Пробиотический потенциал штаммов Propionibacterium freudenreichii и микробиологическая защита хлеба тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Ли Хао (КНР)

• Ли Хао (КНР)
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ли Хао (КНР)

Введение.

Обзор литературы

Биология Propionibacterium Jreudenreichii в связи с решаемой проблемой.

1. Молекулярно-биологическая идентификация микроорганизмов и филогения пропионовокислых бактерий.

2 (А). Физиология и биохимия классической ПКБ (P. jreudenreichii) в основе её пробиотических и технологически значимых свойств.

Б). P. freudenreichii как кандидат в пробиотики: пробиотическое действие и пробиотически значимые свойства бактерии.

3. Практическое значение P. Jreudenreichii: применение и разработка способов микробиологической защиты пищевых и сельскохозяйственных продуктов.

Цель и задачи работы.

Экспериментальная часть.

Объекты, материалы и методы.

Результаты и обсуждение.

1. Секвенирование фрагментов 16S рРНК и филогенетический анализ исследуемых штаммов ПКБ.

2. Пробиотически значимые свойства исследуемых штаммов

P. freudenreichii и их действие на макроорганизм.

2.1. Выживаемость штаммов P. jreudenreichii в условиях модельного ЖКТ.

2.2. Действие штаммов P. freudenreichii на макроорганизм.

2.3. Иммунотропные свойства исследуемых штаммов P. freudenreichii.

2.4. Внеклеточный витамин В12 (корриноиды) и некоторые ферменты культуральной жидкости штаммов P. freudenreichii.

2.5. Избирательная антимикробная активность исследуемых штаммов

P. freudenreichii.

2.6. Антиоксидантные свойства жидких культур штаммов P. freudenreichii.

3. Разработка способов применения P. freudenreichii для защиты пшеничного хлеба от «картофельной болезни», вызываемой развитием бацилл.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пробиотический потенциал штаммов Propionibacterium freudenreichii и микробиологическая защита хлеба»

Поиск новых пробиотиков - современная и актуальная проблема. Слова «пробиотики» и «антибиотики» противоположны по смыслу. Понятие «пробиотики» (ПРО) подразумевает живые микроорганизмы с их эк-зометаболитами, поступившие в организм естественным путём, например, перорально, и благоприятно воздействующие на физиологическое состояние макроорганизма: животного и человека (см. определение ВОЗ, 2002).

Одним из проявлений их действия является нормализация (регуляция) микробиоты желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) животного и человека. Возникновению и развитию концепции этого нового направления «на стыке» смежных наук: физиологии и экологии животных (человека), общей микробиологии, клинической микробиологии, науке о питании человека и других дисциплин, мы обязаны прежде всего русскому учёному, лауреату Нобелевской премии, Илье Ильичу Мечникову. В 1908 году он опубликовал работу по применению болгарской палочки (L. delhrueckii subsp. bulgaricus) в кисломолочных продуктах, что привело к массовому излечиванию желудочно-кишечных заболеваний на Балканах. Понятие «пробиотики» впервые упоминается Лиллеем и Стилвелом (Lilley, Stillwell) в 1965 году, однако исследования стали широко проводится только с 2000 года.

Важные вопросы, которые сейчас являются открытыми, состоят в следующем: обязательно ли ПРО должны выживать в ЖКТ (болгарская палочка нежизнеспособна), прикрепляться к эпителию кишечника, колонизировать его (размножаться), вносят ли они вклад в здоровье человека (животного) в целом и какой конкретно.

Среди пробиотических эффектов пробиотиков упоминаются: подавление нежелательной микробиоты и стимуляция истинных (индигенных, автохтонных, хозяйских) пробиотиков или эубиотиков в ЖКТ, иммуно-тропное действие (иммуномодуляция, иммуностимуляция), снижение воспалительных и аллергических реакций, противораковое действие и в целом оздоровление организма животного и человека. [Rolfe, 2000; Шендеров, 2001; Tannock, 2004; Jan, 2004; Nomoto, 2005; Суворов, 2007; Adams, Huang, 2008]. Эти эффекты ПРО-микроорганизмов определяются устойчивостью к агрессивным факторам ЖКТ, способностью функционировать в ЖЕСТ в транзиторном состоянии (если они не являются эубиотиками), а главное, пробиотическими свойствами, обусловленными их специфической физиологией и метаболизмом.

