гр, является плато, продолжающееся около трех недель после облучения. Эта особенность РИУЖ указывает на потенциальный характер и этапность в развитии радиационно индуцированных повреждений, ведущих к старению и смерти насекомых.

7. Разработана математическая модель гипотетического процесса старения клеток эукариот. Она основана на предположении о том, что к старению ведет программированное разрушение регуля торных зон генома (некоторых семейств повторяющихся последовательностей ДНК). Показано, что на качественном уровне предложенная гипотеза согласуется с основными фактами о течении старения, в частности, задает типичный характер кривых выживания.

Список литературы диссертационного исследования Потапенко, Андрей Игоревич, 1984 год

1. Акифьев А.П., Потапенко А.И. Старение высших организмов, как процесс программированного разрушения систем внутриклеточной генетической регуляции. В сб. Геронтология и гериатрия. Киев, 1979, с. 96-100.

2. Бостон К., Саммер э. Хромосома эукариотической клетки. -М.: Мир, 1981, с. 273-312.

3. Бостон К., Саммер Э. Хромосома эукариотической клетки. -М.: Мир, 1981» с. 25-130 и 468-501.

4. Ванюшин Б.Ф., Бердышев Г.Д. Молекулярно-генетические механизмы старения. М.: Медицина, 1977, с. 88-111.

5. Виленчик М.М. Молекулярные механизмы старения. М.: Наука,1970 168 с.

6. Гаврилов Л.А., Гаврилова Н.С. Культура диплоидных клеток как объект изучения молекулярных механизмов старения. Успехи современной биологии, 1978, вып. 2, с. 267-283.

7. Гаврилов Л.А., Гаврилова Н.С. Определение видовой продолжительности жизни. Докл. АН СССР, 1979, Л 2, с.465-469.

8. Гаврилов л.А. Исследование генетики продолжительности жизни с помощью кинетического анализа. Автореф. дис. . канд. биол. наук - М., 1980 - 22 с.

9. Дертингер г., Юнг X. Молекулярная радиобиология. -М.: Атом-издат, 1973, с. 85-239.

10. Камышев Н.Г. Продолжительность жизни и ее связь с двигательной активностью у мутантов дрозофилы метаболического пути триптофан-ксантоматтин. Докл. АН СССР, 1980, 253. Jf 6, с. 1476-1480.

11. Кудряшов Ю.Б., Беренфельд Б.С. Радиационная биофизика.- но

12. М.: Изд-во МГУ, 1979, с. 167-178.

13. Левонтин Р. Генетические основы эволюции. М.: Мир, 1978 -351 с.

14. Ли Д. Действие радиации на живые клетки. М.: Госатомиз-дат, 1963 - 288 с.

15. Лисенков А.Н. Математические методы планирования многофакторных медико-биологических экспериментов. М.: Медицина, 1979 - 343 с.

16. Лэмб М. Биология старения. М.: Мир, 1980, с. 38-59.

17. Митрофанов В.Г., Полуэктова Е.В. Возрастная специфичность действия 5-бромдезоксиуридина на дифференцировку и спектр пуффов хромосом СЛЮННЫХ желез у Drosophila virilis sturt. -Генетика, 1977, ХШ, If 7, с. I2Q2-I209.

18. Накаидзе Н.Ш., Обухова Л.К., Смирнов Л .Д., Акифьев А.П. Влияние геропротектора 2-этил-б-метил-З-оксипиридина на продолжительность ЖИЗНИ D. melanogaster, ИЗВ. АН СССР сер. биол., 1978, $ 4, с. 632-635.

19. Накаидзе Н.Ш., Кузьмин В.И., Розанцев Э.Г., Обухова Л.К. Влияние некоторых антиоксидантов на продолжительность жизни Drosophila melanogaster . ИЗВ. АН СССР Свр. бИОЛ., 1979, Я 6, с. 926-929.

20. Накаидзе Н.Ш., Акифьев А.П., Обухова Л.К. К вопросу об инициальном субстрате старения У D. melanogaster. Изв. АН СССР сер. биол., 1980, 6, Jf 2, с. 158-163.

21. Накаидзе Н.Ш. Экспериментальный анализ механизма старения

22. D. melanogaster . АВТОреф. ДИС. . КЭНД. бИОЛ. Наук1. М. 1980 23 с.

23. Нири Р., Мансон р., Мак Р. Биологическое действие длительного нейтронного облучения. М.: Изд-во иностр. лит., 1961 -271 с.- Ill

24. Окада Ш. Радиационная биохимия клетки. М.: Мир, 1974, с. 167-184.

