Пространственная структура димарганцевой каталазы Thermus thermophilus с разрешением 1 A тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.18, кандидат физико-математических наук Антонюк, Светлана Владимировна

• Антонюк, Светлана Владимировна
• кандидат физико-математических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Антонюк, Светлана Владимировна

Введение.

Глава 1. Марганцевые кластеры в белках (по литературным данным).

1. Введение. Роль марганца в живой природе.

2. Химическая природа геометрическая координация ионов Мп в марганецсодержащих белках.

2.1. Координационные связи иона Мп с азотами имидазола гистидина.

2.2. Координационные связи иона Мп с кислородами карбоксильных групп.

2.3. Экзогенные лиганды.

3. Природные белки, содержащие ионы марганца в активном центре.

3.1.Аргиназа из печени крысы.

3.2. Пролин специфическая аминопептидаза (АМРР) из Escherichia Coli.

3.3. Протеиновая фосфатаза-1.

3.4. Супероксиддисмутаза (СОД).

4. Димарганцевые каталазы.

4.1. Первичная структура димарганцевой каталазы из Thermits thermophilus.

4.2. Магнитные свойства Мп кластеров в марганцевых каталазах.

4.3. Влияние анионов на окислительное состояние и активность димарганцевой каталазы.

4.4. О механизме действия димарганцевой каталазы.

Глава 2. Исследования каталазы с использованием метода Электронного Парамагнитного Резонанса.

1. Введение.

2. Материалы и методы. 42 2.1. Э1 IP - измерения.

2.2. Ферментативная активность.

2.3. Оценка относительного содержания активных центров в различных состояниях окисления.

2.4. Влияние перекиси водорода на различные окислительных состояния биядерного кластера.

2.5. Обсуждение.

Глава 3. Рентгеноструктурные исследования димарганцевой каталазы из Ткегтиз ОгегторкИт.

1. Пространственная структура димарганцевой каталазы при разрешении 1.4 А.

2. Определение структуры нативного фермента и ингибированного ионами хлора с атомным разрешением 1.05-0.98 А.

2.1. Материалы и методы

2.1.1. Кристаллизация.

2.1.2. Применение метода многократного перемораживания к кристаллам димарганцевой каталазы и его усовершенствование.

2.1.3. Сбор и обработка экспериментальных данных.

2.2. Уточнение пространственной структуры димарганцевой каталазы

2.2.1. Уточнение и достраивание атомной модели фермента. Общая стратегия.

2.2.2. Уточнение структуры нативного фермента.

2.2.3. Уточнение структуры ингибированного фермента.

Глава 4. Описание и анализ атомной модели димарганцевой каталазы.

1. Анализ качества модели.

2. Водородные связи внутри субъединицы.

3. Сульфат ионы и ионы и их окружение.

4. Различия в структуре субъединиц, связанных некристаллографической симметрией.

5. Сравнение структур димараганцевой каталазы в кислых и щелочных условиях.

6. Пространственная структура активного центра димарганцевой каталазы. Сравнение активных центров нативного и ингибированного фермента

7. Каналы.

8. Сравнение структуры и строения активного центра суперокисленной димарганцевой каталазы (Мп3+, Мп4+) со структурой нативной димарганцевой каталазы (Мп3+, Мп3+).

Глава 5. Обсуждение результатов.

1. Отличия активного центра димарганцевой каталазы от активных центров других ди-марганцевых ферментов.

2. Несоответствия предложенного ранее механизма ферментативной реакции пространственной структуре активного центра димарганцевой каталазы.

3. Механизм действия димарганцевой каталазы с учетом пространственной структуры активного центра. 99 Основные результаты и выводы.

Благодарности

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пространственная структура димарганцевой каталазы Thermus thermophilus с разрешением 1 A»

Изучение пространственной структуры биологи чеких макромолекул является важным направлением современной науки, так как позволяет связать накопленные различными методами наблюдения над функционированием биологических систем с пространственным описанием на молекулярном уровне. Атомное разрешение (выше 1.2 А) позволяет получить самую полную информацию о структуре фермента, расположении водородных атомов и подвижности боковых цепей аминокислотных остатков белка, анизотропии неводородных атомов, включении в модель белковой молекулы молекул растворителя с частичной заселенностью. Получение рентгеновских дифракционных данных атомного разрешения стало возможно только благодаря применению синхротронного излучения, двумерным детекторам и методике низкотемпературной съемки. В настоящее время в PDB (Банк Белковых Данных) имеется только 40 структур с атомным разрешением из более чем 3000 белковых структур.

