Прогностическое значение динамики показателей оксидативного стресса у пациентов с острым коронарным синдромом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.05, кандидат наук Быкова, Александра Александровна

• Быкова, Александра Александровна
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Быкова, Александра Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Свободные радикалы и антиоксиданты в условиях нормальной 9 физиологии

1.1. Оксид анты

1.2. Антиоксиданты 18 1.3.Оксидативный стресс

2. Оксидативный стресс и заболевания сердечно-сосудистой системы

2.1. Оксидативный стресс и атеросклероз

2.2. Дисфункция эндотелия и оксидативный стресс

3. Маркёры оксидативного стресса 32 ЗЛ.Миелопероксидаза

3.2.Продукты окисления липидов

3.3.Продукты окисления белков

4. Стратификация риска у пациентов с острым коронарным синдромом

5. Заключение 45 ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Материалы исследования 46 1.1 .План исследования

1.2. Критерии включения

1.3.Критерии не включения

1.4.Критерии исключения 49 1.5.Общая характеристика исследуемой выборки

2. Методы исследования

2.1. Методы обследования больных

2.2. Методика забора крови и подготовки материала 54 2.3.Определение маркёров оксидативного стресса

3. Статистический анализ данных

ГЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ НАБЛЮДЕНИЙ

1. Сравнительная характеристика пациентов с различным течением 59 заболевания

2. Оценка показателей оксидативного стресса, их корреляционные 61 взаимосвязи и динамика у пациентов с острым коронарным синдромом

2.1. Миелопероксидаза

2.2. Активность миелопероксидазы

2.3. ТБК-реактивные продукты - малоновый диальдегид

2.3.1. МДА в нативной плазме

2.3.2. МДА после медь-индуцированного окисления плазмы

2.4. Связывающая способность альбумина

2.5. Кобальт-связывающая способность альбумина

2.6. Карбонильные группы белков

2.7. Карбонильные группы фибриногена

3. Сравнение показателей оксидативного стресса у пациентов с различным 74 течением заболевания и тридцатидневный прогноз

3.1. Миелопероксидаза

3.2. Активность миелопероксидазы

3.3. ТБК-реактивные продукты

3.3.1. МДА в нативной плазме

3.3.2. МДА после медь-индуцированного окисления плазмы

3.4. Связывающая способность альбумина

3.5. Кобальт-связывающая способность альбумина

3.6. Карбонильные группы белков

3.7. Карбонильные группы фибриногена

4. Показатели оксидативного стресса и долгосрочный прогноз пациентов 88 после ОКС

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Миелопероксидаза и её активность у пациентов с ОКС

2. Продукты перекисного окисления липидов у пациентов с ОКС

3. Продукты окислительного повреждения белков у пациентов с ОКС

4. Влияние показателей оксидативного стресса на прогноз у пациентов с 97 ОКС

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПРИЛОЖЕНИЕ № 1. Метод определения активности миелопероксидазы в 118 плазме крови (Асейчев A.B., Азизова O.A.)

ПРИЛОЖЕНИЕ №2 Общая методика спектрофотометрического определения 119 карбонильных продуктов в белковых препаратах по реакции с ДНФГ (Азизова O.A., Пирязев А.П., Швачко А.Г.)

ПРИЛОЖЕНИЕ №3 Определение содержания карбонильных продуктов в 123 реакции с ДФНГ в гидролизатах фибринового сгустка плазмы крови (Азизова O.A., Швачко А.Г., Пирязев А.П.)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Прогностическое значение динамики показателей оксидативного стресса у пациентов с острым коронарным синдромом»

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) и ее осложнения по-прежнему остаются основными причинами заболеваемости и смертности населения в Российской Федерации. По данным федеральной службы государственной статистики смертность от болезней системы кровообращения в 2014 году занимает первое место в структуре общей смертности и составляет 49,8% (650,3 случаев на 100 тыс. населения). При этом две трети случаев приходятся на различные формы ишемической болезни сердца (ИБС), в том числе инфаркт миокарда (3,4% или 44,8 случаев на 100 тыс. населения).

В термин острый коронарный синдром включают несколько состояний (инфаркт миокарда (ИМ) с подъёмом сегмента ST, ИМ без подъёма сегмента ST, нестабильная стенокардия), различающихся по прогнозу. Стратификация риска у пациентов с ОКС по сей день является актуальной задачей кардиологии.

В последних отечественных и зарубежных рекомендациях по диагностике и лечению ОКС [ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation, 2012; AHA/ACC Guideline for the Management of Patients With Non-ST-Elevation Acute Coronary Syndromes, 2014] для стратификации риска предлагается использование клинических шкал (TIMI, GRACE).

В последние десятилетия получены убедительные данные, указывающие на ведущую роль оксидативного стресса (ОС) в инициации, прогрессировании и осложнениях атеросклероза [Valko М et al, 2007].

Показатели оксидативного стресса, преимущественно продукты окисления липидов и белков плазмы крови, позволяют судить о напряженности этого процесса у пациентов с различными заболеваниями. Показано, что маркёры оксидативного стресса значительно выше у пациентов с ИБС по сравнению со здоровыми добровольцами и больными без ИБС. Отдельные работы указывают на

возможность использования этих показателей для прогнозирования неблагоприятных исходов у пациентов со стабильной ИБС [Азизова O.A., 2011].

Активация оксидативного стресса предшествует клиническим проявлениям ОКС. В связи с этим, вероятно, что показатели оксидативного стресса могут иметь прогностическую ценность, сравнимую с клиническими шкалами. Кроме того, возможно, что с помощью этих маркёров можно выделить группу неблагоприятного течения среди больных с низким риском согласно клиническим шкалам.

ЦЕЛЬ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследовать показатели оксидативного стресса и их динамику у больных с острым коронарным синдромом, оценить их прогностическое значение на фоне современных подходов к лечению этого состояния.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Сравнить содержание маркёров оксидативного стресса в крови больных с различными формами острого коронарного синдрома

2. Сравнить содержание показателей оксидативного стресса и их динамику у пациентов с различным течением заболевания

3. Оценить влияние показателей оксидативного стресса на краткосрочный (тридцатидневный) прогноз у пациентов с острым коронарным синдромом

4. Выделить показатели оксидативного стресса и сроки их определения наиболее информативные для оценки прогноза у больных с ОКС

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые в рамках одного исследования произведена комплексная оценка показателей оксидативного стресса у пациентов с ОКС: важнейшего источника свободных радикалов (СР) в атеросклеротической бляшке - миелопероксидазы (МПО), конечных продуктов перекисного окисления липидов, окисленных модификаций белков плазмы крови - альбумина и фибриногена, конечных продуктов окисления белков. Кроме этого, впервые проанализирована динамика

этих показателей в раннем периоде инфаркта миокарда и их связь с клиническими формами ОКС.

Впервые определена возможность использования некоторых показателей оксидативного стресса (общей концентрации альбумина (ОКА), МПО) для прогнозирования течения заболевания. Впервые показано, что с помощью маркёров оксидативного стресса можно выделить группу риска неблагоприятных сердечно-сосудистых событий среди пациентов с низким риском смерти согласно традиционным шкалам.

В работе впервые показана техническая возможность выделения окислительной модификации фибриногена из общей структуры окисленных белков. Показано, что этот показатель достоверно выше у пациентов с ИБС по сравнению с здоровыми добровольцами. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Внедрение показателей оксидативного стресса в практику может помочь уточнить прогноз у пациентов с ОКС. У пациентов с низким риском смерти, рассчитанным с помощью традиционных шкал, с помощью определения общей концентрации альбумина можно выделить группу с потенциально неблагоприятным прогнозом.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Наиболее информативными показателями оксидативного стресса у пациентов с ОКС являются общая концентрация альбумина, источник свободных радикалов в нестабильной бляшке (миелопероксидаза и её активность), продукты перекисного окисления липидов (МДА после медь-индуцированного окисления плазмы) и продукты взаимодействия свободных радикалов с белками плазмы крови (КССА, общая концентрация карбонильных групп белков).

2. Динамика маркёров оксидативного стресса в течение 7 дней после начала заболевания не влияет на прогноз у пациентов с ОКС.

3. Низкие значения общей концентрации альбумина увеличивают риск неблагоприятного течения заболевания (смерть от сердечно-сосудистых причин,

нефатальный инфаркт миокарда, развитие ранней постинфарктной стенокардии, потребность в экстренной реваскуляризации), в том числе у пациентов с низким риском, рассчитанным с помощью традиционных шкал (Т1М1).

4. Высокие значения МПО на 7 сутки увеличивают риск неблагоприятного течения заболевания у пациентов, госпитализированных по поводу ОКС.

5. МДА после медь-индуцированного окисления плазмы и КССА можно использовать для оценки риска нефатального инфаркта миокарда у пациентов с ОКС.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы, из них 2 представлены в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные результаты работы представлены на Международном форуме кардиологов, г. Москва (2013г.); Общероссийском научно-практическом мероприятии - Эстафета «Вузовская наука-2013», г. Москва (2013 г.). ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Диссертация обсуждена и апробирована на заседании кафедры профилактической и неотложной кардиологии ИПО ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова 27 марта 2015 года (протокол №3).