Поиск новых ПРО и правильное их использование, например, в функциональном (клиническом) питании, нацелено на уменьшение применения химических медицинских препаратов, в том числе антибиотиков.

В- пищевых технологиях микроорганизмы широко используются. Выбор микроорганизмов для тех или иных микробиологических (пищевых) производств заведомо оправдан, если они уже признаны ПРО, хотя не все «пищевые» микроорганизмы могут и должны, относится к ПРО. Важно, чтобы они были безопасными для человека и осуществляли целевой процесс. Вместе с тем, защита пищевых и сельскохозяйственных продуктов от портящих микроорганизмов и в настоящее время, не исключает применения химических препаратов-ксенобиотиков. Среди них - бензоаты, сорба-ты, антибиотики и значительно более вредные химические агенты, например, серный ангидрид.

В настоящей работе мы разрабатывали микробиологическую технологию производства пшеничного хлеба, защищенного от поражения гнилостными бактериями, его «картофельной болезни». Микробными агентами служили классические пропионовокислые бактерии.

Изоляты бактерий-были получены раньше в нашей лаборатории из сыра и по физиологии и морфологии были, отнесённые к р. Propionibacterium. Они имеют фенотипические разницы, но в результате филогенического анализа были признаны нами как принадлежащие к одному виду: Propionibacterium freudenreichii.

Эта бактерия с 2007 г. имеет статус QPS (Qualified presumtion of Safety) Европейского комитета по безопасности микроорганизмов (EFSA), который действует с 2002 года, и внесена в Список GRAS: Generally Recognized As Safe, USA [Lan et al., 2007]. Подвид этой бактерии (P. freudenreichii ssp. shermanii) на коловиквиумах GRAS обсуждался дважды: в 2003 и 2008. В настоящее время P. freudenreichii рассматривают в качестве кандидата в пробиотики.

Выявлению и начальному изучению пробиотических свойств семи исследуемых штаммов P. freudereichii, а также разработке эффективного способа приготовления пшеничного хлеба, устойчивого к заболеванию «картофельной болезнью», посвящена настоящая работа.

Работа выполнена в рамках Договора (2006-2009 гг) о научном и учебно-методическом сотрудничестве между Биологическим факультетом МГУ имени М.В. Ломоносова и Институтом систематики и экологии животных СО РАН.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Биология Propionibacterium freudenreichii в связи с решаемой проблемой

Пропионовокислые бактерии (ПКБ) образуют компактный филогенетический кластер в домене (империи или надцарстве) Bacteria. Они принадлежат к царству или филетической линии «Грамположительные бактерии», ветви с высоким содержанием ГЦ-пар в хромосомной ДНК. ПКБ объединены в род Propionibacterium, который входит в состав семейства Propionibacteriaceae.

Philum В XIY Actinobacteria Class I Actinobacteria Subclass I Actinobacteridae Order I Actinomycetales Suborder XII Propionibacterineae Family 1 Propionibacteriaceae Genus I Propionibacterium

Бактерии рода Propionibacterium по местообитанию и специальным фенотипическим и генотипическим характеристикам подподают под одну из двух категорий [Cummins, Johnson, 1992; Glatz 1992]: классические или "молочные" и "кожные"(си1епеоиз). В настоящее время идентифицированы (признаны) следующие виды пропионовокислых бактерий (ПКБ):

Классические (молочные) ПКБ P. freudenreichii (ssp. freudenreichii и ssp. shermanii) P. acidipropionici P.jencenii P, thoenii

Кожные ПКБ P. acnes P. avidum P. granulosum

P. propionicus (Arachnid propionica). P. limphophilum

ПКБ, имеющие особые местообитания

P. innocuum = Propioniferax innocula (1991) -обитает на коже людей, но имеет фенотип класических ПКБ;

P. cyclohexanicum (1997) выделена из сбраживаемого апельсинового сока, физиологически близка P. freudenreichiv,

P. microaerophilum (2001) - выделена из промывных вод оливок.

Taxonomic Outline of the Procaryotes Bergeys Manual of Systhematic Bacteriology, Second Edition. Release 3.0 July 2002 http://dx.doi.org/10.1007/bergeysoutline2Q0210

Основным объектом настоящей работы является классическая ("молочная") бактерия Propionibacterium freudenreichii (Pfr, ПКБ), поэтому именно ей мы уделяем внимание в настоящем Обзоре.