Данная работа посвящена ренгеноструктурным исследованиям димарганцевой каталазы из Thermus thermophilics с разрешением 1 А.

Актуальность этой работы связана с тем, что в настоящее время известны и изучены шесть гемовых каталаз. выделенных из различных источников, и значительно менее изученными являются димарганцевые каталазы, живущие в термофильных условиях при 90аС, при которых гемовые каталазы денатурируют. Известны димарганцевые каталазы. выделенные из бактерий Thermus thermophilus, Lactobacillus plantarum и Thermoleophilum album. Пространственная структура только одной из них, каталазы из Thermus thermophilus, была исследована с разрешением 3 А [1]. Были показаны ход основной цепи и расположение двух ионов Мп в межспиральной области. Оказалось, что структура димарганцевой каталазы отличается от структур гемовых каталаз, как по укладке полипептидной цепи, так и по активному центру, содержащему вместо гемогруппы два расположенных рядом иона марганца. Однако разрешение ЗА не позволяло определить расположение аминокислотных остатков в активном центре и понять стереохимический механизм действия фермента. Поэтому актуальной задачей было определение, уточнение и описание структуры димаганцевой каталазы с атомным разрешением.

В задачу диссертации входило определение и уточнение пространственной структуры нативной и ингибированной ионами хлора димарганцевой каталазы из Thermus thermophilus с атомным разрешением, анализ пространственной структуры и определение механизма ферментативной активности димарганцевой каталазы на основе точных структурных данных высокого разрешения.

Диссертация состоит из пяти глав. Первая глава представляет собой обзор литературы по свойствам ионов марганца и известным природным белкам, содержащим либо два иона марганца в активном центре, либо один ион марганца, способный менять состояние окисления в процессе ферментативной реакции. В главе также затрагиваются данные о гемовых каталазах и димарганцевой каталазе из Thermus thermophilus, рассматривается предложенный ранее механизм ферментативной реакции димарганцевой каталазы.

Во второй главе диссертации представлена экспериментальная часть работы по исследованиям активных состояний димарганцевой каталазы методами ЭПР и фотометрическим методом.

В третьей главе представлена экспериментальная часть работы по структурным исследованиям димарганцевой каталазы, состоящая из материалов и методов определения структуры нативной каталазы и ее комплекса с хлоридом с разрешением 1.05 и 0.98 А, соответственно, и их уточнению.

Четвертая глава посвящена анализу качества построенной модели, детальному описанию пространственной структуры молекулы основанном на анализе водородных связей и описанию строения активного центра.

В пятой главе обсуждается возможный стереохимический механизм ферментативной активности димарганцевой каталазы.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые с атомным разрешением определена пространственная структура димарганцевой каталазы и ее активного центра. Точные структурные сведения о расположении аминокислотных остатков в активном центре, полученные в данной работе представляют надежную структурную базу для построения стереохимического механизма каталазной реакции. Полученные результаты существенно расширяют и уточняют существующие представления о механизме ферментативной активности фермента, основанные на исследованиях биохимическими методами и методами электронного парамагнитного резонанса.

Заключение диссертации по теме «Кристаллография, физика кристаллов», Антонюк, Светлана Владимировна

Основные результаты и выводы.

1. Методом ЭПР исследованы состояния ионов Мп в окисленной и восстановленной форме фермента. Показано, что активный центр каталазы в процессе разложения перекиси водорода переходит из состояния (Мп2+, Мп2+) в состояние (Мп3+, Мп3+).

2. Найдены условия получения кристаллов димарганцевой каталазы из Thermus thermophilus VK1, дифрагирующих до 1.0 А.

