Промышленная технология производства препаратов на основе экстрактов мицелия Pleurotus ostreatus и оценка их эффективности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Захаров, Сергей Викторович

• Захаров, Сергей Викторович
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Захаров, Сергей Викторович

ВВЕДЕНИЕ.................................................... 8

ГЛАВА 1. ПРОМЫШЛЕННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАЗИ-ДИОМИЦЕТА PZenroZws ол/гелйм (Fr.) Kumm. МЕДИКОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТОВ ИЗ БАЗИДИ-АЛЬНЫХ ГРИБОВ................................................ 25

1.1. Промышленное культивирование базидиомицета

оз/гелй/л.................................................... 25

1.2. Направления по совершенствованию технологии промышленного

культивирования мицелия PZezzzo/z/y в глубинной культуре. 45

1.3. Медико-биологические свойства препаратов на основе базидиаль-

ных грибов PZezz/'ofzz3 o^/z ea/zzs'......................... 50

1.4. Обоснование направлений по разработке и созданию препарата на

основе экстракта мицелия PZezzrofzz.y ол/геаЦ/д 1137......... 84

1.5. Формулировка проблемы исследования ................... 91

ГЛАВА 2. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ДВУХСТАДИЙНОГО ПРОМЫШЛЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИЦЕЛИЯ

1137 В СИСТЕМЕ: «РОТАЦИОННАЯ КАЧАЛКА (ИНОКУЛЯТОР) - ФЕРМЕНТЕР С МЕХАНИЧЕСКИМ ПЕРЕМЕШИВАНИЕМ СРЕДЫ».............................................. 96

2.1. Постановка цели и задач исследования.................. 96

2.2. Экспериментальные исследования двухстадийного глубинного культивирования мицелия в системе «ротационная качалка (инокулятор)

- ферментер с механическим перемешиванием среды»............. 97

2.2.1. Материалы и методы исследования..................... 97

2.2.2. Результаты культивирования и экстракции мицелия вешенки.. 112

2.3. Химический состав экстракта мицелия вешенки ......... 123

3

2.3.1. Материалы и методы исследования..................... 123

2.3.2. Результаты определения химического состава экстракта мицелия

вешенки...................................................... 124

2.4. Технология промышленного двухстадийного глубинного культивирования мицелия и выделения из него экстракта.............. 125

2.5. Стимулирующий эффект наноструктурных частиц серебра на рост

и продуктивность мицелия вешенки в глубинной культуре........ 148

Выводы по главе 2.......................................... 174

ГЛАВА 3. ЭФФЕКТ СИНЕРГИЗМА ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ ВЕЩЕНКИ (ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ) С ЦИТОСТАТИКАМИ ПРИ СОЧЕТАННОМ ДЕЙСТВИИ НА ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ (in vitro)......................... 180

3.1. Постановка задачи исследования........................ 180

3.2. Действие экстракта и цитостатиков на цитокинетические параметры культивируемых клеток ................................. 181

3.3. Индивидуальное и сочетанное с цитостатиками действие

экстракта на пролиферативную активность трансформированных клеток HeLa......................................................... 183

3.4. Индивидуальное и сочетанное с цитостатиками действие экстракта

на индукцию апоптоза трансформированных клеток HeLa.......... 187

3.5. Действие экстракта и циклофосфана на культивируемые нормальные фибробласты человека..................................... 195

3.6. Клеточные мишени действия экстракта................... 197

3.6.1. Индивидуальное действие экстракта и циклофосфана на

митотические хромосомы трансформированных клеток HeLa........ 197

3.6.2. Сочетанное с циклофосфаном действие экстракта на митотические хромосомы трансформированных клеток HeLa.............. 199

3.6.3. Эффект синергизма действия экстракта с факторами,

влияющими на структурно-функциональное состояние хроматина... 200

4

3.6.4. Определение роли митохондрий, как возможных мишеней

действия экстракта на индукцию апоптоза ..................... 204

3.6.5. Индивидуальное и сочетанное с циклофосфаном действие

экстракта на плазматические мембраны клеток.................. 210

3.6.6. Влияние экстракта при его индивидуальном или сочетанном с

циклофосфаном действии на подвижность клеток................. 211

3.6.7. Гипотеза о механизме действия экстракта ............ 212

Выводы по главе 3.......................................... 213

ГЛАВА 4. ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ ВЕШЕНКИ (ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ) НА РАЗЛИЧНЫЕ НОЗОЛОГИЧЕСКИЕ ФОРМЫ НА МОДЕЛИ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ (in vivo)......................... 219

4.1. Постановка задачи исследования........................ 219

4.2. Проверка токсичности экстракта........................ 222

4.3. Противоопухолевая активность экстракта................ 225

4.3.1. Материалы и методы.................................. 225

4.3.2. Результаты исследований............................. 227

4.4. Влияние экстракта и циклофосфана на гематологические

показатели периферической крови здоровых мышей............... 232

4.4.1. Материалы и методы.................................. 233

4.4.2. Результаты исследования............................. 233

4.5. Гиполипидемическая активность экстракта............... 235

4.5.1. Материалы и методы.................................. 235

4.5.2. Результаты исследования............................. 240

4.6. Гепатопротекторное действие экстракта................. 243

4.6.1. Материалы и методы.................................. 243

4.6.2. Результаты исследований............................. 247

4.7. Действие экстракта на коррекцию лекарственной непереносимости

в комплексной терапии туберкулеза легких..................... 249

5

4.8. Перспективы применения экстракта мицелия вешенки в ветеринарии............................................... 273

4.8.1. Экстракт мицелия вешенки в животноводстве........ 273

4.8.2. Экстракт мицелия вешенки в ветеринарии домашних животных . 277

Выводы по главе 4....................................... 279

ГЛАВА 5. АКТИВНОЕ ВЕЩЕСТВО ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ ВЕШЕНКИ (ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ): ТЕХНОЛОГИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ.................................. 282

5.1. Технология выделения активного вещества............ 282

5.1.1. Фракционирование экстракта....................... 282

5.1.2. Выделение активного вещества из экстракта хлористым

метиленом................................................. 288

5.2. Идентификация вещества, определяющего биологическую

активность экстракта ..................................... 290

5.3. Действие дезметилинцистерола на цитокинетические параметры культивируемых клеток.................................... 301

5.4. Действие дезметилинцистерола на цитокинетические параметры

культивируемых клеток в условиях модификации клеточных мембран глутаровым альдегидом..................................... 304

5.5. Биологические мишени и механизм действия экстракта с

активным веществом........................................ 310

Выводы по главе 5....................................... 314

ГЛАВА 6. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПО СОЗДАНИЮ И ПРОИЗВОДСТВУ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА И ОЦЕНКА ЕГО ПОЛИ-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНО-

СТИ....................................................... 316

6.1. Базовые предпосылки создания лекарственного препарата. 316

6

6.2. Состав лекарственного препарата........................ 320

6.3. Задачи медико-биологических исследований разработанного

лекарственного препарата...................................... 322

6.4. Результаты медико-биологических исследований разработанного

лекарственного препарата...................................... 322

6.4.1. Проверка токсичности препарата....................... 322

6.4.2. Противоопухолевая активность препарата и отдельных его

фракций на модели солидной опухоли меланомы В16 .............. 325

6.4.3. Действие препарата и отдельных его фракций на прогрессию

дислипидемии, индуцированной атерогенной диетой............... 337

6.5. Предложения по производству инновационного лекарственного

препарата-адаптогена с полифункциональной медико-биологической активностью................................................... 362

6.5.1. Феноменологическая модель технологического процесса

производства препарата ....................................... 362

6.5.2. Предложения по созданию технологического комплекса по

производству фармакологической субстанции и лекарственного препарата..................................................... 365

6.5.3. Технологии получения обогащенных фракций, применяемых в

составе препарата............................................. 372

6.5.4. Предложения по производству лекарственного препарата. 375

6.5.5. Технико-экономическая оценка промышленного производства

фармакологической субстанции препарата ....................... 383

Выводы по главе 6........................................... 385

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................. 389

ВЫВОДЫ...................................................... 394

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.................................... 397

