Протеализин - новая протеиназа Serratia proteamaculans 94: структура, свойства и перспективы практического использования тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Громова, Татьяна Юрьевна

• Громова, Татьяна Юрьевна
• кандидат химических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат химических наук Громова, Татьяна Юрьевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность работы.

Цели исследования.».!.

Научная новизна.

Практическая значимость.

Положения, выносимые на защиту.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ТЕРМОЛИЗИНПОДОБНЫХ ПРОТЕИНАЗ.

1.1. Организация каталитических доменов.

1.1.1. Организация сайтов связывания ионов кальция.

1.1.1.1. Первый двойной сайт связывания ионов кальция (Cal ,2).

1.1.1.2. Третий сайт связывания ионов кальция (СаЗ).

1.1.1.3. Четвертый сайт связывания ионов (Са4).

1.1.2. Организация каталитического центра.

1.1.3. Организация субстратсвязывающей области.

1.1.4. Открытая и закрытая конформация молекул ТПП.

1.2. Структура предшественников термолизинподобных протеина*.

1.2.1. Структура и функции длинных АКР предшественников ТПП.

1.2.2. Структура и функции коротких АКР предшественников ТПП.

1.2.3. Функции С-концевых регионов предшественников ТПП.

1.3. Механизмы удаления N-концевых пропептидов термолизинподобных протеинах.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.2. Общие методы.

2.2.1. Состав питательных сред.

2.2.2. Трансформация бактериального штамма Escherichia coli.

2.2.3. Выделение плазмидной ДНК.

2.2.4. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.2.5. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот.

2.2.6. Полимеразная цепная реакция.

2.2.7. Генно-инженерные манипуляции с ДНК.

2.2.8. Электрофоретический анализ белков.

2.2.9. Определение протеолитической активности ферментов.

2.2.10. Количественное определение белка.

2.2.11. Масс-спектрометрический анализ.

2.2.12. Определение N-концевой аминокислотной последовательности.

2.2.13. Расчет изоэлектрической точки.

2.2.14. Анализ аминокислотных последовательностей и пространственных структур.

2.3. Очистка зрелого протеализина.

2.4. Влияние рН на стабильность протеализина.

2.5. рН Оптимум протеолитической активности.

2.6. Влияние температуры на стабильность протеализина.

2.7. Температурный оптимум протеолитической активности.

2.8. Влияние ионов кальция на стабильность фермента.

2.9. Влияние ингибиторов.

2.10. Определение константы гидролиза ФАГЛА протеализином.

2.11. Аналитическая гель-проникающая хроматография.

2.12. Оценка возможности использования рекомбинантного протеализина в пищевой промышленности.

2.12.1. Получение ферментного препарата в колбах.

2.12.2. Оценка термоинактивации протеализина в ферментном препарате.

2.12.3. Получение ферментного препарата в ферментере на 100 л.

2.12.4. Технологическая схема выработки варено-копченой колбасы с использованием ферментного препарата, полученного из генно-инженерного штамма.

2.13. Конструирование векторов для экспрессии генов модифицированных предшественников протеализина.

2.14. Очистка зрелого протеализина с шестью гистидинами на С-конце молекулы (Р1пШ86).

2.15. Очистка предшественника протеализина (ргоР1пН1«6).

2.16. Очистка предшественника протеализина с мутацией в активном центре (ргоР1пШ56/А).

2.17. Ингибирование активности протеализина (Р1пШ56).

2.18. Процессинг предшественника протеализина (ргоР1пН156).

2.19. Процессинг предшественника протеализина (ргоР1пШ$6) при различных рН.

2.20. Процессинг предшественника протеализина (ргоР1пШ«6) на 1Ч12<-НТК-агарозе.

2.21. Ингибирование процессинга предшественника протеализина (ргоР1пШ«6).

2.22. Процессинг мутантного предшественника протеализина активными протеиназами (ргоР^ШЯб/А).