3. С использованием синхротронного излучения и низкотемпературной съемки собраны и обработаны дифракционные данные от нативных кристаллов димарганцевой каталазы из Thermus thermophilus и комплекса с ингибитором хлоридом натрия с разрешением 1.05 и 0.98 Ä соответственно.

4. Построены атомные модели нативной и ингибированной димарганцевой каталазы из Thermus thermophilus, которые уточнены до R-фактора 9.8 и 10.0% соответственно.

5. Проведен анализ и сравнение пространственной структуры нативной и ингибированной хлоридом димарганцевой каталазы, включающий анализ водородных и ионных связей, контактов между субъединицами и контактов между молекулами.

6. На основании анализа пространственной структуры активного центра нативного и ингибированного фермента предложен механизм реакции разложения перекиси водорода димарганцевой каталазой из Thermus thermophilus с учетом пространственной структуры активного центра фермента.

Автор выражает глубокую благодарность В.Р.Мелик-Адамяну за руководство диссертационной работой;

В.В.Барынину и С.В.Хангулову за обсуждение результатов и поддержку;

A.И.Гребенко за ценные советы по кристаллизации фермента;

B.C. Ламзину за предоставленную возможность использовать оборудование и компьютеры EMBL в ходе выполнения работы;

А.Н.Попову за помощь в получении и обработке данных и плодотворную дискуссию в ходе выполнения работы;

Всем сотрудникам Лаборатории структуры биокристаллов за моральную поддержку и интерес, проявленный к работе.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Антонюк, Светлана Владимировна, 2000 год

1. Барынин, В.В., Вагин А.А, Мелик-Адамян, В.Р., Гребенко А.И., Хангулов, С.В., Попов А.Н.; Андрианова М.Е., Ваинштейн Б.К. (1986). Пространственная структура Т-каталазы с разрешением 3.OA. Докл. Акад.наук СССР 288(4), 877-880;

2. Cotton, F.A. & Wilkinson, G. (1980) Advanced Inorganic Chemistry, 4th Edn. Wiley, New York; 3.2. Bemshtein, F.C., Koetzle, T.F., Williams, G.J.B., Meyer, E.F., Brice, M.D., Rodgers, J.R., et al (1977) Journal of Molecular Biology 112, 535-542;

3. Christianson, D.W. Anfinsen, C.B., Edsall, J.T., Richards, F.M. & Eisenberg, D.S. (1991) Structural biology of zinc. Advances in Protein Chemistry: Metalloproteins Structural Aspects 42, 281-355;

4. Weighardt K. (1989) Angew. Chem. Int. Ed.Engl. 28, 1153-1172;

5. Glusker, G.P., Anfinsen, C.B., Edsall, J.T., Richards, F.M. & Eisenberg, D.S. (1991) Structural aspects of metal-liganding to functional groups in proteins. Advances in Protein Chemistry: Metalloproteins Structural Aspects 42, 1-76;

6. Chakrabarty, P. (1990) Geometry of interaction of metal-ions with histidine-residues in proteinstructures. Protein Engineering 4(1), 57-63;

7. Carrell, C.J., Carrell, H.L., Erlebacher, J., Glusker, J.P. (1988). Structural aspects of metal-ioncarboxylate interactions. Journal Of The American Chemical Society 110(26), 8651-8656;

8. Vedani A., Huhta D.V. (1990) A new force-field for modeling metalloproteins. Journal Of The

9. American Chemical Society 112(12), 4759-4767;

10. Christianson, D.W. (1997) Structural chemistry and biology of manganese metalloenzymes.

11. Progress In Biophysics & Molecular Biology 67(2-3), 217-252.

12. Bradbury, J.H. and Carver, J.A. (1984) Conformational differences between various myoglobin ligated states as monitored by H-l-NMR spectroscopy. Biochemistry 23(21), 4905-4913;

13. Carver, J.A. and Bradbury, J.H.(1984) Assignment of H-l-NMR resonances of histidine and other aromatic residues in met-myoglobin, cyano-myoglobin, oxy-myoglobin, and (carbon monoxy)myoglobin. Biochemistry 23(21), 4890-4905;