Практические рекомендации, разработанные в диссертации, применяются в Клинике кардиологии УКБ №1 ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова при лечении больных с острым коронарным синдромом.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Материалы диссертации изложены на 124 страницах машинописного текста. Работа включает: введение, 4 главы, выводы, практические рекомендации и 3 приложения. Библиографический указатель содержит 140 источников литературы (11 отечественных и 129 зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 22 таблицами и 39 рисунками.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ И АНТИОКСИДАНТЫ В УСЛОВИЯХ НОРМАЛЬНОЙ ФИЗИОЛОГИИ

Парадокс аэробной жизни, или «кислородный парадокс», заключается в том, что высшие эукариотические организмы не могут жить в отсутствие кислорода, в то же время кислород по своей сути опасен для их существования [35]. Теория о повреждении клетки свободными радикалами (СР) кислорода появилась в 50-х годах XX века [101]. С тех пор накоплена огромная фактическая база об образовании и метаболизме свободных радикалов [32, 79, 84]. В настоящее время, очевидно, что живые системы не только адаптированы к существованию в условиях непрерывного формирования СР, но и используют их в различных физиологических функциях.

Свободные радикалы определяются как молекулы или молекулярные фрагменты, содержащие один или несколько неспаренных электронов на атомных или молекулярных орбиталях [30, 42]. Свободные радикалы кислорода, чаще их называют «активные формы кислорода» (АФК), также как и активные формы азота (АФА) являются продуктами нормального метаболизма клетки. В низких и средних концентрациях они участвуют в физиологических процессах клетки, например, в защите против инфекционных агентов, в ряде сигнальных систем, в индукции митоза и т.д.

В высоких концентрациях свободные радикалы могут повреждать биомолекулы (липиды, белки, ДНК), угнетая их нормальные функции. Для защиты от негативного влияния АФК у аэробных организмов есть антиоксидантная система, которая состоит из ферментных и неферментных антиоксидантов. Вредные воздействия свободных радикалов, вызывающие повреждение клетки, обозначают как оксидативный и нитрозативный стресс. Это состояние возникает при смещении равновесия между оксидантами/антиоксидантами в пользу первых. Таким образом, оксидативный стресс является важной составляющей многих патологических состояний (онкогенез, неврологические заболевания,

атеросклероз, гипертония, ишемия/реперфузия, сахарный диабет, острый респираторный дистресс-синдром, ХОБЛ и бронхиальная астма).

Баланс между полезными и вредными эффектами свободных радикалов в нормальной физиологии поддерживается благодаря нескольким механизмам, получившим название «редокс регуляция».

1.1 ОКСИДАНТЫ

Свободные радикалы - наиболее распространенные оксиданты в биологических системах. Наиболее часто встречающимися являются активные формы кислорода и азота. Помимо них существуют эндогенные оксиданты, не являющиеся СР. Основные эндогенные оксиданты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Основные эндогенный оксиданты.

Название Формула Комментарий

СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ

Углеводородный радикал > Эти радикалы с неспаренным электроном на атоме углерода, быстро реагируют с молекулярным кислородом с образованием пероксил-радикалов

Супероксид анион и гидропероксильный радикал ■02 но2- Первичные кислородные радикалы

Пероксил и алкоксил радикалы ro2- ro- Кислородные радикалы, образующиеся в результате реакции углеводородного радикала с молекулярным кислородом (КОг), или после разрушения органических пероксидов, например, шон(яо2-,ко-)

Гидроксил радикал •ОН Очень активный кислородный радикал, реагирующий с любыми биомолекулами

Моно- и диоксиды азота no no2 Монооксид азота образуется из Ь-аргинина с помощью фермента М>синтазы. Диоксид азота образуется в результате взаимодействия n0 с 02

Тиол и пертиол радикалы RS-RSS- Группа радикалов с неспаренным электроном на атоме серы

Ионы металлов-переносчиков Fe, Cu Способны менять степень окисления, таким образом являются донорами/акцепторами одиночных электронов и, следовательно, катализируют

свободнорадикальные реакции

ОКСИДАНТЫ, НЕ ЯВЛЯЮЩИ1 ЗСЯ СВОБОДНЫМИ РАДИКАЛАМИ

Пероксид водорода Н202 Обладает способностью диффундировать через клеточные мембраны; слабый окислитель с низкой реакционной способностью. Выполняет сигнальную функцию. В присутствии металлов-переносчиков образует гидроксил радикал (ОН)

Гипохлорит, гипохлорная кислота ОС1" НОС1 Слабая кислота, но сильный окислитель. Взаимодействует с активными центрами железосодержащих ферментов (места, где атомы железа прикреплены к белковой молекуле с помощью тиоловых лигандов, как правило остатками метионина и цистеина). В ходе подобных реакций образуются хлорамины и дериваты аминокислот.

Пероксинитрит ONOO" Формируется в результате взаимодействия N0 с 02; вещество с высокой реакционной способностью. Взаимодействуя с С02, образует нитрозопероксикарбонат (01\Ю0С02-). Данное вещество участвует в целом ряде реакций нитрации биомолекул, а также в процессах оксидативного и нитрозивного стресса.

Алкилпероксинитрит, оксид азота (III), нитрил хлорид, нитрил ион ROONO, N2O3, N02C1, no2+ Активные формы азота. Оксид азота (III) - главный нитрозирующий агент в реакциях нитрозивного стресса

Нитрозотиолы RDNO Образуются в ходе реакции тиоловых радикалов с оксидом азота. Нитрозотиолы — слабые окислители

1.1.1 Активные формы кислорода

Активные формы кислорода образуются из молекулярного кислорода в результате процессов нормального клеточного метаболизма. «Темная» сторона кислорода заключается в том, что атомарный О имеет 1 неспаренный электрон на внешней электронной оболочке, а молекулярный кислород (02) - 2 неспаренных электрона. Таким образом, атомарный кислород является свободным радикалом, а молекулярный - свободным бирадикалом [35, 43].

АФК разделяют на 2 группы: первичные (супероксид анион и гидропероксильный радикал) и вторичные (гидроксильный радикал, пероксид водорода, органические пероксиды). В организме человека наиболее важную роль играют 3 АФК: супероксид анион (02*;), гидроксильный радикал (-ОН) и пероксид водорода (Н2О2).

Супероксидный анион образуется в результате присоединения электрона к молекуле кислорода [84]. Этот процесс происходит в митохондриальной цепи переноса электронов или посредством НАДФ(Н)-оксидазы и ксантин-окидазы. Основным местом образования супероксид аниона в клетке является митохондрия, где в процессе клеточного дыхания образуется АТФ. В норме электрон проходит по дыхательной цепи в процессе окисления молекулярного кислорода до воды, однако от 1 до 3% электронов ускользают с последующим образованием супероксид аниона. Показано, что в нормальных условиях около 50% всего супероксид аниона, образовавшегося в митохондрии, инактивируется там же (либо связываясь с Ге8 кластерами в I комплексе дыхательной цепи, либо с помощью Мп-супероксиддисмутазы).

Другой путь образования супероксид аниона связан с действием фермента НАДФ(Н)-оксидазы. НАДФ(Н)-оксидаза находится преимущественно в фагоцитирующих клетках (полиморфноядерных лейкоцитах, моноцитах и макрофагах). В процессе фагоцитоза в этих клетках происходит «респираторный взрыв», который и определяет их бактерицидную активность. В нефагоцитирующих клетках активность НАДФ(Н)-оксидазы составляет лишь 110% по сравнению с лейкоцитами. Супероксид анион в этих клетках образуется в качестве сигнальной частицы.

Супероксидный анион превращается в пероксид водорода с помощью специального фермента - супероксиддисмутазы (ЗОБв). Пероксид водорода легко диффундирует через клеточные мембраны. Помимо вышеуказанного пути пероксид водорода образуется с помощью ксантин-оксидазы, аминоацид-оксидазы и НАДФ(Н)-оксидазы [49], а также в пероксисомах при потреблении молекулярного кислорода в метаболических реакциях. В последовательных

реакциях Габера-Вейса (рис. 1) и Фентона (рис. 2) пероксид водорода окисляется до гидроксильного аниона в присутствии металлов-переносчиков, таких как двухвалентное железо и медь [40]. Супероксидный анион сам может реагировать с Н2О2 с образованием ОН [54, 2].

Fe3+ + 02 Fe2+ + 02 Fe2+ + Н2О2 -> Fe3+ + ОН + ОН Рисунок 1. Последовательная реакция Габера-Вейса

Fe2+ + Н2О2 Fe3+ + ОН + ОН Fe3+ + Н202 Fe2+ + ООН + Н+ Рисунок 2. Реакция Фентона

Гидроксильный радикал - самый активный из АФК, время его полужизни in vivo составляет около 10"9 сек [12]. Таким образом гидроксильный радикал in vivo может повреждать белки, углеводы и ДНК, а также инициировать реакции перекисного окисления липидов только в месте своего образования.

Таким образом редокс статус клетки зависит от доступности ионов железа/меди в цитозоле. Ранее считалось, что механизмы регуляции обмена железа, исключают возможность наличия свободного железа в клетке. Однако in vivo выявилось, что в состоянии оксидативного стресса избыток супероксид аниона повреждает железосодержащие белки, освобождая при этом в цитозоль железо и делая его доступным для реакций Фентона и Хербера-Вейса. Что с свою очередь приводит к образованию крайне активного гидроксильного радикала [39, 69, 83, 133].

