Пространственно-временная организация транскрипции перицентромерной тандемно повторяющейся ДНК в позднем оогенезе человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Добрынин Михаил Алексеевич

• Добрынин Михаил Алексеевич
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Добрынин Михаил Алексеевич

Список сокращений

Введение

Актуальность работы

Цели и задачи исследования

Основные положения, выносимые на защиту

Научная новизна работы

Теоретическая и практическая значимость исследования

Апробация работы

Личный вклад автора

Финансовая поддержка диссертации

Объем и структура диссертации

Список публикаций по теме работы

1 Обзор литературы

1.1 Организация генома эукариот. Конститутивный гетерохроматин

1.2 Тандемно повторяющаяся ДНК человека

1.2.1 Основные принципы организации тандемно повторяющейся ДНК человека

1.2.1.1 Альфоидная ДНК

1.2.1.2 «Классические» пцтпДНК человека

1.3 Функции сателлитных ДНК

1.3.1 Транскрипция пцтпДНК

1.3.2 Транскрипция пцтпДНК у человека

1.3.2.1 Роль транскриптов центромерной сатДНК в формировании центромера и конститутивного ГХ

1.3.2.2 Транскрипция пцтпДНК в соматических клетках

1.3.2.3 Транскрипция пцтпДНК в пролиферирующих и стареющих клетках

1.3.2.4 Транскрипция пцтпДНК при клеточном стрессе

1.3.2.5 Транскрипция пцтпДНК при канцерогенезе

1.4 Организация ГХ в позднем оогенезе и раннем эмбриогенезе

млекопитающих

1.4.1 Стадии фолликулогенеза

1.4.2 Транскрипция пцтпДНК в оогенезе и эмбриогенезе млекопитающих

1.5 Участие транскриптов пцтпДНК HS2 в процессах фазового перехода

1.5.1 Общая характеристика биоконденсатов

1.5.2 Зародышевые гранулы

1.5.3 Тела Бальбиани

2 Материалы и методы

2.1 Этическое одобрение

2.2 Материалы

2.2.1 Лимфоциты, стимулированные фитогемагглютинином

2.2.2 Преовуляторные ооциты человека

2.2.3 Олигонуклеотиды

2.3 Методы

2.3.1 Флуоресцентная гибридизация in situ

2.3.1.1 ДНК-ДНК FISH

2.3.1.2 ДНК-РНК FISH

2.3.1.3 Иммуно-FISH

2.3.2 Двойное иммуноцитохимическое окрашивание

2.3.3 Проверка способности 2^'Met- антисмысловых олигонуклеотидов при инактивировать транскрипцию HS2

2.3.3.1 Индукция транскрипции HS2 в фибробластах человека тепловым шоком

2.3.3.2 Трансфекция клеток фибробластов человека после теплового шока

2.3.4 Микроиньекции

2.3.5 Микроскопирование

2.3.6 Обработка данных конфокальной микроскопии

2.3.7 Выделение тотальной РНК и ПЦР в реальном времени

2.3.8 Биоинформатический анализ транскриптома преовуляторных ооцитов

2.3.9 Огатистический анализ

3 Результаты

3.1 Поиск последовательностей перицентромерной тандемно повторяющейся ДНК ИБ2 в транскриптомах поздних ооцитов человека

3.2 Локализация перицентромерных ТП ДНК ИБ2

3.3 Локализация транскриптов перицентромерных ТП ДНК ИБ2 в ооцитах относительно РНК-хеликаз DDX5 и DDX4 и митохондрий

3.4 Транскрипция ТП ДНК ИБ2 в преовуляторных ооцитах человека идет как с АТТОО, так и с GGAAT участков ИБ2 в геноме

3.5 Сравнительная количественная оценка транскрипции ИБ2 в ооцитах человека и клетках кумулюса

3.6 Инактивации транскрипции ИБ2 2-О'Met антисмысловыми-олигонуклеотидами

3.6.1 Отработка метода инактивации транскрипции Ж2 2-О'Met антисмысловыми-олигонуклеотидами

3.6.2 Инактивация транскрипции ТП ДНК Ж2 путем микроинъекций олигонуклеотидов

4 Обсуждение

4.1 Транскрипция пцтпДНК ИБ2 в позднем оогенезе

4.2 Транскрипция О- и С-богатых участков пцтп ДНК

4.3 Роль пцтп ДНК в сборке безмембранных включений

4.3.1 Безмембранные РНП включения ассоциированные с митохондриями в поздних ооцитах человека

4.3.2 Инактивация транскрипции пцтпДНК Ж2 в позднем оогенезе человека

4.3.3 Возможная клиническая значимость полученных результатов

5 Выводы

6 Список литературы

7 Благодарности

Список сокращений

АТ - антитела

ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии

дцРНК - двухцепочечные РНК

(Гн-РГ) - гонадотропин-рилизинг-гормоны

ГЭР - гладкий ЭР

ЗГ - зародышевые гранулы

ЗП - зародышевая плазма

ЛГ - лютеинизирующий гормон

миРНК - малые интерферирующие РНК

МаСат - мажорная сателлитная ДНК мыши

МиСат - минорная сателлитная ДНК мыши

нкДНК - некодирующая ДНК

сатДНК- сателлитная ДНК

пцтпДНК - перицентромерная тандемно повторяющаяся ДНК

ГХ- гетерохроматин

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЯ - проядрышки

РТ-ПЦР- полимеразная цепная реакция в реальном времени ФСГ- фолликулостимулирующий гормон ЭСК - эмбриональные стволовые клетки ЯСТ - Ядерные стресс тельца

ЯПТ -ядрышкоподобное тело

CENP-A (Centromere Protein A) - центромерный белок B CENP-B (Centromere Protein B) - центромерный белок B CENP-C (Centromere Protein С) - центромерный белок C CH (chromosomal heteromorphisms) - хромосомные гетероморфизмы CPLs (cytoplasmic lattices) - белки цитоплазматических решеток CPC - Chromosomal passenger complex

DAPI (4, 6-diamidinophenylindole) - 4, 6-диамидофенилиндол

IDR (intrinsically disordered domains) - внутренне неупорядоченные домены

GG (germ granules) - «зародышевые гранулы»

hnRNPs (heterogeneous nuclear ribonucleoproteins) - гетерогенные ядерные рибонуклеопротеиды

KMT (Histone lysine methyltransferase) - гистоновая лизин-метилтрансфераза LCD (low-complexity disordered domains) - неупорядоченные домены низкой сложности

LLPS (liquid-liquid phase separation) - фазовый переход «жидкость-жидкость»

LNA (locked nucleic acid) - замкнутая нуклеиновая кислота

lncRNA (long non-coding RNA) - длинные некодирующих РНК

MEF (mouse embryonic fibroblasts) -мышиные эмбриональные фибробласты

MITE Elements (Miniature Transposable Elements with inverted repetitions)

Элементы MITE типа, неавтономные мобильные элементы II класса (ДНК-

транспозоны)

MVH (Mouse Vasa Homologue) -гомолог VASA у мыши

NLB (nucleolus-like bodies) - ядрышкоподобные тела

NSB (nulear stress bodies) - ядерные стресс тельца

NSN (non surrounded nucleolus) - неокруженное ядрышко

pSN (partly surrounded nucleolus) - частично окруженное ядрышко

SN (surrounded nucleolus) - окруженное ядрышко

HP1 - гетерохроматиновый белок

HDAC (histone deacetyltransferase) - гистоновые деацетилазы

HAT(histone acetyltransferase)- гистоновые ацетилтрансферазы

HSF(heat shock factor) - фактор теплового шока

siRNA (small interference RNA) - малые интерфирирующие РНК

HMT (histone methyltransferase) - гистоновая метилтрансфераза

PrLD (prion-like domains) - прионоподобные домены

RBD (RNA-binding domains) - РНК-связывающие домены

RRM (RNA recognition motif) - мотив распознавания свернутой РНК

TERT (Telomerase reverse transcriptase) - теломеразная обратная

транскриптаза

TFF (total fertilization failure) - полная неудача оплодотворения RNP (ribonucleoproteins) -рибонуклеопротеиновые комплексы RITC (RNA-induced silencing complex) - РНК-индуцирующий комплекс выключения гена

RDRC (RNA-directed RNA complex) - РНК-зависимый РНК полимеразный комплекс

ORFs (open reading frames) - открытые рамки считывания

PTMS (post-translational modifications) - посттрансляционные модификации

PN (pronucleus) - пронуклеусы

FISH (Fluorescence in situ hybridization) - флуоресцентная in situ гибридизация

HS1, HS2, HS3 (human satellite 1, 2, 3) - «классические» сателлиты человека 1, 2,

GV (germinal vesicle) - стадия зародышевого пузырька

GVBD (germinal vesicle breakdown) - стадия разрушения зародышевого

пузырька

MI (metaphase I meiosis) - стадия метафазы I деления мейоза STR (short tandem repeats) короткие тандемные повторы VNTR (variable numbers of tandem repeats) - тандемные повторы с переменным количеством

SAFB (Scaffold attachment factor B) - фактор прикрепления скэффолда B SAHF senescence-associated heterochromatin foci - очаги гетерохроматина, связанные со старением

SCMC (subcortical maternal complex) - подкорковый материнский комплекс ооцитов

SRSF (SR splicing factors) - богатые серином и аргинином (SR) факторы сплайсинга пре-мРНК

SSRE (small scale repetitive elements) - мелкомасштабные повторяющиеся элементы

TonEBP (Tonicity-responsive enhancer binding protein) - белок связывающий энхансер, реагирующий на тонус

WGS (whole genome sequencing) - полногеномное секвенирование ZGA (zygotic genome activation) - зиготическая активации генома

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пространственно-временная организация транскрипции перицентромерной тандемно повторяющейся ДНК в позднем оогенезе человека»

Актуальность работы

Долгое время считалось, что некодирующая ДНК (нкДНК) - это сопутствующая или «мусорная» ДНК, которая не обладает важными биологическими функциями. Большую часть нкДНК представляют повторяющиеся последовательности, которые могут быть разделены на две группы: рассеяные по геному, или диспергированные повторы и тандемные повторы.

Тандемно повторяющаяся нкДНК обычно классифицируется по размеру кластера повторяющейся единицы и размеру мономера на «большие» сателлиты, минисателлиты и микросателлиты или короткие тандемные повторы (short tandem repeats, STR) [1]. У человека перицентромерная тандемноповторяющаяся ДНК (пцтпДНК) представлена, в основном, «большими» или «классическими» сателлитами - сателлитами человека 1, 2, 3 (human satellite 1,2,3 - HS1, HS2, HS3), которые представлены последовательностями из мономеров 5-15 нуклеотидов и образуют достаточно протяженные «поля», содержащие более 50 мономеров [2-4].

В конце прошлого века появились первые данные о функциях пцтпДНК. Подобные последовательности ДНК часто выполняют структурные функции в геноме [5]. Долгое время не было данных, о том транскрибируется ли пцтпДНК. Однако к началу XXI века была выявлена

транскрипция пцтпДНК у птиц [6-8], у мышей [9-11], у земноводных [12], у человека [13-15].

У эмбрионов мыши и человека транскрипция перицентромерных сателлитов была продемонстрирована на стадиях 2- и 4-клеток [11,16]. Следующие всплески транскрипции пцтпДНК наблюдаются на стадии бластулы и при начале органогенеза [16-22]. Однако функциональное значение транскрипции в ходе эмбриогенеза установлено только у мышей, у которых перицентромерные сателлитные транскрипты участвуют в формировании участков ассоциации гетерохроматина — хромоцентров. Блокирование транскрипции приводит к нарушению образования хромоцентров и остановке развития эмбрионов на стадии 2-4 клеток [11,23]. При этом до последнего времени считалось, что вся повторяющаяся ДНК транскрибируется в эмбриогенезе, но не в половых клетках. После анализа транскриптомов ооцитов некоторых млекопитающих это предположение было пересмотрено [24]. Также транскрипция пцтпДНК была обнаружена на хромосомах ламповых щеток ооцитов у амфибий и птиц [8]. Подобных исследований транскрипции пцтпДНК в оогенезе млекопитающих ранее не проводилось, хотя известно, что зрелый ооцит является носителем большого запаса материнских белков и РНК, которые используются эмбрионом до активации собственного генома. Выявлено, что транскрипты пцтпДНК, в малых количествах, присутствуют в эмбрионах до зиготической активации [11].

Хромосомная специфичность и изменчивость хромосом, наряду с тандемной организацией сателлитных ДНК, усложняли функциональные и биоинформатные исследования транскрипции пцтпДНК. Благодаря созданию полной теломер-теломерной сборки генома человека (telomere-to-telomere assembly, T2T-CHM13) появилась возможность выявить организацию и закономерности эволюции этих пцтпДНК, а также провести аннотацию многих из них [25]. Помимо сборки генома T2T-CHM13, опубликованные транскриптомы различных стадий оогенеза также облегчают исследование роли транскриптов пцтпДНК в гамето- и эмбриогенезе [26-28]. Таким образом, совершенствование технологий секвенирования и биоинформатной обработки данных позволило получить новые данные in silico о транскрипции пцтпДНК. Однако такие данные нуждаются в проверке экспериментальными методами in vivo и in vitro.

Исследования оогенеза человека in vitro и in vivo ранее были сопряжены с методическими трудностями. В результате развития вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) для исследований стали доступны ооциты человека стадии GV, стадии разрушения зародышевого пузырька (germinal vesicle breakdown, GVBD) и стадии MI. Эти ооциты в большинстве случаев не имеют аномалий и сохраняют способность к спонтанному дозреванию без использования дополнительных обработок [29,30]. Данные клетки не используются в программах ЭКО, так как

подобные технологии до сих пор экономически нецелесообразны для клиник ВРТ в случае донорских программ.

Таким образом, в настоящее время стало возможным исследовать поздний оогенез человека, сочетая методы биоинформатики и экспериментальной биологии. Период активной транскрипции в ооцитах завершается к GV стадии, в то время как активация эмбрионального генома приходится на позднюю 4-8 клеточную стадию развития эмбриона человека [31-33]. В перерыве между материнской и эмбриональной геномной активностью важную роль играет посттранскрипционный контроль.

На сегодняшний день цитоплазматические компартменты, которые бы были связаны с регуляцией локализации и стабильности депонированных РНК выявлены только в раннем оогенезе человека. Обнаружены уникальные перинуклеолярно локализованные РНП структуры, являющиеся подвидом «зародышевых гранул» (ЗГ) (germ granules, GG), которые обозначаются термином nuage (фр. облако) [34]. Nuage, как и другие ЗГ, формируются при помощи процессов фазового перехода, когда белки, содержащих мультивалентные домены, образуют биоконденсаты-капли жидкости, чье содержимое изолируется от прочего содержимого клетки [35-38]. Известно, что nuage содержат РНК-хеликазы и различные некодирующие транскрипты и часто расположены вблизи митохондрий [39-42]. Биоконденсаты могут играть решающую роль в процессах посттрансляционой регуляции и завершении мейоза и созревания ооцита. Известно, что транскрипты

некодирующих ДНК играют важную роль в образовании подобных биоконденсатов [37]. Данные о составе и локализации РНП-биоконденатов могут дать уникальную возможность для понимания фундаментальных клеточных механизмов регуляции макромолекулярных взаимодействий, в частности в момент завершения мейоза и созревании ооцитов, а также влияния процессов позднего оогенеза на последующий эмбриогенез.

