Противоположные эффекты рецептора интерлейкина-1 при микробной инвазии в спонтанном раке толстого кишечника и воспалении, вызванном опухолевым процессом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.03, кандидат наук Дмитриева Оксана Сергеевна

• Дмитриева Оксана Сергеевна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Дмитриева Оксана Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................10

1.1. Рак толстого кишечника и его характеристики........................................10

1.2. Воспаление и онкогенный процесс............................................................12

1.3. Цитокины как главные медиаторы воспаления, вызванного опухолевым

процессом.............................................................................................................16

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................29

2.1. Реактивы и оборудование............................................................................29

2.2. Объекты исследования................................................................................33

2.3. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле....................................35

2.4. Подготовка тканевых лизатов для изоляции РНК и белков....................35

2.5. Выделение РНК, обратная транскрипция и количественная ПЦР в реальном времени................................................................................................35

2.6. Выделение IEL и LPL из опухолей и эпителия толстого кишечника мыши..................................................................................................................... 36

2.7. Иммунофлуоресцентный анализ и сортировка клеток на проточном цитофлуориметре................................................................................................37

2.8. Внутриклеточное окрашивание цитокинов...............................................38

2.9. Сортировка иммунных и эпителиальных клеток ткани толстого кишечника мыши на проточном цитофлуориметре........................................38

2.10. ИФА для измерения концентрации белка ИЛ-1а и ИЛ-1Р...................39

2.11. Обработка мышей препаратом «Анакинра» (рекомбинантный синтетический ингибитор рецептора интерлейкина-1)...................................40

2.12. Подготовка и иммуногистохимическое окрашивание образцов опухолей мышей...................................................................................................................40

2.13. Получение образцов бактериальной ДНК для секвенирования............41

2.14. Секвенирование бактериальной рРНК....................................................41

2.15. Выделение нейтрофилов из костного мозга, селезенки и перитонеальной полости.................................................................................................................41

2.16. Стимулирование нейтрофилов рекомбинантным белком ИЛ-1Р.........42

2.17. Функциональный анализ фагоцитирующей и антимикробной элиминирующей способности нейтрофилов....................................................42

2.18. Исследование нейтрофилов с помощью иммунофлюоресцентной

микроскопии ........................................................................................................ 43

2.20. Статистическая обработка данных ........................................................... 43

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ...................................................................................44

3.1. Экспрессия мРНК ИЛ-1а и ИЛ-1Р повышенна в популяции моноцитов в модели спонтанного РТК (рак толстого кишечника) в мышах APCdel/wt CDX2cre+.............................................................................................................44

3.2. Уровень цитокинов ИЛ-1а и ИЛ-1Р повышен в опухолевой ткани СРТК ..................................................................................................................... 47

3.3. Изучения влияния ингибитора ИЛ-Ж ("Анакинра») на экспрессию цитокина ИЛ-17А в иммунных фракциях опухолей толстого кишечника ... 48

3.4. Изучение влияние ИЛ-1 на воспаление по типу ТЫ7 (ТЕ1) в модели СРТК.....................................................................................................................50

3.5. Изучение влияния ИЛ-1 рецептора на развитие СРТК в модели АРС^^ CDX2cre+..............................................................................................................52

3.6. Изучение влияния рецептора ИЛ-1, экспрессируемого эпителиальными клетками кишечника на развитие СРТК...........................................................55

3.7. Изучение роли сигнального пути ИЛ-1 в Т-клетках в модели СРТК.....58

3.8. Изучение роли сигнального пути рецептора ИЛ-1 в клетках миелоидного ряда в модели СРТК............................................................................................62

3.9. Изучение роли бактерии, ассоциированных с опухолью на развитие СРТК ..................................................................................................................... 66

3.10. Изучение роли ИЛ-Ж-сигнального пути в нейтрофилах в модели СРТК ..................................................................................................................... 78

3.11. Сигнальный путь ИЛ-Ж регулирует антибактериальные функции в

нейтрофилах в СРТК...........................................................................................83

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ....................................................90

ВЫВОДЫ...........................................................................................................107

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................108

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

СРТК - спонтанный рак толстого кишечника

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

APC - аденоматозный полипоз толстого кишечника

ИЛ-Ш - рецептор Интерлейкина 1

ИЛ- 17а - Интерлейкин 17а

ИЛ-22 - Интерлейкин 22

ИЛ-1 - Интерлейкин 1

HRP - пероксидаза хрена

TEI - tumor elicited inflammation - воспаление, вызванное опухолевым процессом

IEL - intraepithelial lymphocytes-LPL - lamina propria lymphocytes -

TCRaP - T cell receptor ap chain - Т-клеточный рецептор ар цепь

TCRyS - T cell receptor y5 chain - Т-клеточный рецептор у5 цепь

SDS - sodium dodecyl sulfate - додецил сульфат натрия

RORyt - RAR-related orphan receptor gamma - орфановый рецептор гамма

COX2 - cyclooxygenase 2 - ЦОГ2 - циклооксигеназа 2

ILC - innate lymphoid cells - клетки врожденного иммунитета

NF-кВ - ядерный фактор кВ

Th17 - Т-хелперы 17 типа

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Противоположные эффекты рецептора интерлейкина-1 при микробной инвазии в спонтанном раке толстого кишечника и воспалении, вызванном опухолевым процессом»

Актуальность темы исследования

В настоящее время наука иммунология стата восприниматься и утверждаться как наука интегративная и многогранная, находящая свое применение не только в классических аутоиммунных, иммунодефицитных и аллергических состояниях, но и в таких, как, казалось бы, далеких от иммунологии, на первый взгляд, заболеваниях как онкология, атеросклероз и даже различные психические расстройства. Объясняется это явление тем, что в этиологии всех вышеперечисленных заболевание лежит общий процесс - воспаление. В возникновении и развитии всех признаков воспаления в той или иной мере задействованы иммунные клетки организма. Так, привлеченные в место поражения лейкоциты вызывают отек ткани и как следствие болевые ощущения, и в последствие, потерю функции. Макрофаги, воспалительные моноциты и нейтрофилы в месте очага поражения призваны выполнять защитную функцию, но, тем не менее, зачастую их избыточное присутствие может вызвать ухудшение состояние, способствуя нарастанию коэффициента воспаления. В онкологии, такой тип воспаления, вызванный опухолевым процессом, определятся привлечением иммунных клеток в место развития и роста опухоли, (на поздних стадиях). Данное воспаление может существовать независимо от клеточной гибели, предшествующей развитию опухоли, и может вызываться, и поддерживаться секрецией хемокинов и цитокинов из самой опухоли. Именно воспаление, вызванное опухолевым процессом рассмотрено в данной работе, как наиболее актуальное и перспективное направление в изучении, прогнозировании и лечении рака толстого кишечника.

Одним из наиболее изученных цитокинов в онкогенезе толстого

кишечника является ИЛ-17А. Высокая концентрация ИЛ-17А в аденомах

кишечника 1-2 стадии коррелирует с неблагоприятным прогнозом

выживаемости (безметастазный период) у пациентов в течение 5 лет после

6

резекции опухоли. Также большое количество опубликованных данных на моделях рака толстого кишечника и печени, подтверждающих что блокировка ИЛ-17А ведет к снижению размера и количества опухолей. Таким образом, поиск новых мишеней и дополнительных регуляторов иммунного ответа по типу ТЫ7 является актуальной проблемой в иммунной терапии онкологических заболеваний.