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.................... 399

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................... 401

7

ПРИЛОЖЕНИЕ.............................................. 437

П.1 Режимные листы..................................... 438

П.2 Регистрационные свидетельства, санитарно-эпидемиологические заключения, свидетельства на товарные знаки............... 451

П.З Патенты............................................ 471

П.4 Дипломы и медали................................... 496

П.5 Информационные материалы........................... 500

П.6 Акты реализации и внедрения........................ 508

8

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Промышленная технология производства препаратов на основе экстрактов мицелия Pleurotus ostreatus и оценка их эффективности»

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время одним из приоритетных направлений в области отечественного здравоохранения является разработка новых лекарственных средств. Важность исследований, направленных на получение новых перспективных лекарств, подчеркивается в Распоряжении Правительства Российской Федерации от 6 июля 2010г. № 1141-р и в Федеральной целевой программе «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности РФ на период до 2020 года и дальнейшую перспективу», утвержденной Распоряжением Правительства РФ от 1.10.2010 № 1660-р. В этих документах приводится перечень стратегически значимых лекарственных препаратов, производство которых должно быть обеспечено на территории Российской Федерации.

Известно, что препараты, используемые в различных областях медицины (в том числе, рекомендованные к производству в РФ Постановлением Правительства), могут оказывать серьезные побочные действия на организм человека, в частности, вызывать нарушения функции печени, астению, диспепсию, панкреатит и т.д. (Титюхина М.В., 2010). Особо токсичными являются цитостатики, широко используемые в онкологии: циклофосфан, доксорубицин, метотрексат, 5-фторурацил, таксаны и др. (Блохин Н.Н., 1984; Корман Д.Б., 2006; Александров Б.Л., 2010), и средства, применяемые при комплексном лечении больных туберкулезом легких, такие как изониазид, рифампицин, фторхинолоны, этамбутол и др. (Мишин В.Ю., 2006; Ерохин В.В., 2008.)

Одна из областей применения препаратов на основе медицинских грибов - это ветеринария, где не менее остро стоит проблема, связанная с побочными эффектами лекарственных препаратов. В ветеринарии она возникла в связи с массовым применением кормовых антибиотиков, что привело к снижению эффективности других антибиотиков при лечении животных и человека. Кроме того, продукты животноводства содержат остаточные количества антибиотиков и их метаболитов, весьма опасных для человека.

9

Настоящая работа направлена на решение одной из наиболее актуальных проблем современной биотехнологии, медицины, ветеринарии и фармакологии, связанной с разработкой промышленной технологии производства новых препаратов, направленных на снижение побочного действия токсических лекарственных препаратов.

В связи с тем, что многие современные цитостатики являются ярко выраженными иммунодепрессантами (Александров Б. Л., 2010) для нейтрализации их токсического действия применяются препараты, поддерживающие иммунный статус организма (Трещалина Е.М., 2005; Корсун В.Ф., 2010).

Одним из перспективных источников биологически активных веществ, пригодных для создания таких препаратов, являются медицинские грибы (Wasser S.P.,2011r).

Изучение лечебных свойств базидиальных грибов и создание новых лекарственных средств на их основе является одним из активно развивающихся направлений современной биотехнологии, фармакологии и медицины. Результаты этих исследований особенно широко используются в Китае, России, Японии, Корее, США, Норвегии и Канаде [41, 92].

Значительный вклад в разработку технологий культивирования базидиальных грибов и в изучение их медико-биологической активности внесли ученые и специалисты: Бухало А.С., Бисько Н.А., Гарибова Л.В., Герасименя В.П., Дудка И.А., Дьяков Ю.Т., Ефременкова О.В., Капич А.Н., Касперовичюс М.М., Камзолкина О.В., Краснопольская Л.М., Корзун В.Н., Конопля Е.Ф., Кузьминский Б.Б.. Морозова Г.Р., Медведев В.А., Мюллер Э., Милевич Т.И., Соломко Э.Ф., Таратутина Л.В., Решетников С.В., Преображенская Е.И., Феофилова Е.П., Elisashvili V., Bobek Р., Burnett J.H., Hilber О., Li A., Begin М., Miller О.К., Nobles М.К., Peterson R.H., Wasser S.P., Weis A.L., Lavi I., Ozdin L., Mizuno T. и др.

В качестве продуцентов разного рода фармакологических субстанций чаще всего используются зимний гриб (Ғ/плпии/йкт ге/ш/рау), шиитаке, или японский

10

гриб, (Аел/йшл вешенка обыкновенная (Р/еиго/ид о^^*еяйм), навозник

компостный (Сс%7/7/?иу соя?я/и^), шимия (7Vjy7.s7Z)^g//.y ^^и/я//м), намеко (7^/ю//о/Я ия/ие/го), трутовик лаковый, или рейши, (Сяло^е/7ля /пс^и/и), гриб-баран (С/т/Ь/я У/о/^о^я), трутовик (G/7/о/я пл!/?е//я^я), львиная грива (ТУепсйпл е/й!ясеи^) (Бисько Н.А. и др., 2011; Бухало А.С. и др., 2011; Elisashvili V, 2012).

Как правило, основу фармакологических субстанций составляют различные экстракты плодовых тел или мицелия базидиомицетов. С химической точки зрения экстракты представляют собой сложные системы, содержащие различные биологически активные компоненты: полисахариды, белки и их комплексы, фенольные соединения, тритерпеноиды, стероиды, алкалоиды, нуклеотиды, витамины, ганодеровые кислоты, лектины, протеазы и др.

Некоторые из этих соединений проявляют активность по снижению уровня холестерина, а также антидиабетической, антиоксидантной, противоопухолевой, иммуномодулирующей, противомикробной и противовирусной активностями [39, 188, 258, 266]. В многочисленных публикациях, посвященных изучению экстрактов из базидиомицетов [36, 39, 210, 215-217, 257], показана их высокая эффективность при лечении рака, бактериальных и вирусных инфекций, ВИЧ, диабета, сердечно-сосудистых и целого ряда других заболеваний (Соломко Э.Ф., 2011; Дудка И.А., 2011; Бисько Н.А. и др., 2011; Корсун В.Ф., Краснопольская Л.М. и др.,2012; Elisashvili V, 2012).

Этими и многими другими авторами показано, что полнеахаропептиды ([3-глюканы), выделенные из водных экстрактов некоторых медицинских грибов, индуцируют у экспериментальных животных продукцию гамма-ингерферона, интерлейкина-2 и пролиферацию Т-клеток. На этом основании [3-глюканы рекомендовано применять при химио- и радиотерапии рака и для лечения различных инфекционных заболеваний [214].

Другая (но не альтернативная) стратегия направлена на разработку способов снижения токсичности лекарственных препаратов и заключается в поиске и изучении веществ, обладающих синергетическим взаимодействием с цитостатиками и повыщающих их эффективность [187]. Условно, по характеру

11

воздействия на организм больного, такие препараты можно отнести к группе детоксикационных.

Ранее, в работе [76] нами было показано, что возможность потенцирования действия цитостатиков может быть реализована с использованием водно-этанольного экстракта одного из представителей медицинских грибов - Р/еиго/ил о-уц-едЦпз (Богуш Т.А., 2003; Поляков В.Ю. и др., 2007). В работе [157] в качестве модели использовались культивируемые трансформированные клетки человека (HeLa), клетки миелоидного лейкоза человека (линия К-562) н нормальные фибробласты человека. Модель культивируемых клеток исключает многие трудно учитываемые факторы, опосредующие действие экстракта и его отдельных фракций на уровне целого организма и позволяет тестировать ряд функциональных показателей эффективности действия препарата в строго контролируемых и воспроизводимых условиях.