Цели и задачи исследования

Цель работы: определение пространственно-временной организации транскрипции перицентромерной тандемно повторяющейся ДНК в позднем оогенезе человека. Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Провести биоинформатический анализ транскриптомов полученных от здоровых доноров с целью выявления транскриптов перицентромерной тандемно повторяющейся ДНК HS2 в позднем оогенезе человека.

2. Проверить наличие выявленных in silico транскриптов перицентромерной тандемно повторяющейся ДНК HS2 в позднем оогенезе человека с помощью ПЦР в режиме реального времени

3. Изучить локализацию пцтп РНК HS2 в позднем оогенезе человека с помощью FISH

4. Оценить возможность транскрипции ATTCC и GGAAT участков перицентромерной тандемно повторяющейся ДНК HS2.

5. Исследовать локализацию РНК ИБ2 в позднем оогенезе человека относительно компонентов безмембранных РНП включений, содержащих РНК-хеликазы DDX5 и DDX4, ассоциированных с митохондриями, с помощью методов иммуноцитохимии.

6. Оценить влияние инактивации транскрипции перицентромерной тандемно повторяющейся ДНК ИБ2 в позднем оогенезе человека на формирование РНП включений в ооплазме.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В преовуляторных ооцитах человека присутствуют полиаденилированные транскрипты перицентромерной тандемно повторяющейся ДНК ИБ2, транскрибированные с ATTCC- и GGAAT-богатых участков

2. РНК ИБ2 в позднем оогенезе локализованы в составе РНП структур, расположенных вблизи митохондрий.

3. Инактивация транскрипции перицентромерной тандемно повторяющейся ДНК ИБ2 в позднем оогенезе человека приводит к уменьшению количества РНК ИБ2 и к диссоциации РНП-структур.

Научная новизна работы

Впервые в опубликованных транскриптомах GV и МП ооцитов человека обнаружены 4 полиаденилированных транскрипта пцтпДНК ИБ2. В

транскриптомах GV и MII ооцитов, полученных от одного донора, впервые выявлено увеличение количества копий транскриптов пцтпДНК HS2 в MII ооцитах по сравнению с GV ооцитами, тогда как содержание транскриптов HS2 в GV ооцитах выше, чем в кумулюсных клетках. Показано, что в ооците присутствует РНК HS2, транскрибированная как с ATTCC, так и с GGAAT участков HS2 в геноме. РНК HS2 локализованы в составе безмембранных РНП-структур, содержащих РНК-хеликазы DDX5 и ББХ4,ассоциированных с митохондриями. Впервые выявлено, что инактивация транскрипции пцтпДНК HS2 в позднем оогенезе человека приводит к достоверному уменьшению количества сигналов соответствующих РНК HS2 после FISH и к диссоциации РНП-структур.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Исследования роли пцтпДНК и ее транскриптов в эмбриогенезе и оогенезе человека идут медленнее, чем у прочих организмов. Это связано с этическими и методическими сложностями. Данные о роли пцтпДНК и ее транскриптов в оогенезе человека могут дать уникальную возможность для понимания фундаментальных клеточных механизмов созревания ооцитов и роли пцтпДНК в этих процессах, а также влиянии процессов позднего оогенеза на последующий эмбриогенез.

Кроме того, полученные данные о транскрипции пцтпДНК, о регуляции этой транскрипции и функциях транскриптов могут быть использованы для оптимизации протоколов программ ВРТ. Наблюдение

динамики РНП-структур, видимых на световом уровне, может использоваться для разработки систем для оценки качества донорских ооцитов при отработке методов ВРТ. Также разрабатываются идеи о поиске диагностических маркеров для раннего выявления предрасположенности к остановке созревания или возникновению патологических синдромов, в том числе связанных с проблемами оплодотворения, на основе наблюдение динамики РНП-структур, содержащих транскрипты HS2 пцтпДНК и РНК-хеликаз DDX5 и DDX4.

Материалы диссертации используются в курсах лекций для бакалавров и магистров Биологического факультета СПбГУ и могут быть использованы в общих и специальных курсах лекций биологических факультетов других университетов.

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены и обсуждены на: Международной конференции CTERP INTERNATIONAL CONFERENCE -2018. (Москва, 2018).

Конференции молодых ученых "Актуальные проблемы биологии развития".(Москва, 2021)

Международной конференции 26th Wilhelm Bernhard Workshop on the Cell Nucleus (Дижон, Франция, 2019)

XXVIII Международной конференции Российской Ассоциации Репродукции Человека (РАРЧ) «Репродуктивные технологии сегодня и завтра». (Уфа, 2018).

XXIX Международной конференции Российской Ассоциации Репродукции Человека (РАРЧ) «Репродуктивные технологии сегодня и завтра». (Ростов-на-Дону, 2019).

Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ-2019». (Москва, 2019).

Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ-2021». (Москва, 2021)

Международной конференции Европейского общества репродукции человека и эмбриологии. European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE) 36th Annual Meeting (2020).

Международной конференции Европейского общества репродукции человека и эмбриологии. European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE) 38th Annual Meeting (Milan, Italy, 2022).

Всероссийском симпозиуме с международным участием "СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ КЛЕТОЧНОГО ЯДРА". (Санкт-Петербург, 2018). Всероссийской конференции с международным участием "StemCellBio-2018: Фундаментальная наука как основа трансляционной медицины". (Санкт-Петербург, 2018).

Всероссийской конференции с международным участием "Актуальные проблемы клеточной биологии и клеточных технологий". (Санкт-Петербург, 2019).

VI Молодёжной конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН. (Санкт-Петербург, 2018)

VII Молодёжной школе-конференции по молекулярной и клеточной биологии Института Цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2020).

Личный вклад автора

Основные результаты работы получены автором лично. Автор провел: анализ литературы по теме работы, получение основной части результатов. Планирование экспериментов, написание статей и подготовка докладов на конференциях было выполнено под руководством к.б.н. Н.И. Енукашвили. Для отработки методов иммунофлуоресции и FISH на ооцитах, автором были лично получены ооциты и зиготы мыши с помощью гормональной суперстимуляции овуляции путем вымывания клеток из яйцеводов. Медицинские манипуляции, необходимые для получения GV, GVBD и MI ооцитов, были выполнены коллективом клиник ВРТ «Ава-Петер» при содействии Н.М. Корчагиной. Автор самостоятельно провел все этапы фиксации ооцитов и иммунофлюоресцентного окрашивания и все этапы подготовки и проведения ДНК-ДНК и иммуно-ДНК-РНК FISH на ооцитах мыши и человека. Также автор лично проводил исследование полученных препаратов с помощью светового, флуоресцентного и лазерного

конфокального микроскопа и последующую обработку результатов, включая количественный анализ изображений.

Выделение тотальной РНК из ооцитов человека и проведение РТ-ПЦР было проведено автором лично.

Биоинформатический анализ опубликованных транскриптомов GV и MII ооцитов был выполнен совместно с А.Д. Пржибельским и Д. Д. Шафранской.

Работы по разработке дизайна вариантов 2-O'Met антисмысловых олигонуклеотидов к последовательности РНК HS2 были проведены совместно с Н.В. Пономарцевым и Н.И. Енукашвили. Процедуры по культивированию клеток фибробластов человека (HFL) и их трансфекции липофектамином 2000 для проверки работоспособности олигонуклеотидов были проведены автором лично.

Отработка и проведение микроинъекций олигонуклеотидов в ооциты человека были проведены совместно с Н.М. Корчагиной. Исследование как живых ооцитов, так и фиксированных препаратов ооцитов после микроинъекций с помощью световой и конфокальной микроскопии и последующая статистическая обработка данных была выполнена автором лично.

Финансовая поддержка диссертации

Работа была выполнена на средства грантов: РФФИ 18-34-00279 мол_а, РНФ 19-74-20102, грант Министерства науки и высшего образования

Российской Федерации (Соглашение №075-15-2021-1075 от 28.09.2021), грант Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Соглашение №075-15-2021-1063 от 28.09.2021).

Объем и структура диссертации

Диссертация содержит разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы», «Благодарности», изложена на 210 страницах и проиллюстрирована 23 рисунками и 4 таблицами.

Список публикаций по теме работы

По теме диссертации опубликовано 22 работы, из них 6— статьи, 12 тезисы. Статьи:

1. Dobrynin, M.A.; Bashendjieva, E.O.; Enukashvily, N.I. Germ granules in animal oogenesis. J. Dev. Biol. 2022, 10, 43. https://doi.org/10.3390/jdb10040043

2. M. A. Dobrynin, N. M. Korchagina, N. V. Ponomartsev, O. I. Podgornaya, and N. I. Enukashvily. Influence of inactivation of tandemly repeated pericentromeric DNA transcription on the formation of membraneless structures at the end of oocyte maturation. 2022. Russian Journal of

Developmental Biology. Vol. 53, No. 2, pp. 128-133. DOI: 10.1134/S1062360422020059

3. M. A. Dobrynin, N. M. Korchagina, A. D. Prjibelski, D. Shafranskaya, D. I. Ostromyshenskii, K. Shunkina, I. Stepanova, A. V. Kotova, O. I. Podgornaya & N. I. Enukashvily. 2020. Human pericentromeric tandemly repeated DNA is transcribed at the end of oocyte maturation and is involved in the formation of membraneless mitochondria-associated structures. Sci.Rep. 10:19634 D0I:10.1038/s41598-020-76628-8

4. Enukashvily N.I., Dobrynin M.A., Chubar A.V. 2021. RNA-seeded membraneless bodies: Role of tandemly repeated RNA. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. Academic Press., V. 126, P. 151-193. https://doi.org/10.1016/bs.apcsb.2020.12.007

5. М.А. Добрынин, Н.И. Енукашвили. 2020. Зародышевые гранулы ооцитов. Цитология. 62 (12): 1-15. DOI: 10.31857/S0041377120120020 ISSN 00413771

6. М.А. Добрынин, А.С. Калугина, Г.Н. Почукалина, Н.М. Корчагина, Н.И. Енукашвили. 2018. Локализация белков TRF2 и DDX5 в ооцитах человека.

Цитология. 60 (11): 947-950 DOI: 10.1134/S0041377118110196. ISSN 00413771

Тезисы:

M.A. Dobrynin, N.M. Korchagina, N.V. Ponomartsev, O.I. Podgornaya, N.I. Enukashvily. Influence of tandemly repetitive pericentromeric DNA transcripts inactivation on the formation of membraneless RNP structures at the end of human oocytes maturation. 2022. Human Reproduction. V.37 P. i437. Suppl.1, Meeting Abstract: P-531, Abstract citation: ID: deac107.489

М.А. Добрынин, Н.М. Корчагина, О.И. Подгорная, Н.И. Енукашвили. 2021. Влияние инактивации транскрипции тандемно повторяющейся перицентромерной ДНК на формирование безмембранных структур в созревающих ооцитах человека. Материалы Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы биологии развития», 12-14 октября 2021 г., Москва, ИБР РАН. — М. Издательство Перо. ISBN 978-5-00189-552-7. http://idbras.ru/conf2021/materials.pdf

Добрынин М.А., Корчагина Н.М., Н.И. Енукашвили. 2021. Тандемно повторяющаяся перицентромерная ДНК человека транскрибируется в созревающих ооцитах человека и связана с безмембранными структурами.

Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2021» М.: МАКС Пресс, ISBN 978-5-317-06593-5

М.А. Добрынин, Н.М. Корчагина, А.Д. Пржибельский, Д. Шафранская, Н.И. Енукашвили. 2020. Транскрипты тандемноповторяющейся днк участвуют в формировании безмембранных, ассоциированных с митохондриями структур в преовуляторных ооцитах человека. Гены & Клетки Том XV, № 3, 87-88. ISSN 2313-1829

Dobrynin, M.; Prjibelski, A.; Korchagina, N.; Shafranskaya, D.; Enukashvily, N. Transcription of human pericentromeric non-coding DNA at the end of human oocyte maturation. 2020 Human Reproduction. V.35 P. I385-I385 Suppl.1, Meeting Abstract: P-539

М.А. Добрынин, Н.М. Корчагина, О.И. Подгорная, Н.И. Енукашвили*. распределение транскриптов сателлита 3 и РНК-хеликазы DDX5 в преовуляторных ооцитах человека. 2019. Гены & Клетки XIV, № 3, 101-102.ISSN 2313-1829

M. A. Dobrynin, A. S. Kalugina, N. M. Korchagina, A. Prjibelski, O. I. Podgornaya, N. I. Enukashvily*. Transcription of pericentromeric tandemly

repeated DNA transcripts in human preovulatory oocytes. Biopolymers and Cell, vol. 35, N3, pp. 207-208. doi:10.7124/bc.0009DB. ISSN 0233-7657

M.A. Dobrynin*, A.S. Kalugina, N.M. Korchagina, N.E. Enukashvily. Distribution of a tandem repeats binding protein DDX 5 (RNA-helicase p68), in oogenesis and early embry ogenesis in mouse. Ontogenesis, vol. 49, app. 4, pp. 9. DOI:10.1134/S0475145018010081 ISSN 0475-1450

Добрынин М.А., Ю.Е. Гладышева, Н.И. Енукашвили. 2019. Распределение транскриптов прицентромерной тандемно повторяющейся ДНК и белков-регуляторов в преовуляторных ооцитах человека. Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2019» [Электронный ресурс]. - М: МАКС Пресс, 2019.ISBN 978-5-317-06100-5

М.А. Добрынин, А.С. Калугина, Г.Н. Почукалина, Н.М. Корчагина, Н.И. Енукашвили. 2018. Распределение DDX 5 (РНК-хеликазы p68), связывающей тандемные повторы, в оогенезе человека и мыши. © Материалы VI Молодёжная конференция по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 25-27 апреля 2018 года) Стр. 35-36.

М.А. Добрынин, А.С. Калугина, Н.М. Корчагина, О.И. Подгорная, Н.И. Енукашвили. Цитоплазматические образования, схожие с nuage, в преовуляторных ооцитах человека. Сборник материалов XXIX международной конференции РАРЧ "Репродуктивные технологии сегодня и завтра" (7-8 сентября, Ростов-на-Дону, 2019). стр. 52-53.

М.А. Добрынин, А.С. Калугина, Н.М. Корчагина, О.И. Подгорная, Н.И. Енукашвили. Некодирующие последовательности тандемно повторяющейся днк и белки, с ними связанные, в оогенезе человека. Сборник тезисов XXVIII ежегодной международной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Уфа, 5-8 сентября 2018).стр. 22-23.

1 Обзор литературы

1.1 Организация генома эукариот. Конститутивный гетерохроматин

Хейц в 1928 г, исследуя ядрах печеночных мхов с помощью окраски клеток карминовой кислотой, впервые предложил термин гетерохроматин (ГХ) для части хроматина, который в течение всего клеточного цикла находится в конденсированном состоянии [43]. Хроматин, который был неплотно упакован в интерфазе, он в свою очередь назвал эухроматином.