Ферменты гранулоцитов, такие как эозинофильная пероксидаза и миелопероксидаза, увеличивают активность пероксида водорода. В активированных нейтрофилах Н2О2 накапливается с помощью МПО. В присутствие ионов хлора, Н2О2 превращается в гипохлорную кислоту (НОС1). Гипохлорная кислота - сильный окислитель, и играет большую роль в устранении

патогенов в воздухоносных путях [62]. Кроме того, НОС1 реагирует с ДНК и индуцирует реакции между ДНК и белками, а также присоединять хлорид к основаниям ДНК [136].

Эозинофильная пероксидаза и миелопероксидаза способствуют усилению оксидативного стресса с помощью модификации белков посредством галогенации, нитрирования и образования межбелковых сшивок через тирозольные радикалы [22, 65, 70].

Остальные кислород-содержащие свободные радикалы являются пероксилами (ROO ). Самый простейший из них - гидропероксил (НОО ). Свободные радикалы запускают цепные реакции перекисного окисления липидов. В дальнейшем липидные радикалы реагируют с кислородом и образуют пероксильные радикалы. Пероксильные радикалы запускают цепную реакцию, в ходе которой полиненасыщенные жирные кислоты превращаются в липидные гидропероксилы. Эти молекулы крайне нестабильны и быстро распадаются на вторичные продукты, такие как альдегиды (4-гидрокси-2,3-ноненаль) и малоновый диальдегид (МДА). Изопростаноиды - другая группа продуктов окисления липидов, они образуются в ходе перекисного окисления арахидоновой кислоты. Уровень изопростаноидов повышен в крови и в выдохе у больных бронхиальной астмой [71]. Окисление липидов нарушает целостность клеточной мембраны и приводит к нарушению её структуры.

1.1.2 Активные формы азота Биомедицинский интерес представляют лишь три оксида азота: закись азота

(N2O), диоксид азота (NO2) и монооксид азота (NO). NO2 в окружающем воздухе

является поллютантом, однако может образовываться in vivo из NO. NO2

запускает перекисное окисление липидов.

N0- - это маленькая молекула с 1 неспаренным электроном во внешней

электронной оболочке. N0- образуется с помощью фермента N0 синтазы, которая

переводит аргинин в цитруллин с образованием монооксида азота [44]. Влияние

N0- на жизнедеятельность клетки можно свести к его прямым и непрямым

эффектам. К прямым воздействиям относят те реакции, в которых N0

непосредственно взаимодействует с молекулами-мишенями. В свою очередь опосредованные эффекты N0, осуществляются через продукты его метаболизма -активные формы монооксида азота (Ш\Ю8). Свои прямые эффекты N0 оказывает в низких концентрация (<1ммоль/л). Это очень быстрые реакции, как правило с гем-содержащими белками (гуанилатциклаза, цитохром Р450, гемоглобин). В этих реакциях N0- ведет себя как сигнальная молекула, в различных физиологических процессах (передача нервного импульса, регуляцию АД, расслабление гладкомышечных волокон, регуляция иммунной системы) [27, 63].

Для осуществления непрямых эффектов необходимо взаимодействие N0 с супероксид анионом или кислородом с формированием активных форм N0, которые вступают в реакции с биологическими целями. ЬШОБ высоко реактогенны и могут вступать в реакции с белками, липидами и ДНК, что впоследствии может привести к МО-опосредованной гибели клетки. Однако эти реакции возможны только при высокой локальной концентрации N0 (>1ммоль/л) в течение длительного времени. Такие условия создаются вокруг активированных лейкоцитов или других клеток, чувствительных к стимуляции цитокинами [138]. Активированные клетки иммунной системы продуцируют и супероксид анион, и монооксид азота во время реакций респираторного взрыва. В это время может происходить реакция образования пероксинитрита (рис. 3). Одновременно с этим N0 стимулирует образование Ог и Н2О2 в митохондриях [92]. Причина этого лежит, вероятно, в ингибировании цитохрома С, что приводит к утечке электронов из дыхательной цепи. Н2О2 в свою очередь участвует в ир-регуляции экспрессии ЫО-синтазы через активацию ядерного фактора кВ (ИР-кВ).

N0 - + 02 ОЖЮ" Рисунок 3. Реакция образования пероксинитрита

Пероксинитрит, являясь сильнейшим окислителем, вступает в реакции с белками и липидами, взаимодействует с ДНК, вызывая её фрагментацию. Кроме того, в реакциях с участием пероксинитрита образуются такие оксиданты, как N02, ОН, МЭ2+. Таким образом, снижая доступность N0 и усиливая продукцию

оксидантов, пероксинитрит занимает не последнее место в патогенезе атеросклероза[103].

1.1.3 Экзогенные источники АФК Сигатерный дым содержит большое количество оксидантов и свободных

радикалов, таких как супероксид анион и оксид азота [32]. К тому же, вдыхание

сигаретного дыма запускает некоторые эндогенные механизмы, например -

активацию нейтрофилов и макрофагов, что впоследствии усиливает повреждение,

наносимое свободными радикалами.

Озон. Воздействие озона усиливает перекисное окисление липидов и

проникновение нейтрофилов в эпителий воздухоносных путей. Даже короткое

воздействие озона вызывает высвобождение медиаторов воспаления, таких как

МПО, эозинофильный катионный белок, ЛДГ и альбумин [102].

Ионизирующая радиация в присутствии кислорода превращает гидроксильный

радикал, супероксид и органические радикалы в пероксид водорода и

органические пероксиды. Эти вещества в свою очередь вступают в окислительно-

восстановительные реакции с металлами, преимущественно с железом и медью, и

через реакцию Фентона усиливают оксидативный стресс. Показано, что в

фибробластах, облученных альфа частицами, достоверно повышалась продукция

•О2И Н2О2 за счет увеличения активности мембран-связанной НАДФ(Н) оксидазы

[88]. Ультрафиолетовое излучение (UVA) запускает оксидативный стресс

посредством активизации фоточувствительных молекул, таких как порфирины,

НАДФ(Н) оксидаза, рибофлавины. Отмечено, что ультрафиолет действует

преимущественно на ДНК. Гидроксильный радикал, супероксид анион и другие

радикалы реагируют гуанином [89], в результате чего образуется 8-оксо-7,8-

дигидрогуанин (8-oxoGua).

Тяжелые металлы. Ионы тяжелых металлов (железо, медь, кадмий, ртуть,

никель, свинец, мышьяк) могут усиливать образование свободных радикалов и

таким образом вызывать повреждение клетки посредством значительного

снижения активности ферментных систем. Это достигается, во-первых,

усилением процесса перекисного окисления липидов, и, во-вторых, непосредственным воздействием свободных радикалов на белки и ДНК [121].

Усиление образования свободных радикалов происходит в первую очередь с помощью реакции Фентона. Супероксид анион и пероксид водорода взаимодействуют с металлами с образованием гидроксильного радикала.

Metal3"1" + О2 —► Metal2"1" + О2 Реакция Хербера-Вейса

Metal2+ + Н2О2 Metal3+ + ОН" + • ОН Реакция Фентона

Помимо реакции Фентона некоторые ионы тяжелых металлов реагируют непосредственно с биоорганическими молекулами с образованием свободных радикалов. Как правило, окисляются сульфгидрильные группы белков с образованием тиоловых радикалов. Тиоловые радикалы взаимодействуют с другими молекулами, содержащими сульфгидрильную группу, с последующим формированием супероксид-аниона.

Оксиданты, образованные в этих реакциях, повреждают азотистые основания ДНК [116]. В результате окислительного повреждения ионами Fe2+, Cu2+ и Ni2+ в ДНК происходят 3 основных замены: G—*С, G—>Т, С—* Т. При этом отмечено, что замена G—»С преимущественно индуцируется Fe2+, в то время как замена С—*Т происходит только при воздействии Си2+ и Ni2+.

Мышьяк - крайне токсичное вещество, с помощью которого образуются различные оксиданты, включая супероксид анион ( Ог), синглетный кислород ('Ог), пероксил радикал (ROO ), оксид азота (N0 ), пероксид водорода (Н2О2) и пероксид диметиларсеникума [119]. Вещества, содержащие трехвалентный мышьяк, ингибируют активность эндогенных глутатион-зависимых антиоксидантов (глутатион-8-трансфераза, глутатион пероксидаза, глутатион редуктаза), связываясь с их сульфгидрильными (-SH) группами.

Свинец усиливает перекисное окисление липидов. Также доказано значительное снижение активности SOD после воздействия свинца. Замещая цинк, который служит ко-фактором многих ферментов, свинец инактивирует их

[132]. Также свинец может снижать антиоксидантную защиту, ингибируя глутатион-Б-трансферазу.

1.2 АНТИОКСИДАНТЫ

Для нейтрализации вредных воздействий свободных радикалов, образующихся из разнообразных источников, в живых организмах существует серия защитных механизмов. Это, во-первых, превентивные механизмы (ограничивающие генерацию СР), во-вторых, регенеративные системы (способные устранять повреждения биомолекул, преимущественно ДНК), в-третьих, механизмы физической защиты от СР, и, наконец, непосредственно антиоксидантная система [30]. В практических целях антиоксиданты можно разделить на ферментные и неферментные [94]. Краткий перечень основных антиоксидантов в организме человека приведет в таблице 2.