25. Оловников A.M. Принцип маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. Докл. АН СССР, 1971, 2QI, ii 6, с. 14691499.

26. Полуэктова Е.В., Митрофанов В.Г., Гаузе Г.Г. Гетерогенность по чувствительности к 5-бромдеоксиуридину у линий Drosophiia viriiis . -Генетика, 1976, ХП, й 4, с. 73-82.

27. Стрелер Б. Время, клетки и старение. М.: Мир, 1964 -253 с.

28. Фролькис В.В. Ре1улирование, приспособление и старение. -- Л.: Наука, 1970 432 с.

29. Шеффе Г. Дисперсионный анализ. М.: Наука, 1980 - 512 с.

30. Эмануэль Н.М. Некоторые молекулярные механизмы и перспективы профилактики старения. Изв. АН СССР сер. биол., 1975, Я 4, с. 503-511.

31. Эмануэль Н.М. Ингибиторы радикальных процессов и возможности продления жизни. В сб. геронтология и гериатрия, Киев, 1979.

32. Aebersold P.M. Mutagenic mechanism of 5-bromodeoxyuridine in Chinese hamster cells. Mutat. Res., 1976, 36, № 3, p. 357-362.

33. Atlan H., Jaime M.D., Bimm Ph.D.R. Difference between radiation-induced life shortening and natural ageing in Drosophiia melanogaster. J. Geront., 1969, 24, № 1,p. 1-5.

34. Baxter R.C., Blair H. Kinetics of ageing as revealed by X-ray dose lethality relations in Drosophiia. - Radiat. Res., 1967, 30/ Ns 1' P* 48-70.

35. Bick M.D., Davidson R.L. Total substitution of bromode-oxyuridine for thymidine in the DNA of a bromodeoxyuridine-dependent cell line. Proc. Nat. Acad. Sci., 1974, 71,5, p. 2082-2086.

36. Bick M.D., Devine E.A. Interaction of chromosomal proteins with BrdU substituted DNA as determined by chromatin-DNA competition. Nucl. Ac. Res., 1977, 4, № 11, p. 3687-3700 .

37. Biorksten J. The crosslinkage theory of ageing. J. Amer. Gerist. Soc., 1968, XVII, № 4, p. 408-427.

38. Birky C.W., Skavaril R.V. Maintenance of genetic homoge-nity in systems with multiple genomes. Genet. Res., 1976, 27, № 2, p. 249-265.

39. Blair H.A., Baxter R.C. Radiation life shortening in Drosophila as a function of age and prior exposure. -Radiat. Res., 1970, 43, № 2, p. 439-451.

40. Bozcuk A.N. DNA synthesis in the absence of somatic cell division associated with ageing in Drosophile subobscura. Exp. Geront., 1972, 7, № 3, p. 147-156.

41. Boscuk A.N. The effect of some genotypes on the longevity of adult Drosophila. Exp. Geront., 19 78, 1J3, NQ 5, p. 279-285.

42. O'Brien R.D., Wolfe L.S. In: Radiation, radioactivity and insects. N.Y.-London, Acad. Press, 1964, p. 2.

43. Brizee K.R., Kuon C. The ageing process in the neuron. -Ageing Phen., 1980, 129, № 1, p. 71-98.

44. Brush D.E., Hart R.W. Molecular biology of aging. In: The biology of ageing. Eds. Behnke J.A. et al. N.Y.-London, Plenum Press, 1978, p. 57-81.

45. Callan H.G. On the organization of genetic units in chromosomes. J. Cell Sci., 1967, 2, № 1, p. 1-7.

46. Ciess M.C. Difference between natural ageing and radio-induced shortening of the life expectancy in Drosophiia melanogaster. Gerontology, 1980,\26, NQ б' P* 301-310.

47. Coel N.S., Islam S. Error catastrophe in and the evolution of the protein synthesizing machinery. J. Theor. Biol., 1977, № 2, p. 167-182.

48. Colbert D.A., Coleman J.R. Transcriptional expression of nonrepetitive DNA during normal and BUDR-mediated inhibition of mutogenesis in culture. Exp. cell, res., 1977, 109, № 1, p. 31-42.

49. Cole A., Humphrey R.M., Dewey W.C. Low-voltage electron beam irradiation of normal and 5-bromouridine deoxyribo-side-treated L-P^^ mouse fibroblast cells in vitro. -Nature, 1963, 199, № 4895, p. 780-782.