ИЛ-1 уже был показан как важный регулятор дифференцировки ^17 клеток в аутоиммунных и воспалительных заболеваниях. Тем не менее роль ИЛ-1 в СРТК остается неизученной. Как потенциальный регулятор ^17 иммунного ответа, ИЛ-1 может стать новой молекулярной мишенью в онкоиммунотерапии в СРТК.

Цель

Цель настоящей работы - выявить роль ИЛ-1 и его рецептора в развитии рака толстого кишечника и в воспалении, вызванном опухолевым ростом.

Задачи исследования:

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Установить источник ИЛ- 1а и ИЛ-1Р в опухолях и нормальной ткани толстого кишечника.

2. Изучить влияние ИЛ-1 и его рецептора на развитие и рост опухоли в толстом кишечнике.

3. Определить влияние ИЛ-1 на экспрессию ИЛ-17А иммунными клетками в опухолевом микроокружении.

4. Определить функции рецептора ИЛ-1 на эпителиальных, Т-клетках и миелоидных клетках, инфильтрирующих опухоль при СРТК.

Научная новизна

В работе были впервые описаны уникальные модели рака толстого кишечника на мышах со специфическими генетическими нокаутами рецептора ИЛ-1. Были описаны фенотипы рака толстого кишечника у мышей со специфическими нокаутами ИЛ-1 на эпителиальных, различных миелоидных клетках и Т-клетках. Показано, что путем генетической инактивации рецептора ИЛ-1 на эпителиальных клетках кишечника количество опухолей в толстом кишечнике уменьшается при неизменном ^17 ответе, а при инактивации рецептора ИЛ-1 на иммунных Т-клетках, уменьшение опухолей также сопровождается подавлением воспалительного иммунного ответа. Противоречивые результаты были получены при генетическом нокауте рецептора на клетках миелоидного ряда, где ИЛ-1 играет антимикробную и противопухолевую функцию, тем самым препятствуя прогрессии опухолевого роста и распространению воспаления.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты представляют огромную ценность для будущих клинических испытаний иммунотерапии антителами к ИЛ-1. Из-за специфического и противоположного эффекта ИЛ-1 на различных клеточных популяциях, необходимо с осторожностью применять цитокиновую иммунотерапию на раковых пациентах. Представленные данные также способствуют более детальному пониманию молекулярных и клеточных процессов, происходящих в микроокружении опухоли, дополняя сложную картину онкогенеза и доказывая в очередной раз, что процесс развития опухоли не является исключительно автономным процессом, происходящим из одной малигнизированной клетки, а представляет собой комплексную систему взаимодействия между раковыми эпителиальными клетками, воспалительными иммунными клетками и микробиомом человека.

Таким образом появляются новые знания для улучшения современных методов предотвращения, прогнозирования течения и терапии рака толстого кишечника в различных научно-исследовательских центрах, таких как Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина, Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена, а также иммунологических институтах и клиниках.

Все полученные данные представляют интерес как с практической и клинической точки зрения, в качестве создания новых стратегий терапии, так и с точки зрения фундаментальных дисциплин: молекулярной и клеточной иммунологии.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Рак толстого кишечника и его характеристики

Термин «колоректальный рак», или «рак кишечника», объединяет следующие формы онкологических заболеваний: рак прямой кишки и рак ободочной кишки. К раку ободочной кишки, в свою очередь, относятся: рак сигмовидной кишки, рак нисходящей ободочной кишки, рак селезёночного изгиба ободочной кишки, рак поперечной ободочной кишки, рак печёночного изгиба ободочной кишки, рак восходящей ободочной кишки, рак слепой кишки, рак червеобразного отростка. Колоректальный рак — это группа онкологических заболеваний, развивающихся в толстой кишке. Толстая кишка — это конечный отдел кишечника, в котором происходят основные процессы всасывания жидкости и окончательного формирования кала.

Колоректальный рак - второе по распространённости онкологическое заболевание в России. В 2009 году в нашей стране зарегистрировано 32 334 новых случаев рака ободочной кишки и 25029 случая рака прямой кишки. В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями мужского населения рак ободочной кишки занимает 5-е место (5,5%), женского населения - четвертое место (6.9%), рак прямой кишки- шестое место (5,0%) и 4,7% (восьмое место) соответственно. Отмечается тенденция к значительному росту заболеваемости колоректальным раком: прирост абсолютного числа заболевших раком ободочной кишки с 2004 по 2009 г. составил 11,3%; раком прямой кишки - 9.9%. В структуре смертности населения России от злокачественных новообразований колоректальный рак также занимает второе место (после рака лёгкого.) В 2012 в нашей стране от колоректального рака умерли 38 343 человек, из них 21 523 от рака ободочной кишки и 16 820 от рака прямой кишки. В структуре смертности мужчин рак ободочной кишки занимает 4-е место (5,7%), рак прямой кишки

- 5-е место (5,3%); у женщин рак ободочной кишки занимает 3-е место

10

(9,3%), рак прямой кишки - 5-е место (6,3%). Смертность от рака ободочной кишки в России с 2004 по 2009 г увеличилась на 2% у мужчин и на 2.7% у женщин (Давыдов, 2014). Ежегодно в мире диагностируется более полутора миллиона новых случаев рака толстого кишечника (РТК). РТК является третьим наиболее распространенным онкологическим заболеванием в мире среди мужчин и вторым среди женщин, также стоит на четвертом месте в мире по числу смертей в мире и на третьем по количеству диагнозов в год (Bray et al., 2012). Это огромная цифра, если учесть, что заболевание является потенциально излечимым, когда диагноз поставлен на ранней стадии. На сегодняшний день статистические данные свидетельствуют о том, что в России колоректальный рак занимает одну из ведущих позиций. Более чем у 90% больных возникает спорадический рак толстой кишки, в то время как его наследственная форма развивается у 510% пациентов, а колит-ассоциированная форма рака только у 2% больных (Grivennikov et al., 2012). Относительный риск развития колоректального рака у больных с неспецифическим язвенным колитом (и другими воспалительными заболеваниями кишечника) колеблется от 2% до 15% по отношению к общепопуляционному (в зависимости от локализации и распространенности очага воспаления). Кумулятивный риск рака на фоне неспецифического язвенного колита составляет 2, 8 и 20% после 10, 20 и 30 лет заболевания, соответственно (Grivennikov et al., 2012). Таким образом, хронические воспалительные заболевания толстого кишечника, могут рассматриваться как факультативные предраковые состояния. Впервые последовательная модель канцерогенеза РТК была представлена в литературе в 1988 году Eric Fearon и Bert Vogelstein. Ген АРС (так называемый «ген-привратник») ответственен за развитие аденом у больных семейным полипозом (Hinoi et al., 2007). Детальная характеристика САП была представлена H. Bussey в 1990 г., хотя первое описание пациента с большим числом полипов в желудочно-кишечном тракте датировано 1721 годом. Значительно позже были четко определены признаки заболевания,

11

число и локализация полипов, их морфологическая характеристика, семейная и популяционная частота, риски развития РТК. J. Woodward в 1881 г. предложил подразделение полипов на первичные, возникающие на не видимом невооруженным глазом фоне, и вторичные, при которых появлению полипов предшествуют воспалительные и язвенные процессы в толстом кишечнике (Woodward, 1881). САП стал первым заболеванием, ассоциированным с РТК, для которого был идентифицирован ген предрасположенности APC (Adenomatous Polyposis Coli), являющийся доминирующим этиологическим фактором в развитии данной' патологии. Мутация этого гена (потеря аллели в пятой хромосоме) ведет к гиперпролиферации нормального эпителия. Одним из основных следствий мутации АРС является гиперактивация сигнального Wnt-пути, в результате чего происходит накопление ß-катенина (который деградирует и инактивируется через связывание с APC). Переход ранних аденом в «промежуточные» обусловлен дальнейшей активацией сигнальных путей Ras и B-raf. Мутации К-ras и N-ras генов обнаруживаются у 45-50% больных РТК.