Позже была выявлена гетерогенность ГХ у D.melanogaster, который стали подразделять на факультативный, образующийся, когда нужно инактивировать гены на длительный период, и конститутивный, который остается конденсированным в течение всей жизни организма [44]. Открытие ГХ-ассоциированных белков, которые путем модификации гистонов устанавливают «гистоновый код», необходимый для эпигенетического контроля сборки ГХ, позволило выделить новые типы ГХ [45]. Был выявлен ГХ, которые маркировался белками группы Ро1усотЬ (PcG) и метилированием лизина 27 гистона Н3 (Н3К27). Этот ГХ образовывал большие непрерывные домены, которые в первую очередь регулировали гены с функциями развития [46]. Второй выделенный тип ГХ маркировался гетерохроматиновым белком 1 (НР1) и несколькими ассоциированными белками в сочетании с метилированием по Н3К9. Этот тип гетерохроматина мог охватывать большие геномные сегменты, особенно вокруг центромер. Репортерные гены, интегрированные в НР1-ассоциированный ГХ или рядом

с ним, были склонны к репрессии транскрипции, хотя многие гены, которые связаны с HP1, являются транскрипционно активными [47]. Прямое сравнение полногеномных карт связывания показало, что PcG и HP1 типы ГХ не перекрывались [48].

В настоящее время, опираясь на локализацию комбинаций хроматин-ассоциированных белков, было предложено выделять 5 видов хроматина у D. melanogaster, обозначенных различными цветами [49]. Зеленый хроматин соответствует классическому конститутивному гетерохроматину, который маркируется SU(VAR)3-9 и HP1 и богат H3K9me2 метками.

Синий хроматин соответствует хроматину PcG, о чем свидетельствует интенсивное связывание белков PcG. Этот тип хроматина хорошо выявлялся в известных локусах-мишенях PcG, таких как кластеры Hox генов и был насышен гистоновыми метками H3K27me3 [46,49]

Черный хроматин покрывает 48% генома и является наиболее распространенным типом хроматина, в котором локализовано большинство молчащих генов. При этом классические маркеры гетерохроматина в нем отсутствуют. Черный хроматин характеризуется отсутствием активных гистоновых меток H3K4me2 и H3K79me3 и более высоким содержанием гистона H1, белками D1 (AT-hook protein) и SUUR (Suppressor of Underreplication) [49]. Гены в черном хроматине могут стать активными, хотя их экспрессия, как правило, ограничена только несколькими тканям [50].

Желтый и красный хроматин — два разных типа эухроматина. В отличие от черного и синего хроматина, красный и желтый хроматин имеют признаки транскрипционно активного эухроматина. Большинство генов этих двух типов хроматина продуцируют значительное количество мРНК, а уровни РНК-полимеразы, H3K4me2 и H3K79me3 обычно высоки, тогда как уровни H3K9me2 и H3K27me3 низкие [49].

Ряд белков входит в состав, как красного, так и желтого хроматина. Среди них HDAC RPD3 и SIR2 [49]. Помимо сходства, между красным и желтым хроматином существуют и различия. Красный хроматин содержит несколько белков, которые, в основном, отсутствуют в четырех других типах хроматина. Среди них нуклеосом-ремоделирующая АТФаза Brahma (BRM); регулятор структуры хромосом SU(VAR)2-10; медиаторная субъединица MED31; субъединица CAF1 55 кДа, присутствующая в различных гистон-модифицирующих комплексах [51,52]. Кроме того выявлено, что оба типа хроматина обычно реплицируется рано в S фазе, однако красный хроматин имеет тенденцию реплицироваться даже раньше, чем желтый хроматин [49].

В тоже время, в литературе сохраняется разделение хроматина на конститутивный и факультативный ГХ и эухроматин. Хотя в некоторых работах также предлагается выделять третий специализированный тип хроматина, который присутствует в центромерах, где канонический гистон H3 заменен его вариантом CENP-A, что является необходимым для формирования кинетохора [53].

Конститутивный ГХ формируется преимущественно из последовательностей пцтпДНК [54]. Конститутивный ГХ включает в себя центромерные, перицентромерные и субтеломерные районы хромосом и зоны окружающие области ядрышкового организатора (ЯОР), причем подобная локализация выявляется у организмов от делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe до дрозофилы и человека [55]. Образование же факультативного гетерохроматина регулируется в ходе развития [56-58].

Репликация ДНК ГХ происходит в поздней S-фазе [59]. После окраски красителем Гимза транскрипционно неактивный ГХ дает G-полосы (темное окрашивание) и реплицируется в поздней S-фазе, тогда как транскрипционно активный эухроматин дает R-полосы (светлое окрашивание) и реплицируется в ранней S-фазе. При этом конститутивный ГХ более ярко окрашивается некоторыми ДНК-интеркалирующими красителями, например 4,6-диамидофенилиндолом (DAPI) [60]. Но окраска DAPI не является точным маркером участков конститутивного гетерохроматина [61].

Конститутивный ГХ также содержит характерные эпигенетические маркеры, такие как метилирование ДНК 5-метилцитозиновых остатков метилтрансферазой, локализованных в CpG островках [62]. Метилирование цитозинов может происходить как de novo, так и за счет поддержания метилированного статуса на матричной цепи ДНК при репликации [62,63]. В нормальных соматических клетках тканей человека метилировано от 70 до 90% CpG динуклеотидов ДНК ГХ [64]. Регионы конститутивного ГХ

человека также обогащены HP1 или его изоформами (у млекопитающих -HP1a, HP1ß, HP1y), за исключением инактивированной X-хромосомы, где HP1 отсутствует [65,66]. Кроме того конститутивный ГХ у человека может связываться с PcG белками [67], так как помимо метилирования ДНК ,в образовании ГХ, также вовлечены специфические пострансляционные модификации гистонов. ГХ у человека характеризуется моно-, ди-, триметилированием гистона H3 по остатку лизина 9 (H3K9) и по остатку лизина 27 (H3K27). Гипоацетилирование гистонов Н3 и Н4 по лизинам приводит к инактивации хроматина, тогда как гиперацетилирование к активации. Peters et al. (2003) и Rice et al. (2003) показали, что H3K9 триметилирование и H3K27 монометилирование характерно для перицентромерного района хромосом [67,68]. Также для перицетромер характерна замена линкерных гистонов H1 на H5 и общее повышение их уровня [65,69].

Перечисленные модификации являются основными биохимическими маркерами конститутивного ГХ. Несмотря на большое количество критериев ГХ, ни один из описанных выше не является абсолютным.

1.2 Тандемно повторяющаяся ДНК человека

Конститутивный ГХ формируется преимущественно на основе пцтпДНК. пцтпДНК (историческое название сатДНК) впервые обнаружена Китом в 1961 г. как дополнительная (сателлитная) фракция в составе фрагментированной геномной ДНК, выявляемая при равновесном

центрифугировании в градиенте плотности хлористого цезия [70]. Подобное разделение возможно благодаря наличию в пцтпДНК большего количества АТ участков по сравнению с GC. Исследования по кинетике реассоциации ДНК показали, что сатДНК содержит высокоповторяющиеся последовательности [71,72], которые составляют до нескольких десятков процентов от всей ядерной ДНК эукариот. Позже у человека выявили так называемые сателлиты "с простой последовательностью" (simple sequence satellites), мономерами размером 5-15 нуклеотидов [73]. Другие семейства сателлитной ДНК, например субсемейства альфоидной (а-сателлитной) ДНК были обнаружены с помощью эндонуклеаз рестрикции [74,75].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Добрынин Михаил Алексеевич, 2023 год

- Н М1

щЦ .1.1. -Щ да

Идентификатор донора

1000-1 800* 600>

О

| 4002000-

|1|

I

И Н I

с\/ ми

■ ■ " ■ ■ I

Л> > «Э N "V "Ъ > <3 Идентификатор донора

Рисунок 6. Биоинформатический анализ количества транскриптов И82 в транскриптомах СУ и М11 ооцитов, опубликованных [28] (а) ТРМ, рассчитанный для транскриптов, сгруппированных с использованием иСЬИБТ (см. «Материалы и методы»); (б) Суммарный ТРМ трех уже известных эталонных последовательностей И£2: Х60726.1, 890110.1, Х82942.1. Уже известные последовательности были взяты в качестве эталонов для сравнения их значения ТРМ со значением ТРМ сгруппированных транскриптов, показанных на (а). Ось X, идентификатор донора, как показано в публикации. Ось У, процент ТРМ И$2 в М11 (значение ТРМ И$2 СУ ооцитов установлено за 100% для каждой пары СУ-МП от одного и того же донора). Абсолютные значения ТРМ кластеров приведены в таблице 4.

б

а

Известно, что количество транскриптов гена АСТВ (в-актин) относительно стабильно на стадиях ОУ-М11 развития ооцитов мышей, поэтому его можно использовать для сравнения транскриптомов, используя в качестве референса как при проведении ПЦР, так и при биоинформатном анализе [281]. Согласно количественной оценке транскрипции гена АСТВ в

анализируемых транскриптомах, данные, опубликованные разными

авторами, не могут быть объединены для сравнения. TPM транскриптов ACTB сильно различался между публикациями (Таблица 2) из-за отличий в пробоподготовке РНК и деталей протоколов секвенирования РНК. Однако в каждой из одной публикаций TPM в-актина в транскриптомах стабилен, особенно при попарном сравнении ооцитов (GV и MII от одного и того же донора). Чтобы сравнить уровни экспрессии HS2 на стадиях GV и MII, мы использовали необработанные данные, опубликованные Reyes et al (2017) [28]. Авторы опубликовали транскриптомы GV и MII ооцитов, полученных от десяти доноров. Был пересобран транскриптом из опубликованных необработанных прочтений и проведен анализ количества транскриптов HS2 (рисунок 6 и таблица 4). В GV ооцитах значение TPM HS2 было относительно низким по сравнению с в-актином (таблица 2). У 7 из 10 доноров количество транскриптов HS2 увеличилось в MII по сравнению с GV ооцитами (Таблица 4, Рисунок 6) [131].

Поли-T

Фрагмент последовательности цинкового пальца человека 4 с доменами KRAB и SCAN BLAST DYZ1 HS

BLAST HS3

Censor HS2

BLAST HS3 X60726.1/ граница между HS3 и а-сателлитом X67031.1

Рисунок 7. Анализ последовательности четырех наиболее распространенных транскриптов, собранных из SRR опубликованных транскриптомов MI/MII ооцитов человека (см. Таблицу 3). Транскрипты анализировали с помощью программ BLAST и Censor (программа маскирования повторов). Использована аннотация сателлитов

программы Censor. Последовательности, показанные в легенде, имеют высокую степень гомологии с анализируемыми последовательностями (E-value—0-10 23).

В результате анализа транскриптомов и анализа полученных последовательностей было подтверждено, что четыре наиболее представленных в транскриптомах ооцитов последовательности принадлежат к перицентроменым сателлитам (Рисунок 7) [131]. Согласно подходу к аннотации, предложенному группой под руководством Др. К. Мига (2019) все эти сателлиты относились к классу HS2 [76,111,112]. Один из транскриптов также содержал короткий фрагмент кодирующей последовательности (цинковый палец Homo sapiens с доменами KRAB и SCAN 4) на 5'-конце кДНК сразу после полиТ-хвоста.

а

б

SUR«j;ovis

SRR5Í9589J

CGÂTtîATTOTTCCATTCGATTCTiîTTCOSTGA'riCCATTCGÂTTCCA'nTGATAArfîATT 60

---------------------------ОССАТТСТАТТТСАГТОСЛАТЗСАТТССАТ-Т Э1

--------—--------------ATTCCATTCAAGTCCATTCCATTCCAT-T 2B

-------------------------CATtCCATTCCATTCCATTCCATTCCAT-T 2»

SRAilîOSI»

s¡»i2>i9oi-i 3RR!>25S8»3

CCGTTCCAGACCATTCGATGATTCCATTCAATTCCATTCAATAAACATTCCATTCG' 120

CCATTCCATTCCAT.......-ГХАТТССАТТССАТСАСАТГАС-ЛТТАССТТТС X 82

ССАГТСТАГТССА7--------ТССАТТССАСТССаСТССААТГС -ATTCCATÎCC :c 7 9

CCATTCCATTCCAT——- - -ТТСАТТГСТАТТССАТТССАТГ ~C -АТГССАТТССАСТС. 80

3HR«3tOS75 SMU: »5901-1 SBRlilSSÍJ ШИК«!-!

LATTCATTUATTCCCTTCAAGT- .AnCGATeArtCCA':i.AGATTLXATTCAAlUWTCC 183

CACTTC---ATTTC.......-............-..................................................93

CATTCC---ATTCCATTATATTCCA7TCGACTCTATTC-CCTTCCAATACTCTIGA3TCC ]3b

САСГСС - - -АТТССАТТАСАПСТАСТСТАГСТВЛОТС -ООТТТТАГГ------------------------124

SRAÍ350S7S

ÎKR529S901-1

srrs:958J3 »uiunwi-г

АТТС01ГГССАГТСАСТаАТСАТТССЛГГСАТТТССАТСТСАТЗАТСАТТССАТГСЗАТТ 243

-----A7GCCATTCGATÜCCAATAC-----------------ATACCATTC CATTCGAAT III

АТТССА77ССАС7ССАГТССААТСС------------АГ7АСАТТССТТТССАСТ 17S

---SCATTAGAT7CTAJTCCATT3G----------------АТТАСТТТССАИСЗАГГ 1Ь4

S»UMNt-l SHR529Í893 SHÍU9S901-2

CCATTCAATSAnCCAriCAATTCCATTiaATCATGAmCAATCAATTTCATTCCOTCA 303

ССАГТСААТТТ---------CATTCCA7TATACTCAATTCCATTCCATTCAA7TATAT - - 18]

CCATTCCATTüCT----ТССЗ^КСТП-ССАТТСААПХАТГСОАСТССАГГССАТ-- 232

АСАГТССАТТСА1----STACATTCCATTCCAC7CAAT?ACATTCCACTTCAT7ACGT-- 218

SKR« 3! 057 S JMti2«901-l SRRi;9S893 ЗШ2»901-2

TTCCATTCtïAATCCACTCCATGATGAGTCCATCCATTTCAATTTCATGATAATTCCATTC 360

-ТАСАТТССТТТСААОТСТАП-гСАТТССАТТАСГГТССАТГГ-ОТОАгСАГГССАТТО 237

-ТОСАСТССАТТСТАТТССАГГ-СААСТССАТТССТТГеСАТТС-САСТССАТТССАТТС 289

-ТАСАТТССЛОТАТАТТССАГГ-ЗГАГГССАТСССЛГТ---------------ССТТГС 260

5RR43Î0375

SBHJ9S901-1 3RRJ2 9S893 SM529S901-2

—ТЗТ7САТТССАТТТПТТ7 416

САТТССАПССАСТССАТС-----------------САСТССАСГССАТТССАГГССАГГ 283

САТТССАТТССАЙТССАТТТСА-ТТТСАТТвСАТТТСАТСССАОТССАТТССАТГССАСТ 34 S

AATTCCA7TTCATTCGACTCCA-TTATATT--------------ССАТТССАТТССАС7 }04

SRR«3«0S1S SaRU9î90i-t SRR525S893 SRA3293901-2

CCATTRCATnATCATTCCCTTÏTCTCTrCATTCCATCATtiATrATATTÏjGATTTCATTCCA 476

ССАТ-----ГССАТТССТПСОАвГССАСТСААТТССАТАС------------------------------------316

ТСТТ-----ГССАТТССАТТСАТСГССАТТСААТТССАПССАТТС-СТСТАСАТТСС- 403

ССАА------TCCATTCCATIAGAGGACATTCCATTCACAT--------------------------------------33»

