Пути и методы повышения эффективности диагностики нематодозов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.19, кандидат биологических наук Гаевая, Эмма Анатольевна

• Гаевая, Эмма Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гаевая, Эмма Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ | :

Глава 1 Патогенетические особенности нематодозов человека (обзор литературы) |

1.1 Влияние энтеробиозной инвазии на организм 9 человека , ¡

1.2 Влияние аскаридозной инвазии на организм 12 человека | !

1.3 Влияние трихинеллезной инвазии на организм 16 человека |

Глава 2 Материал, методы исследований |

Глава 3 Выявление растворимых антигенов нематод в различных биологических субстратах !

3.1 Выявление копроантегенов при аскаридозе, 34 энтеробиозе и трихинеллезе

3.2 Выявление растворимых антигенов трихинелл в 47 различных биологических субстратах

Глава 4 Выявление гуморальных антител при нематодозах

4.1 Выявление гуморальных антител при кишечных 54 нематодозах (аскаридоз,энтеробиоз) |

4.2 Выявление гуморальных антител при висцеральных. 57 нематодозах (трихинеллез) < I

Глава 5 Характеристика кишечной микрофлоры и местного иммунитета при нематодозах |

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пути и методы повышения эффективности диагностики нематодозов»

1 ! ■' ■ ' ^ ■ ■ ■ - ■ ' ■ * ■ • ■ , Актуальность проблемы. Анализ заболеваемости людей инфекционными (кроме гриппа и ОРВИ) и паразитарными заболеваниями свидетельствует о значительном преобладании гельминтозов над другими нозолоj . ' гическими формами (З.С. Макарова и соавт.,1994; В.П. Сергиев, 1991; Sergiev V.P., 1993). В Российской Федерации наиболее массовыми среди гельминтозов являются такие немаггодозы, как аскаридоз и энтеробиоз. В последние годы резко обострились эпидемическая ситуация по трихинеллёзу (A.C. Бессонов, 1996; А.Я. Сапунов и соавт., 1996).

В настоящее время для диагностики и изучения кишечных нематодозов j аскаридоз, энтеробиоз и др.) используются рутинные методы исследования.

Для повышенщ низкой чувствительности копроовоскопических методов i ■ предложено 3-х- 5-ти кратное исследование фекалий одного и того же человека. Такой Подход удлиняет и удорожает копроовоскопические анализы.

Ранняя диагностика при кишечных нематодозах затруднена, т.к. методы инj i дикации юных и неполовозрелых паразитов не разработаны (A.C. Козлов, 1985; A.B. Маркин, 1994).

Специфическая диагностика трихинеллёза основана на выявлении антител в сыворотке крови больных и установлении сероконверсии. Се: 1 . ' рологическая диагностика трихинеллёза отличается достаточно высокой точностью и специфичностью, однако носит ретроспективный характер (А.Ф. Костецкий, 1989; О.Г. Полетаева и соавт., 1989; Т.И. Твердохлебова и соавт,, 1996). j |. ;„ . , .

В то же время при многих инфекционных заболеваниях используются методы индикации возбудителей с целью ранней диагностики. Общие принципы ранней диагностики заболеваний были сформулированы В.И. Иоффе (1968); П.Ф. Здродовским (1963). Поэтому актуальной задачей диагностики гельминтозов является разработка иммунологических методов и средств определения уровня гумораль

I I ных антител и индикации антигенов гельминтов на ранних стадиях заболевания и в различных биологических субстратах. | и Цель и задачи исследования, Целью исследования является экспериментальное обоснование подходов к повышению эффективности диагно I стики нематодозов в зависимости от их патогенетических особенностей. ! н Для достижения поставленных целей необходимо было решать следующие задачи: с : !

- разработать, общие принципы и дать оценку специфичности и чувствительности иммунологических методов, используемых! для выявления антигенноактивных продуктов жизнедеятельности нематод;! !

- ■ изучить динамику выявления экскреторно-секреторных антигенов в различных биологических субстратах;

- изучить частоту выявления гуморальных антител у больных нематодозами; . >

- дать оценку влияния растворимых компонентов нематод на состояние качественного и количественного состава микрофлоры кишечника и уровень секреторного иммуноглобулина А.

Научная новизна. Установлено, что аскариды и острицы содержат фактор, вызывающий агглютинацию стафилококков. В опытах торможения агглютинации с использованием антител к антигенам аскарид и остриц было выявлено, что фактор вызывающий, агглютинацию стафилококков, обладает антигенными свойствами. Показана принципиальная возможность использо I . вания реакции торможения агглютинации микробов (РТАМ) для выявления копроантигенов аскарид и остриц. |

Показано, что при немато дозах, имеющих кишечную стадию развития паразитов (аскариды, острицы, трихинеллы), могут быть выявлены копроантигены, а в фазе мигрирующих личинок в крови больных (трихинеллёз) об: ' | г наружи ваются циркулирующие антигены. Наличием циркулирующего антигена в крови больных трихинеллёзом в значительных количествах может I быть объяснено развитие токсико-аллергического синдрома при этом заболе I вании.