50. Comfort A. The biology of senescence. London: Churchill Livingstone, 1979, - 414 p.

51. Comings D.E., Mattoccia E. Replication of repetitions DNA and the S-period. Proc. Nat. Acad. Sci., 1970, 61, № 1, p. 448-455.

52. Cullen B.R., Bick M.D. Thermal denaturation of DNA from bromodeoxyuridine substituted cells. Nucl. Ac. Res., 1976, 3, № 1, p. 49-62.

53. Cutler R.G. Evolution of human longevity and the genetic complexity governing ageing rate. Proc. Nat. Acad. Sci., 1975, 72/ NQ 11, p. 4664-4668.

54. Cutler R.G. Evolution of human longevity: a critical overview. Development, 1979, 9, № 3/4, p. 337-354.

55. Davidson E.H., Klein N.H., Britten R.J. Sequence organization in animal DNA. Develop. Biol., 1977, 55, № 1,p. 69-84.

56. Davidson E.H., Britten R.J. Regulation of gene expression: possible role of repetitive sequences. Science, 1979, 204, № 4397, p. 1052-1059.

57. Davies R.V., Mill A.J., Thompson S.C., Atherton H.A., Hollingsworth M.J. The effect of hypoxis on radiation life shortening in Drosophila melanogaster. Br. J. Radiol., 1972, 45, № 538, p. 800-801.

58. Fahmy M.J., Fahmy O.J. Altered controle of gene activity in the soma by carcinogenesis. Mutat. Res., 1980, 72, № 1, p. 165-172.

59. Flanagan J.R. Detecting early-life components in the determination of the age of death. Mech. Ageing a. Development, 1980, 13, № 1, p. 41-62.

60. Flickinger R.A. The effect of 5-bromodeoxyuridine on chick embryo limb bud mesenchyme in organ culture. Cell Differ., 1975, 4, № 5, p. 295-304.

61. Forbes W.F., Sprott D.A., Feldstein M. A model to account for mortality curves of various species. J. Theor. Biol., 1970, 29, № 2, p. 293-299.

62. Friedman B.E., Bouchard R.A., Stern H. DNA Sequences Repaired at Pachytene Exhibit Strong Homology Among Distantly Related Higher Plants. Chromosoma, 1982, JT7, № 4,p. 409-424.

63. Gartner L.P. Ultrastructural examination of ageing and radiation-indused life-spen shortening in adult Drosophila melanogaster. Int. J. Radiat. Biol., 1973, 23, № 1,p. 23-39.

64. Gonzalez B.M. Experimental studies on the duration of life. VIII. The influence upon duration of life of certainmutant genes of Drosophiia melanogaster. Amer. Naturalist, 1923, 57, № 651, p. 289-325.

65. Good P.I. A stochastic model for in vitro ageing. II. A theory of marginotomy. J. Theor. Biol., 1977, 64^, № 2, p. 261-276.

66. Greer S. Studies on ultraviolet irradiation of Escherichia coli containing 5-bromouracil in its DNA. J. Gen. Microbiol., 1960, 22, № 3, p. 618-634.

67. Harman D. Free radical theory of ageing: effect of free radical reaction inhibitors on the mortality rate of male LAFX mice. J. Geront., 1968, 23, № 4, p. 476-482.

68. Hart R.W., Setlov R.B. Correlation between deoxyribonucleic acid exition-repair and life span in a number of mammalian species. Proc. Nat. Acad. Sci., 1974, Tl, № 6, p. 2169-2173.

69. Henneberry T.J. Effects of gamma radiation at the fertility and longevity of Drosophiia melanogaster. J. Econ. Entomol., 1963, 56, № 3, p. 279-281.

70. Jacob M. Differential radiosensitivity of the uni- and bi-filarly BrdUrd-substituted chromatids of muntjac chromosomes. Mutat. Res., 1979, 63, № 1, p. 211-213.

71. Kaplan H.S., Smith K.S., Tomlin P.A. Effect of halogenat-ed pyrimidines on radiosensitivity of E. coli. Radiat. Res., 1962, 16, № 1, p. 98-113.

72. Kasupski G.J., Mukherjee B.B. Effects of controlled exposure of L cells to bromodeoxyuridine ,(BUdR).I. Evidence for ordered gene replication during S phase. Exp. Cell Res., 1977, 10j5, № 2, p. 327-328.

73. Kasupski G.J., Mukherjee B.B. Effects of controlled exposure of L cells to bromodeoxyuridine (BUdR). II. Turnover rates and activity profiles during cell cycle of bromodeoxyuridine and resistant enzymes. Exp. Cell Res., 1977, JJ38, № 2, p. 393-401 .