3RRÍ350S7S S«Ü2 »1901-1 3RS52S5Í93 $ЯМ29!90!-2

7AATTC7ATTCCAATCCA7TTGATGAT S03

------------------)1«

----------------40Э

---------------33»

SRR6350575 SRR5295893

CGATGATTGTTCCATTC6ATTCTGTTCCGTGATTCCATTCGATTCCATTTGATAATGATT 6в

........ATTCCATTCAAGT.......-ССАТТССАТТССАТТССАТТСТАТТССАТТС 44

*******ф • • *»»***•*• **•**••* ** •

SRR6350575 SRR5295893

CCGTTCGAGACCATTCGATGATTCCATTCAATTCCATTCAATAAAGATTCCATTCGAGTC 120

С........................ATTCCACTCCGCTC-CAATCCATTCCATTCGAGCC 79

* »••» • *•* *• • •»»«»»»»»»•» •

SRR6350575 SRR5295893

CATTCATTGATTCCCTTCAAGTCCATTCGATGAT — TCCATCAGATTCCATTCAATGAA 177 САТТССАТ- - -TCCATTATATTCCATTCGACTCTATTCCGTTCCAATAC----TCTTGAG 132

ф*ффф • » » » фф * ффффффффф * ф фф фф ф ***

SRR6350575 SRR5295893

TCCATTCGATTCCATTCAGTGATGATTCCATTCATTTCCATCTGATGATGATTCCATTCG 237 ТССАТТССАТТССАСТССАТТССААТССАТТА.................CATTCCTTTCG 175

ффффффф фффффф *• ф фф ф ф ффффф фффф

SRR6350575 SRRS295893

АТТССАТ ГСАА-TGATTCCATICAAT ТССАТ1TGATGATGAT Т ТСААТСААТ TTCATTCG 296 AGTCCATTCCATÎGCTTCCAAATCCTTTCCATTCAATTTCATTCGAGTCCAT........ 227

• **•»*•* » фф ффффф фф ф фф ф ф ффф ф фф фф

SRR6350575 SRR529S893

GTGATTCCATTCGAATCCACTCGATGA----7GAGTCCATCCATTTCAATTTCATGATAA 352

.....TCCATTCCACTCCATTCTATTCCATTCAAGTCCATTCCTTTGCATTCCAC - ТССА 281

ффффф** * **** фф фф ******* * *** *** ** *

SRR6350575 SRR5295893

TTCCATTCGTTTCCTTTCGATGGCGTTTCCATTCGATTCCATTCGAT.........GTTG 403

TTCCATTCCATTCCATTCCAGTCCATTTCATTT-CATTGCATTTCATCCCAGTCCATTCC 340 ******** •*** *** * * **** *• *** **** ** *

SRR6350575 SRR5295893

ATTCCATTTGTTTCCATTGGATGATGATTCCGTTCGTGTCCATTCGATGATGATCATATT 463 АТТССАСТТСТТТССАТ-----------TCCATTCATGTCCATTCAATTCCATTCCATTC 389

*•*••* »• ******* *** 4** ***•*•*•• »• ** *

SRR6350575 5RR5295893

GGATTTCATTCCATAATTCTATTCGAATCCATT7GATGAT 503

•GTGTACATTCC........................................................400

* * ******

в

Query №

»Jet Ш

Query Sft

»Jet Ш

Query m

VbjU M

<fc»ery

лм

J4<»

«>}CT 144

Query MM

»Jet 84

ТОССАПСТАТТТСАГТЫААТОСАИССАГТССАТТССАПССАГГССАГТСМИС- - ft?

inn i 111 iii! и i кишим iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii

TGf <MTTC,l,rrCi ATTCCATT<C»TI{CATTtCTTTCC*TT(CATT((ATT«ATTi ТА JM .........CATCACATTACATTACCITTGCACCCAOTTCATTICATGCC.......... 12ft

II Mil Mil I III III I MillM II

M:TC6G(.l1b»trCCATT«ATTCtAmcATtCtATT(b»11ItArTCtATT№A(lt»l 2«S ATT«,A1^((WrACATAC<ATK(AII(WATC<ATKAA1IICATT((ATTATiC!(A Ш

Mil II III I III lllllllllll I III1111 II IMIIIII I II

ЛП«А1 KCAC TCCATT«AT T«AI 1ССАГ It £ ATIIATTCCATTTCAT1CC »5

АП«АТКСАТТС4АПАТАТТАСАПССТТТСЖ«Т<ТАПССАТТСаПАСтСС Ш

Mllllllllllll III III 11111В1111 I.......Fit.....I nil

ATT((ATT(fAT7CCATTCfATT«ATTCCTTTf fATTCTATTCCATT(CATTCfATT(C US

АТТТСТСАССАТТСГАГГСГАПССATTCCACTCfA TCCACTCGAGTCfATTCCATTCC »7

111 till 11111111 IIII llllll I MM Mil II I lllllllll I I

АТТТСТОГГСАГГССАТТССАТТССАТТССАГТСГАТТССАТТССАТТССДТТССАСТйС ftS

ATTttAI 1ССАГТ 3»

llllll llllll ATTCCAAKCATT 72

Рисунок 8. (а) Множественное выравнивание последовательностей четырех транскриптов, собранных из данных необработанных ридов опубликованных транскриптомов ооцитов MI / MII человека. Транскрипты анализировали с помощью программного обеспечения CLUSTALO. (б) Парное выравнивание последовательностей транскриптов из двух наборов данных, SRR6350575 и SRR5295893 (таблица 2), выполненное с помощью программного обеспечения Emboss Needle. (в) Пример выравнивания транскрипта SRR5295901 (таблица 3) с мРНК HS3, полученной ранее из клеток HeLa, подвергшихся тепловому шоку [135] (последовательность мРНК сателлита III клона 14 Homo sapiens Acc № AY845701.1, клонированная Valgarsdottir et al).

Множественное выравнивание 4 транскриптов и попарное выравнивание последовательностей показало, что они не идентичны (рисунок 8а, б). Все собранные транскрипты имели гомологию (идентичность > 75%) с различными клонами ТП РНК (названными авторами «сателлитной мРНК»), полученными Valgardsdottir et а1. (2005) из клеток HeLa, подвергшихся тепловому шоку (пример приведен на рисунке 8в) [131,135].

а

3RR6350575 GOOCGOC11 I I I I I I I I I I 1 I I 111 I 11 111 I I I IICOATOATTOTTCCATTCOATTCTC 60

X6072 6. 1 --------------------------------------------------------------0

SPR6350575 TTCCCTCATTCCATTCCATTCCATTTCATAATCATTCCCTTCCACACCATTCCATCATTC 120

X60726.1 ----------------------------------------------------------------------------------------------------0

3PR6350575 С ATTC A ATTCСATTCAATAAAOАТТСС ATTCCACTC СATTCATTC ATTCCC TTCA ACTC С 160

X60726.1 -----------------------TCCCTTTCGAGTCCATTCААТСАТТССАТТССАСТСС 37

3RR6350373 АТТСОАТвАТТССАТСАОАТТССАТТСААТОААТССАТТСОАТТССАТТСАОТОАТОАТТ 2 40

Z6072 6.1 ATTCGATGАТТССАТСТСАТТССATTCААТСААТССATTCGАТТССАТТСТАТСACCATT »7

3RR6350575 СС ATTC АТТТССАТСТОАТОАТОАТТССАТТСОАТТСС ATTC AATGАТТССATTC AATTC 300

Х6072 6.1 ССATTCАТТТССATCTGАТСАТОАТТССATTCCATTCCATTCAATGATACCАТТССATTC 137

SRR63 S0S7S С ATTTG АТС ATGATTTC ААТС ААТТТС ATTCGCTCАТТСС АТТССААТССАСТССАТСAT 3 60

Х6072 6.1 CATTGOATOATOATTTCAATCAATГ1IATTCGАТСАТТССATTCGААТССАТТССАТОAT 217

3RR63 50S7S САСТССАТССАТТТСААТТТСАТСАТААТТССАТТССТТТССТТТССАТ<ХХ:СТТТССАТ <20

Х6072 6.1 САСТССАТССАТТТСААТТТСАТСАТААТТССАТТССТ ТТСААТТССАТССТС11ICCAT 277

б

в

Рисунок 9. Биоинформатический анализ транскриптов. (а) Выравнивание последовательности олигонуклеотида DYZ1 и последовательности транскрипта GenBank Acc No BK063198.1, аннотированного нами в транскриптоме человека, опубликованном Zhang et al. (2018) [26,114,131]. (б) Выравнивание последовательности транскрипта из набора данных SRR6350575 и последовательности транскрипта, ранее обнаруженной в тканях развивающегося эмбриона человека (номер доступа X60726.1), с использованием другого набора праймеров [283]. (в) Анализ транскрипта из набора данных SRR6350575 с помощью RepBase. Картинка содержит три части, обозначенные как HS2 (зеленые прямоугольники).

Один из транскриптов (GenBank Acc No BK063198), который мы собрали из необработанных данных, опубликованных Zhang et al. (2018) содержал сайты гомологии с зондом DYZ1 (рисунок 9а) [26,114,131]. Он состоял из блоков перицентромерной ТП ДНК HS2. Транскрипт имел

высокую степень гомологии с пограничной областью между центромерным а-сателлитом и перицентромерными И8 (рисунок 7). Сравнение с помощью RepBase показало, что он содержит три крупных блока ИБ2 примерно одинаковой длины (рисунок 9в). Это был единственный транскрипт среди найденных (таблице 3), который содержал мотив ОАТОАТ, один из отличительных признаков ИБ3 1 хромосомы (^^Ь) [107]. Кроме того, транскрипт содержал полную последовательность ИБ3, которую мы ранее обнаружили транскрибируемой в некоторых линиях раковых клеток, стареющих фибробластах легких и некоторых тканях развивающегося человеческого эмбриона с использованием различных зондов и наборов праймеров (рисунок 9б) [15,134]. Таким образом, данная последовательность транскрибируется достаточно часто при активации различных процессов в клетках.

3.2 Локализация перицентромерных ТП ДНК И82

Биоинформатический анализ показал, что последовательность зонда БУ71 присутствует в перицентромерных районах большинства хромосом (см. раздел «Материалы и методы»). В ходе экспериментов были подобраны условия гибридизации зонда БУ71 (см. раздел 2.3.1.) для ооцитов, иммобилизованных на предметных стеклах [131].

Рисунок 10. Локализация ДНК HS2 в GV и MI ооцитах человека. Локализация ДНК HS2 выявлена с помощью зонда DYZ1 (красный) в GV ооцитах (а) и MI (б) человека, путем ДНК-ДНК FISH. Белые стрелки — (а) кольцо высококонденсированного ГХ, (б) метафазная пластинка. Желтые стрелки — (а) кумулюсные клетки. На вставках показано: (а) гетерохроматиновое кольцо и (б) метафазная пластинка. Хроматин окрашивали DAPI (синий). Масштабная линейка: 30 мкм.

В GV ооцитах человека гибридизационный сигнал ДНК HS2 был обнаружен как часть высококонденсированного гетерохроматинового кольца с помощью ДНК-ДНК FISH (рисунок 10а) [131]. Таким образом, на этой стадии развития ооцитов перицентромерные участки хромосом входили в состав гетерохроматинового кольца, окружающего ЯПТ, и не были выявлены в других участках ооплазмы. На стадии MI (рисунок 10б) ДНК HS2 обнаружили только на конденсированных метафазных хромосомах [131]. Таким образом, в преовуляторном ооците ДНК HS2 располагается исключительно в ядре или хромосомах. Зонд DYZ1 не гибридизировался с какими-либо структурами в ооплазме вне ядра (GV) или вне хромосом (MI) в использованных условиях ДНК-ДНК FISH (см. «Материалы и методы»). Таким образом, используемый нами паттерн ДНК-ДНК гибридизации при использовании данного зонда полностью соответствовал ожидаемому,

неспецифический отжиг на внехромосомных элементах отсутствовал, что позволило использовать DYZ1 для РНК-ДНК FISH.

3.3Локализация транскриптов перицентромерных ТП ДНК HS2 в ооцитах относительно РНК-хеликаз DDX5 и DDX4 и митохондрий

а б в

%

%

30 мкм

Рисунок 11. Локализация РНК HS2, выявленная с помощью зонда DYZ1 (красный), в ооцитах GV (а) и MI (б, в) человека, путем ДНК-РНК FISH без (а, б) и с (в) обработкой РНКазой A. Белые стрелки - (а) высококонденсированное кольцо ГХ; (б, в) метафазная пластинка. Ядро обведено пунктирной белой линией (а). Хроматин окрашивали DAPI (синий). Масштабная линейка: (30 мкм) (а-в).

Локализацию транскриптов HS2 в преовуляторных ооцитах человека оценивали методом ДНК-РНК FISH с пробой DYZ1. На стадии GV (рисунок11а) гибридизационный сигнал в малом количестве выявили в цитоплазме ооцита. На стадии MI (рисунок 11 б) были обнаружены яркие гибридизационные сигналы вблизи хромосом метафазной пластинки и по всему пространству ооплазмы [131]. Размер сигналов варьировал от мелких (200-500 нм) до крупных (3-4 мкм).

В препаратах ооцитов, обработанных РНК-азой А, гибридизационные сигналы после ДНК-РНК гибридизации выявлены не были (Рисунок 11в). Отсутствие флуоресцентных сигналов в обработанных РНКазой А ооцитах (Рисунок 11в) рассматривали как подтверждение того, что наблюдаемые в необработанных ооцитах сигналы обусловлены взаимодействием зонда с РНК, а не с ДНК. Таким образом, транскрипты HS2 были выявлены в созревающих ооцитах. Транскрипты обнаруживались в ооцитах на стадии GV. Однако при переходе к стадии MI количество относительно крупных (более 200 нм) сигналов соответствующих РНК HS2 увеличивалось. Эти данные свидетельствуют о том, что транскрипция HS2 происходила в конце стадии GV перед глобальной репрессией генома, а синтезированные транскрипты были распределены не диффузно, а в виде включений различного размера [131].