В эксперименте на животных показано, что в мышечной ткани инвази-рованных трихинеллами животных накапливаются растворимые антигены, которые могут быть выявлены методом иммуяоферментометрического анаI лиза (ИФМА) с 115-го дня инвазии, т.е. в период, когда инкапсуляции личинок ещё не происходит.

Впервые доказано, что развитие дисбиотических изменений при ки шечных нематодозах (аскаридоз, энтеробиоз) может быть связано с прямым воздействием структурных компонентов нематод на кишечную микрофлору. В частности установлено, что растворимые белки половозрелых аскарид и I остриц изменяют адгезивную активность лактобактерий. Выявлена опредег 1 лённая закономерность между развитием дисбиоза и снижением уровня секреторного 1|>А. I | :

I ' 1 .

Практическая значимость. Установлена принципиальная воз: ! ■ можность использования иммунологических реакций (ИФМА,;РТАМ) для выявления копроантигенов и антигенов нематод, циркулирующих в крови ! ! . ' больных, что | позволяет применять на практике эти серологические реакции для ранней диагностики нематодозов.

Изучение динамики иммунного ответа при трихинеллёзе показывает, что гуморальные антитела у некоторых больных выявляются, на 8-й 12-й день болезни^ Практически у всех больных трихинеллёзом (100%) на 30-й

40-й день болезни выявляются гуморальные антитела к экскреторносекреторному антигену трихинелл. I I

Изучение показателей нормальной микрофлоры и секр^тррного I при кишечных нематодозах обосновывает необходимость применения биокоррекции с использованием эубиотических (лактобактерин' и др.) и иммунобиологических (лактоглобулин) препаратов.

I . ■ . ' . *

Положения, выносимые на защиту:

- использование иммунологических методов позволяет выявлять раствори

I . ■ ■ мые антигены гельминтов в различных биологических субстратах в зависит мости от патогенетических особенностей нематодозов; 1 1 ■ > I ' .

- подтверждена возможность использования РИГА для серологической диагностики трихиреллёза;

- одним из механизмов развития дисбиоза. при кишечных нематодозах может быть снижение адгезивной активности лактобактерий и некоторых показателей местного иммунитета, в частности выражающихся в снижении уровня секреторного ^А. I ' '

Реализация и внедрения.

1. Приоритетная справка на предполагаемое изобретение «Агглютинин нематоды А. ЬшпЬпсо1с1еБ» № 97]03701 от 11.03.1997.

2. Лабораторный; регламент «Иммуноглобулин энтеробиозный диагностический жидкий», утверждённый Учёным советом РНИИМП. Протокол №6 от 13.06.1996.

3. Проект производственного регламента и ФС «Диагностикум эритроцитар-ный трихинеллёзный антигенный сухой». Утверждён Ученным Советом РИИИМП. Протокол № 10 от 03.12.1996. и ! г

4. Методические указания. Профилактика трихинеллёза. Утверждены и введены в действие главным Государственным врачом по Ростовской области ог 4 октября 1998. ! . -7- ' ' ■ ;

I '

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации апробированы на VII Научной конференции по трихинеллёзу человека и животных /Москва 1996/.

Диссертация доложена и обсуждена на заседании Учёного совета РНИИМП /Протокол № 7 от 26.11.1997/. По теме диссертации опубликовано 3 научных работы. 1

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 97 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 таблицами, 9 рисунками.

Состоит из введения, обзора литературных данных, описания используемых методов ц материалов, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций; список использованной литературы включает 220 источников, из них 105 иностранных.

Глава Ï Патогенетические особенности нематодозов человека ; • : . > обзор литературы).

Гельминты оказывают разнообразное воздействие на хозяина, вызывая функциональные нарушения органов, в которых они локализуются, вызывая общие расстройства обменных процессов и нейрогуморальной регуляции в организме ( К.И. Скрябин, Р.-Зд С. Шульд,1933; Е,С. Лейкина, 1985;Сох G, 1992).

Естественно, что всякого рода функциональные нарушения не могут не сопровождаться (соответствующими морфологическими изменениями, которые на протяжении инвазионного процесса в причинно-следственных отно

I • . шениях нередко меняются местами с функциональными (Б.А. Астафьев, 1987- Zhang S., Castro G.A. 1990, Yeper-Mulia L., Guadalupe О., 1994).