Для количественной оценки эффективности действия цитостатиков и экстракта использовались показатели, характеризующие жизнеспособность популяции культивируемых клеток: митотический индекс (доля клеток, находящихся в состоянии деления) и апоптотический индекс (доля клеток с выраженными признаками программируемой смерти). Функциональное состояние плазматических мембран оценивалось по способности клеток к прижизненному окрашиванию трипановым синим.

Полученные данные [157] показали, что при индивидуальном действии экстракт является слабо выраженным индуктором апоптоза и вызывает аномальную сегрегацию хромосом на стадии метафазы, появление хромосомных аберраций типа «мост» на стадии анафазы и телофазы. При сочетанном использовании экстракта и циклофосфана проявился их ярко выраженный синергизм, который в зависимости от концентрации реагентов и от способа их инсталляции выражается в частичном подавлении пролиферации и в индукции апоптотической гибели клеток. Принципиально важно, что комбинация препаратов оказывает апоптогенное действие только на трансформированные

12

клетки, тогда как нормальные фибробласты не включают программу апоптоза при тех же дозах экстракта и цитостатиков.

Всестороннее изучение (Богуш Т.А. и др., 2001; Милевич Т.И. и др, 2001; Конопля Е.Ф. и др., 2002; Герасимепя В.П. и др., 2009; Смирнова З.С. и др., 2013) действия экстракта мицелия Р/епгой/з оз/геа/из1137 и циклофосфана на гематологические показатели периферической крови здоровых животных (мыши линии С57В1/6), показало, что применение экстракта снижает гематотоксичность цитостатика, применяемого в дозах от 100 мг/кг до 300 мг/кг веса тела, в частности уменьшает выраженность и продолжительность лейкопении.

По данным, полученным на модели стеатоза, индуцированого атерогенной диетой у крыс, экстракт из Р/еиго/нз оз/гедЩз блокирует развитие жировой дистрофин печени (Поляков В.Ю., Захаров С.В. и др., 2012), тем самым проявляя свойства эффективного гепатопротектора [31, 42, 154]. Очевидно, что такое многоплановое действие экстрактов грибов требует нового научного объяснения.

С одной стороны, полифункциональность действия экстрактов [16-19, 37, 54, 90, 100, 102, 103, 109, 138, 177, 178] может определяться их

многокомпонентностыо по составу и биологическим активностям. Вполне вероятно, что, кроме описанных в литературе компонентов, базидиомицеты содержат ряд неидентифицированных веществ, обладающих, возможно, строго специфическими, но разнонаправленными механизмами (мишенями) действия. Выделение и изучение химической структуры этих веществ открывает широкие возможности для получения новых лекарственных препаратов [77, 148].

С другой стороны, полифункциональность действия экстрактов может объясняться некоторыми общими свойствами «патологических» клеток, например, измененным строением их мембран и/или мембранных рецепторов. С позиций этой гипотезы выяснение механизма действия на биологические системы конкретных веществ, выделенных из экстрактов, представляет большой теоретический интерес для клеточной и молекулярной биологии.

Таким образом, полученные результаты открывают реальную перспективу для создания препарата на основе водно-этанольного экстракта мицелия Р/еигоЩз

13

о-у/гел/нл, повыщающего эффективность цитостатиков и снижающего токсическую нагрузку на организм при использовании высокотоксичных лекарств в онкологии и других областях медицины [19, 154, 178]. Первоочередной задачей в этом направлении является установление активного вещества экстракта и проведение испытаний его биологической активности на моделях культивируемых клеток и различных типах нозологий.

Возможный методический подход заключается во фракционировании водно-этанольного экстракта Р/еиго/ил о-у/гея/ил с помощью органических растворителей (Кирьянов Г.И., Захаров С.В. и др., 2013).

Известно, что при использовании различных органических растворителей (этанола, метанола, этилацетата и т. д.) белки и полисахаропептиды в экстракт не переходят. Следовательно, активными веществами в таких экстрактах являются низкомолекулярные соединения, из которых идентифицированы эргостерины, никотиновая кислота, полифенолы, антиоксидантны и некоторые другие. Вопрос о том, какие именно компоненты водно-этанольного экстракта P/enro/zAy ол/гепЩ-у потенцируют действие цитостатиков, остается открытым.

Объектом исследования является штамм гриба /УепгоЩу оу/гелДлу 1137, который хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов Государственного научного центра Российской Федерации ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов («ГосНИИгепетика») под регистрационным номером ВКПМ- F819 (Приложение П.2).

Критерием отбора этого штамма послужила выраженная антимикробная и антитоксическая активность экстракта из его мицелия (Камзолкина О.В., Ефременкова О.В. и др, 2001; Конопля Е.Ф., Милевич Т.П. и др, 2002).

Предметом диссертационной работы является разработка промыщленной технологии производства препаратов на основе экстрактов мицелия Г7е;/го/и.у оуЦея/z/y 1137 (ВКПМ, F819) и оценка их эффективности.

Для решения обозначенной выше проблемы в работе поставлена цель и сформулированы задачи исследования.

14

Цель работы - разработка промышленной технологии глубинного культивирования мицелия, гарантирующей устойчивый количественный выход ЭМВ и постоянство (стабильность) его химического состава, технологии получения из экстракта мицелия Р/еиго/пз озй'еп/пз 1137 ранее не идентифицированных химически чистых активных веществ (или вещества), потенцирующих действие цитостатиков, установление химической природы и возможных механизмов действия этих веществ и предложение по промышленному производству лекарственного препарата.

Для достижения поставленной цели в качестве продуцента в работе использовался штамм 7%;//*ощз о.у//гя/пз 1137 (ВКПМ, F-819). Критерием отбора послужила наиболее выраженная антимикробная и антитоксическая активность выделенного экстракта из мицелия этого штамма. Разработан унифицированный метод двухстадийного ферментативного культивирования мицелия Ғ7епго/пз оз/геяЩз 1137 в глубинной культуре и получения из него экстракта. Разработаны различные методы фракционирования экстракта с использованием двухфазной системы растворителей с последующим скринингом экстрактов с помощью HPLC.

Проведено изучение влияния экстракта мицелия TVenro/пз оз/гел/из 1137 и его отдельных компонентов на состояние ядра клетки, хромосом, хроматина с оценкой митогенного и апоптогенного эффекта в норме и в сочетании с агентами известного действия на клетку (цитостатики, ингибиторы модификации ДНК и хроматина).

Оценено также действие экстракта на мембраны клеток и митохондрии.

Все эти маркерные показатели использовались в качестве критериев отбора активного вещества при варьировании способов фракционирования экстракта.

В ходе исследования разработана технология промышленного глубинного культивирования мицелия 7%игоЩз озЦгдЩз 1137, обеспечивающая устойчивый количественный выход экстракта и постоянство (стабильность) его химического состава [136, 139, 140,142-146,148-151].

15

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи исследования:

1. Усовершенствовать технологию глубинного культивирования мицелия Р/емгоЩу о<у;ге<зЩ.у 1137 для обеспечения максимально высокого выхода ЭМВ и стабильности его химического состава.

2. Выявить эффекты индивидуального и сочетанного с цитостатиками (циклофосфаном, доксорубицином, метотрексатом, фторурацилом и азацитидином) действия ЭМВ in vitro на трансформированных клетках HeLa и нормальных культивируемых клетках Vero.

3. Провести биоиспытания ЭМВ in vivo на моделях различных нозологических форм.

4. Разработать методы фракционирования ЭМВ и провести испытания полученных фракций для выявления их биологической активности in vitro и in vivo. .

5. Разработать технологию выделения активного вещества из ЭМВ и определить его химическую структуру.

6. Провести биоиспытания отдельных фракций ЭМВ на моделях различных нозологических форм in vivo и in vitro. Определить возможные механизмы и клеточные мишени действия ЭМВ, полученных фракций и активного вещества.

7. Разработать композицию лекарственного препарата с детоксицирующим действием на основе экстракта мицелия Р/еигоЩу оз?гелЩ.у 1137 и предложения по его промышленному производству.