Таблица 2. Основные антиоксиданты

Ферментные антиоксиданты

Название Сокращение Катализируемая реакция

Супероксиддисмутаза SOD M(n+1)+-SOD + 02 ^ Mn+-SOD + 02 Mn+-SOD + 02 + 2Н+ M(n+1)-SOD + Н202

Катал аза САТ 2Н202-> 02+2Н20 Н2О2 + Fe(ni)-E Н20 + 0=Fe(IV)-E(+) Н2О2 + 0=Fe(IV)-E(+) Н20 + Fe(III)-E + 02

Глутатионпероксидаза GTPx 2GSH + H2O2 GSSG + 2 H20 2GSH + ROOH GSSG + ROH + H20

Тиоредоксин TRX АМФ + сульфит + тиоредоксина дисульфид —> 5'-аденилсульфат + тиоредоксин АДФ + сульфит + тиоредоксина дисульфид —> З'-фосфоаденил сульфат + тиоредоксин

Пероксиредоксин PRX 2 R'-SH + ROOH R'-S-S- R' + H20 + ROH

Глутатионтрансфераза GST RX +GSH —► HX + R-S-GSH

Неферментные антиоксиданты

Витамин А

Витамин С

Витамин Е

ß - каротин

Глутатион

1.2.1 Ферментные антиоксиданты

Так как супероксид анион является первичной АФК и образуется в разнообразных реакциях в клеточных органеллах, цитозоле и межклеточном пространстве, главнейшей задачей антиоксидантной системы является его обезвреживание. Перевод супероксид аниона в менее активный пероксид водорода с помощью специфического фермента супероксиддисмутазы - главная защита клетки от повреждающего действия АФК. В организме человека существует три изоформы SOD. CuZn-SODl локализуется преимущественно в цитоплазме клеток, в активном центре фермента располагается медь, а цинк служит для стабилизации структуры белка. В митохондриях обнаруживают Мп-SOD2, а в межклеточном матриксе SOD3, также содержащую Си в активном центре. SOD3 обнаруживают в местах богатых коллагеном 1 типа, а также вокруг сосудов большого и малого кругов кровообращения [140].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Быкова, Александра Александровна, 2015 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Азизова О. А. Метод определения окисляемости белков сыворотки и плазмы крови / Азизова О. А., А.П. Пирязев, С.Н. Москвина. // Биомедицинская химия. - 2007. - Т. 53.- №1-С. 99-106.

2. Атеросклероз и окислительные процессы. Новые способы оценки окислительной модификации белков / Рагино Ю.И., Баум В.А., Полонская Я.В. и др. // Бюллетень СО РАМН. - 2006. - № 4 (122). - С. 6774.

3. Влияние окисленного фибриногена на агрегацию активированных тромбоцитов с нейтрофилами / Асейчев A.B., Азизова O.A., Шуленина J1.B. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009.

- Т. 147. - № 3. - С. 284-290.

4. Гао Лина. Прогностическое значение маркёров оксидативного стресса у больных стабильной ишемической болезнью сердца: автореф. дис. ... канд. мед. Наук / Гао Лина. - М., 2011. - 26 с.

5. Грацианский H.A. Национальные рекомендации по лечению острого коронарного синдрома без стойкого подъема ST на ЭКГ / Грацианский H.A. и др. // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2006. - 5, Приложение 1.

6. Грызунов Ю.А., Альбумин сыворотки крови в клинической медицине / Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е. - М.: ГЭОТАР, 1998. - 440 с.

7. Новые подходы к определению концентрации и пероксидазной активности миелопероксидазы в плазме крови человека / Горудко И.В., Черкалина О.С., Соколов A.B. и др. // Биоорганическая химия. - 2009. -35(5). - С. 629-39.

8. Окислительная модификация фибриногена замедляет его превращение в фибрин под влиянием тромбина / Азизова O.A. Пирязев А.П., Асейчев A.B. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009.

- 147(2).-С. 201-3

9. Повышенная активность миелопероксидазы - фактор риска ишемической болезни сердца у больных сахарным диабетом / Горудко И.В., Костевич В.А., Соколов А.В. и др. // Биомедицинская химия. - 2012. - 58 (4). - С. 475-484.

10. Руда М.Я. Национальные рекомендации по диагностике и лечению больных острым инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST ЭКГ / Руда М.Я. и др. // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2007. - 6 (8), Приложение 1.

11. Фролова М. Ю. Возможности метода определения карбонильных групп белков сыворотки крови для оценки состояния «окислительного стресса» в клинической практике: дис. ... канд. биол. наук / М.Ю. Фролова. - Спб., 2003. - 148 с.

12. A detailed interpretation of ОН radical footprints in a TBP DNA complex reveals the role of dynamics in the mechanism of sequence specific binding / Pastor, N., Weinstein, H., Jamison, E. et al. // J Mol Biol. - 2000. - 304. - P. 55-68.

13. A prospective natural-history study of coronary atherosclerosis / Stone GW, Maehara A, Lansky AJ et al. // N Engl J Med. - 2011. - 364(3). - P. 226-35.

14. A simple risk index for rapid initial triage of patients with ST-elevation myocardial infarction: an InTIME II substudy / Morrow DA, Antman EM, Giugliano RP et al. // Lancet. - 2001. - 358. - P. 1571-1575.

15. A tale of two controversies: defining both the role of peroxidases in nitrotyrosine formation in vivo using eosinophil peroxidase and myeloperoxidasedeficient mice, and the nature of peroxidase-generated reactive nitrogen species / Brennan ML, Wu W, Fu X et al. // J Biol Chem. -2002. - 277. - P. 17415-17427.

16. Akira S. NF-IL6 and NF-kB in cytokine gene regulation / Akira S, Kishimoto A. // Adv Immunol. - 1997. - 65. - P. 1-46.

17. Amsterdam EA. 2014 AHA/ACC Guideline for the Management of Patients

With Non-ST-Elevation Acute Coronary Syndromes: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines / Amsterdam EA. et al. // J Am Coll Cardiol. - 2014 Dec 23. -64(24).-P. 139-228.

18. Antibodies to malondialdehyde oxidized low-density lipoproteins predict long term cardiovascular mortality in high risk patients / G.Maiolino, L. Pedon, M. Cesari et al. // International Journal of Cardiology. - 2013. - 168(1). - P.484-9.

19. Antibody to oxidized low-density lipoprotein and cardiovascular mortality in endstage renal disease / T. Shoji, M. Fukumoto, E. Kimoto et al. // Kidney International. - 2002. - vol. 62. - no. 6. - P. 2230-37.

20. Antman EM. The TIMI risk score for unstable angina/non-ST elevation MI: A method for prognostication and therapeutic decision making / Antman EM, Cohen M, Bernink PJ, et al. // JAMA. - 2000. - 284. - P. 835^2.

21. Apple FS. Clinical and analytical review of ischemia-modified albumin measured by the albumin cobalt binding test / Apple FS. // Adv Clin Chem. -2005.-39.-P. 1-10.

22. Arthur JR. The glutathione peroxidases / Arthur JR. // Cell Mol Life Sei. -2000.-57.-P. 1825-1835.

23. Association of fibrinogen with cardiovascular risk factors and cardiovascular disease in the Framingham Offspring Population / Stec JJ, Silbershatz H, Toiler GH et al. // Circulation. - 2000. - 102(14). - P. 1634-8.

24. Association of plasma level of malondialdehyde-modified low-density lipoprotein with coronary plaque morphology in patients with coronary spastic angina: implication of acute coronary events / Tani S, Nagao K, Anazawa T et al. // Int J Cardiol. - 2009. - 135(2). - P. 202-6.

25. Autoantibody against, malondialdehyde-modified low density lipoprotein in patients with non-diabetic unstable angina: a potential role in immunologic reaction of plaque instability / Kwon KH, Kwon HM, Hong BK et al. // Yonsei Med J. - 2002. - 43(2). - P. 203-10.

26. Bar-Or D. A novel assay for cobalt-albumin binding and its potential as a marker for myocardial ischemia-a preliminary report / Bar-Or D, Lau E, Winkler JV. // J Emerg Med. - 2000. - 19(4). - P. 311-5.

27. Bergendi, L. Chemistry, physiology and pathology of free radicals / Bergendi, L., Benes, L., Durackova, Z.,&Ferencik, M. // Life Sci. - 1999. - 65. - P. 1865-1874.

28. Biomarkers in acute myocardial injury / Kehl DW, Iqbal N, Fard A et al. // Transl Res. - 2012. - 159(4). - P. 252-64.

29. Carotenoid radical chemistry and antioxidant/pro-oxidant properties / El-Agamey A, Lowe GM, McGarvey DJ et al. // Arch Biochem Biophys. - 2004. -430.-P. 37—48.

30. Changes in the cardiac glutathione status after ischemia and reperfusion / Curello S, Ceconi C, Bigoli C et al. // Experientia. - 1985. - 41. - P. 42-43.

31. Chu FF. Expression, characterization, and tissue distribution of a new cellular selenium-dependent glutathione peroxidase, GSHPx-GI / Chu FF, Doroshow JH, Esworthy RS. // J Biol Chem. - 1993. - 268. - P. 2571-2576.

32. Church DF. Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications / Church DF, Pryor WA. // Environ Health Perspect. - 1985. - 64. -P. 111-126.