2.23. Кристаллизация и рентгеновские исследования кристаллов мутантного предшественника протеализина.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Анализ аминокислотной последовательности протеализина.

3.2. Очистка зрелого протеализина.

3.3. Характеристика протеализина.

3.3.1. Амино-концевая последовательность зрелого протеализина.

3.3.2. Молекулярная масса зрелого протеализина.

3.3.3. Влияние рН, температуры и ионов кальция на активность протеализина.

3.3.4. Влияние ингибиторов на активность протеализина.

3.3.5. Изучение кинетики гидролиза ФАГЛА.

3.4 Оценка возможности использования рекомбинантного протеализина в пищевой промышленности.

3.5. Процессинг предшественника протеализина.

3.5.1 Конструирование и экспрессия модифицированных генов протеализина.

3.5.2. Очистка и некоторые свойства зрелого протеализина, несущего шестигистидиновую последовательность на С-конце молекулы.

3.5.3. Процессинг предшественника протеализина.

3.6. Пространственная организация предшественника протеализина.

3.6.1. Получение кристаллов предшественника протеализина.

3.6.2. Анализ пространственной структуры предшественника протеализина.

3.6.2.1. Анализ сайтов связывания кальция.

3.6.2.2. АУБО-шпилька.

3.6.2.3. Структурная организация пропептида и его взаимодействие со зрелой частью.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ

ТПП термолизинподобные протеиназы

ПГТП протеализинподобные протеиназы sp. species

ККР карбокси-концевой регион

АКР амино-концевой регион

ИПТГ изопропил-р-О-тиогалактопиранозид трис трис-(гидроксиметил)-аминометан

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

SDS додецилсульфат натрия

ТХУ трихлоруксусная кислота

ФАГЛА 3-(2-фурил)акрилоил-глицил-Ь-лейцинамид

ФМСФ фенилметилсульфонилфторид

ПЦР полимеразная цепная реакция proPln предшественник протеализина

Pin зрелый протеализин proPlnHisó предшественник протеализина с шестью гистидинами в С-концевой области

PlnHiSé зрелый протеализин с шестью гистидинами в С-концевой области proPlnHis6/A предшественник протеализина с мутацией в активном центре и с шестью гистидинами в С-концевой области

PlnHisr/A зрелый протеализин с мутацией в активном центре и с шестью гистидинами в С-концевой области

АК аминокислота

АО аминокислотный остаток

АОХ анионообменная хроматография

ГХ гидрофобная хроматография

ГПХ гель-проникающая хроматография

Мш молекулярная масса

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Протеализин - новая протеиназа Serratia proteamaculans 94: структура, свойства и перспективы практического использования»

Актуальность работы

Одним из наиболее активно развивающихся направлений современной биотехнологии является использование широкого круга ферментов в технологических процессах. Среди таких ферментов важную роль играют протеиназы. Они используются в медицине, косметологии, индустрии моющих средств, пищевой и кожевенной промышленности, а также для ферментативного синтеза пептидов [1]. Однако, несмотря на большое разнообразие природных ферментов, их свойства часто не оптимальны для технологических процессов. Для решения этой проблемы могут быть использованы два основных подхода. Первый заключается в поиске новых природных ферментов с подходящими характеристиками, а второй - в направленной модификации уже известных и хорошо охарактеризованных белков. Второй подход кажется более привлекательным, поскольку позволяет конструировать ферменты оптимальные для данного биотехнологического процесса. Фундаментом для реализации этого подхода является изучение структурно-функциональной организации белков.

В лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН в результате широкомасштабного скрининга микроорганизмов, добытых из необычных природных и промышленных источников, был отобран штамм Serratia proteamaculans 94, который способен с высокой эффективностью гидролизовать нативный коллаген при низких положительных температурах. Ферменты, которые определяют такую способность данного штамма, перспективны для использования в пищевой промышленности, так как могут избирательно разрушать соединительную ткань в составе мясного сырья. С целью клонирования генов протеолитических ферментов была создана геномная библиотека Serratia proteamaculans 94, при анализе которой был охарактеризован ген новой металлопротеиназы (протеализина), относящейся к семейству пептидаз М4 - термолизинподобных протеиназ. Изучение структурно-функциональной организации протеализина представляет интерес как с прикладной, так и с фундаментальной точки зрения. С одной стороны, этот фермент перспективен для использования в мясоперерабатывающей промышленности для улучшения качества низкосортного мясного сырья. А с другой стороны, структурные особенности предшественника протеализина делают его удобной моделью для изучения механизмов действия пропептидов пептидаз семейства М4.

Цели исследования

Целями данной работы являются исследование структуры и свойств протеализина, а таюке оценка возможности применения рекомбинантного фермента в пищевой промышленности для улучшения качества мясного сырья.

Научная новизна

В ходе данной работы впервые очищен и охарактеризован протеализин -новая протеиназа Serratia proteamaculans. Проведен анализ первичной структуры протеализина и показано, что протеиназы, имеющие структуру схожую с предшественником протеализина, образуют отдельную группу внутри семейства термолизинподобных протеиназ. Впервые детально изучен механизм созревания предшественника фермента, относящегося к этой группе. Получены кристаллы предшественника протеализина и впервые решена пространственная структура предшественника ТПП.

Практическая значимость

Данные, полученные в ходе работы, показали, что на основе протеализина может быть создан препарат для улучшения качества низкосортного мясного сырья. Эти результаты позволяют перейти к конструированию промышленных продуцентов протеализина.

Информация о структурно-функциональной организации предшественника протеализина может быть использована для создания на основе этого белка ферментов с направленно модифицированными свойствами.

Положения, выносимые на защиту

1. Анализ первичной структуры, очистка и изучение свойств рекомбинантного протеализина.

2. Оценка возможности использования рекомбинантного протеализина в пищевой промышленности для улучшения качества низкосортного мясного сырья.

3. Изучение механизма созревания предшественника протеализина.

4. Кристаллизация предшественника протеализина и установление его пространственной структуры.

5. Анализ пространственной структуры предшественника протеализина.

Работа поддержана грантами РФФИ № 03-04-48754-а «Структурные основы низкотемпературной активности ферментов. Новая психрофильная коллагеназа», №06-04-48678-а «Пропептиды как модуляторы функциональной активности белков» и № 06-04-08123-офи «Создание активного при пониженных температурах коллагенолитического ферментного препарата для мясной промышленности».

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Громова, Татьяна Юрьевна

выводы

1. По структуре и свойствам протеализин, новая протеиназа Serratia proteamaculans, относится к семейству пептидаз М4, более известному как термолизинподобные протеиназы.

2. На модели протеализина впервые проведено исследование механизма удаления нового типа пропептидов пептидаз семейства М4. Установлено, что пропептиды протеализинового типа, в отличие от классических пропоследовательностей ферментов семейства, могут быть удалены только межмолекулярно, но при этом как авто-, так и гетерокаталитически.

3. Получен препарат протеализина и в опытно-промышленных условиях изучено его действие на мясное сырье. Продемонстрировано, что протеализин перспективен для использования в пищевой промышленности как агент для улучшения качества мясного сырья.

4. Получены кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного анализа, и установлена пространственная структура предшественника протеализина - первая пространственная структура предшественника пептидазы семейства М4.

5. Консервативный структурный элемент пропептидов протеализинового типа, PPL-мотив, непосредственно взаимодействует с субстратсвязывающим районом фермента.

6. В структуре протеализина не содержится ионов кальция. Пептидаза семейства М4 с такой структурной особенностью обнаружена впервые.