74. Klein W.H., Thomas T.L., Lai C., Shelter H.C., Britten R.J., Davidson E.H. Characteristics of individual repetitive sequence families in the sea urchin genome studied with cloned repeats. Cell, 1978, 14, № 4, p. 889-900 .

75. Lamb M.J. The effects of radiation on the longevity of female Drosophila subobscura. J. Insect Physiol., 1964, 10, № 3, p. 487-497.

76. Lamb M.J. The relationship between age at irradiation and life shortening in adult Drosophila. In: Radiation: Ageing. London, 1966, p. 163.

77. Lamb M.J. Radiation induced life-shortening in Drosophiia.- Radiat. Res., 1969, 40, № 2, p. 450-464.

78. Lamb M.J. Ageing. In: The genetics and biology of Drosophiia. Eds. Ashburner M., Wright T.R.F., London-N.Y., Acad. Press, 1978, vol. 2c, p. 43-95.

79. Lin S., Lin D., Riggs A.D. Histones bind more tightly to bromodeoxyuridine-substituted DNA than to normal DNA. -Nucl. Ac. Res., 1976, 3, № 9, p. 2183-2191.

80. Lints F.A., Stole J., Gruver G., Lints E.V. An attempt to select for increased longovity in Drosophiia melanogaster.- Gerontology, 1979, 25, № 4, p. 192-205.

81. Lo S.C., Ross J., Mueller G.G. Localization of globin gene replication in friend leukemia cells to a specific interval of the S phase. Biochim. Biophys. Acta, 1980, 608, № l, p. 103-111.

82. Massie H.R., Baird M.B., Williams T.R. Increased longe-wity of D. melanogaster with diiodomethane. Gerontology, 1978, 24, № 2, p. 104-110.

83. Matthes E., Fenske H., Erichhorn P., Langen P., Lindig-keit R. Altered histone-DNA interactions in rat liver chromatin containing 5-bromodeoxyuridine-substituted DNA. -Cell Differ., 1977, 6, № 3,4, p. 241-251.

84. Miller A. In Biology of Drosophiia. Ed. Demerec M., N.Y.: Wiley, London: Chapman & Hall, 1950, p. 486.

85. Moore G.P., Sheller R.H., Davidson E.H., Britten R.J. Evolutionary change in the repetition frequency of sea urchin DNA sequences. Cell, 1978, Г5/ NQ 2, p. 649-660.

86. Opara-Kubinska Z., Lorkiewicz Z., Szybalski W. Genetic transformation studies: II. Radiation sensitivity of halogen laveled DNA. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1961,4, № 4, p. 288-291.

87. Ordy J.M., Samorajski Т., Hershberger T.J., Curtis A.J. Life-shortening by deuteron irradiation of the brain in C57BL/10 female mice. J. Geront., 1971, 26>, № 2,p. 194-200.

88. Orgel L.E. Ageing of clones of mammalian cells. Nature, 1973, 243, № 5408, p. 441-445.

89. Orgel L.E. The maintenance of the accuracy of protein synthesis and its relevance to ageing. Proc. Nat. Acad. Sci., 1963, 4J3, № 4, p. 517-521.

90. Price P.M. The effect of 5-bromodeoxyuridine on messager RNA production in cultured cells. Biochim. Biophys. Acta, 1976, 447, № 3, p. 304-311.

91. O'Brien R.D., Wolfe L.S. Radiation, radioactivity and insects. N.Y.-London: Acad. Press, 1964.

92. Reff M.E., Davidson R.L. Deoxycitidine reverses the su-pression of pigmentation caused by 5-BrdUrd without changing the distribution of 5-BrdUrd in DNA. J. Biol. Chem., 1979, 2j54, № 15, p. 6869-6872.

93. Rizki R.M., Rizki T.M. Somatic cell lesions induced by the base analog 5-bromodeoxyuridine. Cancer res., 1969, 29, № 1, p. 201-208.

94. Rizki R.M., Douthit H.A., Rizki T.M. Morphogenic effects of halogenated thymidine analogs on Drosophila. Mutat. Res., 1972, 14, № 1, p. 101-111. II. Incorporation of5.bromodeoxyuridine into DNA.

95. Rizki R.M., Rizki T.M. Morphogenic effects of halogenated thymidine analogues on Drosophila. Differentiation, 19 75, 3, p. 133-142.

96. Rockstein M. The genetic bases for longevity. In: Theoretical aspects of ageing. - N.Y.: Academic Press, 1974, p. 1-10.