Местообитания Pfr — молоко и молочные продукты: свежее коровье молоко [Cummins, Johnson, 1981; Fessler et al., 1999 (а)], кисломолочные продукты длительного хранения, например, сброженная жирная сметана (каймак)[Шакирзянова и др., 2002], "твёрдые" и "полутвёрдые" сычужные сыры (индигенная микробиота, ПКБ) с высокой температурой второго нагревания (52 - 55°С), которые долго созревают (до 3-х месяцев и более) при пониженной температуре [Cummins, Johnson, 1981; Fessler et al., 1999 (b)]. Источником Pfr являются также сброженные травы, силос [Воробьёва, 1995; Merry, Davies, 1999].

В каймаке, сырах и силосах классические ПКБ имеет трофическая связь (образуют трофическую цепь) с молочнокислыми бактериями, которые предварительно сбраживают углеводы (лактозу, глюкозу, мальтозу) с образованием молочной кислоты, которую в форме лактатов ПКБ используют в качестве источников углерода и энергии.

Подходящие ("богатые") натуральные среды для культивирования Pfr в лабораторных и производственных условиях - это глюкозо- или лак-татно-кукурузная среда, лактатная молочная сыворотка и другие натуральные среды. Отдельные штаммы Pfr способны использовать лактозу, т. е. расти на обезжиренном молоке.

Вышесказанное свидетельствует о том, что Pfr тяготеет к пищевым субстратам, причём не вызывая порчи модифицируют их качество. Поэтому эту бактерию можно назвать "пищевым микроорганизмом".

Безопасность P. freudenreichii признаётся Европейским комитетом (European Food Safety Authority, EFSA), основанном в 2002 году: статус QPS(Qualified presumtion of Safety, http://www.efsa.europa.eu/EFSA/en.html'). Комитет США (Food and Drug Administration) недавно включил эту бактерию в список GRAS (Generally Recognized Absolutely Safety) под номером: 21 CFR133.195 [Lan et al., 2007].

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Ли Хао (КНР)

выводы

1. Филогенетический анализ семи штаммов p. Propionibacterium, изолированных и фенотипически охарактеризованных ранее, позволил установить их принадлежность к одному и том же виду: Р. freudenreichii, несмотря на существенные фенотипические различия. Принадлежность к этому виду свидетельствует о безопасности данных бактерий для животных и человека. Два штамма: RVS-2-ims и RVS-4-irf, депонированы в ВКПМ; последний заявлен и зарегистрирован в International GenBank (AC number EU418709).

2. На примере P. freudenreichii штамм RVS-4-irf с использованием модельного (неполного) желудочно-кишечного тракта показали, что пропионовокислые бактерии способны сохранять жизнеспособность, при этом концентрация живых клеток снижается с 109 до 106.

3. Проведены испытания действия штаммов P. freudenreichii RVS-2-ims и RVS-4-irf на организм животного (птицы). Пробиотический эффект штаммов обнаружен.

4. Выявлены и частично изучены пробиотически значимые свойства исследуемых штаммов:

- иммунотропные (по стимуляции образования цитокинов в крови в системе ex vivo);

- избирательно антимикробные на основе пропионатов и бактериоцин-подобных веществ, действующих в нейтральных условиях;

- антиокислительные (показано для жидких культур методом катодной вольтамперометрии);

- экзометаболитные и экзоферментные (низкое внеклеточное содержание витамина Bi2 может быть существенным в сконцентрированных препаратах; протеолитическая активность проявляется как в кислых, так и в нейтральных условиях).

Для испытаний и применения в качестве пробиотических препаратов нами рекомендованы штаммы P. freudenreichii RVS-2-ims и RVS-4-irf как наиболее изученные и эффективно действующие.