Общие закономерности в развитии морфологических и иммунологиче-i - ' ских реакций при гельминтрзах очень сложны. Во-первых, гельминты разнообразны по размерам, биологическим особенностям, путям миграции и локализации в органах и тканях хозяина. Во-вторых , в ходе развития паразитов происходят такие превращения их, в результате которых образуются по существу организмы, оказывающие на хозяина качественно новые воздейстj I вия . В третьих ,! чрезвычайно различны способы воздействия гельминтов на организм хозяина, которыми может определяться развитие тех или иных па-томорфологических изменений ( Dunn J., Wright К., 1987; CandoHi Е. et al., ï987;Collins S. et al, 1989; Takahashi Y. et al., 1989 ; Madas.E, et al., 1994;).

В связи этим мы считаем целесообразным дать общее описание наиболее характерных'патолого-морфологических изменений при энтеробиозе, аскаридозе, трихинеллёзе, в зависимости от стадий развития паразитов, определяющих соответствующие этапы инвазионного процесса.

1.1. Влияние знтеробиозной инвазии на организм человека.

Патогенное воздействие Enterobius vermicularis на организм человека складывается из комплекса раздражений механо- и хеморецепторов слизистой оболочки кишечника на различных её участках и воспалительных явлений, возникающих в местах травм слизистой. Выделяющиеся токсины, в состав которых входит муравьиная кислота и летучие жирные кислоты, оказывают воздействие на слизистую оболочку кишечника и Общую интоксикацию организма, наличие которой подтверждается положительным и кожными ре1 акциями и высокой эозинофилией. (Е. С. Шульман, 1989; М.Д. Великорецкая, М.Г.Маркова, 1991).

Механическое раздражение слизистой кишечника осуществляется острицами при их движении вдоль кишечной стенки. Наиболее травмирующее . i ' ■• действие на слизистую оказывает длинный и острый хвост самки, а также головная везикула, которой паразит плотно прилегает к стенке кишечника хозяина и присасывается с помощью нагнетательного действия бульбуса пара: ! ' ■ зита. На слизистой стенке кишечника вследствие разрушения поверхностных слоев слизистой оболочки возникают дефекты в виде полулунных углублений. Острицы способны внедрятся в ткань кишечной стенки до 2/3 или

3/4 длины тела. В некоторых случаях в глубине ткани кишечника обнаружи-i ' ! ■ ■ вали обьизвертвлённых остриц или их остатки в виде скопления яиц, вокруг которых образовались гранулемы, состоящие из эозинофилов, лимфоцитов и макрофагов. На всём протяжении тонкого и толстого кишечника развивается гиперемия слизистой оболочки, эрозия слизистого и нодслизистого сло-ёв.(С.В. Жукова, С.Г. Раденска, 1991; A.C. Козлов, 1982; В.П. Подъяпольская, В.Ф. Капустин, 1958; К.И. Скрябин, Р.-Эд.С. Шульц, 1933; Foltinova I., Kapeleer К., 1987; Romero-Rodriguez l. et al., 1987).

В литературе нет единого мнения о роли остриц в развитии аппендицитов. Воспалительные явления в червеобразном отростке могут возникать под влиянием токсического и травматического действия, однако основная /роль принадлежит вторичной инфекции. Скопление остриц в червеобразном отростке вызывает повреждение его стенок с последующим проникновением инфекции в дефекты слизистой ( Т. Сайдалиев и соавт., 1982). Изменения, вызываемые острицами, ведут к возникновению воспалительных явлений той • ' : I ' или иной степени в кишечной стенке не только аппендикса, но и других участков кишечника, начиная с нижних отделов тонкого кишечника и заканчивая толстым кишечником. При особо тяжёлых случаях может наблюдаться анальный зуд, диарея (А.Л. Гребнев, Л.П. Мягков, 1994; А.С. Козлов,

1985; Натаиёа к!. е1 а1., 1989). ! :

Острицы могут нарушать целостность слизистой с последующим вое

1 ; палением в периаиальной области, в промежности, в вульве, вагине и в других отделах женских половых органов, куда заползает часть мигрирующих из кишечника остриц (К.И. Скрябин, Р.-Эд.С. Шульц, 1933). По данным 211а^Сиаг^-\¥еп е1, а!, (1990), при вскрытии острицы были обнаружены в брыжеечных ¡лимфатических узлах и сосудах брыжейки, кровеносных сосудах печени и лёгких. Данное наблюдение является первым случаем, когда остриц обнаруживали в брыжеечных лимфатических узлах и кровеносных сосудах лёгких, в венах печёночной триады.