14. Rardin R.L., Tolman W.B. and Lippard S.J. (1991) Monodentate carboxylate complexes and the carboxylate shift implications for polymetalloprotein structure and function. New Journal Of Chemistry 15(6), 417-430:

15. Carrell, C.J., Carrell, H.L., Erlebacher, J., Glusker, J.P. (1988). Structural aspects of metal-ion carboxylate interactions. Journal Of The American Chemical Society, 110(26), 8651-8656;

16. Lippard, S.J. and Berg, J.M. (1994) Principles of Bioinorganic Chemistry. University Science Books, Mill Valley, CA;

17. Dismukes, G.C. (1996) Manganese enzymes with binuclear active sites. Chemical Reviews, 96(7), 2909-2926;

18. Kanyo, Z.F., Scolnick, L.R., Ash, D.E., Christianson, D.W. (1996) Structure of a unique binuclear manganese cluster in arginase. Nature 383, 554-557;

19. Krebs, H.A., Henseleit, K. & Hoppe-Seyles, Z. (1931) Physiol.Chem.210, 33-66.

20. Reckowski R.S., Ash D.E. (1989; Journal Of The American Chemical Society 111, 6412-6419.

21. Scolnick, L.R., Kanyo, Z.F., Cavalli, R.C., Ash, D.E., Christianson, D.W. (1997) Altering the binuclear manganese cluster of arginase diminishes thermostability and catalytic function. Biochemistry 36(34), 10558-10565;

22. Wilce, M. C. J. C. S. Bond, N. E. Dixon, H. C. Freeman, J. M. Guss, P. E. Lilley and J. A. Wilce (1998) Structure and mechanism of a proline-specific aminopeptidase from Escherichia coli.

23. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95(7), 34723477;

24. Roderick, S.L. and Matthews, B.W. (1993) Structure of the cobalt-dependent methionine aminopeptidase from escherichia-coli a new type of proteolytic-enzyme. Biochemistry 32(15), 3907-3912;

25. Cohen, P. (1989) The structure and regulation of protein phosphatases. Annual Review Of Biochemistry 58. 435-508;

26. Shenolikar, S. (1994) Protein serine/threonine phosphatases new avenues for cell regulation. Annual Review Of Cell Biology 10, 55-86;

27. Johnson, L.N., Barford, D. (1993) The effects of phosphorylation on the structure and function of proteins. Annual Review Of Biophysics And Biomolecular Structure 1(22), 199-232;

28. Stone, R.L., Dixon, J.E. (1994) Protein-tyrosine phosphatases. Journal Of Biological Chemistry, 269(50): 31323-31326;

29. Goldberg, J., Huang, H.B., Kwon, Y.G., Greengard, P., Nairn, A.C., Kuriyan, J. (1995) 3-dimensional structure of the catalytic subunit of protein serine/threonine phosphatase-1. Nature 376, 745-753;

30. Egloff, M.P., Cohen, P.T.W., Reinemer, P., Barford, D. (1995) Crystal-structure of the catalytic subunit of human protein phosphatase-1 and its complex with tungstate. Journal of Molecular Biology, 254(5), 942-959;

31. Vincent, J.B., Averill, B.A. (1990) Sequence homology between purple acid-phosphatases and phosphoprotein phosphatases are phosphoprotein phosphatases metalloproteins containing oxide-bridged dinuclear metal centers? FEBS Letters, 263(2), 265-268;

32. Berndt, N. and Cohen, P.T.W. (1990) Renaturation of protein phosphatase-1 expressed at high-levels in insect cells using a baculovirus vector. European Journal Of Biochemistry, 190(2), 291297;

33. Koonin, E.V. (1994) Conserved sequence pattern in a wide variety of phosphoesterases. Protein Science, 3(2), 356-358;

34. Zhuo, S.Q., Clemens, J.C., Stone, R.L., Dixon, J.E. (1994). Mutational analysis of a ser/thr phosphatase identification of residues important in phosphoesterase substrate-binding and catalysis. Journal Of Biological Chemistry, 269(42), 26234-26238;

35. Beese, L.S., Stietz, T.A. (1991) Structural basis for the 3-5'exonuclease activity of Escherichia-coli DNA-polymerase-i a 2 metal-ion mechanism. Embo Journal, 10(1), 25-33;