Научная новизна:

Разработаны и экспериментально обоснованы технологические режимы двухстадийного культивирования мицелия Р/емгоЩу о^гсаИлу 1137 в глубинной культуре в системе «ротационная качалка (инокулятор) - ферментер (с механическим перемешиванием культуры)».

16

Проведена валидация технологического процесса производства экстракта мицелия ол/геаЦгу 1137, являющегося фармакологической субстанцией

разработанного лекарственного препарата.

Разработан метод фракционирования биологически активных веществ из экстракта мицелия и алгоритмы испытания экстракта in vitro и in vivo.

Впервые обнаружен феномен стимуляции роста мицелия в присутствии наноструктурных частиц коллоидного серебра.

Доказана эффективность экстракта при лечении рака, выявлены его вирулицидные свойства, установлена нормализация липидного обмена при экспериментальном стеатозе и определено гепатопротекторпое действие при применении экстракта и его отдельных фракций.

Предложена гипотеза, согласно которой полифункциональная активность экстракта (фармакологической субстанции) связана с измененными свойствами мембранных рецепторов «патологических» клеток, реагирующих на внешние сигналы.

Впервые показан синергизм экстракта с цитостатиками, проявляющийся в резком усилении апоптотической и митостатической активности при их сочетанном применении.

Разработан оригинальный метод фракционирования экстракта и получена фракция, обладающая апоптогеппым действием на трансформированные клетки HeLa. Фракция не содержит в своем составе р-глюканы, обладает полифункциональной фармакологической активностью при различных заболеваниях, в том числе усиливает апоптогенный эффект в синергизме с медицинскими цитостатиками, уменьшая их токсическое действие на здоровые клетки.

Из фракции с апоптогеппым действием выделено и охарактеризовано вещество, обладающее собственной апоптотической активностью. Это вещество идентифицировано как производное стерола - дезметилинцистерол (ДМИ) 4-hydroxy-17R-methylincisterol (патент РФ № 2422151 от17.03.2010 г., в

соавторстве). Показано, что дезметилинцистерол (ДМИ) обладает ярко

17

выраженным синергизмом с цитостатиками. При этом эффективность действия ДМИ, как проапоптотического агента, многократно превышает соответствующую активность как фармакологической субстанции в целом, так и исходной фракции. Это означает, что терапевтический эффект, достигаемый от индивидуального использования цитостатиков, при их сочетанном применении с ДМИ может быть получен при значительном снижении дозы цитостатиков. Именно с этой целью ДМИ, как главный компонент (активное вещество) включен в состав инновационного препарата-адаптогена, обладающего в том числе детоксицирующим действием.

Принципиально важно, что точно установленная формула ДМИ открывает путь к его химическому синтезу (патент РФ № 2477635 от 14.02.2012 г., в соавторстве).

Разработана композиция инновационного препарата-адаптогена, обладающего детоксицирующим действием (патент РФ № 2487930 от 19.06.2012 г., в соавторстве).

Полученные в работе результаты вносят существенный вклад в решение одной из наиболее актуальных проблем современной биотехнологии, медицины и фармакологии, связанной с преодолением токсичности сильнодействующих лекарственных препаратов, которые используются для лечения тяжелых патологий (патенты РФ № 2422151 от 17.03.2010 г. и № 2435600 от 23.08.2010 г., в соавторстве).

В целом, полученные в работе данные вносят существенный вклад в решение одной из наиболее актуальных проблем современной биотехнологии, медицины и фармакологии, связанной с преодолением токсичности сильнодействующих лекарственных препаратов, которые используются для лечения пациентов с тяжелыми патологиями.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость работы определяется выявленными свойствами впервые обнаруженного в экстракте мицелия ол/геяЩу 1137 вещества -

группы стеролов, получившего название дезмегилинцистерол, 1UPAC:

18

(3aS,5aR,6R,8aR)-6-[(2R,3E,5S)-5,6-dimethylhept-3-en-2-yl]-3a-hydroxy-5a-methyl-3a,4,5,5a,6,7,8,8a-octahydro-2H-indeno[5,4-b] furan 2-one) с молекулярной массой 332,2452 дальтон.

На основании проведенных в работе экспериментов сформулированы следующие теоретические положения:

- экстракт мицелия содержит специфический индуктор (ДМИ), который «узнает» патологически измененные клетки, обладающие общим свойством включать программу апоптотической гибели в ответ на взаимодействие с определенным классом веществ;

- изучение антигиперлипидемического действия активного вещества экстракта (ДМИ) подводит к выводу, что мишенью ДМИ является рецепторный путь транспорта холестерина в организме, включающий в себя как этап образования мицелл холестерина, так и функционирование клеточных рецепторов липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). В обоих случаях ДМИ может обладать антагонистическим эффектом;

- данные по модификации мембран клеток глутаровым альдегидом позволяют заключить, что низкие концентрации глутарового альдегида в клетках СПЭВ и HeLa блокируют активность клеточных рецепторов, относящихся к группе ионных каналов.

Практическая значимость работы:

- синергизм с цитостатиками позволяет использовать ДМИ для существенного снижения дозы применяемых в химиотерапии опухолей крайне токсичных лекарственных препаратов - циклофосфана, доксорубицина, метотрексата и 5-фторурацила;

- в связи с тем, что ЭМВ, обогащеный ДМИ, блокирует прогрессию экспериментальной дислипидемии у крыс, дезметилинцистерол можно позиционировать как препарат, обладающий гепатопротекторными свойствами;

- на основе активного вещества (ДМИ) и фармацевтической субстанции (экстракта мицелия Р/бл/'оИм одйеаШз 1137) предложена композиция инновационного препарата-адаптогена, обладающего полифункциональной

19

медико-биологической активностью и относящегося к фармакологической группе лекарственных средств А13А «Общетонизирующие средства и адаптогены», применяемых при химиотерапии ряда тяжелых патологий в качестве препаратов «сопровождения».

- проведенная технико-экономическая оценка подтверждает целесообразность промышленного производства лекарственных средств с разнонаправленными эффектами действия на основе ДМИ.

- экспериментально доказана эффективность усовершенствованной промышленной технологии глубинного культивирования мицелия, которая гарантирует стабильные параметры производимого из него экстракта (фармакологической субстанции). Технология внедрена в производство, и на ее основе ООО «Витапром» выпускает БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН% в виде сиропа [183, 184], (Приложение П.2);

- разработаны и внедрены в производство инновационные элементы технических средств (устройств) и обоснования способов их применения для культивирования мицелия: комплекты защиты и активизации роста сельскохозяйственных культур (налажен серийный выпуск, сертификат соответствия № РОСС RU.AT75.H07315 от 29.10.2013 г.); дезинфицирующие средства, фильтры для очистки воды и воздуха от токсических примесей и микробиологических загрязнений (патенты РФ № 2069641 от 09.11.1998 г., № 87098 от 02.06.2009 г., № 2394668 от 13.03.2009 г, № 2400268 от 19.12.2008 г. в соавторстве), в том числе на основе наноструктурных частиц серебра.

Организовано опытно-промышленное производство фармакологической субстанции на основе экстракта мицелия вешенки в ОАО «Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ» (ОАО «Г осНИИсинтезбелок»).

Разработаны проекты комплектов нормативной документации (НД) на фармакологическую субстанцию «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН^» и лекарственное средство «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН^» (сироп) для Государственной регистрации и промышленного производства.

20

Составлено пособие для врачей по применению ЭМВ «ОВОДОРИН» для коррекции лекарственной непереносимости в комплексном лечении больных туберкулезом легких и рекомендовано Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы послевузовского профессионального образования врачей № УМО-17-28/610 25.11.10 [57].

Принципиально важно, что точное определение формулы дезметил-инцистерола открывает путь к его химическому синтезу. Это, в свою очередь, дает возможность на основе дезметилинцистерола создать группу фармацевтических препаратов с различной фармакологической активностью.