По данным Б.А. Астафьева (1987), при энтеробиозе наблюдаются аллергические реакции замедленного типа, ведущие к опосредованным изменениям во всех органах, обнаруженные при паталого-анатомическом1 исследовании. У практически здоровых детей, умерших в результате несчастных случаев, при паталогоанатомически подтверждённом диагнозе энтеробиоза наблюдается интенсивная эозинофильная инфильтрация селезёнки, желудочно-кишечного тракта, обнаруживается значительное количество эозинофилов в сосудах легких. Очаги лимфоидно-эозинофильной инфидьтрации межмы : | . | . . .:■ • - . . :., , шечной соединительной ткани миокарда и повышенное количество тучных клеток в лёгких указывает на выраженную аллергизацию организма. Мелкоочаговый кардиосклероз с признаками неспецифического воспаления меж i . . i ' -11- . . мышечной соединительной ткани, очаговый некротический паренхиматозно ' ; / .

- интерстициальный гепатит, очаговый гломерулонефрит, пролиферация всего лимфатического аппарата - все эти изменения возникают в результате аллергического процесса, вызванного энтеробиозом.

Явления иммунитета при энтеробиозе изучены недостаточно, однако • имеются данные! позволяющие считать, что у лиц, повторно инвазированных острицами, имеются сдвиги в реактивности организма. Изучение гуморального иммунитета было проведено на мышах, заражённых яйцами Syphacia I obvelata. Антитела против антигенов мышиных остриц начали выявляться i ■ через 12 дней после заражения и в дальнейшем отмечалось увеличение титров, причем титры антител тесно коррелировали с интенсивностью инвазии (Sato Yukita, 1993).

Помимо аллергических реакций при энтеробиозе наблюдаются дерма-юзы, анемии; гипоксии, а также проявление иммунодефицита, в частности лимфопения (В.П. Юровская, ВВ. Маркина, 1985; Б.А. Астафьев, 1987; Т.А. Вахабов и coáBT., 1991; М.П. Макарова и соавт., 1995). А.Я. Лысенко и соавт. (1991) М.Е. БагаЬва (1994) получили данные об отрицательном воздействии остриц на сохранение поствакцинального иммунитета против кори и дифтерии.

При энтеробиозе отмечается нарушение состава микрофлоры кишечника, снижение её антагонистических свойств по отношению к острым кишечным инфекциям, развитие дисбактериозов. По данным С.Е. Журавлёва (1975) дисбактериоз у инвазированных острицами детей, выявлен в 4 раза чаще, чем у цеинвазированных. Восстановление нормальной микрофлоры кишечника с помощью биопрепаратов повышает уровень неспецифической защиты организма от кишечной инфекции, т.к. при энтеробиозе происходит подавление микрофлоры кишечника (H.A. Благов, 1989; В.П. Сергиев и соавт., 1992; 1993)1 Однако механизм, лежащий в развитии дисбактериоза, остаётся нераскрытым.

Таким образом, эитеробиоз, являясь кишечным нематодозом, не имеющим миграционной стадии, оказывает опосредованное патогенетическое воздействие на все системы организма. Учитывая, что весь жизненный цикл остриц проходит в кишечнике, продукты жизнедеятельности и распада остриц могут быть определены в месте паразитирования нематод при использовании иммунологических методов. j- L '■ " "

Заключение диссертации по теме «Паразитология», Гаевая, Эмма Анатольевна

Выводы. перспективы в выявлении инвазированных. Использование иммунологических методов является наиболее эффективным при нематодозах, сопровождающихся миграционной стадией инвазии. 2. Экспериментально установлено, что иммунологическими методами при еробиозе может быть выявлено от 60,0±3,6 до 0,2±0,02 мкг игенов в грамме фекалий, что может служить дополнитедь-агностики этих кишечных нематодозов. Сравнительный анализ использования реакций: имму но диффузии (РИД), торможения иммуно-диффузии (РТИД), торможения агглютинации микроорганизмов (РТАМ), РИГА, и м м уноферментометри ческого анализа (ИФМА) показал, что наибольшей чувствительностью и специфичностью для выявления растворимых антигенов обдадёл иммуцдферщд1омдтрц-Ч£Ский анализ, а для определения гуморальных антител - иммуноферментный анализ и РИГА. ;

3. Показано, что ны трихинелл могут быть обнаружены в фекалиях кроликов с 5-го по 12-й день инвазии, а Высоким уровне при экспериментальном трихинеллёзе растворимые антигев| сыворотках крови кроликов с 8-го по 26-й день инвазии, м антигенемии (ЮОмкг) может быть объяснено наличие выраженного токсико - аллергического синдрома при этом заболевании.

4. Установлено, что растворимые антигены трихинелл могут быть выявлены ИФМА в мыщечной ткани уже на 15 день инвазии, когда: рутинные методы индикации мышечных личинок являются неэффективными.

5. Высокий процент (35,5±17,2%) положительных реакций торможения агглютинации микробов (РТАМ) с аскаридозным и энтеробиозным; антигеном у лиц больных "иными гельмицтозами (дифиллоботриоз, описторхоз, гименошоидоз, трихоцефалёз, трихинеллёз, токсокароз, эхинококлегшдоз, стронги : '.Л'