1.2. Воспаление и онкогенный процесс

Гипотеза о связи рака и воспаления появилась в 1863 году, когда Рудольф Вирхов обнаружил присутствие лейкоцитов во многих раковых опухолях и предположил, что многократное повреждение ткани предшествует образованию опухолей (Хаитов, Кадагидзе, 2018; Mantovani et al., 2008). Данная гипотеза косвенно подтвердилась многочисленными клиническими исследованиями, указывающих на взаимосвязь процессов хронического воспаления и опухолеобразования в тех или иных тканях и органах (Coussens, Werb, 2002; Balkwill, Coussens, 2004; Galon et al., 2006). Известно, что интенсивность воспаления часто усиливается при старении организма, а возраст, в свою очередь, является главным фактором риска возникновения онкологических заболеваний. Установлено, что от 15 до 20%

различных видов рака имеет прямую зависимость от наличия хронического воспаления или инфекции в той же ткани или органе, предшествующих развитию рака. Например, хроническая бактериальная инфекция патогеном Helicobacter pilory является причиной гастритов и рака желудка, а хронические воспалительные заболевания тонкого и толстого кишечника (язвенный колит и болезнь Крона) увеличивают риск развития колит-ассоциированного рака толстого кишечника (Canavan et al., 2006; Osawa et al., 2006; Kuraishy et al., 2011). В то же время гепатит и хроническое воспаление, вызванное вирусами гепатита типа В и С, провоцируют развитие гепатоцеллюлярной карциномы, наиболее распространенной формы рака печени (Shalapour et al., 2017).

Как именно воспаление и повреждение тканей способствует развитию онкологических заболеваний? Спонтанный мутагенез, геномная нестабильность и эпигенетические модификации, вызванные хроническим воспалением, играют важную роль в процессе инициации опухолей, но даже наличие всех этих факторов может быть недостаточным (Grivennikov et al., 2010). Значительное сходство ключевых параметров регенерации повреждений тканей с таковыми наблюдаемыми при развитии опухолей (активация миофибробластов, увеличенная клеточная пролиферация, воспаление и активный ангиогенез), позволяет предположить, что хроническое повреждение тканей и "неправильная" регенерация могут быть причиной образования опухолей (Grivennikov, 2013). В настоящее время известно множество работ, подтверждающих роль воспаления как в регенерации тканей, так и в процессе онкогенеза (Grivennikov et al., 2012; Meng et al., 2012; Grivennikov, 2013). Согласно современным представлениям выделяют четыре стадии онкогенеза: рост (инициация опухоли), прогрессия, инвазия и метастазирование, на каждой из которой воспаление может играть свою роль. Исторически роль воспаления наиболее изучена на первых двух стадиях онкогенеза - рост и прогрессия,

так как соответствующие экспериментальные модели занимают меньшее количество времени и наиболее просты в изучении.

В норме процесс острого воспаления ограничивается клеточной гибелью - апоптозом. Однако, при хроническом воспалении своевременное удаление воспалительных клеток и полное восстановление поврежденной ткани нарушены, и, в отличие от "нормального" или острого воспаления, при хроническом воспалении процессы регенерации никогда успешно не завершаются. При воспалительном процессе иммунные клетки привлекаются в место инфекции, повреждения или тканевого стресса. Там они подвергаются экспансии и дифференцировке, секретируют различные факторы, необходимые для регуляции воспаления (например, цитокины и хемокины), антибактериальные молекулы, а также факторы необходимые для пролиферации клеток и заживления ран (Симбирцев А. С., 2018). Некоторые виды воспаления, например, воспаление, вызванное опухолевым процессом (TEI), характеризуется привлечением иммунных клеток в участок развития и роста опухоли, возникновение которой уже произошло, и, следовательно, в данном случае онкогенез предшествует воспалительному процессу. Такой тип воспаления может существовать независимо от клеточной гибели, предшествующей развитию опухоли, и вызываться секрецией хемокинов и цитокинов из провоспалительных иммунных клеток в опухолевом микроокружении (Grivennikov et al., 2010; Grivennikov, Karin, 2010; Grivennikov et al., 2012).

Возникновение неопластической трансформации клеток требует нескольких значимых составляющих, включающих в себя увеличение продукции факторов роста, нечувствительность к ингибиторам роста (опухолевым супрессорам), уклонение от апоптоза, ограниченный репликативный потенциал, непрерывный ангиогенез, тканевую инвазию и метастазирование (Hanahan, Weinberg, 2011). В настоящее время разные группы ученых пришли к единому мнению, что хроническое воспаление и

его медиаторы могут усугублять течение онкогенеза, влияя на опухолевые клетки, или клетки из микроокружения опухолей.

Одним из основных регуляторов воспаления в общем его смысле и воспаления, сопряженного с онкогенезом, является транскрипционный фактор NF-kB, который активируется большим количеством вне- и внутриклеточных стимулов, включая бактериальные и вирусные сигналы от PRR (TLR и NLR; рецепторов распознавания молекулярных паттернов), факторы стресса и сигналы повреждения тканей, а также многие цитокины (TNF, ИЛ-1, ИЛ-6) (Greten, Karin, 2005). NF-kB является транскрипционным фактором, регулирующим экспрессию многих генов, контролирующих важные для онкогенеза функции (Natoli 2009; Barish et al., 2010; Smale, 2011). В норме активность сигнального пути NF-kB в клетке строго контролируется, однако в онкогенезе его активация становится постоянной, во многом благодаря конститутивному присутствию внешних сигналов, ведущих к активации NF-kB (цитокины, микробные продукты), и не активирующим мутациям в сигнальном пути (как для многих других онкогенных путей) (Atreya et al., 2000; Karin et al., 2002; Karin, Lin, 2002; Atreya et al., 2008; Karin 2009).

Одними из самых важных генов-мишеней для NF-kB являются анти-апоптотические белки, такие как Bcl-2 и Bcl-xL, экспрессия которых предотвращает апоптоз эпителиальных и раковых клеток (Atreya et al., 2000; Karin et al., 2002; Karin, Lin, 2002; Atreya et al., 2008; Karin, 2009). NF-kB также контролирует экспрессию многих воспалительных цитокинов, роль которых в развитии рака уже установлена, например, TNF, ИЛ-23, ИЛ-6, а также ИЛ-1, роль которого подробно рассматривается в данной диссертации. NF-kB и NF-кВ-зависимые цитокины, синтезируемые в ходе процесса хронического воспаления, обладают мощным ангиогенным действием, стимулируя продукцию VEGF и рост сосудов в опухоли (Nagasaki et al., 2014). NF-кВ-зависимые воспалительные цитокины также способствуют инициации опухолей, усиливая различные эпигенетические

15

модификации генов опухолевых супрессоров, блокируя апоптоз и ускоряя деление мутантных клеток (Grivennikov, 2013; Louis et al., 2014). Так как конститутивная активация NF-kB приводит к постоянной экспрессии профиля генов, которые положительно регулируют онкогенез, то гены, кодирующие некоторые субъединицы NF-kB, относят к прото-онкогенам (Atreya et al. 2000; Karin et al. 2002; Karin, Lin, 2002; Atreya et al. 2008; Karin, 2009). Например, наиболее связанным с воспалением и онкогенными процессами является гетеродимер NF-kB, состоящий из субъединиц р50 и р65. Хотя вопрос почему именно эти субъединицы являются наиболее онкогенными по-прежнему остается открытым, существует несколько гипотез, которые частично проясняют данный аспект. Во-первых, активация р50 и р65 вовлекает в себя путь передачи сигнала через так называемую киназу IKKaß, для активации которой как раз-таки и нужны различные цитокины и микробные стимулы, в избытке присутствующие в опухолевом микроокружении. Во-вторых, промоторы генов, необходимые для онкогенеза, а также промотеры генов воспалительных цитокинов содержат большое количество сайтов узнавания для р50- р65 гетеродимеров NF-kB. Наконец, возможная кооперация NF-kB с другим проонкогенным транскрипционным фактором STAT3 (см. ниже) может быть исключительно важна для специфичной онкогенной роли NF-kB (Yu et al., 2009).