Оценка технико-экономической эффективности подтверждает целесообразность промышленного производства такого рода лекарственных средств.

Методология и методы исследования:

Избранная методология соответствует общепринятой схеме биотехнологического поиска фармакологически активных веществ среди объектов растительного происхождения, которые рассматриваются как потенциальные продуценты новых лекарственных препаратов.

В работе в качестве такого продуцента использовался базидиомицет Р/енго/их оз/гепЩз 1137 (ВКПМ, F-819), являющийся источником ряда биологически активных веществ (БАВ) с различной направленностью фармакологической активности.

Для оптимизации технологического этапа культивирования использовался метод математического планирования Гаусса-Зейделя. Расчеты и построение технологических графиков осуществлялись с помощью пакета MICROSOFT OFFICE EXCEL 2010, построение технологических и аппаратурных схем - с помощью программы Microsoft Office 2010.

Обработка результатов доклинических исследований (с числом повторов > 3) проводилась статистическим методом анализа и обработки данных - методом определения грубых ошибок («промахов»).

21

Биологически активные фракции отбирались методом полномасштабного скрининга экстракта мицелия и полученных фракций экстракта. С этой целью в экспериментах на культивируемых клетках (in vitro) и на животных (in vivo) проводилось систематическое изучение спектра фармакологической активности отобранных фракций.

В качестве моделей in vitro использовались трансформированные и нормальные культивируемые клетки, a in vivo - здоровые животные и животные с различными формами нозологий (экспериментальный стеатоз, гипертензия, туберкулез, вирусная инфекция, онкология). Специфическая активность отобранных фракций проверялась путем сравнения с известными (эталонными) соединениями (статины, цитостатики и антивирусные вещества).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Захаров, Сергей Викторович, 2015 год

использования

дня использования в пищеэой промышленности при производстве биологически активных

клише

) А!\1ОЖЕННЫЙ СОЮЗ

РЕСНУБ.1ИКИ БЕ1АР5СБ. РЕСПУ БЛИКИ КАЗАХСТАН

И РОССИЙС КОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человеке Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Российская Федерация

о государственной регистрации

Продукция:

'Экстракт мицелия вешенки "ОВОДОРИН" (емкости по 100 г - для промышленной переработки) Изготовлена в соответствии с документами ТУ 9317-01-87552538-08 е изм №1. Изготовитель (производитель): ЗАО Мирра-М" 105082, г Москва, Переведеновский пер., д.6, стр 2 (адрес производства 142279, Московская обл . Серпуховский р-н. л Оболенск, ФГУП "ГНЦ ПМ" корпус 31): ООО 'биталром' 121471 г Москва, ул Рябиновая, д 43. стр 1,111250, г Москва, ул Красноказарменная, д 15 стр 1. Российская Федерация Получатель. ООО "Инбиофарм'.

105264. г Москва, ул 10-я Парковая, д. 18, Российская Федерация

санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)

прошла государственную регистрацию. Государственной PH ИОПаЦИИ

выдано на основании (перечислигь рассмо)репные протоколы исследований, наименование организации (испытательной лаборатории, центра).проводившей исследования,,лру[ нерассмотренныедокументы): взамен свидетельства о государственной регистрации №RU 77.99.11 ОбЗЕ 05379612 11 от 26 12 2011 г экспертное заключение ГУ НИИ питания РАМН №72/3-926'6-08 от 27 11 2008 г, №72/3-1261/6-09от 2611 2009г., ФГБУ "НИИ литания" РАМН МТ72/Э-223ЙИ-12 от 13.12 2012 г

С рок .teiic ] вяя сеиде гельс гм о t ocyaapci ценной регистрации/ уста

период шготоялення нродукггии

гу Ойищамно

,'М Я. е;

460

'Ч!!!!И(.ТЕРСГ!Х)ЗДРА!КХ)ХРА}!]1[ЧЯ РЕСПУБЛИКИ !ЯДАРУ( i,

ГЛАВ!!!))!'!! (X Y IAPt Л ВИ i! it.!!] - А! В1ТАР! !Ы!1 ВРАЧ

РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

Здравоохранения от 04 02 2002 г №5

№ 08-33-0.386425

Вил продукции: биологически активные добавки к пище (готовые формы)

(по перечню продукции. подлежащей аосурарстеениой аиаиенической рмистрации)

] [редукция: Биологически активная добавка к пище Экстракт мицелия вешеики ОВОДОРИН

(флаконы № 10 по 50 мг. № 10 по 100 мг). ТУ 9317-01-87552530-08. см приложение, всего номеров регистрации -1

(наименование продукции)

Изготовитель ООО Витапром по заказу ООО Инбиофарм г. Москва, РОССИЯ

(наименование изеотоеителя. страна)

Натначение для реализации через аптеки и использования

(производство. реализация использование)

с соблюдением санитарных правил и норм

взрослым и детям старше14 лет принимать по 50 или 100 мг. предварительно растворив в 100мл кипяченой воды,охлажденной до комнатной температуры.1 раз утром за час до приема пищи Противопоказания инд непереносимость компонентов,беременность,кормление грудью

(область применения оареничения)

Номер государственной П-0.40110-1006

гигиенической регистрации

Срок действия удостоверения до 3 июня 2015 г.

Удостоверение выдано Инбиофарм ООО г. Москва, РОССИЯ

( данный государственный сани тарный врач Республики Беларусь

Даш выдачи.

3 июня 2010 г

N5 0946301

461

Ч1))Н}< II Пьч 3,'!)'W А!'\ЧПН!И II ' i!\i HIM! И 1\1'\< Ь

74WWW

РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

№ 08-33-0.386427

(? <*OQ <)ы/?с/иб<?//ис,й

Вт чри.^кчии: биологически активные добавки к пище (готовые формы)

I )рч п кччк Биологически активная добавка к пище Экстракт мицелия вешенки

ОВОДОРИН сироп (флаконы по 80 мл), ТУ 9317-02-87552538-08;

см. приложение, всего иомеров регистрации -1

И<г<чопигс.]Ь ООО Витапром по заказу ООО Иибиофарм г. Москва, РОССИЯ

(чаимамоеамиеимопюеителя страна)

Назначение: для реализа^и через аптеки и использования

(лроимоЗспзбо реализация, исоользоеамие;

с соблюдением санитарных нрави.! и нор%<

взрослым и детям старшем лет сироп принимать, предварительно растворив в 100мл кипяченой коды.охлажден ной до комнатной температуры.1 раз утром за час до приема пищи.Протмвопоказами*:инд.мопоремосимостъ комлонентов.беременность,кормление грудью

(облаете применения оарамичемия/

Номер гос) дарственной ппнеиичесхой регистра!шн

Ср<ж дейс!юм удостоверения до

П-0.40111-1006

3 июня 2015 г.

Удостоверение выдано Инбиофарм ООО г. Москва, РОССИЯ

Главный государственный санитарный врач Республики Беларус:.

Дата выдачи:

3 июня 2010 г

Н И. Качан

С946300

462

Качественное удостоверение

Общество с ограниченной ответственностью

«ВИТАПРОМн «Экстракт мицелия вешенки ОВОДОҒИН сироп»

Россия, ] ] 1250 г. Москва, ул. Красноказарменная, д. t5, стр.1 Дата выработки: 07.07.20t4 года

Тел. [phone]_________________________Количество: 1500 флаконов по 106 гр (М мл.)