7. Активный центр протеализина содержит, отсутствующий в других пептидазах семейства М4 с известными пространственными структурами, дополнительный структурный элемент, который изменяет организацию субстратевязывающего региона и участвует во взаимодействии с лигандом.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Громова, Татьяна Юрьевна, 2008 год

1. Березин И.В., Клячко H.JT., Левашов А.В., Мартинек К., Можаев В.В., Хмельницкий Л. Биотехнология. Иммобилизованные ферменты. 1987, Москва: Высшая школа.

2. Rawlings N.D., Tolle D.P., Barrett A.J. MEROPS: the peptidase database. // Nucleic Acids Res., 2004. 32(Database issue): p. 160-164.

3. Schechter I., Berger A. On the size of the active site in proteases. I. Papain. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1967. 27(2): p. 157-162.

4. Thayer M.M., Flaherty K.M., McKay D.B. Three-dimensional structure of the elastase of Pseudomonas aeruginosa at 1.5-A resolution. // J. Biol. Chem., 1991. 266(5): p. 2864-2871.

5. Серкина А.В., Шевелев А.Б., Честухина Г.Г. Структура и функции предшественников бактериальных протеиназ. // Биорг. хим., 2001. 27(5): с. 323-346.

6. Mclver K.S., Kessler E., Olson J.C., Ohman D.E. The elastase propeptide functions as an intramolecular chaperone required for elastase activity and secretion in Pseudomonas aeruginosa. II Mol. Microbiol., 1995. 18(5): p. 877-89.

7. Braun-P., Tommassen J., Filloux A. Role of the propeptide in folding and secretion of elastase of Pseudomonas aeruginosa. II Mol. Microbiol., 1996. 19(2): p. 297 306.

8. Marie-Claire C., Ruffet E., Beaumont A., Roques B.P. The prosequence of thermolysin acts as an intramolecular chaperone when expressed in trans with the mature sequence in Escherichia coli. II J. Mol. Biol., 1999. 285(5): p. 1911-1915.

9. Serkina A.V., Gorozhankina T.F., Shevelev A.B., Chestukhina G.G. Propeptide of the metalloprotease of Brevibacillus brevis 7882 is a strong inhibitor of the mature enzyme. II FEBS Lett., 1999. 456(1): p. 215-219.

10. O'Donohue M.J., Beaumont A. The roles of the prosequence of thermolysin in enzyme inhibition and folding in vitro. // J. Biol. Chem., 1996. 271(43): p. 26477-26481.

11. Kessler E., Safrin M. The propeptide of Pseudomonas aeruginosa elastase acts an elastase inhibitor. II J. Biol. Chem., 1994. 269(36): p. 22726-22731.

12. Kearns D.B., Bonner P.J., Smith D.R., Shimkets L.J. An extracellular matrix-associated zinc metalloprotease is required for dilauroyl phosphatidylethanolamine chemotactic excitation in Myxococcus xanthus. II J. Bacteriol., 2002. 184(6): p. 1678-1684.

13. Miyoshi S., Kawata K., Tomochika K., Shinoda S., Yamamoto S. The C-terminal domain promotes the hemorrhagic damage caused by Vibrio vulnificus metalloprotease. // Toxicon, 2001. 39(12): p. 1883-1886.

14. Miyoshi S., Wakae H., Tomochika K., Shinoda S. Functional domains of a zinc metalloprotease from Vibrio vulnificus. II J. Bacteriol., 1997. 179(23): p. 7606-7609.

15. Miyamoto K., Nukui E., Hirose M., Nagai F., Sato T., Inamori Y., Tsujibo H. A metalloprotease (Mprlll) involved in the chitinolytic system of a marine bacterium, Alteromonas sp. strain 0-7. // Appl. Environ. Microbiol., 2002. 68(11): p. 5563-5570.

16. Wetmore D.R., Wong S.L., Roche R.S. The role of the pro-sequence in the processing and secretion of the thermolysin-like neutral protease from Bacillus cereus. II Mol. Microbiol., 1992. 6(12): p. 1593-1604.