Клетки зародышевых линий различных организмов характеризуются наличием особых РПН-биоконденсатов, формирующихся в процессах фазового перехода, - ЗГ, к которым относится и nuage [35,36,38,242]. Nuage, вместе со специфическим подмножеством митохондрий, элементами шероховатого ЭР, многочисленными комплексами Гольджи образуют структуру, которая у млекопитающих была обнаружена только в оогониях — ТБ [243]. Nuage содержат различные РНК-хеликазы и нкРНК, а РНК-хеликаза DDX4 (гомолог VASA у человека) является маркерным белком ЗГ [37,38,242,284]. В другом типе ЗГ, хроматоидном теле сперматоцитов, среди

прочих была обнаружена РНК-хеликаза DDX5, которая часто колокализуются с репрессированной мРНК и способна непосредственно связываться с последовательностями ДНК ИБ2 [35,285].

а I б в

Рисунок 12. Пространственная локализация РНК И$>2 и РНК-хеликазы ББХ5 в GV (а-конфокальная микроскопия, г - световая микроскопия того же препарата), GVBD (б -конфокальная микроскопия, д - световая микроскопия) и в М1 (в - конфокальная микроскопия, е - световая микроскопия) ооцитах человека после иммуно-ДНК-РНК-Б18Н. Белые стрелки — (а, г) кольцо высококонденсированного гетерохроматина; (б, в, д, е) метафазная пластинка. Коричневые стрелки -РНК И82, зеленые стрелки -белок ББХ5. Хроматин окрашен БАР! (б, синий). Масштабная линейка - 30 мкм.

Пространственную локализацию РНК HS2 и РНК-хеликазы DDX5 исследовали с помощью комбинации FISH и иммуноцитохимического окрашивания с АТ против DDX5. На стадии GV в ооплазме обнаружены

слабые гибридизационные сигналы соответствующие транскриптам ИБ2 (рисунок 11а, 12а), тогда как АТ против ББХ5 выявили белок в ооплазме, а также рядом с кольцом гетерохроматина в ядре (рисунок 12а) [131,286]. Однако частичное перекрытие сигналов было выявлено в ооплазме (рисунок 12а). Большая часть белка ББХ5, локализованного в цитоплазме, выявлялась в виде ярко окрашенных включений (рис12а).

При переходе от стадии ОУ к стадии М1 (стадия GVBD) транскрипты ИБ2 выявлялись в виде включений в ооплазме и вблизи хромосом формирующейся метафазной пластинки (рисунок 12б) [131]. DDX5 наблюдался в ооплазме и вблизи хромосом [131,286]. Часто сигналы РНК ИБ2 и ББХ5 были колокализованы в виде РНП-гранул. Диаметр окрашенных гранул был менее 2 мкм.

На стадии М1 транскрипты ИБ2 были обнаружены в основном в ооплазме. Рядом с хромосомами наблюдали слабый сигнал или сигнал отсутствовал (рисунок 11б, 12в) [131]. Диаметр окрашенных гранул составлял до 2 мкм. С помощью АТ против ББХ5 выявили ярко окрашенные включения (также до 2 мкм) в ооплазме, и включения меньшего размера, примыкающими к хромосомам метафазной пластинки [131,286]. РНК ИБ2 и ооплазматические включения ББХ5 часто были колокализованы в виде РНП-структур (рисунок 11б, 12в).

Рисунок 13. Прижизненная световая микроскопия MI ооцита человека. Белые стрелки -включения в ооплазме. Вставка на изображении показывает увеличение области цитоплазматических включений. Масштабная линейка: 30 мкм.

Несмотря на то, что в ооцитах мыши nuage разбираются при приближении к завершению оогенеза, в ооцитах человека присутствие/отсутствие ЗГ в конце оогенеза остается под вопросом. В наших экспериментах окрашиваемые включения, помимо флуоресцентной, были хорошо различимы при световой микроскопии (рисунок 12 г-е). Кроме того подобные гранулярные структуры были обнаружены при прижизненной световой микроскопии на живых MI ооцитах человека, что позволило сделать предположение о сходстве данных структур и выявленных методом иммуно-FISH (рисунок 13). Данное предположение было проверено in vivo (см. подраздел микроиньекции)

Ассоциация с митохондриями - отличительный признак nuage. Пространственную ассоциацию обнаруженных РНП и митохондрий выявляли с помощью двойного иммуноцитохимического окрашивания с АТ

против белка Тот20 (рецептор транслоказы наружной мембраны митохондрий) и АТ против DDX5 [131].

а б

^ Совмещение

* *

В

41

Рисунок 14. Локализация Тот20 (г, красный) и РНК-хеликазы DDX5 (в, зеленый) на двух разных оптических срезах ОУ ооцита (I — оптический срез через плоскость ядра, II — оптический срез через участок цитоплазмы, не содержащий ядро), на оптическом срезе М1

ооцита (III) и в кумулюсных клетках, использованных в качестве контроля окрашивания антителами (V). Структуры с ооплазматического оптического среза, окрашенные совместно с АТ против Тот20 и DDX5, показаны при большем увеличении на (IV). Вставка на изображении 2-[в показывает увеличение области кольца ГХ, окрашенного АТ против DDX5. Белые стрелки — кольцо высококонденсированного ГХ; серая стрелка — ядро ОУ ооцита; желтые стрелки —клетки кумулюса. Хроматин окрашен DAPI (б, синий). Совмещенные изображения показаны на (а). Масштабные линейки - 30 мкм (!-Ш), 10 мкм (IV-V).

На некоторых препаратах GV ооцитов АТ к ББХ5 окрашивали ядро диффузно (рисунок 144с, 14а), а в других - точечно (рисунок 12а). Колокализации РНК Ж2 и ББХ5 в ядре не наблюдалось (рисунок 12а), тогда как ББХ5 прилегал к кольцу ГХ, окружающему ЯПТ (рисунок 14-1, II). Сигналы окрашивания АТ против ББХ5 частично перекрывались с митохондриями, выявленными с помощью АТ против Том20 на поздней ОУ стадии и стадии М1 (рисунок 14-Ш, !Уб). Сигналы окрашивания митохондрий также слабо окрашивались БАР! (рисунок 2-Й), который, как известно, способен взаимодействовать как с ДНК так и с РНК [287]. В тоже время в клетках, обработанных РНКазой А, подобные включения не были обнаружены. Это позволило предположить, что слабое окрашивание БАР^ в необработанных клетках, могло быть связано с наличием РНК (например, рисунок 11в). Однако, подобное окрашивание также могло быть результатом наличия митохондриальной ДНК. Колокализация сигналов АТ против ББХ5 и Тот20 не наблюдалась в кумулюсных клетках (рисунок 14-V). Таким

образом, наличие артефакта двойного иммуноокрашивания в ооцитах маловероятно.

Обобщая вышесказанное, при переходе от стадии GV к стадии М^ мы наблюдали колокализацию транскриптов ИБ2 с РНК-хеликазой ББХ5 в виде РНП, расположенных вблизи митохондрий ооцита.

Рисунок 15. Локализация РНК-хеликаз DDX5 (а-в, зеленый) и DDX4 (а,б - красный, в -синий) в GV ооците (а, I), в позднем GV (а, II и в), в GVBD (а , III) и в MI (а, IV) ооците) и в кумулюсных клетках (б). Хроматин окрашен DAPI (а, б — синий; в — голубой). Совмещенные изображения одного оптического сечения показаны на (а), (б). Черно-белые изображения на (а), (б) представляют собой фазово-контрастные изображения, снятые одновременно с соответствующим оптическим сечением. Колокализация сигналов АТ против хеликаз и ДНК-РНК FISH с зондом DYZ1 показано на (в). Масштабные линейки — 30 мкм (а, в), 10 мкм (б).

Все выявленные цитоплазматические РНП структуры также окрашивались АТ против DDX4, маркерным белком nuage, на всех изученных стадиях ооцитов [131]. Напротив, сигналы АТ против DDX4 не были выявлены в кумулюсных клетках (рисунок 15 а, б), где DDX5 ранее выявлялся только в ядре (рисунок 14-V, 15б).

DDX4 как и многие белки семейства DEAD-box обладают АТФ-зависимой РНК-хеликазной активностью и РНК-зависимой АТФазной [288]. Соответственно как хеликаза DDX4 использует энергию АТФ для разделения спаренных оснований двойной нити РНК, например чтобы сделать РНК доступной для нуклеаз. Благодаря РНК-зависимой АТФазной активности DDX4 глобально регулирует фазовое разделение РНП: DDX4, связывая АТФ, образует мультивалентные взаимодействия с РНК, чтобы способствовать фазовому разделению [263].

Таким образом, обнаруженные в преовуляторных ооцитах РНП включали в себя, как минимум из 2 РНК-хеликазы и транскрипты HS2 и были локализованы вблизи митохондрий.

3.4Транскрипция ТП ДНК HS2 в преовуляторных ооцитах человека идет как с ATTCC, так и с GGAAT участков HS2 в геноме.

До появления T2T-CHM13 сборки генома человека, считалось, что транскрипция пцтпДНК возможна с разных (с AT- и GC- богатой) цепей ДНК. Как правило, транскрипция с одной цепи была интенсивнее, чем с

другой, т.е. протекала ассиметрично. Доминантное транскрибирование с одной из цепей ДНК зависело от типа клеток, окружающих их условий и от стадии развитии организма [10,13,15,20,132-136]. У человека была продемонстрирована цепь-специфичность транскрипции перицентромерных сателлитов при тепловом шоке, когда преимущественно экспрессировалась GGAAT богатая цепь, тогда как в стареющих фибробластах и некоторых раковых линиях транскрибировалась ATTCC богатая цепь [15,20,136]. Однако, данные полученные при изучении T2T-CHM13 сборки генома человека показали, что, возможно, речь шла не о транскрипции доминантной цепи, а о транскрипции последовательностей в определенной ориентации -одна и та же последовательность могла располагаться на разных цепях из-за многочисленных инверсий перицентромерных участков [21,76,114]. Поэтому было решено оценить возможность транскрипции ATTCC и GGAAT участков пцтпДНК HS2 и определить зону, где локализованы транскрипты. Для выполнения данной задачи использовали двойной РНК-FISH с зондом DYZ1 и зондом PCT14. PCT14 содержащий последовательность HS2 из подсемейства 14 хромосомы (pTRS63), основанный на повторе GGAAT и его вариациях, был конъюгирован с флуорохромом FAM.

DAPI PCT14 I DAPI PCT14 DAPI PCT14

DYZ1 DYZ1 DYZ1

Рисунок 16. ДНК-гибридизация зонда PCT14 (I) и РНК-гибридизация зонда PCT14 (II-III) относительно РНК, гибридизующихся с зондом DYZ1 (II-III). (I) Локализация ДНК HS2 / HS3, выявленной с помощью FISH с зондом PCT14 (зеленый) в метафазных спредах лимфоцитов человека. РНК-FISH с двумя зондами (DYZ1, красный и PCT14, зеленый) была проведена для изучения того, является ли транскрипция HS2 / HS3 цепь-специфичной в ооцитах GV (II) и MI (III) человека. Ядро на (II) было обведено пунктирной белой линией на основе данных, полученных с помощью световой микроскопии (не включены в панель). Хроматин контрастно окрашивался DAPI (синий). Масштабные линейки: (5 мкм) (I) и (20 мкм) (II-III).

Несмотря на то, что подсемейство специфично для 14 хромосомы, зонд гибридизовался с перицентромерными областями большинства хромосом (рисунок 16). Сигналы гибридизации, полученные от зонда PCT14, перекрывались с сигналами, полученными от зонда DYZ1 [131]. Однако в ооцитах GV большинство сайтов гибридизации DYZ1 были свободны от сигналов PCT14, в то время как все сигналы PCT14 были колокализованы с DYZ1 (рисунок 16а). На стадии MI сайты гибридизации PCT14 и DYZ1 полностью перекрывались (рисунок 16в). В результате двойной РНК-FISH было подтверждено, что транскрипция HS2 в позднем оогенезе происходит как с ATTCC, так и с GGAAT участков HS2 в геноме [131]. Паттерны

гибридизационных сигналов немного различаются в GV и М1. В ооцитах GV преобладал сигнал DYZ1, тогда как РСТ14 был менее выражен. В ооцитах М1 сигналы DYZ1 и РСТ14 почти полностью перекрывались. Следовательно, транскрипция GGAAT участка, вероятно, задерживается. Различие в гибридизации РСТ14 и DYZ1 повышает вероятность разного времени АТТСС и GGAAT участков ИБ2. При этом, на данный момент, нет возможности достоверно доказать, что транскрипция идет разных цепей или же с одной цепи в разных ориентациях. Для подтверждения нужен широкий анализ окружения последовательностей.

3.5Сравнительная количественная оценка транскрипции HS2 в ооцитах

человека и клетках кумулюса

В экспериментах по флуоресцентной гибридизации транскрипция ИБ2 была выявлена в ооцитах при переходе от стадии GV к стадии М1 (рисунок 12).

в

1000

GAPdH

ß-actin

Кумулюсные клетки Ооциты

а

б

Рисунок 17. Относительная экспрессия HS2 в ооцитах человека и клетках кумулюса. Транскрипция HS2 выявленная с помощью РНК-FISH с зондом DYZ1 (красный) в клетках

кумулюса ограничена (а) или отсутствует (б). Данные ПЦР в реальном времени были

о-дда

рассчитаны методом 2 с уровнями экспрессии генов, нормированными по двум генам: ОЛРОИ и Р-актин (в). Ось У: изменение кратности (среднее значение ± стандартное отклонение) между клетками кумулюса (полученными от 5 доноров) и ооцитами (полученными от 7 доноров, всего п = 60). ** - р<0,01, 1-критерий. Ядра (а, б) были окрашены БАР! Масштабная линейка: 50 мкм.

В тоже время в клетках кумулюса было обнаружено лишь небольшое количество сигналов или их отсутствие (рисунок 17а, б.) Количественную оценку транскрипции ИБ2 в ооцитах человека и клетках кумулюса выполняли помощью ПЦР в реальном времени (рисунок 17в). В качестве референсных генов были использованы: ОЛРОИ и ЛСТВ ^-актин). ОЛРОИ является наиболее широко используемым референсом. Однако созревающий ооцит представляет собой высокоспециализированную клетку, в которой многие гены действуют иначе, чем в соматических клетках. В позднем оогенезе крупного рогатого скота была обнаружена нестабильная транскрипция ОЛРОИ, особенно между GV-MII стадиями, когда ее уровень снижается в 10 раз [289]. Напротив, в созревающих ооцитах свиней ОЛРОИ считается одним из наиболее стабильных референсных генов для оценки транскрипции [290]. Таким образом, было решено использовать как ОЛРОИ, так и в-актин как референсные гены.

В обеих сериях опытов уровень транскрипции ИБ2 был во много раз выше в ооцитах по сравнению с кумулюсными клетками [131]. Однако значение кратности изменения было разным в зависимости от эталонного гена, использованного для расчетов. В наших экспериментах средние

пороговые циклы ОЛРОИ составляли 27,2 ± 0,4 для клеток кумулюса и 36,7 ± 0,75 для ооцитов. Такой результат, возможно, связан с тем, что в позднем оогенезе человека транскрипция ОЛРОИ подавляется, как это было показано для оогенеза крупного рогатого скота. Пороговые циклы в-актина были относительно стабильными: 28,2 ± 0,3 в ооцитах против 26,5 ± 1,1 в кумулюсе. Таким образом, мы считаем более надежными данные, рассчитанные с помощью в-актина как референсного гена.