5. Разработан новый способ применения P. freudenreichii в заквасочной технологии производства пшеничного хлеба для его защиты от гнилостных бактерий («картофельной болезни» хлеба): он включает последовательное культивирование на мучной среде L. delbrueckii и про-пионовокислой бактерии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Классическая («молочная») пропионовокислая бактерия Propionibacterium freudenreichii признана безопасным «пищевым» микроорганизмом. Применение её штаммов в пищевой промышленности и сельском хозяйстве в настоящее время расширяется: это стартерные культуры в производстве твёрдых сыров (с 90-х годов прошлого века), силосов, ферментированных молочных и овощных продуктов, источники ферментов-антиоксидантов и других ферментов. Важнейшим является её антимикробный потенциал, используемый в биоконсервировании. Следует отметить, что штаммы Pfr способны продуцировать биологически активные веще-ства-нутрицевтики, полезные для обмена веществ человека (животного) и для микробиоты ЖКТ. Среди них - витамины группы В, в том числе фо-лиевая кислота и витамин В12, бифидогенные факторы и другие экзомета-болиты.

Ведётся поск новых штаммов, активных в отношении образования ЛЖК (пропионовой и уксусной кислот), бактериоцинов, витамина Bi2 и других биологически активных веществ. Propionibacterium freudenreichii является наиболее изученной и широко распространённой в природе. В сыром молоке коров и твёрдых сырах более 80% всех ПКБ составляет именно эта бактерия. Поиск новых штаммов Pfr, изучение их биологических свойств актуально в связи с проблемой пробиотиков. Эту бактерию в последнее время интенсивно изучают в качестве кандидата в пробиотики (пропионовокислым бактериям посвящают специальные международные симпозиумы). Сложность состоит в том, что она, по-видимому, истинным пробиотиком (эубиотиком) не является, а относится, скорее, к транзитор-ным.

Располагая штаммами классических пропионовокислых бактерий, изоляты которых были получены в нашей лаборатории ранее (в конце 80-х годов прошлого столетия) и изучены фенотипически, мы с использованием молекулярно-биологических методов и филогенетического анализа идентифицировали их как Propionibacterium Jreudenreichii. При этом исследуемые штаммы, имея общие признаки, заметно различаются фенотипически.

Приступили к выявлению и начальному изучению их пробиотиче-ского потенциала. Под влиянием КЖ PJr двух штаммов с наиболее активным образованием ЛЖК и витамина В12: P. Jreudenreichii RVS-2-ims (Рг 2) и RVS-4-irf (Рг 4), перепела с перепелиной фермы (Физиологический двор Государственного научного учреждения Сибирского научно-исследовательского и проектно-технического института животноводства Сибирского отделения Россельхозакадемии, ГНУ СибНИПТИЖ) проявили по сравнению с контролями большую сохранность и прирост живой массы (на несколько процентов) при меньшей потребности в кормах. Необходимо провести более широкие испытания'пробиотического действия штаммов Р. Jreudenreichii на млекопитающих, а также клинические эксперименты с привлечением пациентов-добровольцев.

Исследовали ряд свойств, позволяющих подойти к объяснению выявленного пробиотического эффекта (на перепелах).

Все исследуемые штаммы PJr после их предварительного инкубиро-ванияь в присутвии желудочного сока или эмульсии желчи оказались способными к росту в жидких культурах. В' модельном ЖКТ на примере штамма RVS-4-irf (Рг 4) установили, что ПКБ более чем на 60% (по* log КОЕ/мл) сохраняет свою жизнеспособность.

Для всех семи исследуемых штаммов P. Jreudenreichii впервые показали, что они индуцируют синтез разных цитокинов в цельной крови в системе ex vivo. Наибольший эффект нативных клеток ПКБ проявился в отношении образования интерлейкина ФНО (фактор некроза опухолей). В целом полученные данные по стимуляции синтеза цитокинов в крови человека показывают, что клетки классических («молочных») ПКБ способны воздействовать на иммунную систему человека. Эти результаты для Р. Jreudenreichii получены нами в 2007-2008 годах, т.е. практически одновременно с группой Кекконена, работа которых на моноцитах с использованием штамма P. freudenreihii ssp. shermanii JS (PJS) была опубликована в 2008 году [Kekkonen et al., 2008].