1.3. Цитокины как главные медиаторы воспаления, вызванного опухолевым процессом.

1.3.1. ИЛ-1 и его характеристики.

ИЛ-1 является центральным медиатором воспаления, а также важным компонентом врожденного и приобретенного иммунитета. Семейство цитокинов ИЛ-1 включает 11 родственных и похожих по нуклеиновой и аминокислотной структуре молекул, из которых насчитывается по крайней

мере 8 цитокинов-лигандов с различными активностями (ИЛ-1а и ИЛ-1Р, ИЛ-18, ИЛ-33, ИЛ-36a, ИЛ-36Ь, ИЛ-36g, ИЛ-37) и 3 рецептора-антагониста (KH-1Ra, ИЛ-36Ra, ИЛ-38) (Garlanda, 2013). ИЛ-1а и ИЛ-1р как у человека, так и у мыши кодируются отдельными близко сцепленными генами и имеют определенную степень белковой гомологии, а также связываются с одним и тем же рецептором KH-1R1, имея похожие физиологические эффекты (Garlanda, 2013).

ИЛ-1 имеет два рецептора: ИЛ-lRl (тип 1) и ИЛ-1Я2 (тип 2) с молекулярной массой 80 кД и 68 кД соответственно. Рецепторы для ИЛ-1 экспрессируются на большинстве типов клеток в организме, включая Т-клетки, миелоидные клетки, фибробласты и эпителиальные/раковые клетки. ИЛ-lRl является непосредственным сигнальным рецептором, в то время как рецептор типа 2 необходим для связывания растворимого цитокина и образования его комплекса с рецептором первого типа. Внеклеточная связывающая часть рецептора организованна в три иммуноглобулин-подобных домена, что позволяет отнести этот белок к иммуноглобулиновому суперсемейству. Для цитокинов семейства ИЛ-1 также часто характерно присутствие эндогенных регуляторов и ингибиторов передачи сигнала, таких как антагонист ИЛ-Жа, который не способен активировать рецептор, но, связываясь с ним, затрудняет активацию рецептора агонистами, действуя как отрицательный регулятор биологической активности ИЛ-1.

Передача сигнала от ИЛ-1 через поверхностный ИЛ-lR представляет собой эволюционно консервативный механизм гомологичный Toll-подобному сигнальному пути (TLRs) (Carpenter, O'Neill, 2007; Kawai, Akira, 2007) и осуществляется при помощи привлечения и димеризации молекулы-адаптера MyD88, который, в свою очередь, необходим для привлечения и активации протеинкиназы IRAKI (Apte, Voronov, 2008). Активная IRAKI служит для запуска последующих сигнальных путей, которые ведут к активации нескольких киназ семейства MAPK, а также к активации NF-kB

17

и индукции воспалительного ответа. Таким образом, ИЛ-УИЛ-IR сигнал изначально запускается при активации NF-kB, так как NF-kB необходим для экспрессии мРНК и незрелой формы белка ИЛ-1. В некоторых ситуациях благодаря тому, что микробные компоненты и продукты повреждения тканей, а также ИЛ-IR используют тот же самый внутриклеточный сигнальный путь, ИЛ-IR может также служить ключевым активатором NF-kB, и замещать в этой функции Toll-подобные рецепторы (Apte, Voronov, 2008). В то время как в одних типах рака микробные компоненты для активации NF-kB всегда присутствуют в избытке (РТК, рак желудка и кожи, а также рак печени, вызванный вирусами гепатита), другие, более «стерильные» виды рака, могут осуществлять активацию NF-kB посредством секреции и действия таких цитокинов, как ИЛ-1.

Как уже отмечено выше, два лиганда для KH-1R — это ИЛ-1 а и ИЛ-1Р, которые при связывании с рецептором вызывают очень схожие последствия в плане передачи сигнала, активации внутриклеточных сигнальных путей и регуляции экспрессии генов. Различия между ИЛ-1 а и ИЛ-1Р в основном существуют на этапе синтеза этих цитокинов различными типами клеток, а также в механизме их активации. Например, белок ИЛ-1 а локализуется в ядре или цитоплазме, в то время как ИЛ-1Р никогда не детектировался в ядре. ИЛ-1Р синтезируется в форме белка-предшественника и является активным только в секретируемой внеклеточной форме, которая образуется при протеолитическом расщеплении посредством каспазы-1, активированной компонентами белковых комплексов-инфламмасом (inflammasomes), или же другими протеазами, которые активны при гибели или повреждении клеток (например, катепсины).

ИЛ-1 а в свою очередь, существует, как в мембрано-связанной, так и в зрелой секретируемой форме. Долгое время господствовала парадигма, что ИЛ-1 а не имеет белка-предшественника и не требует протеолитической

активации. Тем не менее опубликованные работы показывают, что обе формы цитокина способны регулироваться по-разному. Так, мембрано-связанная форма требует лишь активации NF-kB, в то время как секретируемый цитокин ИЛ-1а нуждается в дополнительных стимулах активации от комплексов-инфламмасом и каспазы-1 (Fettelschoss et al., 2011; Rider et al., 2011). Также и биологическая активность, и продукция ИЛ-1а может регулироваться посредством различных протеолитических ферментов, таких как гранзим B, каплаин и эластаза нейтрофилов. Более того, при определенных условиях, ИЛ-1Р также может быть синтезирован и высвобожден без участия каспазы-1 и активации инфламмасомы (Gross et al., 2012).

Следует отметить, что профиль экспрессии ИЛ-1 весьма различен -он может продуцироваться как паракринно, так и аутокринно, а также другие цитокины могут стимулировать его продукцию. Например, KH-17A в значительных количествах присутствует в синовиальной' жидкости пациентов с ревматоидным артритом и провоцирует синтез ИЛ-1 (Nakae et al., 2003). Как и множество процессов в биологии, данный механизм работает и в обратную сторону - ИЛ-1Р участвует в дифференцировке, активации и выживаемости ИЛ-17A-продуцирующих Т-хелперных клеток (Th17 клеток). Раковые клетки напрямую могут продуцировать ИЛ-1 или могут стимулировать клетки из микроокружения опухолей для его продукции (Carmi et al., 2011). В целом в микроокружении опухолей ИЛ-1Р экспрессируется различными эпителиальными клетками, клетками, подверженными процессам старения и миелоидными клетками, такими как дендритные клетки, макрофаги, моноциты и нейтрофилы. ИЛ-1 а экспрессируется в основном внутри эпителиальных и опухолевых клеток. Оба цитокина являются медиаторами воспаления, которое способствует канцерогенезу, инвазивности опухоли и локальной иммуносупрессии (Voronov et al., 2013), но в то же время могут играть и положительную роль,

активируя противоопухолевый компонент иммунной системы и усиливая узнаваемость и иммуногенность опухолей, которые высвобождают ИЛ-1, ведя к активации противоопухолевого иммунного ответа (Voronov et al., 2003; Dinarello, 2006; Carmi et al., 2013; Voronov et al., 2013).