17. Toma S., Campagnoli S., De Gregoriis E., Gianna R., Margarit I., Zamai M., Grandi G. Effect of Glu-143 and His-231 substitutions on the catalytic activity and secretion of Bacillus subtilis neutral protease. // Protein Eng., 1989. 2(5): p. 359-364.

18. Bitar A.P., Cao M., Marquis H. The metalloprotease of Listeria monocytogenes is activated by intramolecular autocatalysis. II J. Bacteriol., 2008. 190(1): p. 107-111.

19. Marie-Claire C., Roques B.P., Beaumont A. Intramolecular processing of prothermolysin. H J. Biol. Chem., 1998. 273(10): p. 5697-5701.

20. Veltman O.R., Vriend G., Hardy F., Mansfeld J., van den Burg B., Venema G., Eijsink V.G. Mutational analysis of a surface area that is critical for the thermal stability of thermolysin-like proteases. // Eur. J. Biochem., 1997. 248(2): p. 433-440.

21. Voordouw G., Milo C., Roche R.S. Role of bound calcium ions in thermostable, proteolytic enzymes. Separation of intrinsic and calcium ion contributions to the kinetic thermal stability. II Biochemistry, 1976. 15(17): p. 3716-3724.

22. Coolbear T., Whittaker J.M., Daniel R.M. The effect of metal ions on the activity and thermostability of the extracellular proteinase from a thermophilic Bacillus, strain EA.l. II Biochem. J., 1992. 287 ( Pt 2): p. 367-374.

23. Corbett R.J., Ahmad F., Roche R.S. Domain unfolding and the stability of thermolysin in guanidine hydrochloride. // Biochem. Cell. Biol., 1986. 64(10): p. 953-961.

24. Hausrath A.C., Matthews B.W. Redetermination and refinement of the complex of benzyl succinic acid with thermolysin and its relation to the complex with carboxypeptidase A. II J. Biol. Chem., 1994. 269(29): p. 18839-18842.

25. Holmes M.A., Tronrud D.E., Matthews B.W. Structural analysis of the inhibition of thermolysin by an active-site-directed irreversible inhibitor. // Biochemistry, 1983. 22(1): p. 236-240.

26. Jin Y., Kim D.H. Inhibition stereochemistry of hydroxamate inhibitors for thermolysin. II Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998. 8(24): p. 3515-3518.

27. Kester W.R., Matthews B.W. Crystallographic study of the binding of dipeptide inhibitors to thermolysin: implications for the mechanism of catalysis. // Biochemistry, 1977. 16(11): p. 2506-2516.

28. Mock W.L., Aksamawati M. Binding to thermolysin of phenolate-containing inhibitors necessitates a revised mechanism of catalysis. // Biochem J., 1994. 302 ( Pt 1): p. 57-68.

29. Matthews B.W. Structural basis of the action of thermolysin and related zinc peptidases. // Acc. Chem. Res., 1988. 21: p. 333-340.

30. Hangauer D.G., Monzingo A.F., Matthews B.W. An interactive computer graphics study of thermolysin-catalyzed peptide cleavage and inhibition by N-carboxymethyl dipeptides. II Biochemistry, 1984. 23(24): p. 5730-5741.

31. Feder J., Lewis C., Jr. Studies on the specificity of Bacillus subtilis neutral protease with insulin B-chain. // Biochem Biophys Res Commun, 1967. 28(3): p. 318-323.

32. Mei H.C., Liaw Y.C., Li Y.C., Wang D.C., Takagi H., Tsai Y.C. Engineering subtilisin YaB: restriction of substrate specificity by the substitution of Glyl24 and Glyl51 with Ala. II Protein Eng., 1998. 11(2): p. 109-117.

33. Bech L.M., Sorensen S.B., Breddam K. Mutational replacements in subtilisin 309. Vail04 has a modulating effect on the P4 substrate preference. // Eur. J. Biochem., 1992. 209(3): p. 869-874.