Обобщая вышесказанное, было впервые обнаружено, что количество транскриптов выявленное в ооцитах GV было выше, чем в клетках кумулюса. Содержание транскриптов ИБ2 увеличивалось по мере приближения к концу оогенеза (от GV к МП стадии). В созревающих ооцитах транскрибировались обе нити ИБ2 (АТТСС и GGAAT). Транскрипты были локализованы в безмембранных РНП-структурах, которые содержали как минимум РНК-хеликазы DDX4 и DDX5, и были тесно связаны с митохондриями.

3.6Инактивации транскрипции И82 2-О'Met антисмысловыми-олигонуклеотидами

3.6.1 Отработка метода инактивации транскрипции Ш2 2-О'Мв1 антисмысловыми-олигонуклеотидами

Для инактивации транскрипции ИБ2 в позднем оогенезе человека, на основе консенсусных последовательностей транскриптов были подобраны 2-О'Ме! антисмысловые РНК олигонуклеотиды, пригодные для инактивации транскрипции ИБ2. Модификация 2'-0-Метил обеспечивала устойчивость

РНК к воздействию нуклеаз и значительно повышала её сродство к РНК-мишени (температура плавления, по сравнению с ДНК-РНК дуплексом выше).

Ранее в нашей лаборатории с помощью молекулярных методов, методом ПЦР в режиме реального времени была выполнена проверка способности олигонуклеотидов инактивировать транскрипцию HS2. Повышенная траскрипция HS2 была в этом случае индуцирована блеомицином. При количественной оценке уровня РНК HS2 было выявлено, что в клетках трансфецированных 2-O'Met олигонуклеотидами, после индукции блеомицином, количество транскриптов HS2 было достоверно меньше, чем в клетках также обработанных блеомицином, но не получившим 2-O'Met олигонуклеотиды [21].

Однако, ввиду ограниченности материала, для ооцитов такой метод малодоступен, поэтому мы проверили, пригоден ли метод FISH для оценки уровня инактивации исследуемых транскриптов. Мы основывались на предположении, что, поскольку HS2, в отличие от уникальных последовательностей, присутствует в большом количестве копий в геноме и активно транскрибируется, то метод FISH будет достаточно чувствительным для определения инактивации. Поэтому была выполнена проверка работоспособности олигонуклеотидов для инактивации транскрипции HS2 на соматических клетках линии фибробластов легких человека HLF-1, подвергнутых тепловому шоку. Поскольку при тепловом шоке транскрипция

ИБ2 и ИБ3 возрастает многократно [135], эта модель является очень удобной для тестирования антисмысловых олигонуклеотидов к пцтп РНК.

DAPI

а

JS2/HS3 DAPI

б

10 ЛЛКЛЛ

10 АЛКАЛ

Рисунок 18. Инактивация транскрипции HS2 2-O'Met антисмысловыми-олигонуклеотидами в клетках линии HFL-1 подвергнутых тепловому шоку. Клетки после трансфекции липофектамином 2000: (а) без добавления 2-O'Met антисмысловых-олигонуклеотидов, (б) с добавлением 100 нг 2-O'Met антисмысловых-олигонуклеотидов. Ядра (а, б) были окрашены DAPI. Масштабная линейка: 10 мкм.

В результате, было подтверждено, что после трансфекции липофектамином, 2-O'Met олигонуклеотиды успешно инактивируют транскрипцию HS2 в клетках линии HFL-1, подвергнутых тепловому шоку (рисунок18).

3.6.2 Инактивация транскрипции ТПДНК HS2 путем микроинъекций олигонуклеотидов

На следующем этапе работы, было проведено исследование по инактивации транскриптов HS2 в GV/MI ооцитах человека с помощью 2-O'Met антисмысловых олигонуклеотидов. Для доставки олигонуклеотидов

внутрь ооцитов использовалась методика цитоплазматических микроинъекций.

•Ч

25 мкм

Рисунок 19. Микроиньекции 2-O'Met антисмысловых олигонуклеотидов в GV/MI ооциты с помощью микроманипулятора Integra. Белая стрелка высококонденсированное кольцо ГХ. Ядро было обведено пунктирной белой линией. Масштабная линейка: (25 мкм).

Рисунок 20. Микроиньекции 2-O'Met антисмысловых олигонуклеотидов в GV/MI ооциты. Первой группе (а, контроль, n=4) ооцитов вводили физиологический раствор (127,5 фл). 2 группе (б, n=3) в каждый ооцит инъецировали 85 фл (8,5 фмоль) антисмысловых олигонуклеотидов. В группе 3 (в, n=4) вводимый объем составлял 127,5 фл (12,75 фмоль) антисмысловых олигонуклеотидов.

В ходе отработки метода цитоплазматических микроинъекций было установлено, что инъекционные манипуляции с ооцитами не приводили к достоверному увеличению числа дегенерировавших ооцитов по сравнению с

внутрилабораторными контрольными значениями гибели ооцитов при инъекционных манипуляциях (рисунки 19,20) Данные внутрилабораторные нормы были установлены клиникой, в которой проводились микроинъекции, на основании собственного и мирового опыта.

НБг/НБЗ ОАР1

а 20 мкм

НБг/НБЗ РАР1

б 20 мкм

НБг/НБЗ РАР1

В 20 мкм

г **

1 р=0,01 1

группы ооцитов

Рисунок 21. Пространственное распределение РНК И$>2 (красный) (а - в) в ОУ и М1 ооцитах человека после инъекций физиологического раствора (а), 8,5 фмоль (б) и 12.75 фмоль антисмысловых нуклеотидов (в). Хроматин окрашен БЛР1 (синий). Масштабная линейка: (20 мкм). Результаты количественного обсчета СЗС конфокальных изображений после РНК-РТБН представлены на графике (г).

В ооцитах 3-й группы, которым вводили 12,75 фмоль 2-O'Met ДНК, было выявлено достоверное (p=0,01) снижение интенсивности флуоресценции (показатель СЗС) до 25,68±1,777 по сравнению с группой 1 (35,50±2,938). В группе 2, получившей 8,5 фмоль 2-O'Met ДНК это показатель (34,47 ±1,984) достоверно не изменялся по сравнению с контрольной группой (Рисунок 21,а-в; г). Поэтому на основании статистически достоверной инактивации ~30% транскриптов пцтпДНК, был сделан вывод об эффективности данного метода инактивации [241].

Инактивация транскриптов перицентромерных ТП человека связана с рядом трудностей. 1. Наличие zona pellucida, затрудняющей использование липофильных реагентов. 2. Остановка транскрипции на завершающем этапе GV стадии, в результате которой также снижается эффективность применения антисмысловых олигонуклеотидов. Однако, в данном исследовании удалось добиться значимого снижения СЗС гибридизационных сигналов в ДНК-РНК FISH и показать хорошую переносимость клетками данной процедуры.

Н82/Н8Э V 0ДР! Н82/Н8Э 0ДР!

• * * г' ■ «В »

} »■.»

'• » > ' . »

Г ^

у .V.- # , * е 1« ^

ч

» ' * . • • > * э

* . *

' • о л •

(а) оэх4 20 мкм (б) 00X4 20 мкм

5

с;

ф

0

1 150-| с

со о

Я юон |_

5

и Л

я 50 Н

3

о с с

к я

3"

ю О

р=0,03 *

п

р=0,02

»

А.

ло"

<5*

<5 V

д

лр4 ^О4 Ср о.*3

° л-

Н82/Н8Э 0ДР! •

(в) 00X4 • 20 мкм

е

г

Рисунок 22. Пространственное распределение РНК И$2 (зеленый) и РНК-хеликазы DDX4 (красный) (a - в) в GV и MI ооцитах человека после инъекций физиологического раствора (а), 8,5 фмоль (б) и 12.75 фмоль антисмысловых нуклеотидов (в). Хроматин окрашен DAPI (синий). Масштабная линейка: (20 мкм). Результаты количественного обсчета общей площади сигналов, среднего размера сигналов и числа отдельных флуоресцентных сигналов на клетку после иммуноокрашивания АТ против DDX4 представлены на графиках (г-е).

Одновременно с инактивацией транскрипции Н52, в ооцитах 3-й группы, была обнаружено достоверное (р=0,03) увеличения общей площади сигналов, полученных при окрашивании АТ против 00X4 до 79,30± 11,05 по сравнению с группой 1 (44,84± 7,426). Тогда как в группе 2 данный

показатель (13,69± 3,650) достоверно ф=0,02) уменьшался по сравнению с контрольной группой (Рисунок 22,а-в; г) [241].

В тоже время, в ооцитах 3-й группы, наблюдалось достоверное ф=0,03) увеличение средней площади сигналов полученных при окрашивании АТ против DDX4 до (1,385± 0,1915) по сравнению с группой 2 (0,5273± 0,1181). Тогда как в группе 2 (0,5273± 0,1181) наблюдалась тенденция (р= 0,25) к уменьшению данного показателя по сравнению с контрольной группой (1,184 ± 0,3217) (Рисунок 22,а-в; д) [241].

Также в ооцитах 3-й группы, было обнаружено достоверное (р=0,04) увеличение числа отдельных сигналов флуоресценции АТ против DDX4 до 71±10,89 по сравнению с группой 2 (26±5,508 сигналов). Тогда как по сравнению с группой 1 (44±8,994 сигналов) данный показатель изменялся меньше, демонстрируя только тенденцию (р=0,4) к увеличению (Рисунок 22,а-в; е). В этом случае, малый размер выборок, вызванный методическими сложностями и ограниченностью материала не позволил получить статистически достоверные данные [241].

Рисунок 23. Прижизненная конфокальная микроскопия GV/MI ооцитов после микроиньекции олигонуклеотидов к РНК И82, меченных флуорохромом Су3 по 5'-концу

(красный) (б, в). (а - световая микроскопия, б - конфокальная микроскопия того же препарата, в - совмещение). Белые стрелки - РНП включения, содержащие РНК HS2, ранее выявленные на фиксированных препаратах после FISH и во время прижизненной световой микроскопии. Вставка на изображении (в) показывает увеличение области цитоплазматических включений. Масштабная линейка: 30 мкм.

Для подтверждения связи между обнаруженными с помощью FISH/иммуно-FISH РНП-структурами в фиксированных ооцитах (как в экспериментах без микроинъекций, так и после них) и структурами в ооцитах во время прижизненной световой микроскопии, были проведены эксперименты по микроиньекциям олигонуклеотидов, меченных флуорохромом по 5'-концу. После инкубации ооцитов проводилась совмещенная прижизненная световая и конфокальная микроскопия. В результате микроскопии было обнаружено, что цитоплазматические включения, выявленные при прижизненной съемке, гибридизуются с меченными олигонуклеотидами (рисунок 23). Таким образом, включения, видимые в живых ооцитах, по-видимому, содержали транскрипты HS2, также как и схожие включения в фиксированных ооцитах (как в экспериментах без микроинъекций, так и после них). Полученные данные прижизненной световой микроскопии подтвердили предыдущие результаты FISH/иммуно-FISH.

4 Обсуждение

В проведенном нами исследовании показано накопление транскриптов HS2 в преовуляторных ооцитах. В работе использованы денудированные ооциты MI, исключенные из программ донирования ооцитов. Данная практика принята в клиниках ВРТ по экономическим соображениям -ооциты MI доноров не используются, в отличие от клеток пациентов, т.к. у пациентов с патологиями количество собранных ооцитов часто бывает невелико. Однако с биологической точки зрения MI ооциты, полученные в стимулированных циклах здоровых доноров, чаще всего вполне пригодны для процедур ВРТ.

Согласно литературным данным, около 4% всех ооцитов, денудированных перед ИКСИ, находятся в MI [291]. Часто эти ооциты достигают мейоза через несколько часов культивирования in vitro и становятся доступными для ИКСИ в тот же день. В этом ретроспективном исследовании, после гормональной стимуляции яичников в 896 циклах было получено 8803 ооцита MII, которые использовали сразу после денудации. Также было получено 1210 MI ооцитов, созревших от MI до MII в течение ~ 4 ч после культивирования in vitro. Скорость оплодотворения ооцитов, созревших in vitro, ниже, чем у зрелых ооцитов MII, однако, количество эмбрионов хорошего качества различалось незначительно: 47,4% эмбрионов хорошего качества было получено в группе ооцитов, созревших in vitro, тогда как 53,2% эмбрионов хорошего качества было получено в группе ооцитов

MII [291]. Для созревших in vitro и зрелых ооцитов были получены близкие пропорции эмбрионов отличного (5,7 и 7,0%) и удовлетворительного качества (17,6 и 15,3%) соответственно. Эмбрионы, полученные из созревших in vitro ооцитов, переносили только в том случае, если они были более высокого качества или если не было достаточного количества зрелых эмбрионов, полученных из ооцитов.

В другом исследовании было выявлено, что 29% ооцитов, полученых в циклах гормональной стимуляции для ИКСИ, денудированные в день пункции, находились на стадиях GV и MI [292]. 13,3% из незрелых ооцитов достигли стадии MII в ходе развития in vitro позже в день извлечения, а 47,6% на следующий день [292]. Исходно зрелые ооциты имели схожий уровень оплодотворения по сравнению с ооцитами созревшими in vitro, а также ожидаемые проценты достижения стадии дробления и блатоцисты. В конечном итоге 20% всех изначально незрелых ооцитов, которые впоследствии созрели и подверглись ИКСИ, внесли свой вклад в пригодные для использования эмбрионы и были либо перенесены, либо заморожены для возможного использования в будущем [292].

Авторы делают вывод, что в циклах с небольшим количеством ооцитов MII может быть целесообразно инъецировать спонтанно созревшие in vitro ооциты MI, чтобы увеличить количество эмбрионов, доступных для переноса. Следовательно, такие ооциты пригодны для проведения исследований in vitro.

4.1 Транскрипция пцтпДНК HS2 в позднем оогенезе

В этой работе была впервые обнаружена транскрипция пцтп ДНК HS2 на поздних стадиях оогенеза человека при переходе от стадии GV к стадии MI (рисунок 11а, б, 12). Полученные результаты согласуются с данными о глобальной репрессии транскрипционной активности в конце стадии GV, непосредственно перед возобновлением мейоза, когда хроматин начинает конденсироваться вокруг ЯПТ [183,184]. В этот период происходит изменение метаболической активности, когда транскрипционно неактивные ооциты депонируют множество РНК и белков, полученных посредством активной транскрипции и трансляции, необходимых для завершения мейоза, оплодотворения и раннего эмбрионального развития[185,203,211-214]. Результаты работ разных научных групп подтверждают, что нкДНК и их транскрипты связывают процессы оогенеза и эмбриогенеза [219-221].