В ранних работах ИЛ-1 описывался только как важный медиатор острого и хронического воспаления (Finnegan, Doodes, 2008; Dinarello, 2011; Rider et al., 2011). Однако в последнее время началось активное изучение его роли на всех стадиях канцерогенеза (возникновение, прогрессия, малигнизация и инвазивность опухоли). Например, появляются данные об уровне экспрессии цитокина как биологического маркера для прогноза ремиссии болезни или устойчивости к терапии, а также проведены первые исследования о роли ИЛ-1 в подавлении или активации противоопухолевого иммунитета (Dinarello, 2006).

Важным потенциальным индикатором участия в онкогенном процессе является увеличение экспрессии мРНК и белковой формы как ИЛ-1а, так и ИЛ-1Р в опухолях различной природы относительно нормальной ткани, а также усиление экспрессии этих цитокинов при воздействии на опухоль химио- или радиотерапией.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Дмитриева Оксана Сергеевна, 2019 год

/ / / /

0.0020' 0.0015' 0.0010' 0.0005' 0.0000

!Иа

*

!И7Д

Б

!МР

!Иа

0.15-1

0.10-

0.05-

0.00-

■

//

4х104-, * 5х104-| *** 1 х105"|

3х104- 4х104- 8х104-

3х104- 6х104"

2х104- 2х104- 4х104"

1 х104- 1 х104- 2х104-

0- - 0- - 0-

!М7Д

*

Рисунок 5. Результаты сравнительного анализа уровня экспрессии цитокинов ИЛ-1 и ИЛ-17 в опухолевой и нормальной ткани толстого кишечника в модели СРТК в мышах АРСАох/^ CDX2cre+. (А) мРНК указанных цитокинов, нормализованных относительно гена L32. Данные ОТ-ПЦР *, р<0.05; ***, р<0.001 (Б) уровни белка указанных цитокинов, оптическая плотность пересчитана на грамм ткани исследуемых образцов. Данные ИФА *, р<0.05;***, р<0.001

3.3 Изучения влияния ингибитора ИЛ-Ш ("Анакинра») на экспрессию цитокина ИЛ-17А в иммунных фракциях опухолей толстого кишечника

Далее, мы решили изучить влияние рецептора ИЛ-1 на иммунные клетки в опухолевом микроокружении, в частности на регуляцию экспрессии цитокина ИЛ-17А, одного из основных компонентов

*

воспалительного ответа, вызванного опухолевым процессом ("tumor elicited inflammation" (TEI)). Для этого мы воспользовались препаратом «Анакинра». «Анакинра» представляет собой рекомбинантную негликолизированную форму антагониста рецепторов человеческого интерлейкина-1 (ИЛ-lRa). Как было показано ранее, «Анакинра» способна блокировать каскад реакций ИЛ-1.

Для данного эксперимента мы использовали мышей генотипа APCflox/wtCDX2Cre-IL17aGFP. Данные мыши содержат генетическую конструкцию, в которой экспрессия флюоресцирующего белка green fluorescent protein (GFP) находится под контролем промотора ИЛ-17а. Такая конструкция позволяет детектировать ИЛ-17а без дополнительной стимуляции клеток. Это делает условия эксперимента максимально физиологичными (подробная схема эксперимента см. материалы и методы).

Мыши генотипа APCflox/wtCDX2Cre+IL17aGFP получали препарат «Анакинра» в течение трех дней. После окончания курса животных забивали для анализа. Получали клетки фракций IEL и LPL, как было описано ранее. После окраски поверхностными антителами образцы анализировались на проточном цитофлуориметре. На рисунке 6 представлены результаты эксперимента. Согласно рисунку 6, мыши из группы, получавшей обработку препаратом «Анакинра» показали уменьшение количества ИЛ-17а продуцирующих клеток, как в популяции Т-клеток (TCRy5+), так и в популяции Th17 CD4+ клеток, а также в популяции ILC (CD90.2+ TCRyS-).

Рисунок 6. Фармакологический ингибитор ИЛ-1Я ("Анакинра») уменьшает экспрессию цитокина ИЛ-17А в 1ЕЬ и ЬРЬ фракциях опухолей толстого кишечника в модели СРТК. Репрезентативные данные проточной цитометрии из пяти экспериментов.

3.4. Изучение влияние ИЛ-1 на воспаление по типу ^17 (TEI) в модели СРТК.

Для непосредственного изучения роли ИЛ-1 в развитии рака толстого кишечника мы использовали модель СРТК, где мыши породы АРСйох/№1СВХ2Сге были скрещены с тотальным нокаутом рецептора ИЛ-1, мышами породы 1Ь1Я-/-.

Для изучения влияния тотального нокаута рецептора ИЛ-1 на воспаление, вызванное опухолевым процессом (ТЕ1) и одного из его главных медиаторов цитокина ИЛ-17а, мы дополнительно скрестили мышей генотипа АРСйох/^СВХ2Сге 1Ь1Я-/- с 1Ь17аОЕР мышами для исследования клеточных популяций, продуцирующих ИЛ-17А.

Как было описано ранее, из фрагмента нормальной и опухолевой ткани выделяли IEL и LPL фракцию. Далее клетки анализировались на проточном цитофлуориметре. На рисунке 7 показаны результаты анализа. Как и ожидалось, основная экспрессия ИЛ-17а наблюдалась в популяции клеток CD90.2+. При сравнении популяций в случае мышей дикого типа и мышей генотипа 1Ь1Я-/-, очевидно уменьшение экспрессии в клетках мышей генотипа 1Ь1Я-/-.

____Опухоль LPL_ _Опухоль IEL_

CD45+ ~ CD45+TCRP" Gated on CD45+ Gated on CD45+

Рисунок 7. Тотальный нокаут рецептора ИЛ-1 уменьшает экспрессию цитокина ИЛ-17А в IEL и LPL фракциях опухолей толстого кишечника в модели СРТК. Репрезентативные данные проточной цитометрии из трех экспериментов

При сравнении количества мРНК генов ИЛ-17а, RORyt, ИЛ-22 в тех же образцах опухоли мы обнаружили, что уровень экспрессии мРНК для генов ИЛ-17А, RORyt, ИЛ-22 оказался ниже у мышей генотипа IL1R-/-, по сравнению с мышами дикого типа в модели CPC-APC (Рисунок 8).

Таким образом, мы ожидали что такое значительное уменьшение воспалительного ответа (TEI) будет непосредственно транслироваться и в фенотип с уменьшением опухолей. Тем не менее, количество опухолей в нокаутных мышах было снижено не значительно, а размер не изменялся вовсе. На рисунке 9б показана репрезентативная фотография гематоксилин-эозинового окрашивания парафинового среза толстого кишечника мыши генотипа IL1R-/- и IL1R+/+ (контроль), где опухоли обозначены черными стрелками. Как видно из рисунка 9а, у мышей с генотипом IL1R-/-обнаруживается небольшое снижение количества опухолей, чем у контрольной группы. Тем не менее, даже при большом количестве экспериментальных мышей данные оказались статически не значимыми.