36. Lavelle,F., McAdam, M.E., Fielden, E.M.(1977) Biochemical Journal 161,3-11.

37. Ludwig, M.L., Metzger, A.L., Pattridge, K.A., Stallings, W.C. (1991) Manganese superoxide-dismutase from thermus-thermophilus a structural model refined at 1.8A resolution. Journal Of Molecular Biology, 219(2), 335-358

38. Parker, M.W. and Blake, C.C.F. (1988). Crystal-structure of manganese superoxide-dismutase from bacillus-stearothermophilus at 2.4A resolution. Journal Of Molecular Biology, 199(4), 649661;

39. Sines, J., Allison, S., Wierzbicki, A., McCammon, J.A. (1990). Brownian dynamics simulation of the superoxide superoxide-dismutase reaction iron and manganese enzymes. Journal Of

40. Physical Chemistry 94(2), 959-961.

41. Vincent, J.B. and Christou, G. (1989) Advances in Inorganic Chemistry 33, 197-257.

42. Lah, M. S., Dixon, M.M., Pattridge, K.A, Stallings, W.C, Fee, J.A, Ludwig, M.L. (1995) Structure-function in escherichia-coli iron superoxide dismutase comparisons with the manganese enzyme from thermus- thermophilus. Biochemistry 34(5), 1646-1660.

43. Halliwell, B. and J. M. C. Gutteridge (1990) Role of free-radicals and catalytic metal-ions inhuman-disease an overview. Methods In Enzymology 186, 1-85.

44. Stadtman, E. R., Berlett, B.S., Chock, P.B. (1990) Manganese-dependent disproportionation ofhydrogen-peroxide in bicarbonate buffer. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America 87(1), 384-388.

45. Неорганическая химия под ред. Эйхорн Г.М. (1978) Издательство «Мир» т.2,с.316.

46. Kono, Y. and I. Fridovich (1983) Isolation and characterisation of the pseudocatalase of lactobacillus-plantarum a new manganese-containing enzyme. Journal Of Biological Chemistry 258(10), 6015-6019.

47. J.Bravo, I.Fita, P.Gonet, H.M.Jouve, W.Melik-Adamyan, G.N.Murshudov Structure of catalases (1997) in "Oxidative stress and the solecular biology of the antioxidant defenses" Cold Spring Harbor Lab.Press.

48. M.Zamocky, F.Koleer Understanding the structure and function of catalases:clues from molecular evolution and in vitro mutagenesis (1999) Prog. Bioph. & Macr. Biology 72, 19-66.

49. Schonbaum G.R., Chance B. (1976) The Enzymes, ed Boyer P.D. 3rd ed. V.13 New York. Acad Press, 363.

50. Fita, I. and M. G. Rossmann (1985) The active-centre of catalase. Journal Of Molecular Biology 185(1), 21-37.

51. Барынин В.В., Гребенко А.И. (1986) Т-каталаза негемовая каталаза экстремально-термофильной бактерии Thermus thermophilus НВ8. Докл. Акад.паук СССР 286(2), 461-464.

52. Kono, Y. and I. Fridovich (1983) Journal Of Biological Chemistry 258(10), 13646-13648.

53. Хангулов, С.В. Барынин, В.В., Мелик-Адамян, В.Р., Воеводская, Н.В., Блюменфельд, J1.A., Добряков, С.Н., Ильясова, В.Н. (1986) ЭПР исследования Т-каталазы из Thermus thermophilus. Биоорганическая химия 12, 741-748

54. Shlyapnikov S.V., Dementev A.A., Moir A.J.G., Keen J.N., Barynin V.V. (частное сообщение).

55. Barynin V.V., Hempstead P.D., Vagin A.A., Antonyuk S.V., Melik-Adamyan W.R., Lamzin V.S., Harrison P.M. & Artymiuk P.J. (1999) High resolution structure of Thermus thermophilus Manganese catalase. EMBL Hamburg Outstation annual report. 283.

56. Meier, A., Whittaker, M.M. & Whittaker, J.W. (1996) EPR polarisation studies on Mn catalase from Labobacillus plantarum Biochemistry, 35, 348-360.