33. Circulating oxidized low-density lipoprotein is an independent predictor for cardiac event in patients with coronary artery disease / K. Shimada, H. Mokuno, E. Matsunaga et al. // Atherosclerosis. - 2004. - vol. 174. - no. 2. - P. 343-47.

34. C-reactive protein, fibrinogen, and cardiovascular disease prediction / Emerging Risk Factors Collaboration // N Engl J Med. - 2012. - 367(14). - P. 1310-20.

35. Davies KJ. Oxidative stress: the paradox of aerobic life / Davies KJ. // Biochem Soc Symp. - 1995. - 61. - P. 1-31.

36. Diagnosis of ischemic heart disease using CK-MB, troponin-I and ischemia

modified albumin / Dawie J, Chawla R, Worku Y et al. // Ethiop Med J. -2011.-49(1).-P. 25-33.

37. Dickinson DA. Glutathione in defense and signaling: lessons from a small thiol / Dickinson DA, Forman HJ. // Ann N Y Acad Sci. - 2002. - 973. - P. 488504.

38. ESC Guidelines for the management of acute coronary syndromes in patients presenting without persistent ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute coronary syndromes (ACS) in patients presenting without persistent ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC) / ESC Committee for Practice Guidelines // Eur Heart J. -2011 Dec. - 32(23). - P. 2999-3054.

39. Extensive eosinophil degranulation and peroxidase-mediated oxidation of airway proteins do not occur in a mouse ovalbumin-challenge model of pulmonary inflammation / Denzler KL, Borchers MT, Crosby JR et al. // J Immunol. - 2001. - 167. - P. 1672-1682.

40. Fenton HJH. Oxidation of tartaric acid in the presence of iron / Fenton HJH. // J Chem Soc. - 1894. - 65. - P. 899-910.

41. Flohé L. Glutathione peroxidase / Flohé L. // Basic Life Sci. - 1988. - 49. - P. 663-668.

42. Free radical biology of the cardiovascular system / Chen AF, Chen DD, Daiber A et al. // Clin Sci (Lond). - 2012. - 123(2). - P. 73-91.

43. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease / Valko M, Leibfritz D, Moncol J et al. // Int J Biochem Cell Biol. -2007. - 39(1). - P. 44-84.

44. Ghafourifar, P. Mitochondrial nitric oxide synthase / Ghafourifar, P., & Cadenas, E. // Trends Pharmacol Sci. - 2005. - 26. - P. 190-195.

45. Ghosh R, Mitchell DL. Effect of oxidative DNA damage in promoter elements on transcription factor binding. Nucleic Acids Res. 1999; 27: 3213-3218.

46. Gimbrone MA Jr. Vascular endothelium, hemodynamics, and the pathobiology

of atherosclerosis / Gimbrone MA Jr, Garcia-Cardena G. // Cardiovasc Pathol. -2013. -22(1).-P. 9-15.

47. Girotti AW. Mechanisms of lipid peroxidation / Girotti AW.// J Free Radic Biol Med. - 1985.- 1.-P. 87-95.

48. Glass CK. Atherosclerosis: the road ahead / Glass CK, Witztum JL. // Cell. -2001.- 104(4).-P. 503-16.

49. Granger DN. Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemiareperfusion injury / Granger DN. // Am J Physiol. - 1988. - 255. - P. H1269-H1275.

50. Gromer S. The thioredoxin systemdfrom science to clinic / Gromer S, Urig S, Becker K. // Med Res Rev. - 2004. - 24. - P. 40-89.

51. Gutteridge JM. Malondialdehyde formation from lipid peroxides in the thiobarbituric acid test: the role of lipid radicals, iron salts, and metal chelators / Gutteridge JM, Quinlan GJ. // J Appl Biochem. - 1983. - 5(4-5). - P. 293-9.

52. Ha CE. Novel insights into the pleiotropic effects of human serum albumin in health and disease / Ha CE, Bhagavan NV. // Biochim Biophys Acta. - 2013. -1830(12).-P. 5486-93.

53. Haber F. The catalytic decomposition of hydrogen peroxide by iron salts / Haber F, Weiss JJ. // Proc R Soc Lond Ser A. - 1934. - 147. - P. 332-351.

54. Halliwell B. Lipid peroxidation: its mechanism, measurement, and significance / Halliwell B, Chirico S. // Am J Clin Nutr. - 1993 May. - 57(5 Suppl). - P. 715S-724.

55. Hjortshoj S. Diagnostic value of ischemia-modified albumin in patients with suspected acute coronary syndrome / Hjortshoj S, Kristensen SR, Ravkilde J. // Am J Emerg Med. - 2010. - 28(2). - P. 170-6.

56. Homocysteine, Creactive protein, lipid peroxidation and mortality in haemodialysis patients / B. Bay'es, M. Cruz Pastor, J. Bonal et al. // Nephrology Dialysis Transplantation. - 2003. - vol. 18. - no. 1. - P. 106-12.

57. Hypochlorous acid oxygenates the cysteine switch domain of pro-matrilysin

(MMP-7). A mechanism for matrix metalloproteinase activation and atherosclerotic plaque rupture by myeloperoxidase / Fu X, Kassim SY, Parks WC et al. // J Biol Chem. - 2001. - 276(44). - P. 41279-87.

58. Intracellular neutrophil myeloperoxidase is reduced in unstable angina and acute myocardial infarction, but its reduction is not related o ischemia / Biasucci LM, D'Onofrio G, Liuzzo G et al. // J Am Coll Cardiol. - 1996. -27(3).-P. 611-6.

59. Ischemia modified albumin, a marker of acute ischemic events: a pilot study / Talwalkar SS, Bon Homme M, Miller JJ et al. // Ann Clin Lab Sci. - 2008. -38(2).-P. 132-7.

60. Ischemia modified albumin: is this marker of ischemia ready for prime time use? / Sbarouni E, Georgiadou P, Kremastinos DT et al. // Cardiol. - 2008. -49(4). - P. 260-6.

61. Kelly FJ. Protein oxidation at the air-lung interface / Kelly FJ, Mudway IS. // Amino Acids. - 2003. - 25. - P. 375-396.

62. Klebanoff SJ. Myeloperoxidase: friend and foe / Klebanoff SJ. // J Leukoc Biol. - 2005. - 77(5). - P. 598-625.

63. Koshland DE Jr. The molecule of the year / Koshland DE Jr. // Science. - 1992 Dec 18. -258(5090).-P. 1861.

64. Kosugi H. Formation of yellow, orange, and red pigments in the reaction of alk-2-enals with 2-thiobarbituric acid / Kosugi H, Kato T, Kikugawa K. // Anal Biochem - 1987. - 165(2). - P. 456-64.

65. Kulcharyk PA. Hypochlorous acid produced by the myeloperoxidase system of human phagocytes induces covalent cross-links between DNA and protein / Kulcharyk PA, Heinecke JW. // Biochemistry. - 2001. - 40. - P. 3648-3656.

66. Lau D. Myeloperoxidase and its contributory role in inflammatory vascular disease / Lau D, Baldus S. // Pharmacol Ther. - 2006. - 111(1). - P. 16-26.

67. Libby P. Molecular and cellular mechanisms of the thrombotic complications of atherosclerosis / Libby P. // J Lipid Res. - 2009. - 50 Suppl. - P. S352-7

68. Libby P. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis / Libby P, Ridker PM, Hansson GK. // Nature. - 2011. - 473(7347). - P. 317-25.

69. Liochev SI. The Haber-Weiss cycle - 70 years later: an alternative view / Liochev SI, Fridovich I. // Redox Rep. - 2002. - 7 (1). - P. 55-57.

70. Liochev, S. I. The role of 02 in the production of HO: In vitro and in vivo / Liochev, S. I., & Fridovich, I. // Free Radic Biol Med. - 1994. - 16. - P. 2933.

71. Lipid peroxidation as determined by plasma isoprostanes is related to disease severity in mild asthma / Wood LG, Fitzgerald DA, Gibson PG et al. // Lipids. -2000.-35.-P. 967-974.

72. Lipoprotein accumulation in macrophages via toll-like receptor-4-dependent fluid phase uptake / Choi SH, Harkewicz R, Lee JH et al. // Circ Res. - 2009. -104(12).-P. 1355-63.

73. Long-term prognostic value of myeloperoxidase on acute coronary syndrome: a meta-analysis / Chen Y, Zhang F, Dong L et al. // Arch Med Res. - 2011. -42(5).-P. 368-74.

75. Macrophages generate reactive oxygen species in response to minimally oxidized low-density lipoprotein: toll-like receptor 4- and spleen tyrosine kinase-dependent activation of NADPH oxidase 2 / Bae YS, Lee JH, Choi SH et al. // Circ Res. - 2009. - 104(2). - P. 210-8.

76. Majesky MW. Developmental basis of vascular smooth muscle diversity / Majesky MW. // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2007. - 27(6). - P. 1248-58.

77. Malondialdehyde-modified low density lipoproteins in patients with atherosclerotic disease / Holvoet P, Perez G, Zhao Z et al. // J Clin Invest. -1995.-95(6).-P. 2611-9.

78. Marietta C. A single 8, 50-cyclo-20-deoxyadenosine lesion in a TATA box prevents binding of the TATA binding protein and strongly reduces transcription in vivo / Marietta C, Gulam H, Brooks PJ. // DNA Repair (Amst). -2002.- 1.-P. 967-975.