Витамин В i2, синтезируемый ПКБ, является незаменимым метаболи-том-нутрицевтиком для животных и человека. Обычно он поступает в организм чеовека с животной пищей. В связи с пробиотическими свойствами бактерии важно его присутствие не столько в клетках бактерии, сколько выделение в окружающую среду. Установили, что КЖ штаммов Pfr содержат витамин В12 , но в очень малых количествах (на 3-4 порядка меньше) по сравнению с его внутриклеточным-содержанием. Не исключено, что присутствие витамина в среде после выращивания ПКБ является следствием автолиза части клеток. Поэтому трудно рассматривать Pfr как существенный источник витамина В12 в ЖКТ. Эти бактерии, скорее всего, там не размножаются. Только перманентное потребление концентрированных препаратов культур Pfr, содержих не только клетки, но и их экзомета-болиты, может заменить естественное потребление витамина В12 с животной пищей.

Исследуемые штаммы P. freudenreichii обладают внеклеточной про-теолитической активностью, которую можно считать невысокой в данных конкретных условиях определения. Важно, что ПКБ способны её проявлять не только в кислой, но и в нейтральной среде, которая характерна для толстого кишечника человека и животного. Её предположительное значение состоит в гидролизе белков, непереваренных пищеварительными ферментами желудка и тонкого кишечника (пепсинами и трипсинами).

Антимикробная активность штаммов Pfr- носила избирательный характер. Мы выявили антагонизм культур в отношении некоторых бацилл, псевдомонад и кишечной палочки. Вместе тем, молочнокислая бактерия L. casei, которая относится к эубитикам, оказалась толерантной к культуре ПКБ, что указывает на возможную биосовместимость ПКБ и МКБ. Кроме того, в присутствии культуры ПКБ возрастала концентрация живых клеток

L. acidophilus.

Пропионат (натрия) как основной антимикробный фактор ПКБ по разному действовал на микроорганизмы-мишени: бацилы, псевдомонады и кишечная палочка были высокочувствительны (эффект ингибирования роста зависел от состава среды), а МКБ: L. casei, L. acidophilus, L. brevis, L. fermentum, Streptococcus thermophilus, — достаточно устойчивы. Последнее характерно и для Saccharomyces cerevisiae. Эти наши наблюдения (наряду с известным стимулирующим действием ПКБ на рост бифидобактерий), обращают внимание на новую проблему: избирательность действия ПКБ в отношении разных микроорганизмов, в том числе присутствующих в желудочно-кишечном тракте. Можно допустить существование сообществ пробиотиков в ЖКТ и мутуализм между ними. Эти предположения требуют соответствующих экспериментальных подтверждений.

У наших штаммов мы впервые выявили антимикробную активность, не обусловленную ЛЖК (пропионатом), а имеющую белковую природу. Речь идёт о бактериоцин-подобных веществах (БПВ), которые недавно были описаны у ПКБ. Интересно, что одни и те же бациллы оказались мишенями не только для пропионата, но и БПВ. БПВ разных штаммов Pfr действовали против разных бактерий-мишеней, но частично их спектры совпадали. В предварительном плане можно заключить, что штаммы Рг 1, Рг 3, Рг 5 и Рг 6 в качестве пробиотиков применять нежелательно, поскольку их БПВ негативно действовали на L. casei и L. acidophilus.

Две культуры Pfr (штаммы Рг 2 и Рг 4), обладающие высокой антимикробной активностью и высоким уровнем образования витамина BJ2, обследовали на антиокидантную активность методом высокочувствительной вольтамперометрии. Активность обеих культур оказалась высокой. Представленные данные свидетельствуют о том, что культуры исследованных штаммов обладают выраженными антиоксидантными свойствами. При этом образцы культур штамма Рг 2 проявили более высокую антиокислительную активность по сравнению с образцами штамма Рг 4, о чём судили по величинам кинетического критерия вольтамперметрии. Поэтому исследованные штаммы пропионовокислых бактерий могут рассматриваться в качестве эффективно действующих биоантиоксидантов. Это свойство также расширяет пробиотический потенциал ПКБ, которые целесообразно использовать, например, при создании физиологически функциональных продуктов питания.