\L17A

\Ь22

0.025

■Я 0.020

(Л (Я

8 0.015

ш

СП О)

;;

ш

0.010

0.005

0.000 !_1Р +/-

-/-

СРС-АРС

0.04-1

0.03-

0.02-

0.01-

0.00 !_Ш

+/- -/-СРС-АРС

0.04

0.03

0.02

0.01

0.00 !1_Ш

+/- -/-СРС-АРС

Рисунок 8. Тотальный нокаут рецептора 1Ь1 приводит к снижению уровня мРНК цитокинов ТЫ7 в опухолях модели СРТК. Результаты анализа ОТ-ПЦР. Данные нормализованы относительно Ь32-контроля. *, р<0.05;

А

Количество опухолей

10-1

4-|

Размер опухолей

Б

ш^-срс-арс

!1_т/-срс-арс

Е 2-

!1_1Р +/-

-/-

СРС-АРС

! 1_ 1К +/- -/-срс-арс

Рисунок 9. Тотальный нокаут рецептора ИЛ-1 в модели СРТК не приводит к уменьшению количества и размера опухолей (А) Подсчет количества (п=13) и размера опухолей (диаметр, мм) (Б) гематоксилин-эозиновое окрашивания парафинового среза толстого кишечника, опухоли обозначены черными стрелками

3.5. Изучение влияния ИЛ-1 рецептора на развитие СРТК в модели APCflox/wt CDX2cre+

Так как гемопоэтические клетки являются главным источником ИЛ-17А и ИЛ-22, то в поисках более выраженного эффекта на развитие и рост опухолей мы решили изучить механизм развития опухолевого процесса и роль ИЛ-Ж исключительно в гемопоэтических клетках. Для этого мы

сгенерировали химерных мышей с трансплантацией костного мозга от мышей IL1R-/- и IL1R+/+ (контроль), (ВМТ-bone marrow transplantation модель, см. материалы и методы). Таким образом, мы получили химерных мышей модели СРТК, в которых рецептор ИЛ-1 был инактивирован на всех клетках гемопоэтического ряда, но оставался интактным на эпителиальных и на некоторых радиорезистентных клетках.

Нами было найдено, что мыши, получавшие костный мозг от нокаутных мышей IL1R-/-, имели одинаковое количество опухолей, как мыши с костным мозгом дикого типа, также размер опухолей не показал значительной разницы между группами (Рисунок 10а). Тем не менее при анализе на проточном цитофлуориметре иммунных клеток, выделенных из опухолей, мы обнаружили значительное снижение уровня экспрессии ИЛ-17А цитокинов (Рисунок 10в). Данные проточной цитометрии коррелировали также и со сниженным уровнем мРНК для ИЛ-17А и других провоспалительных цитокинов (Рисунок 10б).

Данное наблюдение оказалось очень неожиданным, так как такое значительное снижение маркеров воспаления и ИЛ-17А ожидаемо должно было транслироваться и в фенотип самих опухолей, ведя к их уменьшению. Эти неожиданные результаты заставили нас разработать новую гипотезу. Так как рецептор ИЛ-1 является многоликим регулятором иммунитета и физиологии и экспрессируется практически всеми типами клеток, то мы предположили, что сигнальный путь ИЛ-1 в некоторых клеточных популяциях может быть ответственен за про-онкогенные воспалительные реакции во время развития СРТК, но одновременно активность лиганда ИЛ-1 на отдельных клеточных типах возможно имеет противоположный эффект на развитие СРТК, в результате чего, компенсирующие и нивелирующие друг друга активности одного сигнального пути минимального влияют на общий ход и течение болезни. И как результат не оказывая эффект на фенотип опухолей при тотальной инактивации рецептора ИЛ-1 на клетках гемопоэтического ряда.

А

Количество Размер

опухолей опухолей

8П 4П

6-

4-

+/- -/-!Ь1 К ВМТ

1-

+/- -/-!1_Ш ВМТ

Б

!М7Д

*

5 0.04- --

ф

I 0.03- __

I ■

® 0.02- ■■ * ■

г 0.01- ■Н

0.00-!-^-1—

!1_1Р ВМТ

!Ь22

60000-.

40000-

20000-

+/- -/-!1_1Р ВМТ

0.05-

*

3

2

2

0

0

0

Т сеМв 11.С

//. 17А*С04*ТСГ^,-*С090.2* И. 17А+Та^ЬТСЯЬ-С090.2+ 8п 3-1

XV У 11.1ВМТ

х\' У 11.1 ВМТ

TCRY5 сеИБ

а 17А*таъ&*тсирсо90. г+ 0.5-1

ИЖВМТ

Рисунок 10. Гемопоэтический нокаут рецептора ИЛ-1 уменьшает ТЕ1 воспаление, но не влияет на размер и количество опухолей (А) Подсчет количества (п=10) и размера опухолей (диаметр, мм) (Б) мРНК уровень внутриопухолевой экспрессии ИЛ-17а, данные нормализованы относительно L32.; и концентрация белка ИЛ-22 в опухолях модели СРТК (В) Репрезентативные данные проточной цитометрии из четырех экспериментов (Г) Статистический обсчет процентного содержания ИЛ-17а в различных иммунных популяциях клеток ЬРЬ фракции из опухолей СРТК, *, р<0.05, **, р<0.001.

3.6 Изучение влияния рецептора ИЛ-1, экспрессируемого эпителиальными клетками кишечника на развитие СРТК

Для проверки данной идеи мы сгенерировали панель нокаутных мышей CDX2Cre-APC-//1r1del/f со специфичной делецией рецептора ИЛ-1 в эпителиальных и раковых клетках кишечника, а также в главных клеточных подтипах, участвующих в воспалительном процессе при онкогенезе: Т-клетках и миелоидных клетках.

При сравнении мышей нокаутных по рецептору ИЛ-1 в эпителиальных клетках (CDX2Cre-APC- П1г1АеШ) с их контролем (CDX2Cre-АРС-Шг!^1^), мы обнаружили уменьшенное количество опухолей и снижение опухолевой нагрузки (Рисунок 11 а-в).

Необходимо заметить, что данные изменения не были связаны с воспалением и продукцией цитокинов, так как уровень мРНК ИЛ-17А, его транскрипционного фактора RORyt, а также цитокинов ИЛ-22 и ИЛ-17Ф внутри опухолей не отличался между нокаутными и контрольными группами мышей (Рисунок 12).

Тем не менее, данное наблюдение позволяет разделить роли сигнального пути ИЛ-1: его способность индуцировать воспалительный ответ, вызванный развитием опухоли (ТЕ1) от его прямого про-онкогенного эффекта на раковые клетки эпителия толстого кишечника. Данный прямой эффект ИЛ-1 в эпителиальных клетках, скорее всего связан с ролью ИЛ-1 в клеточной пролиферации, так как иммуногистохимическое окрашивание для Ю67 образцов опухолей молодых мышей с генотипом CDX2Cre-APC-П1г1^ш показало, что они пролиферируют с гораздо меньшей скоростью, чем контрольная группа CDX2Cre-APC-//1r1del/w (Рисунок 13, а, б). Более того размер опухолей в молодых мышах CDX2Cre-APC-//1r1del/f был значительно снижен по сравнению с контролем 1/1г1Ле1^ (Рисунок 13в).

В

Количество опухолей

* * *

Размер опухолей

срс-арс

||_1КД/ш1|иКДЯ

срс-арс

Рисунок 11. Специфическая инактивация рецептора ИЛ-1 в эпителиальных клетках толстого кишечника ведет к снижению количества опухолей в модели СРТК. (А) Репрезентативные фотографии открытого толстого кишечника с опухолями мышей CDX2Cre-APC-//1r1del/f со специфичной делецией рецептора ИЛ-1 в эпителиальных и раковых клетках кишечника (ко) и контрольной группы дикого типа (wt) (Б) гематоксилин-эозиновое окрашивание парафинового среза толстого кишечника, опухоли обозначены черными стрелками (В) Подсчет количества (п=10) и размера опухолей (диаметр, мм); ***, р<0.001.