79. McCord, J. M. Superoxide dismutase an enzymic function for erythrocuprein Hemocuprein / McCord, J. M., & Fridovich, I. // J Biol Chem. - 1969. - 244. -P. 6049-6055.

80. Mechanism of hydrogen peroxide formation catalyzed by NADPH oxidase in thyroid plasma membrane / Dupuy C, Virion A, Ohayon R et al. // J Biol Chem - 1991.-266.-P. 3739-3743.

81. Mechanisms of protection of catalase by NADPH / Kirkman HN, Rolfo M, Ferraris AM et al. // Kinetics and stoichiometry. J Biol Chem - 1999. - 274. -P. 13908-13914.

82. Meta-analysis of ischemia-modified albumin to rule out acute coronary syndromes in the emergency department / Peacock F, Morris DL, Anwaruddin S et al. // Am Heart J. - 2006. - 152(2). - P.253-62.

83. Metal-induced oxidative stress and signal transduction / Leonard, S. S., Harris, G. K., & Shi, X. // Free Radie Biol Med. - 2004. - 37. - P. 1921-1942.

84. Miller DM. Transition metals as catalysts of "autoxidation" reactions / Miller DM, Buettner GR, Aust SD. // Free Radie Biol Med. - 1990. - 8. - P. 95-108.

85. Mittal, C. K. Activation of guanylate cyclase by superoxide-dismutase and hydroxyl radical—Physiological regulator of guanosine 3_,5_-monophosphate formation / Mittal, C. K., & Murad, F. // Proc Natl Acad Sci USA. - 1977. -74. - P. 4360-4364.

86. Myeloperoxidase serum levels predict risk in patients with acute coronary syndromes / Baldus S, Heeschen C, Meinertz T et al. // Circulation. - 2003. -108(12).-P. 1440-5.

87. Myeloperoxidase: a new biomarker of inflammation in ischemic heart disease and acute coronary syndromes / Loria V, Dato I, Graziani F et al. // Mediators Inflamm. - 2008. - 2008. - P. 135625.

88. Narayanan PK. Alpha particles initiate biological production of superoxide anions and hydrogen peroxide in human cells / Narayanan PK, Goodwin EH, Lehnert BE. // Cancer Res. - 1997. - 57. - P. 3963-3971.

89. Nitric oxide inhibits electron transfer and increases superoxide radical production in rat heart mitochondria and submitochondrial particles / Poderoso JJ, Carreras MC, Lisdero C et al. // Arch Biochem Biophys. - 1996. - 328. - P. 85-92.

90. Novel mechanisms of natural antioxidant compounds in biological systems: involvement of glutathione and glutathione-related enzymes / Masella R, Di Benedetto R, Vari R et al. // J Nutr Biochem. - 2005. - 16. - P. 577-586.

91. Oxidation-specific biomarkers, prospective 15-year cardiovascular and stroke outcomes, and net reclassification of cardiovascular events / S. Tsimikas, P. Willeit, J. Willeit et al. // Journal of the American College of Cardiology. -2012. - vol. 60.-P. 2218-29.

92. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features / Cadet J, Douki T, Gasparutto D et al. // Mutât Res. - 2003. - 531. - P. 5-23.

93. Oxidative modification of fibrinogen is associated with altered function and structure in the subacute phase of myocardial infarction / Becatti M, Marcucci R, Bruschi G et al. // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2014 Jul. - 34(7). -P. 1355-61.

94. Oxidative stress and antioxidant defense / Birben E, Sahiner UM, Sackesen C et al. // World Allergy Organ J. - 2012. - 5(1). - P. 9-19.

95. Oxidative stress, inflammation and cardiovascularmortality in haemodialysis— role of seniority and intravenous ferrotherapy: analysis at 4 years of follow-up / B. Bay'es, M. C. Pastor, J. Bonal, A. et al. // Nephrology Dialysis Transplantation. - 2006. - vol. 21. - no. 4. - P. 984-90.

96. Oxidized LDL and malondialdehyde-modified LDL in patients with acute coronary syndromes and stable coronary artery disease / Holvoet P, Vanhaecke J, Janssens S et al. // Circulation. - 1998. - 98(15). P. 1487-94.

97. Oxidized low-density lipoprotein as a predictor of outcome in patients with unstable coronary artery disease / N. Johnston, T. Jernberg, B. Lagerqvist et al. // International Journal of Cardiology. - 2006. - 113, 2. - P. 167-73.

98. Oxidized low-density lipoprotein in plasma is a prognostic marker of subclinical atherosclerosis development in clinically healthy men / K. Wallenfeldt, B. Fagerberg, J. Wikstrand, et al. // Journal of Internal Medicine. - 2004. - vol. 256. - no. 5. - P. 413-420.

99. Oxidized phospholipids predict the presence and progression of carotid and femoral atherosclerosis and symptomatic cardiovascular disease: fiveyear prospective results from the bruneck study / S. Tsimikas, S. Kiechl, J. Willeit et al. // Journal of the American College of Cardiology. - 2006. - vol. 47. - no. 11.-P. 2219-28.

100. Oxidized phospholipids, lipoprotein(a), lipoprotein-associated phospholipase A2 Activity, and 10-year cardiovascular outcomes: prospective results from the bruneck study / S. Kiechl, J. Willeit, M. Mayr et al. // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. - 2007. - vol. 27. - no. 8. - P. 1788-95.

101. Oxygen poisoning and x-irradiation—A mechanism in common / Gerschman, R., Gilbert, D. L., Nye, S. W. et al. // Science. - 1954. - 119. - P. 623-626.

102. Ozone-induced inflammation assessed in sputum and bronchial lavage fluid from asthmatics: a new noninvasive tool in epidemiologic studies on air pollution and asthma / Hiltermann JT, Lapperre TS, van Bree L et al. // Free Radic Biol Med. - 1999. - 27. - P. 1448-1454.

103. Padmaja S. The reaction of nitric oxide with organic peroxyl radicals / Padmaja S, Huie RE. // Biochem Biophys Res Commun. - 1993. - 195. - P. 539-44.

104. Pande V. Molecular recognition of 15-deoxydelta (12,14)-prostaglandin J(2) by nuclear factor-kappa B and other cellular proteins / Pande V, Ramos MJ. // Bioorg Med Chem Lett. - 2005. - 15. - P. 4057^1063.

105. Parallel evolutionary pathways for glutathione transferases: structure and mechanism of the mitochondrial class kappa enzyme rGSTKl-1 / Ladner JE, Parsons JF, Rife CL et al. // Biochemistry. - 2004. - 43. - P. 52-61.

106. Persistent high levels of plasma oxidized low-density lipoprotein after acute

myocardial infarction predict stent restenosis / T. Naruko, M. Ueda, S. Ehara et al. // Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. - 2006. - 26. - 4. -P. 877-83.

107. Plasma fibrinogen level and the risk of major cardiovascular diseases and nonvascular mortality: an individual participant meta-analysis / Fibrinogen Studies Collaboration // JAMA. - 2005. - 294(14). - P. 1799-809.

108. Plasma oxidized low-density lipoprotein as a prognostic predictor in patients with chronic congestive heart failure / T. Tsutsui, T. Tsutamoto, A. Wada et al. // Journal of the American College of Cardiology. - 2002. - 39, 6. - P. 957-62.

109. Prediction of mortality after primary percutaneous coronary intervention for acute myocardial infarction: the CADILLAC risk score / Halkin A, Singh M, Nikolsky E et al. // J Am Coll Cardiol. - 2005. - 45. - P. 1397-1405.

110. Predictive value of plasma fibrinogen levels in patients admitted for acute coronary syndrome / Shi Y, Wu Y, Bian C et al. // Tex Heart Inst J. - 2010. -37(2).-P. 178-83.

111. Predictors of hospital mortality in the global registry of acute coronary events / Granger CB, Goldberg RJ, Dabbous O et al. // Arch Intern Med. - 2003. - 163. -P. 2345-2353.

112. Prognostic assessment of patients with acute myocardial infarction treated with primary angioplasty: implications for early discharge / De Luca G, Suryapranata H, van't Hof AW et al. // Circulation. - 2004. - 109. - P. 27372743.

113. Prognostic value of myeloperoxidase in patients with chest pain / Brennan ML, Penn MS, Van Lente F et al. // N Engl J Med. - 2003. - 349(17). - P. 1595604.

114. Proteins as bio markers of oxidative/nitrosative stress in diseases: The contribution of redox proteomics / Dalle-Donne, I., Scaloni, A., Giustarini, D et al. // Mass Spectrom. Rev. - 2005. - 24. - P. 55-99.

115. Prothrombotic Consequences of the Oxidation of Fibrinogen and their

Inhibition by Aspirin / Upchurch Jr GR, Ramdev N, Walsh MT et al. // J Thromb Thrombolysis. - 1998. - 5(1). - P. 9-14.

116. Reid TM. Mutagenesis by metal-induced oxygen radicals / Reid TM, Feig DI, Loeb LA. // Environ Health Perspect. - 1994. - 102(suppl 3). - P. 57-61.

117. Role of "Ischemia modified albumin", a new biochemical marker of myocardial ischaemia, in the early diagnosis of acute coronary syndromes / Sinha MK, Roy D, Gaze DC et al. // Emerg Med J. - 2004. - 21(1). - P. 29-34.