34. McKay D.B., Thayer M.M., Flaherty K.M., Pley H., Benvegnu D. Crystallographic structures of the elastase of Pseudomonas aeruginosa. II Matrix Suppl., 1992. 1: p. 112-115.

35. Hausrath A.C., Matthews B.W. Thermolysin in the absence of substrate has an open conformation. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2002. 58(Pt 6 Pt 2): p. 1002-1007.

36. Veltman O.R., Eijsink V.G., Vriend G., de Kreij A., Venema G., Van den Burg B. Probing catalytic hinge bending motions in thermolysin-like proteases by glycine—»alanine mutations. II Biochemistry, 1998. 37(15): p. 5305-5311.

37. Monzingo A.F., Matthews B.W. Structure of a mercaptan-thermolysin complex illustrates mode of inhibition of zinc proteases by substrate-analogue mercaptans. // Biochemistry, 1982. 21(14): p. 3390-3394.

38. Bolognesi M.C., Matthews B.W. Binding of the biproduct analog L-benzylsuccinic acid to thermolysin determined by X-ray crystallography. // J. Biol. Chem., 1979. 254(3): p. 634-639.

39. Демидкж И.В., Заволотская M.B., Велишаева H.C., Сафина Д.Р., Костров C.B. Про-зависимый фолдинг микробных протеолитических ферментов. // Мол. ген. Микробиол. Вирусол., 2003. 4(4): с. 11-15.

40. Demidyuk I.V., Gasanov E.V., Safina D.R., Kostrov S.V. Structural Organization of Precursors of Thermolysin-like Proteinases. // Protein J., 2008. 27: p. DOI: 10.1007/s 10930-008-9143-2.

41. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., Brunak S. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. II J. Mol. Biol., 2004. 340(4): p. 783-795.

42. Kyostio S.R., Cramer C.L., Lacy G.H. Erwinia carotovora subsp. carotovora extracellular protease: characterization and nucleotide sequence of the gene. // J. Bacteriol., 1991. 173(20): p. 6537-6546.

43. Kwon Y.T., Lee H.H., Rho H.M. Cloning, sequencing, and expression of a minor protease-encoding gene from Serratia marcescens ATCC21074. // Gene, 1993. 125(1): p. 75-80.

44. Bozhokina E., Khaitlina S., Adam T. Grimelysin, a novel metalloprotease from Serratia grimesii, is similar to ECP32. // Biochem.Biophys. Res. Commun., 2008. 367(4): p. 888-892.

45. Held K.G., LaRock C.N., D'Argenio D.A., Berg C.A., Collins C.M. A metalloprotease secreted by the insect pathogen Photorhabdus luminescens induces melanization. H Appl. Environ. Microbiol., 2007. 73(23): p. 7622-7628.

46. Tang B., Nirasawa S., Kitaoka M., Hayashi K. In vitro stepwise autoprocessing of the proform of pro-aminopeptidase processing protease from Aeromonas caviae T-64. // Biochim. Biophys. Acta., 2002. 1596(1): p. 16-27.

47. Tang B., Nirasawa S., Kitaoka M., Hayashi K. The role of the N-terminal propeptide of the pro-aminopeptidase processing protease: refolding, processing, and enzyme inhibition. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002. 296(1): p. 78-84.

48. Chang A.K., Park J.W., Lee E.H., Lee J.S. The N-terminal propeptide of Vibrio vulnificus extracellular metalloprotease is both an inhibitor and substrate for the enzyme. II J. Bacteriol., 2007. 189(19): p. 6832-6838.

49. Mclver K.S., Kessler E., Ohman D.E. Identification of residues in the Pseudomonas aeruginosa elastase propeptide required for chaperone and secretion activities. II Microbiology, 2004. 150(Pt 12): p. 3969-3977.