Наименомние показателя Требования нормативнотехнической документации Результат испытаний

Внешний вид Прозрачная однородная слабовязкая жидкость Соответствует

Цвет Светло-коричневый Соответствует

Запах Травянисто-медовый Соответствует

Масса фасовки одного флакона, гр. 106,04=2,0 Соответствует

Срок и условия хранения В сухом, защищенном от света месте при температуре не выше +25°С

Срок годности 24 месяца

ллкдммйли;

КМАФАнМ, КОЕ/г Не более 5x10* Не обнаружено

БГКП (колиформы), в 0.1 г Не допускаются Не обнаружено

Е. coli в 1 г Не допускаются Не обнаружено

Патогенные, в т.ч. сальмонеллы, в 10 г Не допускаются Не обнаружено

Дрожжи и плесени, КОЕ'г Не более 100 Не обнаружено

а-ГХЦГ мг/кг Менее 0.002 Не более 0.1

г-ГХЦГ мг/кг Менее 0.002

ДДЭ мг/кг Менее 0.002 Не более 0.1

ДДД мг/кг Менее 0.002

ДДТ мг/кг Менее 0.002

Гептахлор мг/кг Не допускаются (< 0.002) Не обнаружено

Алдрин мг/кг Не допускаются (< 0.002) Не обнаружено

Радионуклиды

Цезий-137 Бк/кг Менее 20.0 Не более 200

Стронций-90 Менее 6 2 Не более 100

Свинец мг/кг Менее 0.5 Не более 5.0

Мышьяк МГ/кг Менее 0.02 Не более 3.0

Кадмий мг/кг 0.006 Не более 1.0

Ртуть мг/кг Менее 0.005 Не более 1.0

Заключение: Соответствует требованиям ТУ 9317-02-87552538-03

Д.РОДИОНОВА

463

СИСТЕМА СЕРТИФИКАЦИИ ГОСТ Р

ФЕДЕРАЛЬНО): АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

егифиж*"*

СЕРТИФИКАТ СООТВЕТСТВИЯ

№ POCCRC.MJH3.H))8)2

Срок действия с 4.02.20)3 по )2 02.20)6

№ 0602596

ОРГАН ПО СЕРТИФИКАЦИИ Р*?' № РОСС RC ООО).) )МЛ)З.АВ)ОНОМНАЯ НЕКОММЕРЧЕСКАЯ ОР) АНИЗАЦИЯ ОРГАН ПО СЕРТИФИКАЦИИ ПРОДУКЦИИ И СИСТЕМ КАЧЕСТВА "ЕВРОСТАНДАРТ" ))5088, г Москва. 2-й Южнопортовый проем, л. 20А. стр. 4. тел. [phone]. факс [phone], c-mai): curostandan066inbox.ru.

ПРОДУКЦИЯ Комплект мнпиты я активации росга сельскохомйствениых культур малогабаритный ( КЗАРМ "Зеленые Волны").

ТУ 6398-028-87552538-)3.

Серийный выпуск

СООТВЕТСТВУЕТ ТРЕБОВАНИЯМ НОРМАТИВНЫХ ДОКУМЕНТОВ

ГОСТ Р МЭК 60065-2009. ко.Г.4 ВЭД России

)'ОСТ Р 5)3)7.3.2-2006 (ратд 6.7);

ГОСТР 5)3)7 3 3-2008.

[ кодОК005)ОКП): ] 63 9800

ГОТОВ И ТТАЬ ООО Иноисгфарм", ИНН 77)9687650.

Адрес )05264. г. Москва, у.ч. )0-я Парковая . л.)8 Зелсфон 8 [phone]

СЕРТИФИКАТ ВЫДАН 000"Инбиофарм . ИНН 77)9687650.

Адрес: )05264, г Москва, ул. )0-я 1 )арковая , д.)8.

Телефон [phone].

НА ОСНОВАНИИ Протокол испытаиян № 55С4Р!3-)3 от )3 02 20)3 г. выданный ИЛ "ИЛ ЬТ" ООО "ИЛ )П ЭМС" (Атт. аккр. РОСС RC 000] 21МЛ31). Продокол испытаний № 254D2C4-4 от ]З.О2 20)3 г., выданный ИЛ "ЭП Э\)С" (POCCRU.OOOL2)MT48).

П.В. Верктгни

Ь. ( . Мигачев

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Схема сертификации: 3 й

> - ^Руководитель органа

,г* Эксперт . _______

Сердтгфикат не применяется при обязательной сертификацнн

М.П

' .'7 w '

464

СИСТЕМА СЕРТИФИКАЦИИ ГОСТ Р

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО НО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

) !

!

СЕРТИФИКАТ СООТВЕТСТВИЯ

N9 POCCRU.MB)3.H))8]3

Срок действия с 4.02 20)3 по )2.О2.2О)6

№ 0602597

ОРГАН ПО СЕРТИФИКАЦИИ per. № МКС RU.OOO) НМЛ)3.АВТОНОМНАЯ НЕКОММЕРЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ОРГАН ПО СЕРТИФИКАЦИИ ПРОДУКЦИИ И СИСТЕМ КАЧЕСТВА "ЕВРОСТАНЛАРТ". t) 5088, г. Москва. 2-й Южнопортовый прсеи. д. 20А. стр. 4. тел. [phone], факс [phone]. e-mad: euros(andan06yCinbox ru.

ПРОДУКЦИЯ Комплект штаты и акптваияи роста ссльскохозяйсшеиных куц. ) \-р (К ЗАР "Зеленые Волны"). код ОК 005 (ОКП г

ГУ 6398-027-87552538-)3

Серийный выпуск. 9800

СООТВЕТСТВУЕТ ТРЕБОВАНИЯМ НОРМАТИВНЫХ ДОКУМЕНТОВ

ГОСТ Р МОК 60065-2009; код , Н ВЭД России

ГОСТ Р 5)3)7.3.2-2006 (разд. 6. 7);

ГОСТИ 5)3)7 3.3-2(8'8

ИЗГОТОВИТЕЛЬ ^ЮО "Инбнофарм", ИНН 77) 9687650.

Адрес )05264. г Москва, ул )0-я Парковая . д )8.

Телефон [phone]

СЕРТИФИКАТ ВЫДАН ^К)О "Инбнофарм". ИНН 77)9687650

Адрес: ) 05264. г. Москва, ул. )0-я Парковая .д.) 8.

Те.лефон 8 [phone]

НА ОСНОВАНИИ Протокол испытаний № 56С4 Р4-4 от ) З.О2 20) 3 выданный ИЛ "ИЛ БТ" (ХЮ "ИЛ ЭП ЭМС (Атт. аккр. Р(ХТ R)' 000) .2)МЛЗ)). Протокол испытаний Хе 255D2C4-)3 от )3.02.20)3 г., выданный ИЛ "ЭН ЭМС" (РОСС ки.0001.2)МЭ48).

ДО! 1 ОДН ИТ ЕАЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Схема сергнфиМцин: 3

/' --

........... J

с . Руководитель органа

МП. '

' о- - '

Эксперт

Н В. Всрютнн

Б. С.Мнгачсв

Сертификат не применяется при обязательной сертификации

465

Аттестат аккредитации испытательной лаборатории (центра) № rC3H.RU.UOA.284 о Системе аккредитации лабораторий Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и блшопо.тучня человека. Зарегистрирован в Реестре Системы 02 апреля 2009 г. действителен до 02 апрели 20)4 г.

«Утверждают

«2) ы нюня 20)3 г.

-jjJ ____Сергеев ) И. /

Генеральный директор АНО«НИИЦ«РФТТя

Заключение № 04 от «2! и нюня 20)3 г.

на соответствие требованиям Санитарно - эпидемиологических правил и норм Комплектов защиты и активации роста сельскохозяйственных культур КЗЛР «Зеленые Волны" и КЗАРМ «Зеленые Волны»

Но договору № !6от ! 2.02.20) 3 г между (ХЮ «Инбиофарм" и АНО «НИШ ! «РФЗТа. ИЛ АНО «НИИЦ «РФТТгг ггрггведена санизарно-эггндемиологичсская экспертиза Комплектов тамги ты и активации роста сельскохозяйственных культур (КЗАР «Зе.геньге Полный и КЗАРМ «Зеленые Водным) !У 6398-О27-87552538-2О!3, (У 6398-028-87552538-20!3.

Производитель: ООО «Инбиофарми. адрес: )05264. г Москва. тлПО-я Парковая, д.!8. ИНН 77! 9687650.