118. Role of reactive oxygen species on the formation of the novel diagnostic marker ischaemia modified albumin / Roy D, Quiles J, Gaze DC et al. // Heart. -2006. -92(1).-P. 113-4.

119. Shi H. Oxidative mechanism of arsenic toxicity and carcinogenesis / Shi H, Shi X, Liu KJ. // Mol Cell Biochem - 2004. - 255. - P. 67-78.

120. Stadtman, E. R. Role of oxidant species in aging / Stadtman, E. R. // Curr. Med. Chem - 2004. - 11. - P. 1105-1112.

121. Stohs SJ. Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions / Stohs SJ, Bagchi D. // Free Radic Biol Med. - 1995. - 18. - P. 321-336.

122. Storz, P. Reactive oxygen species in tumor progression / Storz, P. // Front Biosci. - 2005. - 10. - P. 1881-1896.

123. Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis / Skalen K, Gustafsson M, Rydberg EK et al. // Nature. - 2002. - 417(6890). -P. 750-4.

124. Tabas I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis / Tabas I. // Nat Rev Immunol. - 2010. - 10(1). - P. 36-46.

125. Tabas I. Subendothelial lipoprotein retention as the initiating process in atherosclerosis: update and therapeutic implications / Tabas I, Williams KJ, Boren J. // Circulation. - 2007. - 116(16). - P. 1832-44.

126. Tetik S. Oxidative modification of fibrinogen affects its binding activity to glycoprotein (GP) Ilb/IIIa / Tetik S, Kaya K, Demir M, Eksioglu-Demiralp E, Yardimci T. // Clin Appl Thromb Hemost. - 2010 Feb. - 16(1). - 51-9.

127. Thannickal, V. J. Reactive oxygen species in cell signaling / Thannickal, V. J., Fanburg, B. L. // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. - 2000. - 279. - P. L1005-L1028.

128. The levels of MDA-LDL in circulating immune complexes predict myocardial infarction in the VADT study / M. F. Lopes-Virella, K. J. Hunt, N. L. Baker et al. // Atherosclerosis. - 2012. - vol. 224. - P. 526-531.

129. The potentiation of myeloperoxidase activity by the glycosaminoglycan-dependent binding of myeloperoxidase to proteins of the extracellular matrix / Kubala L, Kolafova H, Vitecek J et al. // Biochim Biophys Acta. - 2013. -1830(10).-P. 4524-36

130. The role of oxidized low-density lipoproteins in atherosclerosis: the myths and the facts / Maiolino G, Rossitto G, Caielli P et al. // Mediators Inflamm. -2013.-2013.-P. 714653.

131. TIMI risk score for ST-elevation myocardial infarction: a convenient, bedside, clinical score for risk assessment at presentation: an intravenous nPA for treatment of infarcting myocardiumearly II trial substudy / Morrow DA, Antman EM, Charlesworth A et al. // Circulation. - 2000. - 102. - P. 20312037.

132. Tripathi RM. Blood lead and its effect on Cd, Cu, Zn, Fe and hemoglobin levels of children / Tripathi RM, Raghunath R, Mahapatra S. // Sci Total Environ.-2001.-277.-P. 161-168.

133. Valko, M. Metals, toxicity and oxidative stress / Valko, M.,Morris, H., & Cronin, M. T. D. // Curr Med Chem. - 2005. - 12. - P. 1161-1208.

134. Vitamin E in the primary prevention of cardiovascular disease and cancer. The women's health study: a randomized controlled trial / I.-M. Lee, N. R. Cook, J. M. Gaziano et al. // Journal of the American Medical Association. - 2005. -294(1).-P. 56-65.

135. Von Willebrand factor and oxidative stress parameters in acute coronary syndromes / Koprivica Z, Djordjevic D, Vuletic M et al. // Oxid Med Cell

Longev. -2011. -2011. - P. 918312.

136. Whiteman M. Hypochlorous acid-induced base modifications in isolated calf thymus DNA / Whiteman M, Jenner A, Halliwell B. // Chem Res Toxicol. -1997.- 10.-P. 1240-1246.

137. Widespread coronary inflammation in unstable angina / Buffon A, Biasucci LM, Liuzzo G et al. // N Engl J Med. - 2002. - 347(1). - P. 5-12.

138. Wink DA. Cytotoxicity related to oxidative and nitrosative stress by nitric oxide / Wink DA, Miranda KM, Espey MG. // Exp Biol Med. - 2001. - 226. -P. 621-3.

139. Wudkowska A. Ischemia-modified albumin in differential diagnosis of acute coronary syndrome without ST elevation and unstable angina pectoris / Wudkowska A, Goch J, Goch A. // Kardiol Pol. - 2010. - 68(4). - P. 431-7.

140. Zelko IN. Superoxide dismutase multigene family: a comparison of the CuZn-SOD (SOD1), Mn-SOD (SOD2), and EC-SOD (SOD3) gene structures, evolution, and expression / Zelko IN, Mariani TJ, Folz RJ. // Free Radic Biol Med. - 2002. - 33. - P. 337-349.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

С цитозин

G гуанин

ICAM-1 межклеточная молекула адгезии 1

IL-1(3, 6, 8 интерлейкин 1 р, 6, 8

NF-кВ ядерный фактор кВ

SOD супероксиддисмутаза

Т тимин

UVA ультрафиолет А

VCAM-1 молекула адгезии сосудистых клеток 1

АД артериальное давление

АДМА ассиметричный диметиларгинин

АДФ аденозиндифосфат

АКШ аортокоронарное шунтирование

АМФ аденозинмонофосфат

АТФ аденозинтрифосфат

АФА активные формы азота

АФК активные формы кислорода

ГМК гладкомышечные клетки

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНФГ динитрофенилгидразин-2,4

ИБС ишемическая болезнь сердца

ИМ инфаркт миокарда

ИМА ишемически-модифицированный альбумин

HM6nST инфаркт миокарда без подъёма сегмента ST

MMcnST инфаркт миокарда с подъёмом сегмента ST

ИМТ индекс массы тела

КАГ коронароангиография

КССА кобальт-связывающая способность альбумина

ЛДГ лактатдегидрогеназа

лнпг левая ножка пучка Гиса

лпнп липопротеиды низкой плотности

МДА малоновый диальдегид

ммп матриксные металлопротеазы

мпо миелопероксидаза

НАДФ(Н) никотинамиддинуклеотидфосфат

ОКА общая концентрация альбумина

оке острый коронарный синдром

онмк острое нарушение мозгового кровоснабжения

ОРВИ острая респираторная вирусная инфекция

пол перекисное окисление липидов

сд сахарный диабет

СР свободные радикалы

ссз сердечно-сосудистые заболевания

ТИА транзиторная ишемическая атака

тлт тромболитическая терапия

тп трепетание предсердий

ФК функциональный класс

ФНОа фактор некроза опухолей а

ФП фибрилляция предсердий

ХОБЛ хроническая обструктивная болезнь легких

ХСН хроническая сердечная недостаточность

ЧКВ чрескожное коронарное вмешательство

ЭКА эффективная концентрация альбумина

ЭКГ электрокардиограмма

ЭхоКГ эхокардиография

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ В ПЛАЗМЕ

КРОВИ (АСЕЙЧЕВ A.B., АЗИЗОВА O.A.)

1) Для получения оптически стабильного рабочего раствора плазмы, в котором не происходит заметной агрегации белков, буферная система (50 мМ фосфатно-натриевый буфер) имеет приближенный к нейтральным значениям рН=6,0. Также для стабилизации рабочего раствора, содержащего 380 мкМ о-дианизидинада и 5% плазмы крови, в нём присутствует детергент - 1% Тритон X 100.

2) Кинетика изменения оптической плотности, характеризующая проведение пероксидазной реакции с участием МПО, запускается при добавлении 500 мкМ перекиси водорода и проводится на плашечном спектрофотометре в объёме 300 мкл при регистрации поглощения при 460 нм и т-ре 250 С. Для учёта относительно небольших изменений оптической плотности в ходе проведения цветной реакции проводится длительная запись кинетики - в течение 20 минут, а также предварительный прогрев образца в течение 2 минут.

3) Для учёта активности МПО на фоне проявления активности других пероксидаз в плазме крови измерение проводят в присутствии и отсутствии 50 мкМ аминобензойного гидразида - специфического ингибитора миелопероксидазы.

4) Активность миелопероксидазы определялась по следующей формуле:

ААМПО = (АА/мин - ДАинг/мин) * (V/v),

где АА/мин и ДАинг/мин скорость окисления о-дианизидина в отсутствие и в присутствие ингибитора; V -общий объём реакции, v- объём образца плазмы.

5) Скорость окисления о-дианизидина определяли, как тангенс угла наклона линейного участка кинетической кривой по линейной экстраполяции с использованием статистической программы графического редактора Exel.

ОБЩАЯ МЕТОДИКА СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРБОНИЛЬНЫХ ПРОДУКТОВ В БЕЛКОВЫХ ПРЕПАРАТАХ ПО РЕАКЦИИ С ДНФГ (ШВАЧКО А.Г., ПИРЯЗЕВ А.П, АЗИЗОВА O.A.)

Оборудование: 1) лабораторная настольная центрифуга с горизонтальным ротором типа ОПН-8, СМ-12 или СМ-6М; 2) вортекс; 3) спектрофотометр такого же класса как Backman DU®530; 4) кварцевая кювета с длиной оптического пути 1 см и объемом 4 мл; 5) водяная баня до 100°С; 6) секундомер; 7) термометр для измерения комнатной температуры; 9) круглодонные стеклянные толстостенные пробирки с внутренним диаметром 13,5 мм, высотой 100 мм.