97. Rutter W.J., Ricter R.L., Morris P.V. Toward molecular mechanisms of developmental processes. Ann. Rev. Bio-chem., 1973, vol. 42, p. 601-646.

98. Schwartz S.A., Kirsten W.H. Distribution of 5-deoxyuri-dine in DNA of rat embryo cells. Proc. Nat. Acad. Sci., 1974, 71, № 9, p. 3570-3574.

99. Singer J., Stellwagen R.H., Roberts-Ems J.R., Riggs A.D. 5-Methyleytosine content of rat hepatoma DNA substituted with bromodeoxyuridine. J. Biol. Chem., 1977, 252, № 15, p. 5509-5513.

100. Smith J.A. Application of the theory of transition pro-pability in "ageing" WI 38 cells. Simular behaviour of chongenic cells from early and late passage cultures. -Cell. Biol. Int. Rep., 1977, 1, № 3, p. 283-289.

101. Soliman M.N., Lints F.A. Bibliography on longevity, ageing, and parental age effects in Drosophiia. Gerontology, 1976, 22, № 5, p. 380-410.

102. Stern H. , Hota J. Biochemistry of Meiosis. Phil. Trans. Roy. Sos. Lond. В., 1977, 277, p. 277-294.

103. Strehler M.H. The nature of cellular age changes. -Symp. Soc. Exp. Biol., 1967, № 21, p. 149-177.

104. Strobel L., Dunsmuir P., Pubin G.M. Polymorphisms in the chromosomal locations of elements of the 412, copia, and 297 dispersed repeated gene families in Drosophiia. -Cell, 1979, 17, № 2, p. 429-439.

105. Strom C.M. Diatribution of 5-bromodeoxyuridine and thymidine in the DNA of developing chick cartilage. Proc. Nat. Acad. Sci., 1976, 73' Ns 4' P* Ю19-1023.

106. Szilard I. On the nature of the ageing process. Proc. Nat. Acad. Sci., 1959, 45, № 1, p. 30-45.

107. Szybalski W., Opara-Kubinska Z. In: Cellular radiation biology. Baltimore: Williams & Wilkins, 1965, p. 22 3.

108. Taylor J.H., Wu M., Erickson L.C. Functional subunits of chromosomal DNA from higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1973, vol. XXXVIII, p. 225-231.

109. Taylor J.U. Increase in DNA replication sites in cells held at the beginning of S phase. Chromosoma, 1977, 62, № 4, p. 291-300.

110. Topal M.D., Fresco J.R. Complementary base pairing and origin of substitution mutations. Nature, 1976, 263, № 5575, p. 285-289.

111. Tsuji H., Tobari J. Effects of 5-bromodeoxyuridine on metamorphosis and on cell cycle kinetics of gangion cells on Drosophila melanogaster. Exp. Cell. Res., 1980, 125, № 1, p. 79-85.

112. Unlu H., Bozcuk A.N. Genetics of longevity in Drosophila. I. The effects of w, m and f mutant genes in various genotype combination. Exp. Geront., 19 79, 14, № 3,p. 117-124.

113. Unlti H., Bozecuk A.N. Genetics of longevity in Drosophila. II. The effects of homozygous and hemizygous w, m, f, wm, mf, wf and wmf mutant genotypes. Exp. Geront., 1979, 14, № 3, p. 125-132.

114. Vogel W., Schempp W., Sigwarth A. Comparison of thymidine, fluorodeoxyuridine, hydroxyurea and methotrexate blocking at the Q^/S phase transition of the cell cycle studiedby replication patterns. Hum. Genet., 197 8, 45, № 2, p. 193-198.

115. Warren S., Gates 0. The induction of leukemia and life shortening in mice by continuous low-level external gamma-radiation. Radiat. Res., 1971, 47, № 2, p. 480490.

116. Wensink P.C., Tobata S., Pachl C. The clustered and seram-bled arrangement of moderately repetitive elements in Drosophiia DNA. Cell, 1979, 18f № 4, p. 1231-1246.

117. Wheeler K.T., Weinstein R.E. Accumulation of neuronal DNA damage as an early covariate or determinant of death after whole-brain irradiation. Radiat. Res., 19 79,80, № 2, p. 343-347.

118. Zhimulev J.F., Belyaeva E.S., Semerckin V.F. In: Critical reviews in biochemistry: informational content of polytene chromosome bands and puffs. - Boca Raton. Florida, CRC Press Juc., 1981 (in press).