В качестве образца для испытаний выбрано изделие КЗАР «Зеленые Волны" (ТУ 6398-027-87552538-!3).

Итмермпгя проводились на соответствие требованиям Сал!!иН 2.2.4.! !9] -03. МСалПиН 001-96. Сан!1нН 2.! .2! 002-00.

Измерения переменного электрического и магнитных полей проводились в диапазонах частот 5 Гц- 2000 Гц и 2 кГц 400 кГц.

Измерения напряженности электростатического поля проводились па расстоянии !0 см от поверхности электронного генератора импульсов.

При проведении измерений посторонние источники переменного электрического, магнитного и электростатического полей, а также посторонние шумы отсутствовали.

Цель измерений - определение соответствия изделий КЗАР «Зеленые Водным и КЗАРМ

«Зеленые Волны" требованиям СалПиН 2.2.4.1191-03, МСанПиН 00!-96. СаиПиН 2.1.21002-00.

Результаты измерений представлены в прилагаемом Протоколе лабораторных испытаний № 04 от2!.06.2013 г.

Оценка результатов измерений представ.тема и соответствии с действующими в России СанНиН 2.2.4 ]!9)-03. МСанПиН 00!-96. СанПиП 2.1.21002-00.

Стр.!

466

По результатам нтмсреннй сделаны следующие выводы:

Измеренные уровни переменного электрического поля изделий КЗАР '(Зеленые Полным и

КЗАРМ «Зеленые Волныя СООТВЕТСТВУЮТ нормируемым значениям СанПиН 2.2.4.П91-03, МСаиПиН OCt-96, СанПиН 2.).2t002-00.

Измеренные уровни переменного магнитного поля изделий КЗАР «Зеленые Полным и КЗАРМ «Зеленые Волны)) СООТВЕТСТВУЮТ нормируемым значениям СапИиИ 2.2.4.t !9]-03, МСанПнН 00t-96, СанПиН 2Л.2Ю02-00.

Измеренные уровни напряженности эпектростттгического поля изделий КЗАР чЗеленые Волны)) и КЗАРМ «Зеленые Волныа СООТВЕТСТВУЮТ нормируемым значениям СанПиН 2.2.4.) 19]-03. МСанПнН 00]-96. СанПиН 2Л.2Ю02-00.

Заключение. Уровни переменных электрических и магнитных полей в диапазоне частот 5 Гц-400 кГц (включающем и промышленную часюту 50 Гц) и уровни электростатического поля от Комплектов защиты и активации роста сельскохозяйственных культур КЗАР «Зеленые Вол ныл и КЗАРМ «Зеленые Волны" нс превышают ПДУ. установленных в соответствии с СанПиН 2.2.4.] 19!-03 «Электромагнитные поля в производственных условиях" в МСанПнН 00!-96 «Сантарные нормы допустимых уровней физических факторов при применении товаров народного потребления в бычиных условиях" и СанПиН 2.!.2!002-00 «Санитарно-эпидемиологические требования к жилым зданиях! и помещениям)).

' Должшють Фамилия Подпись /

t Руководите;)). ПЛ Сер) сев Г.И.

Паонянмж включение не может бьпь частично воснроитаслено или размножено бет рюре/йенш) АНО «! !ИИ)! «!'ФТТч

467

DlhTT

Аккредитованная Испытательная Лаборатория Автономная некоммерческая органимция «Научно- исследовательский испытательный центр «Радиофитические Тестовые Текно.тогним

Адрес; )07256. Москва. Ул. t-я Бухвостова, д. 12?П.

Гслсфон. (495) 221-63-М, факс [phone]

Ачесгат аккредитации испытательной лаборатории (центра) №ГСЭН.Ш .ЦОА.284 в Системе аккредитации лабораторий Федеральной службы но надтору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Зарегистрирован в Реестре Системы 02 апреля 2009 т. дейсгвитс-тсн до 02 апреля 20(4 г.

ПРОТОКОЛ

«Утверждаю*

Г енеральный директор

-\ё04ог«2(ы нюня 20)3 г

Лабораторнык испытаний по гигиенической оценке фитичсскик факторов

(.Объект испытаний:

Комплекты защиты и активации роста сельскохозяйственных культур: ( КЗАР «Зеленые Водным и КЗАРМ «Зеленые Водным) Код ОКП продукции 63 9800

ТУ 6398-027-87552538-20)3. ТУ 6398-028-87552538-20)3;

2. Модель для испытаний: КЗАР «Зеленые Водным (ТУ 6398-027-87552538-20)3);

3. Кп оювнгсль (Заявитель) ООО «Инбиофармм;

4. Основание для нроведення испытаний: заявка № 3 от «)9м нюня 20(3 г договор № 16 от )2.О2.2О)3;

5. Юридический адрес (ин отопителя, таявигс.тя): ) 05264, г Москва, ул ) 0-я Парковая, д.)8;

6. Цель: саншарно-эпндемиолотттческая экспертита:

7. Дата получения обратной: 20.06.20(3 ______________________:

8. Время промления испытаний: 2) 06.20)3 9:30 :

9. Код обратна: 04-)3________;

(0. Описание обратна: корпус - пластмассовый , электронный генеранэр импульсов снецианьный ()(31С-)). два волновода спирального типа (катод и анод).

! (. Нормы и методы испытаний:

СанПиН 2.2.4.П9)-О3. МСщтПиП 00)-96. СанПиН 2.).2(002-00;

) 2. Условия проведения испытаний:

температур*СС) -2); атажность(%) - 49.0: давление (мм рт. ст.)- 747; напряжение сети мигания (В) - 220; частота сети питания (Гц) - 50

(3 Средства нтмерений и испытательное оборудование:

Наименование СИ. гав. № Сведения о поверие Сведения о гннрмииоста СИ

И Множить элекгрнчбскогп пмя ИЭП4М № 79 Свилетельство о поверке №026456 до 27.) 2.20)3 г. )0%

Игмсризмк МАГНИТНОГО поля ИМП-04№ !79 С Андон.) кд ао о мюерке №026457 jo27J2.20i3r. )0%

Игчсри;ель хгектросппмческощ поля ИЭСИ-7. № 56 Свидетельство о поверье № 5022 45) дейсгаительно .то 21 09 2013 с )()**

Общее количество страниц 2: страница )

468

14. Результаты испытаний:

Результаты измерений переменного электрического ноля в таблице t. Результаты измерений переменного магнитного поля и таблице 2. Результаты измерений напряженности электростатического поля в таблице 3 ЗАЯВЛЕНИЕ:

t Ретультгпы испытаний относятся только к образлям. подвергнутым испытаниям.

2. Запрещается мол not или чаегнч[юе юммроианме нроичяла бел разрен^иия испытательной лаборатории

Таблица 1 - Результаты измерений переменного электрического поля

Диапазон измерений Фактические значения." В/ы Прслогьно допустимое значение, В/м

Фон Корпус ЭГИ

5 - 2000 Гц t.O П.0 Ю0.Ж

2-400 кГц 0J ол 26,0

Таблица 2 - Результаты измерений переменного магнитного поля

Дггалазоп измерений Фактические значения,* мкТл Предельно допустимое значение. мкТл

Фон Корпус ЭГИ

5 - 2000 Гц <М 0.83 Г 0.0

2-400 кГц 0.02 0. Т5 62,0

Таблица 3 - Результаты измерений напряженности электростатического поля

) Точки контроля Напряженность ЭСП, кВм Прсдсльно-допустимый уровень, кВ м

< 10 см ст поверхностей ЭГИ (максимальное } измеренное значение) ч,о

Примечание: нчп - ниже чувствительности прибора (2 кВ м)

' приведены максимальные из эрек уровней значений

Общее количество страниц 2: страница 2

469

СИСТЕМА СЕРТИФИКАЦИИ ГОСТ Р

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

-ФР""*"**

СЕРТИФИКАТ СООТВЕТСТВИЯ

№ РОССЮ).АГ75Н073)5

Срок действия с 29.!О.2О!3

ио 28.] 0.20! 6

№ 0878692

ОРГАН ПО СЬРЖФИКАЦИИ ре(.№РОСС RU.6001.11 АГ 75 Общество с ограниченной ответственностью «ПродМацгТесТ" !270t5. Москва, Ьумажный пр. 14. стр. ) Телефон [phone]. факс [phone]. адрес электронной почты ptodmachtesPi^yandex гм

ПРОДУКЦИЯ Комплект зашиты и активации роста сельскохозяйственных культур (КЗАР «Зеленые Полные)

ТУ 63984)27-87552538-13. Серийный выпуск.