50. Zabolotskaya M.V., Demidyuk I.V., Akimkina T.V., Kostrov S.V. A novel neutral protease from Thermoactinomyces species 27a: sequencing of the gene, purification, and characterization of the enzyme. // Protein J., 2004. 23(7): p. 483-492.

51. Hase C.C., Finkelstein R.A. Comparison of the Vibrio cholerae hemagglutinin/protease and the Pseudomonas aeruginosa elastase. // Infect. Immun., 1990. 58(12): p. 4011-4015.

52. Norqvist A., Norrman B., Wolf-Watz H. Identification and characterization of a zinc metalloprotease associated with invasion by the fish pathogen Vibrio anguillarum. II Infect. Immun., 1990. 58(11): p. 3731-3736.

53. Oda K., Okayama K., Okutomi K., Shimada M., Sato R., Takahashi S. A novel alcohol resistant metalloproteinase, vimelysin, from vibrio sp. T1800: purification and characterization. II Biosci. Biotechnol. Biochem., 1996. 60(3): p. 463-467.

54. Nirasawa S., Nakajima Y., Zhang Z.Z., Yoshida M., Hayashi K. Intramolecular chaperone and inhibitor activities of a propeptide from a bacterial zinc aminopeptidase. // Biochem. J., 1999. 341 (Pt 1): p. 25-31.

55. Miyoshi N., Shimizu C., Miyoshi S., Shinoda S. Purification and characterization of Vibrio vulnificus protease. II Microbiol. Immunol., 1987. 31(1): p. 13-25.

56. David V.A., Deutch A.H., Sloma A., Pawlyk D., Ally A., Durham D.R. Cloning, sequencing and expression of the gene encoding the extracellular neutral protease, vibnolysin, of Vibrio proteolytics. // Gene, 1992. 112(1): p. 107-112.

57. Teo J.W., Zhang L.H., Poh C.L. Cloning and characterization of a metalloprotease from Vibrio harveyi strain AP6. // Gene, 2003. 303: p'j 147-156'.' , ' ' f 'ч- ■'li

58. Austin В., Austin D.A., Bacterial fish pathogens: diseases in farmed and wild fish. 1999, London: Springer.

59. Zhang F., Chen J., Chi Z., Wu L.F. Expression and processing of Vibrio anguillarum zinc-metalloprotease in Escherichia' coli. II Arch. Microbiol., 2006. 186(1): p. 11-20.1

60. Staroscik A.M., Denkin S.M., Nelson D.R. Regulation of the Vibrio anguillarum metalloprotease lEmpA by posttranslational modification. II J. Bacteriol., 2005. 187(7): p. 2257-2260.

61. Балабан Н.П., Марданова A.M., Шарипова' 'M.P'., i Габдрахманова JI.A., Соколова Е.А., Руденская'Г.Н.,'Лёщйнская Й. Б.КП о лужение !и 'характеристика тиолзависимой сериновой протеиназы 2 Bacillus intermedins 3-19. II Биохимия, 2004. 69(4): с. 420-426.

62. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J., Molecular cloning. A laboratory manual. 1982, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor.

63. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. II Nature, 1970. 227(5259): p. 680-685.

64. Charney J., Tomarelli R.M. Determination of the proteolytic activity of duodenal juice. II J. Biochem., 1947. 177: p. 501-505.

65. Bredford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dge binding. // Anal. Biochem., 1976. 72(1-2): p. 248-254.

66. Гаспаров C.B., Дактярь В.П. Определение по связыванию с красителем кумасси бриллянтовым голубым G-250. II Биохимия, 1994. 59(6): р. 763-777.

67. Feder J. A spectrophotometry assay for neutral protease. // Biochem Biophys Res Commun, 1968. 32(2): p. 326-332.

68. Inouye K. Effects of salts on thermolysin: activation of hydrolysis and synthesis of N-carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester, and a unique change in the absorption spectrum of thermolysia // J. Biochem. (Tokyo), 1992. 112: p. 335-340.