57. Waldo, G. S., Yu, S.Y., Penner-Hahn, J.E. (1992) Structural characterisation of the binuclear Mn site in lactobacillus-plantarum manganese catalase. Journal Of The American Chemical Society 114(14), 5869-5870.

58. Dismukes, G.C. (1992) in Bioorganic cataliysis, Reedijk,J., Ed. Marcel-Dekker, Amsterdam.

59. Gamelin, D. R„ Kirk, M.L., Stemmler, T.L., Pal, S., Armstrong, W.H., Penner-Hahn, J.E., Solomon, E.I. (1994) Electronic-structure and spectroscopy of manganese catalase and di-mu-oxo

60. Mn(III)-Mn(IV). model complexes. Journal Of The American Chemical Society 116 (6), 23922399.

61. Ivancich, A., Barynin, V.V., Zimmermann, J.I. (1995) Pulsed EPR studies of the binuclear Mn(III)-Mn(IV) centre in catalase from thermus-thermophilus. Biochemistry 34(20), 6628-6639.

62. Dismukes, G.S. (1996) Manganese enzymes with binuclear active sites. Chem.Rev. 96, 2909-2926.

63. Sheats, J. E., Czernuszewicz, R.S., Dismukes, G.C., Rheingold, A.L. (1987) Binuclear manganese(III) complexes of potential biological significance. Journal Of The American Chemical Society 109(5), 1435-1444.

64. Czernuszewicz, R.S., (1991) Special Publish R.Soc.Chem. 94.

65. Carroll, J. and J. R. Norton (1992) Protonation of a bridging oxo ligand is slow. Journal Of The American Chemical Society 114(22), 8744-8745.

66. Асатурян. К.А., Черняк, И.В., Нехорошее, H.C., Муромцев. В.И. (1986) Приборы и техника эксперимента 6, 203-207.

67. Goldshtein, D.B. (1968) Analit.Biochem. 24,431-437.

68. Deisseroth, A., Dounce, A.L. (1970) Physiol.Rev. 50, 319-375.

69. Yeh, J.I. & Hoi, W.G.J. (1998) A flash annealing technique to improve diffraction limits andlower mosaicity in crystals of glycerol kinase Acta. Cryst. D54, 479-480.

70. Otwinowski, Z., Minor, V. (1993) DENZO: an oscillation data processing program for macromolecular crystallography. Yale University, New Haven, USA.

71. Murshudov, G. N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. (1997) Refinement of macromolecular structures by the maximum- likelihood method. Acta Crystallographica Section D-BiologicalCrystallography 53(3), 240-255.

72. Sheldrick, G. M. and T. R. Schneider (1997) SHELX: High-resolution refinement. Methods In Enzymology 227, 319-343.

73. Lamzin, V. S. and K. S. Wilson (1993) Automated refinement of protein models. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography 49(1), 129-147.

74. Jones, T. A., Zou, J.Y., Cowan, S.W., Kjeldgaard, M. (1991) Improved methods for building protein models in electron- density maps and the location of errors in these models. Acta Crystallographica Section A 47(2), 110-119.

75. Bailey, S. (1994). The CCP4 suite programs for protein crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography 50(5), 760-763.

76. Cruickshank, D.W.J. (1996) Protein precision re-examined: Luzzati plots do not estimate final errors, in Proceedings of the CCP4 Study Weekend: Macromolecular Refinement 11-22; Dodson, E„ Moore, M„ Ralph, A. & Bailey, S. (Eds)

77. Laskowski, R. A., Macarthur, M.W., Moss, D.S., Thornton, J.M. (1993) Procheck a program to check the stereochemical quality of protein structures. Journal Of Applied Crystallography 26(2) 283.

78. Hutchinson, E. G. and J. M. Thornton (1996) PROMOTIF A program to identify and analyse structural motifs in proteins. Protein Science 5(2), 212-220.

79. Esnouf, R. M. (1997) An extensively modified version of MolScript that includes greatly enhanced colouring capabilities. Journal Of Molecular Graphics & Modelling 15(2), 133-138.