код ОК ОГ((т (OKf 1)'

63 9800

СООТВЕТСТВУЕТ ТРЕЬОВАНИЯМ НОРМАТИВНЫХ ДОКУМЕНТОВ

]у 6398-027-87552538-13; ГОСТ Р МЭК 60065-2009; ГОСТ Р 5)3]7.3.2-2006 (рам. кед ГН ИЗД Р.игии 6.7); ГОСТ Р 51317.3.3-2008

ИЗГОТОВИТЕЛЬ ООО «Иибиофарм.., ИНН 7719687650 Адрес )05264. г. Москва, ул. 10-я Парковая, д. 18. Российская Федерация. Телефон [phone]

СЕРТИФИКАТ ВЫДАН ООО аИнбнофарм", ИНИ 7719687650 Адрес 105264. г Москва, ул. 10-я Парковая, д. 18. Российская Федерация. Телефон [phone]

НА ОТ НОВ АНИ И Протокол Nt 04 ат ч2(* юаня 204 г Лабораторных испытаний по титкеничссхоЯ отнят фиги чесжих факторов Аккркдитомнмя Нспытлтечьняя Лаборжтория Аятоночнжл неюмнерчеасм организация «На)чио-иссясаомтельский иепмттгтетмый ттеигр чРмшфитичеста;е тестовые технологик* (Аттестат амрмитытии № ГСЗН RL ЦОА 284) Адрес 107258, Москм.).к 1-я Бухвостова, д. ЧП Те.,сфон8(495)223-о3-84^8ак.мчеиие№04отк!)йинии'2013г наспотаетствнетребоааттий Санитаряо - жвыежимжичюмх прямы и нори. Ажк)хдитомянтт Исттымпельшм Лаборжтория Автоиочиая нетюнчерчссм ортамиытмы йМяучно-иссэсДояатсдьский испытательный центр сУжлиофитические тестовые технмопчи- ( Аттестат аккредитации Ав ГСЭН RU ЦОА 284) Азрес: 107258, Москва. ул ( я Бухвостсю. л (К Г Телефон Я [phone]. [(рогоко.т испытаний № 49287 (3 от 28 (О 2О!3 г Нспытителыыл ыбератс-рия ООО «ПролМатпТсст*. per А РОСС RC 0901 2( АВ79 от 28 (0 20(). адрес 127015. Мтхжвд Бумажный пр . )4. стр.1

ДОПОАПИТЕАЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ Схема сертификации 3

' МП.

Руководитель органа

Чу (умов А-А. j.

Сертификат не прих(еняется при обязательной сертификатщи

Эксперт

470

МХССИЙДЖАЖ <4МВД1В1РАЩШЖ

сви д втв л ьство

на товарный знак (знак обслуживания)

№411707

Сюита

* -s

: , _ ________________________ _ . --- . .' ' .': . '.

Правбобладйель: 4?$и{е<ыя^р Ъ ^ранм ҷснясй оязмшсомғня^стьм %рсй№, Лсрко^яя, 7^, о^.32^

-ЙКР - -L-

З^вка №2009714579

Приоритет товарного знака 24 ижоНЯ 2009 г. ЗарегйСтрнроя&йб а Государственном реестре товарных зн^в в iMayob обсяуживанйа РОсснЙбжРй ФсАерм^и 22 нюня 2М? д Срок дейстнйй регмстрации истекает 24 тоня 2019 г.

№ Ж Ж № И И № Ж И № № И И № Ж Ж Ж Ж Ж Ж Ж Ж Ж Ж Ж Ж Ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж

а жовйриымзнаком

Ғ.Я. Симонов

471

П.З Патенты

-

РОСС И Й С К А Я^Е Д Е РА Ц И Я ?

КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ПАТЕНТАМ И ТОВАРНОМ ЗНАКАМ (РОСПАТЕНТ)

ПАТЕНТ

2069641-х

. . У

.X

х х;<. * -

на ИЗОБРЕТЕНИҒ/^^

Способ очистки питьевой воды и способ получения бактерицидного средства для очистки воды (варианты)*

* - - ... з. х' ,**.. . * .* .

Патентообладатель (ли) Акционерное общество 'НЕТТЭМ

; : . .с X:

' хх'хХ''''

Автор (авторы) дпьтов Александр Дмитриевич. Андрияшин Александр Иванович. Захаров Сергей Викторович, Зверев Михаил Петрович. Костина Татьяна Федоровна) Маслюков Александр Петрович, Орлов Александр Евгеньевич, Лолоеихина Пяля Александровна, Рахманин Юрий Анатольевич и Сапрыкин Виктор Васильевич ,

Приоритет изобретения

ноября

1993г.

Дата поступления заявки в Роспатент g

ноября

1993Г.

Заявка

93050424

9

Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений

' 27 ноября 1996г.

472

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

РОССИЙСКОЕ АГЕНТСТВО ПО ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ (РОСПАТЕНТ)

ПАТЕНТ

М. !'^S<4

"Способ получения и<Д%рт!?яР"%т^? v$Tбок с и л с о в е р waste г о вспои на*

Патентообладатель (ли): Акционерное общество закрытого типа "МЕТТЭМ-техиологии^

Автор (авторы): Абсулхакова Зания Зиннуровна. Ансрия&ин Алегсзнар Изаносич. Вепобородов Валерий Леонидович. Захаров Сергей йигторосич, Зое ре с Михаил Петрович, тостинэ Татьяна Федоровна и Николотоо Влэдимир Викторович

Приоритет изобретения

2? июни 1996г.

Дата поступления заявки в Роспатент " ими я 1996

Заявка^ 96112740

Зарегистрирован в Государственном

реестре изобретений 20 чнеаоя 19

473

.!

'J

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРА ПИЯ

РОССИЙСКОЕ АГЕНТСПЮ ПО ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ (РОСПАТЕНТ)

ПАТЕНТ

№ 2108980

i

на ИЗОБРЕТЕНИЕ ;;

"Устройство для очистки воды с озонированием" t

)

Патентообладатель (ли)* Товарищество с ограниченной ответственностью Компания "ОТОПИЛ ЛТД"

i

}

Автор (авторы): Петров Валерий Михайлович, Свитский }

Олег Лычарентгг, Орлов Александр Евгеньевич, Николотов Владимир Викторович, Болотовский Юрий Пзрайлевич, Хайтин Михаил Зиновьевич. Копылов Владимир Николаевич. Ананьев Михаил Весильснич. Захаров Сергей Викторович, Смирнов Александр Дмитриевич и Писаренко Алексей Владимирович

Приоритет изобретения 1В июли 1997г.

Дата поступления заявки в Роспатент июля !997г. Заявка № ^"2229

Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 20 апреля 1998г.

ГЕНЕРАЛЬНЫЙ ДИРЕКТОР

!

I

474

РОССИЙСКАЯ ФИДЛРА1ЖЯ

НА ИЗОБРЕТШИЕ

№ 2163829

Российским агентством по патентам и товарным знакам на основании Патентного закона Российской Федерации, введенного в действие t4 октября )992 года, выдан настоящий патент на изобретение

БЫТОВОЙ ФИЛЬТР

Патентообладатель(ли):

по заявке b& 2000 02833, дата поступления 24 05 2000

Приоритет от 24 05.2000