4

3

2

0

IL17A

0.04т

IL22

0.10т

RORYt

0.04т

IL17F

0.04т

0.03-

<и 0.02-

ш 0.01-

0.00

0.08-

■ 0.06-

та 0.04-

75 0.02-

IL1R Д/wt Д/f CPC-APC

0.00

IL1R Д/wt Д/f CPC-APC

■5 0.03-

<и 0.02-

3 0.01-

0.00 il1r

0.03-

ш 0.02-

S 0.01 -

0.00

Д/wt Д/f CPC-APC

IL1R Д/wt Д/f CPC-APC

Рисунок 12. Специфическая инактивация рецептора ИЛ-1 в эпителиальных клетках толстого кишечника не влияла на уровни мРНК провоспалительных цитокнов в опухолях в модели СРТК. Данные ОТ-ПЦР, мРНК уровени внутриопухолевой экспрессии указанных цитокинов, данные нормализованы относительно гена L32.

А

Ki-67

Я

\ur-*cpc-apc IL1RA/f cpc-apc

Б

150т

100-

50-

0

IL1R

Ki67+

Д/wt Д/f CPC-APC

Ki67+

per crypt

100-i

80-

60-

40-

20-

IL1R Д/wt Д/f CPC-APC

В

Количество Опухолей

3 месяца

*

Размер Опухолей

3 месяца

IL1 R Д/wt Д/f CPC-APC

IL1R Д/wt Д/f CPC-APC

Рисунок 13. Специфическая инактивация рецептора ИЛ-1 в эпителиальных клетках толстого кишечника снижает уровень пролиферации Ю67 в молодых мышах в модели СРТК. (А) иллюстрации уровня Ю67 (Б) данные количественного анализа уровня Ю67 (В) Подсчет количества и размера опухолей (диаметр, мм) в молодых мышах *, p<0.05; ***, p<0.001

4

3

2

0

Данный эксперимент доказывает, что сигнальный путь ИЛ-1 играет важнейшую роль в пролиферации и выживаемости раковых эпителиальных клеток на ранних этапах инициирования опухоли. Рассматривая механизмы действия ИЛ-1 в эпителиальных опухолях, мы обнаружили сниженную активацию белка ОТ-кВ в ядрах раковых эпителиальных клеток у мышей СОХ2Сге-АРС-1/1г1йеУ{ (Рисунок 14).

JL

I-1 Г

IL1 Rf/wt APC-CDX2ERT

JL

IL1 Rf/f APC-CDX2ERT

NF-kB p65

Histone H3-контроль

Рисунок 14. Результаты Вестерн блоттинга для белка NF-kB и контроля Histone3, ядерные экстракты из эпителиальных клеток опухоли

Все описанные выше данные позволяют нам предположить, что ИЛ-1 играет значимую роль на этапе инициации опухоли. И по крайне мере одним из механизмов регуляции является онкогенный сигнальный путь NF-kB, контролируя который, ИЛ-1 способен влиять на развитие опухоли.

3.7. Изучение роли сигнального пути ИЛ-1 в Т-клетках в модели СРТК.

Следующей задачей являлось объяснение полученных нами

неожиданных результатов в тотальном и гемопоэтическом нокаутах

рецептора ИЛ-1 в спонтанной модели РТК (см. Рис 10), где ИЛ-1

контролировал воспалительный ответ и продукцию ИЛ-17А, но не оказывал

влияния на опухолевый рост и развитие. Так как CD4+ ТЫ7 клетки являются

главным источником ИЛ-17А внутри опухоли и ИЛ-1 способен

контролировать их дифференцировку и продукцию в других

воспалительных состояниях, мы создали специфический нокаут рецептора

ИЛ-1 исключительно на Т-клетках: мыши с генотипом CD4Cre-I/lrP/f

58

(подробно данные мыши описаны в разделе («Материалы и методы»). В используемой нами мышиной модели СРТК (CDX2Cre-APC), СБХ2Сге рекомбиназа специфически вырезает ген АРС из эпителиальных клеток кишечника, в тоже время, в мышах CD4Cre+I/1r1fr, другая специфичная рекомбиназа CD4Cre удаляет ген рецептора ИЛ-1 в Т-клетках, по этим причинам мы не могли скрестить эти 2 модели без введения мутации гена рецептора ИЛ-1 в эпителий и мутации гена АРС в Т-клетки. Поэтому, чтобы получить чистый специфичный нокаут рецептора ИЛ-1 в Т-клетках на модели СРТК, мы использовали описанную ранее технологию создания химерных мышей с помощью трансплантации костного мозга. Таким образом, мы сравнивали группы мышей, получивших донорский костный мозг с генотипом CD4Cre+I/1r1f/r и контрольную группу без трансгена С04Сге-1/1г1^. Мы обнаружили, что инактивация рецептора ИЛ-1 на Т-клетках ведет к уменьшению уровня мРНК для про-воспалительных цитокинов (Рисунок 15а), а также нарушает продукцию ИЛ-17А и ИЛ-22 из опухоли на уровне белка (Рисунок 15 б).

Одновременно с уменьшением воспалительного ответа, мы наблюдали уменьшение количества опухолей у мышей нокаутных по рецептору ИЛ-1 на Т-клетках (Рисунок 16а, б, в).

Интересно отметить, что в отличие от эпителиального нокаута рецептора ИЛ-1, мыши, с инактивированным рецептором ИЛ-1 на Т-клетках не показали сниженной экспрессии в маркере пролиферации К167 (рисунок 17а), тем не менее, мы обнаружили значительную разницу в экспрессии про-онкогена БТАТ3 в опухолевых клетках нокаутных мышей (Рисунок 17б, в).

Таким образом, сигнальный путь рецептора ИЛ-1 на Т-клетках необходим для экспрессии про-онкогенных и про-воспалительных ТЕ1-цитокинов и развития СРТК.

А

0.06-1

0.04-

0.02-

!М7Д

**

РОРу!

0.00

0.025-1

0.020-

0.015-

0.010-

0.005-

0.000

0.10

0.08

0.06

0.04

0.02

0.00

!Ь22

**

Б

200000

150000 100000 50000

!Ы7Д

!1_22

сге - сге + вмт: !1_1рстср4<

сге - сге + сге - сге +

вм т: !1_1 [сс^ вмт: !1_1 риср4(

800000-

600000-

400000

200000

сге- сге+ ВМТ:!1_1 К'"С04

сге- сге+ ВМТ:!1_1 К'"С04

Рисунок 15. Специфическая инактивация рецептора ИЛ-1 в Т-клетках снижает уровни мРНК провоспалительных цитокнов в опухолях в модели СРТК. (А) Данные ОТ-ПЦР, мРНК уровени внутриопухолевой экспрессии указанных цитокинов, данные нормализованы относительно гена L32. *, р<0.05 **, р<0.01 (Б) Уровни белка указанных цитокинов в пересчете на грамм ткани. **, р<0.01

А

ВМТ: ! 1.1 Р"'СР4 Сге-

Б

ВМТ: !1.1 РМСР4 Сге- ВМТ:! И Р'"СР4 Сге+

В

Количество опухо лей

Размер опухолей

20'

4п

Е 2'

сге - сге + ВМТ: !1_1РСТСР4

1-

0'

сге - сге + ВМТ: !МРетСР4

Рисунок 16. Специфическая инактивация рецептора ИЛ-1 в Т-клетках снижает количество опухолей в модели СРТК. (А) Репрезентативные фотографии открытого толстого кишечника с опухолями мышей со специфичной делецией рецептора ИЛ-1 в Т-клетках. (Б) гематоксилин-эозиновое окрашивание парафинового среза толстого кишечника, опухоли обозначены черными стрелками (В) Подсчет количества (п=) и размера опухолей (диаметр, мм); **, р<0.01

*

0

0

**

3

А

Ш^СМ Сге"

Ш^СМ Сге

+

Б

Ш^'СМ Сге-

!и^С04 Сге"1

.....Л^адГлЛЛЛЛ«^

р-БТДТЭ

В

р-БТДТЭ

150т

100-

50-

0

!И ^004

& С?