69. Батаева Д.С. Создание и использование коллагенолитического препарата микробного происхождения для улючшения качества мясных продуктов. Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук. ВНИИМП, 2001.

70. Gobinda S., Sommer S.S. The "megaprimer" mehtod of site-directed mutagenesis. // Biotechniques, 1990. 8(4): p. 404-407.

71. Костенко Ю.Г., Спицина Д.Н., Батаева Д.С., Костров С.В., Носовская Е.А., Штамм Serratia proteamaculans 94 продуцент коллагеназы. // 2001. Пат. Россия No 2175350.

72. O'Donohue M.J., Roques В.Р., Beaumont A. Cloning and expression in Bacillus subtilis of the npr gene from Bacillus thermoproteolyticus Rokko coding for the thermostable metalloprotease thermolysin. // Biochem J., 1994. 300 ( Pt 2): p. 599-603.

73. Jongeneel C.V., Bouvier J., Bairoch A. A unique signature identifies a family of zinc-dependent metallopeptidases. // FEBSLett., 1989. 242(2): p. 211-214.

74. Антонов B.K., Химия протеолиза. 1991, Москва: Наука.

75. Novagen, рЕТsystem manual. 2002.

76. Sohoni S.S., Joshi P.N. Isolation end characterization of a protease from Bacillus subtilis. II Indian J. Biochem. Biophys., 1982. 19(6): p. 399-402.

77. Amersham pharmacia biotech AB. Protein purification. Handbook. 1999.

78. Feder J., Keay L., Garrett L.R., Cirulis N. Moseley M.H., Wildi B.S. Bacillus cereus neutral protease. // Biochim Biophys Acta, 1971. 251(1): p. 74-78.

79. Шагинян K.A., Изотова JI.C., Йомантас В., Строгин А.Я., Степанов В.М. Металлопротеиназа из Bacillus subtilis внеклеочный и внутриклеточный ферменты. II Биохимия, 1980. 45(11): с. 2083-2095.

80. Паберит II., Панк М.С., Лийдере М.А., Ванаталу К.П. Очистка и свойства нейтральной металлопротеиназы из термофильной бактерии Bacillus brevis. II Биохимия, 1984. 49(2): с. 275-284.

81. Silder W., Kumpf В., Peterhaus В., Zuber Н. A neutral proteinase produced by Bacillus cereus with hith sequence homology to thermolysin: production, isolation and characterization. // Appl. Microbiol, and Biotechnol., 1986. 25(1): p. 18-24.

82. Морозова И.П., Честухина Г.Г., Борматова М.Е., Гололобов М., Иванова Н.М., Лысогорская Е.Н., Филиппова И., Ходова О.М., Тимохина Е.А. Выделение и характеристика металлопротеиназы из Bacillus megaterium. II Биохимия, 1993. 58(6): с. 896-907.

83. Чумаков В.Н., Азимова М.И., Зайцев Д.А., Габриэлян А.Э., Костров С.В. Анализ структурных основ термостабильности секреторных металлопротеиназ на модели химерных ферментов. // Молекулярная биология, 1995.29(5): р. 992-1000.

84. Toma S., Campagnoli S., Margarit I., Gianna R., Grandi G., Bolognesi M., De Filippis V., Fontana A. Grafting of a calcium-binding loop of thermolysin to Bacillus subtilis neutral protease. // Biochemistry, 1991. 30(1): p. 97-106.

85. Dahlquist F.W., Long J.W., Bigbee W.L. Role of Calcium in the thermal stability of thermolysin. II Biochemistry, 1976. 15(5): p. 1103-1111.

86. Khan S.M., Darnall D.W. The hydrolysis of 3-(2-furylacryloyl)-glycyl-l-leucine amide by thermolysin. II Anal Biochem., 1978. 86(1): p. 332-336.