Для экспериментов FISH использовали зонды, которые выявляли сигналы как полиаденилированных, так и неполиаденилированных РНК HS2. Однако при компьютерном анализе было проанализировано только количество полиаденилированных транскриптов, чтобы избежать контаминации геномной ДНК (см. «Материалы и методы»). Известно, что перицентромерные транскрипты ДНК полиаденилированы у человека и мыши, хотя существование неполиаденилированной сателлитной РНК было продемонстрировано в клеточной линии асцитной гепатомы крыс [15,135,293]. Известно, что существует три ключевых механизма,

используемых клетками для контроля трансляции: регуляция трансляционной активности, регуляция локализации и регуляция стабильности РНК. Среди них трансляционная активность РНК, по-видимому, контролируется de novo полиаденилированием транскриптов [256-258].

Количественная оценка транкрипции пцтпДНК HS2 была выполнена двумя методами. Методом ПЦР в реальном времени было подтверждено, что количество транскриптов в GV ооцитах выше, чем в ближайших к ооциту соматических кумулюсных клетках. На следующем этапе с помощью компьютерного анализа транскриптомов GV и MII ооцитов, полученных от доноров в парах, было продемонстрировано увеличение количества транскриптов пцтпДНК HS2 в MII ооцитах по сравнению с GV ооцитами. Однако следует учитывать, что на момент анализа, секвенирование крупных спутников было затруднено из-за высокого GC-содержания. Перицентромерные области эталонного генома, содержащие HS2, оставались несобранными, и стандартные подходы количественного определения были неприменимы. Однако на следующем этапе анализа последовательностей оставшиеся фрагменты сателлитов присутствовали в SRR, так как они не включались в сборки, поскольку могли привести к ошибкам сборки [294]. Появление T2T-CHM13 сборки генома человека, содержащей собранные перицентромерные области, позволит в будущем использовать стандартные подходы для количественного определения. Сейчас эта работа выполняется,

но полученные материалы будут опубликованы позже и войдут в диссертации других молодых ученых.

Несмотря на использование для количественного анализа MII ооцитов, для экспериментов FISH были взяты ооциты стадии GV/MI, так как MII ооциты не доступны для исследований и используются только в программах донорства. Кроме того, тенденция к увеличению количества транскриптов, выявленная на MII ооцитах в этой работе, совпала с увеличением интенсивности сигнала ДНК-РНК FISH в MI ооцитах по сравнению с GV ооцитами. Этот факт позволил предположить, что реальное количество транскриптов HS2 в MII ооцитах выше, чем можно было бы ожидать, исходя из количества прочтений в наборах данных SRR. Увеличению количества транскриптов в ряду GV-MI-MII может быть связано с завершение цитоплазматического созревания ооцитов на стадии MII, когда процессы депонирования РНК и белков, возможно, достигают своего пика. Важно также отметить отсутствие зависимости между уровнем транскрипции пцтпДНК HS2 в транскриптомах GV и MII ооцитов, полученных от доноров парами, от возраста доноров. Не было обнаружено разницы между возрастными (43 года) и более молодыми (20 года) донорами [28].

Транскрипция пцтпДНК ранее также наблюдалась в оогенезе других животных [8,12,122,221]. У птиц последовательности пцтпДНК и их транскрипты были выявлены в составе боковых петель хромосом ламповых щёток [77]. Вместе транскриптами дисспергированных повторов, эти РНК не

могут служить для запасания белков на стадии вителлогенеза для использования в процессах раннего эмбриогенеза. При этом, в отличие от млекопитающих, у птиц стадия ламповых щеток занимает продолжительное время. В связи с эти была высказана гипотеза заблокированной транскрипции [77] Согласно этим представлениям долгоживущие транскрипты сателлитных ДНК, формирующиеся на боковых петлях ламповых щёток птиц, необходимы для закладки определенного эпигенетического паттерна мишеней для метилирования, важных для устройства функциональной организации генома следующего поколения [77]. Подобная эпигенетическая маркировка имеет решающее значение для ремоделирования хроматина в ходе гаметогенеза и ранних этапов эмбриогенеза.

Транскрипты перицентромерных тпДНК были выявлены в яичниках дрозофилы [295]. На примере другого типа повторяющихся ДНК -диспергированных повторов, была обнаружена роль нкРНК в регуляции транскрипции в ооцитах мыши [24].

В эмбриогенезе млекопитающих накопление перицентромерных классических сателлитных транскриптов наблюдалось на стадии 2-4 клеток у мышей [11] Транскрипты МаСат были необходимы для образования хромоцентров - областей ассоциации ГХ участков хромосом, которые формируют необходимый ГХ паттерн генома [11,23]. Блокирование транскрипции МаСат приводило к нарушению процесса гетерохроматинизации и останавливало развитие эмбриона за счет

нарушения хромоцентров [11]. В соматических клетках образование агрегатов гетерохроматина необходимо для секвестрации некоторых кодирующих областей и белков [296,297]. Транскрипты пцтпДНК участвуют в формировании гибридных структур РНК-ДНК у мышей. Авторы предполагают, что они служат для обеспечения взаимодействия перицентромерного ГХ и РНК-белковых каркасов во время гетерохроматинизации [154]. В эмбрионах человека транскрипция перицентромерных сателлитов была продемонстрирована на четырехклеточной стадии [16]. На последующих этапах развития эмбрионов транскрипция пцтпДНК медленно снижалась до минимума на стадии бластоцисты. Повторный всплеск транскрипции пцтпДНК наблюдался уже при начале органогенеза, при котором и у мыши, и у человека показано последовательное переключение транскрипции между различными органами [17,18]. Широкое исследование экспрессии генов в тканях и органах эмбрионов человека, выявило более 6000 РНК, из которых около 90% соответствуют критериям для lncRNA, однако функциональное значение данных транскриптов пока неизвестно [219].

4.2 Транскрипция С- и С-богатых участков пцтп ДНК

В ходе данной работы была выявлена транскрипции G- (TAAGG) и ^ (ATTCC) богатых участков ТП ДНК Ж2 в созревающих ооцитах. До появления T2T-CHM13 сборки генома человека, считалось, что транскрипция пцтпДНК возможна с разных) цепей ДНК. Поскольку основным мономером

НБ2 и НБ3 является пентамер АТТСС, его комплементарная цепь выглядит как ООААТ. Как правило, наблюдалась симметричная транскрипция, т.е. транскрипция с одной цепи была интенсивнее чем с другой. Доминантное транскрибирование с одной из цепей ДНК зависело от типа клеток, окружающих их условий и от стадии развитии организма [10,13,15,20,132136]. У человека была продемонстрирована цепь-специфичность транскрипции перицентромерных сателлитов при тепловом шоке, когда преимущественно экспрессировалась ООААТ богатая цепь, тогда как в стареющих фибробластах и некоторых раковых линиях транскрибировалась АТТСС богатая цепь [15,20,136]. Во всех этих работах либо использовали ООААТ или АТТСС-богатый зонд, либо амплифицировали полиТ кДНК с помощью одного из специфичных праймеров и праймера к адаптеру, присоединенному к полиТ последовательности. Однако, данные полученные при изучении Т2Т-СНМ13 сборки генома человека показали, что, возможно, речь шла не о транскрипции доминантной цепи, а о транскрипции последовательностей в определенной ориентации - одна и та же последовательность могла располагаться на разных цепях из-за многочисленных инверсий перицентромерных участков [21,76,114]. Таким образом, нет возможности достоверно доказать, что транскрипция точно идет разных цепей или же с одной цепи в разных ориентациях. Для подтверждения нужен широкий анализ окружения последовательностей. При этом представления о транскрипции перицентромерных сателлитов в

эмбриогенезе других животных, например, мышей, к данному моменту не изменились. Считается, что транскрипция перицентромерных сателлитов мыши нить-специфична и переключение между цепями регулируется зависимым от времени образом [11]. Для окончательного ответа на этот вопрос необходима полная, без пропусков сборка генома мыши.

4.3 Роль пцтп ДНК в сборке безмембранных включений

Во всех перечисленных работах, описывающих транскрипцию HS2 в соматических клетках, транскрипты локализовались вблизи перицентромерных участков интерфазных хромосом. В нашем исследовании, проведенном на преовуляторных ооцитах, большие кластеры транскриптов HS2 были обнаружены в ооплазме вдали от хромосом в MI ооцитах (рисунок 11б, 12в). Это наблюдение позволяет предположить, что либо обнаруженные транскрипты перицентромерного сателлита играют роль депо, либо выполняют в ооците другую функцию. Выявленные транскрипты HS2 показали высокую степень гомологии с HS РНК, описанными в клетках, подвергшихся тепловому шоку [135]. Эти транскрипты необходимы для сборки ЯСТ — безмембранных РНП-структур, связанных с перицентромерным гетерохроматином во время клеточного ответа на стрессовые стимулы, например, тепловой шок [13,156,157]. Была выдвинута гипотеза, что активация транскрипции HS2, вероятно, участвует в глобальном индуцированном стрессом подавлении экспрессии генома по всему геному посредством временной секвестрации транскрипционных

факторов [157]. Однако транскрипция классических сателлитов ИБ2 пцтпДНК происходит не только в стрессовых клетках, но и в опухолях или при канцерогенезе [15,19,173,175,176,298,299]. В некоторых опухолях мышей сателлитные транскрипты составляют до 50% всей клеточной РНК [173]. Транскрипция перицентромерной ДНК была установлена также в широком спектре опухолей у мышей и человека [19,173]. Транскрипты могут играть различную роль в прогрессии опухоли. Например, они могут увеличивать нестабильность генома [175]. Они также могут участвовать в реорганизации ядерной архитектуры и перепрограммировании генома через механизмы фазового перехода и секвестрации белков. ДНК и РНК ИБ2 обладают исключительной способностью действовать как молекулярные губки и секвестрировать регуляторные белки хроматина в аномальные ядерные тельца при раке [19]. Недавние данные, представленные ЯиЫеп й а1 (2020), позволяют предположить, что наблюдаемая секвестрация геномных регуляторных белков в ЯСТ, содержащие РНК ИБ2 объясняется дифференциальной растворимостью определенных белков в жидких каплях РНК ИБ2 [300]. Авторы продемонстрировали, что фазовое разделение РНК ИБ2 на такие капли зависело от ее длины и последовательности. Таким образом, опираясь на перечисленные примеры, можно предположить, что транскрипты НБ часто участвуют в формировании безмембранных РНП, телец и т. д., выполняя различные функции, в том числе нередко инициируя

сборку подобных структур. Такие РНП структуры участвуют в секвестрации и инактивации различных белков и транскриптов.

4.3.1 Безмембранные РНП включения ассоциированные с митохондриями

в поздних ооцитах человека

В данной работе было обнаружено, что транскрипты HS2 располагались колокализованно с РНК-хеликазами DDX5 и DDX4 в ооплазме поздних ооцитов человека (рисунок 12, 15), предположительно, формируя безмембранные РНП структуры. По литературным данным, известно, что в раннем оогенезе уже выявлены безмембранные РНП, обогащенные РНК-хеликазами и нкРНК, которые обозначают общим термином ЗГ. В оогониях человека и в оогониях и неонатальных ранних ооцитах мыши был выявлен один из подвидов ЗГ — nuage [301-303]. Первоначально nuage описывали как базофильный участок ооплазмы, необходимый для формирования анимально-вегетативной оси в ооците многих животных, например у Xenopus и рыбок Danio. Сейчас известно, что nuage это безмембранные РНП-биоконденсаты, структуры, которые отделены от прочего содержимого клетки с помощью механизмов фазового перехода [259]. nuage характеризуются пернуклеарной локализацией и часто локализованы вблизи митохондрий. Обязательным признаком nuage является наличие РНК-хеликазы DDX4 и других белков, участвующих в ремоделировании РНП. и сплайсинге, а также нкРНК различных типов, в т.ч. miRNA и piRNA [41,304306]. DDX4 является маркерным белков nuage и ЗГ, так как содержит IDR

домены, который имеют решающее значение для процессов фазового перехода и формирования безмембранных структур [263]. У грызунов nuage содержит молекулы, которые необходимы (1) для инактивации ретропозонов и (2) для секвестрации важных материнских РНК, отделяя их от рибосом до тех пор, пока не потребуется их трансляция [41]. Разделение фаз придает этим РНП свойства «капли в капле», позволяя быстро конденсироваться и растворяться в зависимости от состава окружающей среды и обеспечивая им обмен компонентами. Таким образом, конденсаты, дополняют везикулярные органеллы, которые способны на долговременную изоляцию макромолекул, но требуют больше времени на обмен компонентами.

Также в оогенезе всех позвоночных, за исключением мыши, была выявлена особая безмембранная структура, называемая ТБ [243]. ТБ обычно состоит из специфического для зародышевой линии подмножества митохондрий, элементов шероховатого ЭР, многочисленных комплексов Гольджи и вкраплений электронно-плотного материала nuage/ЗГ, сосредоточенного в ближайшей к полюсу области [239,243,246]. У Xenopus и Danio ТБ необходимы для закладки вегетативного полюса яйца, тогда как данных об участии ТБ формировании полярности у млекопитающих до сих пор нет. [245,250,307,308]. ТБ ооцитов млекопитающих имеют много общего с ЯСТ других типов клеток. ЯСТ представляют собой внутриядерные РНП, содержащие мРНК и белки, которые участвуют в регуляции сплайсинга и хранении мРНК. На этом основании была выдвинута гипотеза, что роль ТБ

может заключаться в защите РНК от деградации и/или в депонировании РНК и белков до момента, когда эти транскрипты и белки потребуются. ТБ также обеспечивает механизм пространственного ограничения их активности. Таким образом, путем формирования ТБ, реализуются 2 пути контроля трансляции: регуляции локализации и стабильности РНК. ТБ у Xenopus, в отличие от nuage, которые представляют собой жидкие биоконденсаты, ведут себя как гели или «твердые тела» со стабильной структурой, где «твердое тело» — это вязкоупругий макромолекулярный осадок, состоящий из осажденного белка [37,223,247]. Данный факт может косвенно подтверждать защитную роль ТБ, как структур пригодных к долговременному хранению РНК и белков в периоды покоя ооцитов. При этом физико-химические свойства ТБ человека неизвестны и требуют дальнейших исследований. Примечательно, что материнские мРНК, необходимые на более поздних стадиях для спецификацией клеток зародышевой линии эмбриона, локализованы в ТБ [309]. Ранее у млекопитающих ТБ наблюдались только на ранних стадиях оогенеза в примордиальных фолликулах [310]. Позже они были продемонстрированы в кистах зародышевых клеток и примордиальных фолликулах у мыши [249]. Однако общая структура ТБ у мыши отличается от структуры ТБ у Xenopus: у мыши ТБ не содержит митохондрий и окружен комплексами Гольджи [249]. Поэтому структуру присущую для мышей иногда называли кольцом Гольджи. Согласно последним данным, полученным при прижизненном изучении ооцитов мышей, ТБ-подобная

структура мыши отличается от ТБ человека и лягушки и вероятно не может быть классифицирована как ТБ [251]. Основное отличие заключается в отсутствии IDR-белков (например, XVelo у Xenopus, DDX4 у человека), которые бы скрепляли компоненты ТБ. Другим важным открытием, выступающим против обозначения кольца Гольджи как подвида ТБ, является тот факт, что образование кольца Гольджи является обратимым и не связано с длительным периодом покоя ооцита [251]. Таким образом, принимая во внимание различия оогенеза человека и мыши, стоит сохранять осторожность при экстраполяции результатов исследований, полученных на мыши, на человека.