Реактивы и материалы: 1) 20% раствор HCl, приготовленный из концентрированной соляной кислоты 37 - 38 %; 2) 20% раствор ТХУ; 3) 8М раствор мочевины; 4) 10 мМ раствор ДНФГ в 20% растворе HCl - 2,0 г/л; 5) смесь этанола с этилацетатом в соотношении 1:1; 6) изотонический фосфатно-солевой буферный раствор PBS (таблетки фирмы"81{*та"); 7) препараты белков, предназначенные для анализа.

1. Растворы всех реагентов перед использованием избавляют от взвеси мелких частиц, дающих светорассеяние, путем фильтрации, центрифугирования или отстаивания.

2. Растворы белков готовят на коммерческом PBS ("Sigma"). Перед исследованием растворы белков подвергают центрифугированию в течение 15 мин при 1500g. Замороженную плазму размораживают в воде комнатной температуры в течение 3-5 мин, после чего интенсивно встряхивают на вортексе 30 - 60 с, затем откручивают на центрифуге 15 мин при 1500g для удаления нерастворимого материала.

3. Реакцию с ДНФГ проводят в круглодонных стеклянных толстостенных пробирках с внутренним диаметром 13,5 мм, высотой 100 мм.

4. Для анализа 1 образца требуется 6 пробирок: 3 контрольных и 3 опытных. Исследуемая проба добавляется в объеме 0,5 мл. Затем в контрольные пробирки

добавляют 2,0 мл р-ра HCl (холостая проба), в опытные - 2,0 мл р-ра ДНФГ в HCl.

Время инкубации составляет 60 мин (засекается по секундомеру) при «комнатной температуре». Настоящим Протоколом величина «комнатной температуры» устанавливается равной 22 ± 1°С.

Встречающиеся в литературе указания о необходимости проведения реакции в темноте не имеют практического значения. Инкубацию целесообразно проводить под тягой.

5. После окончания инкубации в контрольные и опытные пробирки добавляют по 2,5 мл холодной ТХУ, хранящейся в холодильнике при +4 - +6 °С. Затем пробирки немедленно помещают в морозильную камеру (-16 —20°С) на 10 мин (время засекают по секундомеру).

6. Осаждение и отмывка осадка производятся на центрифуге при 1500g. Центрифужное поле 1500g достигается на обычных лабораторных центрифугах типа СМ-6М при 3000 об/мин. Время каждого центрифугирования - 10 мин.

Надосадочную жидкость сливают в стакан путем плавного переворачивания пробирки на 180°. После этого подставляют фильтровальную бумагу, чтоб собрать стекающие капли.

Осадок должен быть прочно связан со стеклом. На этом основана выбранная здесь система отмывки без разрушения осадка.

7. Отмывку производят смесью этанола с этилацетатом в том же режиме, что и осаждение. Для отмывки по общему правилу используется объем 2 мл. Отмывку производят трижды. Уменьшение количества отмывок не допускается.

8. Промежутки между центрифугированиями должны быть минимальными, не превышать 2-3 мин. В соответствии с этим требованием определяется количество образцов для одновременного анализа. Не следует одновременно работать со слишком большим количеством образцов - результаты придется выбросить.

Для увеличения производительности смесь этанола с этилацетатом рекомендуется добавлять шприцом со снятой иглой (а не дозирующей пипеткой),

при этом струя жидкости из шприца должна направляться на стенку пробирки, а не на осадок.

9. После последней отмывки пробирки устанавливают в штативе на фильтровальной бумаге в перевернутом состоянии для высушивания. Время высушивания должно составлять не менее 20 мин - остатки смеси этанол/этилацетат затрудняют растворение белка в мочевине. Допускается помещение пробирок в холодильник для высушивания в течение ночи.

10. В пробирки с хорошо просушенными осадками добавляют требуемый объем мочевины (по общему правилу 2,0 мл) и помещают на 180с в кипящую воду.

Растворы белков в мочевине после реакции с ДНФГ сохраняют стабильность показателей оптической плотности в течение не менее 24 часов, что удобно с практической точки зрения. Однако надо принимать меры для предотвращения высыхания образцов.

11. Оптическую плотность измеряют против воды на спектрофотометре такого же класса как Backman DU®530 при длине волны 280, 320 и 370 нм. В связи с низким уровнем регистрируемого сигнала точность результатов будет во многом зависеть от того, насколько удастся избежать влияния дрейфа нулевой линии.

12. Содержание карбонильных продуктов (концентрация С нмоль/мг) рассчитывают, как количество динитрофенилгидразонов (продуктов реакции, образовавшихся при связывании карбонильных групп белка с 2,4-динитрофенилгидразином), выраженное в наномолях на 1 мг белка. Коэффициента молярной экстинкции динитрофенилгидразонов при 370 нм принимают равным 22000 М-1см-1.

Расчет производят по общей формуле:

С = 45,455е (А370опыт-А370контроль) / (концентрация белка в растворе мочевины мг/мл), где множитель 45,455 = 106/22000 возникает в результате преобразования коэффициента молярной экстинкции динитрофенилгидразонов 22000 М-1см-1 и 1*106 - коэффициента перевода размерности моль/литр в нмоль/мл.

Для каждого образца содержания кабонильных групп в белке вычисляется как среднее значение по результатам параллельных измерений в трех контрольных и трех опытных пробах.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ КАРБОНИЛЬНЫХ ПРОДУКТОВ В РЕАКЦИИ С ДНФГ В ГИДРОЛИЗАТАХ ФИБРИНОВОГО СГУСТКА ПЛАЗМЫ КРОВИ (ШВАЧКО А.Г., ПИРЯЗЕВ А.П, АЗИЗОВА O.A.)

Оборудование: 1) водяная баня до 100°С; 2) секундомер; 3) термометр для измерения комнатной температуры; 4) пластиковые пробирки на 12 - 15 мл; 5) круглодонные стеклянные толстостенные пробирки с внутренним диаметром 13,5 мм, высотой 100 мм.

Реактивы и материалы: 1) цитратная плазма замороженная (не мене 4 мл); 2) набора реагентов «Тромбин-реагент» производства НПО «Ренам»; 3) набор реагентов для определения общего белка в сыворотке и плазме крови биуретовым методом «Общий белок-01-витал» фирмы «Витал Диагностике Спб»; 4) 1н. раствор NaOH; 5) 20% раствор HCl, приготовленный из концентрированной соляной кислоты 37 - 38 %; 6) фибриноген человеческий фирмы «Sigma» с известной степенью очистки; 7) изотонический фосфатно-солевой буферный раствор PBS (таблетки фиpмы"Sigma")

Получение фибринового сгустка, проведение гидролиза, подготовка гидролизата для анализа содержания карбонильных групп:

1. Образцы плазмы размораживают и центрифугируют, как описано в Общем стандартном протоколе (Протокол№1, Раздел 1.З.). Из каждого образца плазмы отбирают по 1,0 мл в 3 пробирки на 12 - 15 мл.

К 1,0 мл цитратной плазм добавляют 0,2 мл тромбина с активностью 6 ед. из набора «Тромбин-реагент» производства НПО «Ренам». Инкубируют при 37*С на водяной бане 40 мин.

2. Сгустки трижды промывают в 10 мл PBS и высушивают на фильтровальной бумаге до «воздушно-сухого» состояния (метод и терминология P.A. Рутберга). Для анализа одного образца необходимо получить 3 фибриновых сгустка.

3.Сгустки помещают в круглодонные стеклянные толстостенные пробирки с 1,0 мл раствора NaOH, помещают в кипящую водяную баню на 120с.

4.Через 120±5с в пробирки добавляют по 1,0 мл 20% НС1 и немедленно помещают в холодную воду (10-15 *С) на 5 мин.

6. Гидролизат фибринового сгустка тщательно пипетируют, после чего из каждого образца отбирают по 0,5 мл в 2 круглодонные стеклянные толстостенные пробирки для проведения реакции с ДНФГ (контрольная и опытная проба). Оставшийся гидролизат используют для определения концентрации белка по биуретовой реакции согласно унифицированному колориметрическому методу определения фибриногена [8]. С этой целью можно использовать набор реагентов для определения общего белка в сыворотке и плазме крови «Общий белок-01-витал» фирмы «Витал Диагностике Спб». Для построения калибровочной кривой желательно использовать коммерческий препарат человеческого фибриногена фирмы «Sigma» с известной степенью очистки.

7. Содержание карбонильных групп в гидролизате фибринового сгустка определяют в соответствии с Общим стандартным протоколом (Протокол №1) за несколькими исключениями:

1) для осаждения добавляют 3,0 мл ТХУ, при этом надосадочную жидкость удаляют не переворачивание пробирки, а отбирают пипеткой;

2) для 1-й отмывки используют 5 мл этанол/этилацетата, для 2-й - 3 мл, для 3-й - 2 мл; осадок растворяют в 2,5 мл 8М мочевины.

8. Затраты времени на получение сгустка, гидролиз и подготовку пробы для измерения содержания карбонильных продуктов в реакции с ДНФГ для параллельного исследования 4-х образцов плазмы составляют 1,5-2 часа.