Рисунок 17. Специфическая инактивация рецептора ИЛ-1 в Т-клетках снижает экспрессию р^ТАТЗ в опухолях, но не изменяет уровень пролиферации опухолей в модели СРТК. На рисунках репрезентативные изображения: иммунофлюоресцентное окрашивание для Ю67 (А) и гистохимическое окрашивание р^ТАТЗ (Б) обсчет для р^ТАТЗ (В). ***, р<0.001

3.8. Изучение роли сигнального пути рецептора ИЛ-1 в клетках миелоидного ряда в модели СРТК.

Гемопоэтическая делеция рецептора ИЛ-1 не влияет на развитие и прогрессию СРТК, в то время как специфическая инактивация рецептора ИЛ-1 на Т-клетках ведет к уменьшению количества опухолей. Так как рецептор ИЛ-1 экспрессируется на множестве гемопоэтических клеточных популяциях, играющих различные функциональные роли в опухолевом микроокружении, мы предположили, что на некоторых из них ИЛ-1 играет исключительно анти-опухолевую роль, таким образом нивелируя эффект от про-онкогенного его сигнального пути в Т-клетках. Для проверки нашей гипотезы мы сгенерировали специфический нокаут рецептора ИЛ-1 в клетках миелоидного ряда, экспрессирующих маркер CD11b. Таким образом, CD11bCre+IL1Rf/f мыши не имеют рецептора ИЛ-1 на моноцитах, макрофагах и нейтрофилах. Для проверки нашей гипотезы мы использовали химерных мышей по технологии, описанной выше (см. Специфический нокаут на Т-клетках). Неожиданно, мы обнаружили, что мыши с инактивированным рецептором ИЛ-1 на миелоидных клетках имеют больше опухолей и сильный воспалительный ответ в модели СРТК (Рисунок 17 а-в и Рисунок 19а, б).

Большое количество опухолей сопровождалось увеличенной клеточной пролиферацией в опухолях (Рисунок 18). Замеченный нами усиленный воспалительный ответ и повышенная продукция цитокинов ИЛ-17А, его транскрипционного фактора RORyt, ИЛ-22 и ИЛ-17Ф как на уровне мРНК, так и на уровне белка, нельзя объяснить прямым действием сигнала ИЛ-1 на миелоидных клетках, так как сами миелоидные клетки не продуцируют ИЛ-17А в СРТК.

А

ВМТ: Ш^СРИЬ Сге+ ^ ВМТ:И1РМ СР11Ь Сге+ ВМТМИ^ СР11ЬСге+

В

Количество опухолей

40т *

30-

20-

10-

0

ОР11 Ьсге+

Размер о п ухо лек!

2.5-1 *

2.0-

Е 1.5-

1.0-

0.5-

0.0 ОР11Ьспе +

Рисунок 17. Специфическая инактивация рецептора ИЛ-1 в миелоидных клетках увеличивает количество опухолей в модели СРТК. (А) Репрезентативные фотографии открытого толстого кишечника с опухолями мышей со специфичной делецией рецептора ИЛ-1 в миелоидных клетках. (Б) гематоксилин-эозиновое окрашивание парафинового среза толстого кишечника, опухоли обозначены черными стрелками (В) Подсчет количества (п=) и размера опухолей (диаметр, мм); *, p<0.05.

Рисунок 18. На рисунках репрезентативные иммунофлюоресцентное окрашивание для Ю67

изображения:

Таким образом, делеция рецептора ИЛ-1 в миелоидных клетках спровоцировала дополнительный стимул, в результате действия которого увеличилась экспрессия цитокина ИЛ-17А. Известно, что различные кишечные бактерии являются значимыми стимуляторами продукции ИЛ-17А и других воспалительных цитокинов, как в нормальной, так и воспаленной ткани кишечника. Следующим шагом мы решили проверить спровоцировала ли делеция рецептора ИЛ-1 на миелоидных клетках изменения в кишечной микрофлоре, что в последствии привело к увеличению роста опухолей. Мы исследовали бактериальное содержимое колоректальных опухолей методом ПЦР в реальном времени, используя праймеры распознающие бактериальную 16S РНК. Сравнительный анализ образцов опухолей показал повышенную экспрессию тотальной 16S РНК, а также различных специфических бактериальных семейств, таких как E.coli, Enterobacteroides и SFB в мышах нокаутных по рецептору ИЛ-1 в миелоидных клетках по сравнению с их контрольной группой дикого типа (Рисунок 20).

Также, при окрашивании цельной ткани толстого кишечника красителем Yo-Yo1, проникающим в клетки эпителия и бактерий, мы обнаружили увеличенное присутствие бактерий, ассоциированных с опухолью в мышах нокаутных по рецептору ИЛ-1 на миелодных клетках (Рисунок 27).

Б

4x1Q5-

3x1Q5-

E 2x1Q5-

ro

CP

IL17A

*

1x1Q5-

Л

0'

CD11 bcre+

2.5x1Q6n

2.Qx1Q6H

ro 1.5x 1Q6-E

1? и

Π1.Qx 1Q6-5.Qx 1Q5-|

0.0

CD11 bcre+

IL22

*

Рисунок 19. Специфическая инактивация рецептора ИЛ-1 в миелоидных клетках (CD11bCre+) повышает воспалительные цитокины в модели СРТК. (А) Данные ОТ-ПЦР, мРНК уровени внутриопухолевой экспрессии указанных цитокинов, данные нормализованы относительно гена L32. *, p<0.05 **, p<0.01 (Б) Уровни белка указанных цитокинов в пересчете на грамм ткани. *, p<0.05

16S RNA

ЭРБ

E.coli

Enterobacteria

Clostridia

Bacteroides

о с о (Л с 0.04- о с о (Л

£ 0.02- £ 0.0004- £ 1.0-

0.00' 11 bcre+

V

0.05-

0.03-

a, 0.02'

-p > 0.000^^ (u >0.5"

f H f 0.01- T f ^

-L^P—i— 0.0000^—i— 0.00^—i— 0.0-L^—i—

CD11 bcre+ " ' "

1.5-1

0.00' CD11 bcre+

0.20'

S3 0.15H I ""

Ш .

O. £ 0.10-

X T Q-

® 0.10- « ^Ж

8> ^Ж S 0.05- H

i 0.05- Ё ^B

üä «

и - ■__

0.00^^-1- 0.00-L^-1-

CD11 bcre+ ^ CD11 bcie+ ^ *

0.10'

0.0 CD11 bcre+

0.05'

0.00

Рисунок 20. Специфическая инактивация рецептора ИЛ-1 в миелоидных клетках повышает тотальную бактериальную рРНК и некторые семейства бактерий в опухолях в модели СРТК. (А) Данные ОТ-ПЦР, мРНК уровни внутриопухолевой экспрессии указанных бактерий, данные нормализованы относительно гена L32. *, р<0.05