Хотя образование ТБ у мышей в настоящее время находится под вопросом, существование nuage не подвергается сомнению. Маркерный белок nuage - VASA (MVH/DDX4) обнаруживается в ооцитах взрослых мышей со стадии примордиальных фолликулов до начала формирования антральных фолликулов [253]. Полярная кортикальная область базофильной ооплазмы у мышей сохраняется, по крайней мере, до завершения стадии MI [310]. Некоторые белки характерные для nuage образуют временные РНК-содержащие агрегаты в полностью выращенных SN ооцитах. Эти агрегаты, называемые P-тельцами ооцитов, диссоциируют во время созревания ооцитов, что согласуется с рекрутированием материнских мРНК, происходящим в это время [311]. Также сообщается, что при разборке

nuage/ЗГ или P-телец в ооцитах млекопитающих в субкортикальной области SN ооцитов формируются РНК-содержащих агрегаты [312].

В этом исследовании, РНК-хеликаза DDX4 присутствовала в ооцитах человека на стадии MI. Таким образом, время сборки DDX4-содержащих безмембранных РНП в оогенезе человека отличается от оогенеза мыши. Однако у мыши было установлено существование отдельных кластеров полиА-РНК на GV-MП стадиях [313].

4.3.2 Инактивация транскрипции пцтпДНК И82 в позднем оогенезе человека

Инактивации транкрипции пцтпДНК путем цитоплазматических микроинъекций 2'-О-Метил антисмысловых олигонуклеотидов привела к статистически достоверной инактивации ~30% исследуемых транскриптов сателлитной ДНК [241]. При этом при введении дозы 8,5 фмоль достоверного понижения уровня транскрипции не наблюдалось. Однако достоверно снижалась общая площадь DDX4 сигналов и мы наблюдали тенденцию к снижению общего числа иммунофлюоресцентных сигналов и их среднего размера. Мы предполагаем, что это свидетельствует о нарушениях в сборке DDX4-включений. Напротив, при повышении концентрации антисмысловых олигонуклеотидов, происходило достоверное снижение количества транскриптов ИБ2 в ооците и наблюдалась диссоциация ранее обнаруженных DDX4-содержащих РНП частиц, так как было выявлено увеличение площади

флуоресценции АТ против ББХ4, а также числа отдельных флуоресцентных сигналов, ответствующих ББХ4 [37,241].

Инактивация транскрипции пцтпДНК ИБ2 может приводить к диссоциации РНП, сходной с разборкой Р-телец во время созревания ооцитов, при рекрутировании материнских мРНК [241,311]. В связи с этим, диссоциация РНП частиц может играть критическую роль для развития ооцитов, быть причиной остановки созревания или возникновения патологических синдромов, в том числе связанных с проблемами оплодотворения. Хотя в последние годы предложен принципиально новый механизм регулирования динамики конденсатов. Теория реентерабельного фазового перехода основана на идее о том, что наоборот низкие концентрации РНК способствуют образованию капель конденсата, а более высокие концентрации РНК приводят к их растворению по механизму инверсии заряда [314].

Известно, что функции нескольких типов безмембранных биоконденсатов связаны с пцтпРНК, например, участие мРНК в формировании ЯСТ, сплайсинг мРНК в ядерных спеклах или синтез рРНК в ядрышках [38,222]. Эти работы выявили важную роль пцтпРНК в регуляции процессов фазового перехода [232-234]. Считается, что пцтпРНК могут быть классифицированы как архитектурные РНК, участвующие в секвестрации ГОЯ-содержащих РНП-связывающих белков и повышении их локальной концентрации для запуска механизмов фазового перехода [315]. Также

пцтпРНК, по-видимому, участвует в контроле сборки и разборки биоконденатов и их физических свойств. РНК представляет собой молекулу с уникальным потенциалом для контроля процессов фазового перехода. РНК одноцепочечная и, следовательно, более гибкая по сравнению с двухцепочечной ДНК. Было продемонстрировано, что многие классы РНК или их смеси способны к самосборке биоконденатов без участия белков [233,316-319]. Молекулы РНК могут быть либо структурированы (например, образовывать шпильки, распознаваемые специфическими белками), либо состоять из структурированных и неструктурированных доменов [224,320]. Некоторые из неструктурированных мотивов РНК функционально имитируют LCD-домены белков. Последовательности РНК с такими мотивами ведут себя подобно LCD-содержащим белкам и могут запускать сборку биоконденатов. Таким образом, РНК индуцирует фазовое разделение белка MEG-3, ключевого белка P-гранул C. elegans [321]. Остановка трансляции во время клеточного стресса позволяет мРНК действовать в роли затравки для ЯСТ [233,317]. нкРНК Men е/р и NEAT1 способствуют образованию ядерных параспеклов [222,224,322,323]. РНК низкой сложности (например, поли-U) сами по себе или в комплексе с полиаминами образуют биоконденаты in vitro [316,323], где небольшое количество РНК сначала способствует образованию капелек белка, а затем начинает растворять капли, как только концентрация РНК достигает порогового значения [314]. Длинные и трансляционно-репрессированные (экспонированные) транскрипты имеют

тенденцию входить в состав РНП (Rangan et al., 2009; Namkoong et al., 2018; Hubstenberger et al., 2013). Эти РНК могут иметь больше конформационных состояний, чем трансляционно активные РНК (Ding et al., 2005), а также могут участвовать в большем количестве взаимодействий белок-РНК, РНК-РНК или участвовать в спаривании оснований [224,319]. Было выявлено, что транскрипты HS2 способны секвестрировать РНК-связывающие белки, функционируя как затравочный центр для биоконденсатов в клетках HeLa, подвергшихся тепловому шоку [170].

Обобщая вышесказанное, можно отметить, что пцтпДНК HS2 участвует в процессах сборки-разборки биокондесатов либо играя роль в секвестрации IDR-содержащих РНП-связывающих белков, либо участвуя как затравочный центр, способный к фазовому разделению.

4.3.3 Возможная клиническая значимость полученных результатов

В работах клинических эмбриологов отмечены различные типы цитоплазматических включение (дисморфизмов) выявляемых в поздних ооцитах человека: липофусциновые тельца, центрально расположенные гранулярности, вакуолизация и агрегаты гладкого ЭР (ГЭР) [328]. Наличие этих образований связывают с цитоплазматической незрелость клетки [328]. Среди возможных причин появления дисморфизмов ооцитов рассматривают возраст, генетические и метаболические нарушения, гинекологические заболевания [329,330]. Информации о связи между указанными факторами и появлением дисморфизмов ооцитов на данным момент нет [328].

Центральная гранулярность цитоплазмы представляет собой крупную темную губчатую зернистую область в цитоплазме и встречается в 30-35% случаев [328]. Однозначного мнения о влиянии гранулярности цитоплазмы ооцитов на успешность программ ВРТ на данный момент нет [331].

Вакуоли представляют собой цитоплазматические включения, окруженные мембраной заполненные жидкостью, иногда содержащие дегенерирующие лизосомы или митохондрии. Вакуоли могут появляться спонтанно во время созревания ооцита [328]. Часто вакуоли выявляют в дегенеративных и незрелых ооцитах. В MII ооцитах распространенность вакуолизации составляет лишь 3-4% [328,332]. Наличие вакуолей снижает потенциал дальнейшего развития ооцитов и эмбрионов [332].

Липофусциновые тельца (липофусциновые гранулы) состоят из смеси липидов и плотного материала гранул, часто окруженных мембраной. Липофусциновые тельца выявляют на различных стадиях созревания ооцитов. Размер гранул липофусциновых телец может оказывать влияние на частоту оплодотворения и развитие эмбрионов до стадии бластоцисты [328]. Накопление липофусцина в цитоплазме ооцитов может являться результатом адаптации клетки к неблагоприятным окружающим условиям [333].

Скопление ГЭР представляет собой круглые гладкие прозрачные диски, часто локализованные в центре ооцита. Данный вариант дисморфизмов наблюдается только в 0,5-2% МП ооцитов [328]. Появление

агрегатов ГЭР снижает вероятность оплодотворения клетки и потенциал развития эмбриона [328].

Согласно протоколам СОП клиник, эмбриологи избегают проводить микроманипуляции (например, ИКСИ) в зонах цитоплазматических включений (дисморфизмов), так как повреждение этих включений может приводить к дегенерации ооцитов [328].

К настоящему времени в ооцитах млекопитающих поздних стадий созревания не было описано безмембранных РНП, ассоциированных с митохондриями. Таким образом, обнаруженные РНП, содержащие как минимум транскрипты пцтпДНК ИБ2, РНК-хеликазы DDX4 и DDX5, расположенные вблизи митохондрий, выявлены впервые. Предполагается, что обнаруженные РПН необходимы для депонирования материнских РНК и белков, используемых в процессах раннего эмбриогенеза до запуска собственного генома эмбриона.

165 5 Выводы

1. Полиаденилированные транскрипты перицентромерной тандемно повторяющейся ДНК HS2 присутствуют в транскриптомах преовуляторных ооцитов

2. В ходе завершающей стадии оогенеза происходит накопление транскриптов перицентромерной тандемно повторяющейся ДНК HS2 - их количество в MII ооцитах выше по сравнению с GV ооцитами. Содержание транскриптов в ооцитах выше, чем в кумулюсных клетках

3. Транскрипты перицентромерной тандемно повторяющейся ДНК HS2 в позднем оогенезе после разборки ядра локализованы в составе РНП структур, ассоциированных с митохондриями.

4. В ходе созревания ооцит аккумулирует РНК HS2, транскрибированные как с ATTCC, так и с GGAAT последовательностей

5. Инактивация транскрипции перицентромерной тандемно повторяющейся ДНК HS2 в позднем оогенезе человека приводит к достоверному уменьшению количества сигналов соответствующих РНК HS2 после FISH и к диссоциации РНП-структур.

6 Список литературы

1. Richard G.-F., Kerrest A., Dujon B. Comparative genomics and molecular dynamics of DNA repeats in eukaryotes // Microbiol. Mol. Biol. Rev. Microbiol Mol Biol Rev, 2008. Vol. 72, № 4. P. 686-727.

2. Choo K.H. Centromere DNA dynamics: latent centromeres and neocentromere formation // Am. J. Hum. Genet. 1997. Vol. 61, № 6. P. 1225-1233.

3. Therkelsen A.J., Nielsen A., K0lvraa S. Localisation of the classical DNA satellites on human chromosomes as determined by primed in situ labelling (PRINS) // Hum. Genet. 1997. Vol. 100, № 3-4. P. 322-326.

4. Lee C. et al. Human centromeric DNAs // Hum. Genet. 1997. Vol. 100, № 34. P. 291-304.

5. Thakur J. et al. Sequence, Chromatin and Evolution of Satellite DNA // Int. J. Mol. Sci. 2021, Vol. 22, Page 4309. Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2021. Vol. 22, № 9. P. 4309.

6. Krasikova A. V, Vasilevskaia E. V, Gaginskaia E.R. [Chicken lampbrush chromosomes: transcription of tandemly repetitive DNA sequences] // Genetika. 2010. Vol. 46, № 10. P. 1329-1334.

7. Solovei I. V et al. Transcription of lampbrush chromosomes of a centromerically localized highly repeated DNA in pigeon (Columba) relates to sequence arrangement // Chromosom. Res. An Int. J. Mol. Supramol. Evol. Asp. Chromosom. Biol. 1996. Vol. 4, № 8. P. 588-603.

8. Trofimova I., Krasikova A. Transcription of highly repetitive tandemly organized DNA in amphibians and birds: A historical overview and modern concepts // RNA Biol. 2016. Vol. 13, № 12. P. 1246-1257.

9. Lehnertz B. et al. Suv39h-mediated histone H3 lysine 9 methylation directs DNA methylation to major satellite repeats at pericentric heterochromatin // Curr. Biol. CB. 2003. Vol. 13, № 14. P. 1192-1200.

10. Rudert F. et al. Transcripts from opposite strands of gamma satellite DNA are differentially expressed during mouse development // Mamm. Genome Off. J. Int. Mamm. Genome Soc. 1995. Vol. 6, № 2. P. 76-83.

11. Probst A. V et al. A strand-specific burst in transcription of pericentric satellites is required for chromocenter formation and early mouse development // Dev. Cell. 2010. Vol. 19, № 4. P. 625-638.

12. Macgregor H.C. In situ hybridization of highly repetitive DNA to chromosomes of Triturus cristatus // Chromosoma. 1979. Vol. 71, № 1. P. 57-64.

13. Rizzi N. et al. Transcriptional activation of a constitutive heterochromatic domain of the human genome in response to heat shock // Mol. Biol. Cell. 2004. Vol. 15, № 2. P. 543-551.

14. Plohl M. et al. Satellite DNAs between selfishness and functionality: structure, genomics and evolution of tandem repeats in centromeric (hetero)chromatin // Gene. 2008. Vol. 409, № 1-2. P. 72-82.

15. Enukashvily N.I. et al. Human chromosome 1 satellite 3 DNA is

decondensed, demethylated and transcribed in senescent cells and in A431 epithelial carcinoma cells // Cytogenet. Genome Res. 2007. Vol. 118, № 1. P. 42-54.

16. Yandlm C., Karakulah G. Expression dynamics of repetitive DNA in early human embryonic development // BMC Genomics. BMC Genomics, 2019. Vol. 20, № 1.

17. Кузнецова Т.В. et al. Локализация и транскрипция прицентромерного гетерохроматина хромосомы 1 в эмбриональных и экстраэмбриональных тканях человека // Медицинская Генетика. 2012. Vol. 11, № 4 (118). P. 19-24.

18. Трофимова И.Л. et al. Транскрипция сателлитной ДНК в эмбриогенезе человека: обзор литературы и собственные данные // Медицинская генетика. 2018. Vol. 17, № 3. P. 3-7.

19. Hall L.L. et al. Demethylated HSATII DNA and HSATII RNA Foci Sequester PRC1 and MeCP2 into Cancer-Specific Nuclear Bodies // Cell Rep. 2017. Vol. 18, № 12. P. 2943-2956.

20. Enukashvily N.I., Malashicheva A.B., Waisertreiger I.S.-R. Satellite DNA spatial localization and transcriptional activity in mouse embryonic E-14 and IOUD2 stem cells // Cytogenet. Genome Res. 2009. Vol. 124, № 3-4. P. 277-287.

21. Enukashvily N.I. et al. Pericentromeric satellite lncRNAs are induced in cancer-associated fibroblasts and regulate their functions in lung

tumorigenesis // Cell Death Dis. 2023 141. Nature Publishing Group, 2023. Vol. 14, № 1. P. 1-15.