В совокупности обнаруженные пробиотические эффекты и свойства исследованных штаммов ПКБ позволяют отнести их сразу к трём условно выделяемым категориям пробиотиков [Суворов, 2007]: метаболическим, иммуномодулирующим и антимикробным. Остаётся открытым вопрос: есть ли среди наших штаммов эубиотики (авохтонные, индигенные или резидентные пробиотики)? Для ответа на него требуются специальные исследования по оценке адгезии (колонизации) эпителия кишечника, подсчету живых клеток пропионовокислых бактерий не только в стуле, но и непосредственно в ЖКТ. Такие исследования должны проводиться совместно со специалистами - физиологами животных и человека. Пока нет «запрета» на ожидание положительного результата. Отметим, что адгезию и размножение в ЖКТ показали только для одного штамма классических ПКБ: Р jensenii 702 [Huang et al., 2003; Adams, Huang, 2008]. Пять испытанных авторами штаммов P. freudenreichii-. SCCC 2200, 2201, 2206, 2207, 2216, вообще не проявили адгезии, хотя для штамма P. freudenreichii JS ранее была показана 12% степень адгезии [Lehto, Salminen, 1997], т. е. адгезия зависит от штамма ПКБ.

Поиск эубиотиков среди новых штаммов P. freudenreichii недавно продолжен в группе проф. Жана (Франция) [Lan et al., 2007], хотя облигат-ным пробиотическим свойством адгезия (и колонизация эпителия ЖКТ), по-видимому, не является. Важнее выживаемость клеток, их метаболизм и пробиотическое действие при прохождении ЖКТ. Корпорация Standa Industrie (Франция) разрабатывает препарат «Propiofidus» на основе штамма P. freudenreichii SI41 [Jan et al., 2002]. Для перманентного длительного потребления используют капсулы, содержащие большие количества живых клеток ПКБ (5x10ю). Данные о значении этого штамма в функциональном (клиническом) питании людей, видимо, являются закрытыми (нами в литературе не найдены).

Научные предпосылки (сведения из литературы) и полученные нами данные свидетельствуют о широком спектре свойств классической ПКБ, которые имеют значения для проявления её пробиотических эффектов, однако испытаний для выявления пробиотического действия Р. freudenreichii на животных проведено немного (практически, всего три вместе с нашими опытами на птице). Расширение таких исследований на животных и пациентах-добровольцах должно стимулировать разработку и применение пробиотических препаратов на основе P. freudenreichii. Настоящая работа, по сути, пропагандрует эту классическую пропионовокислую бактерию, и прежде всего рассматриваемые штаммы, в качестве новых пробиотиков.

Нами был разработан способ ведения пропионовой закваски, которую можно накапливать в условиях хлебозаводов в нужном количестве и количественно вводить в конечное дрожжевое тесто при замесе. Способ подразумевает размножение ПКБ в мучной среде и, после удвоения биомассы клеток, двукратное разбавление свежей средой с повторением циклов. При этом пропионовокислая культура на нестерильной мучной среде (ПКБ-закваска) не должна быть вытеснена контаминирующей микрофлорой. Эта технологическая стратегия для ПКБ оказалась возможной только на основе трофической цепи: МКБ - ПКБ. Сами по себе пропионовые бактерии, как мы установили, не способны к росту на мучной среде. Вместе с тем, термофильная МКБ: L. delbrueckii превращает глюкозу, но преимуще-ственнно мальтозу «осахаренного» жидкого теста (заварки), в молочную кислоту, которая, с одной стороны, подавляет развитие спонтанных бактерий (МКБ), а с другой - после превращения её в лактат, является источником углерода и энергии для развития ПКБ. Этот простой (экономичный и удобный) способ позволил решить проблему защиты пшеничного хлеба от картофельной болезни» при улучшении его органолептических, физических и нутрицевтических свойств. Предположительно хлеб обогащается биологически активными веществами, выделяемыми P. freudenreichii, а убитые нагреванием (при выпечке) клетки способны, возможно, оказывать иммунотропное действие (аналогия с P. jensenii 702).

Таким образом, на наш взгляд, поставленные в работе цель и задачи в целом решены.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ли Хао (КНР), 2009 год

1. Афанасьева О.В. Микробиология хлебопекарного производства. — К.: Береста, СПб Ф ГОСНИИ ХП, 2003. С. 221с.

2. Белобородова Н.В., Белобородов С.М. Метаболиты анаэробных бактерий (летучие жирные кислоты) и реактивность макроорганизма // Антибиотики и химиотерапия. 2000. № 2. С. 28-36.

3. Богатырева Т.Г. Научные основы технологий хлебобулочных изделий с направленным культивированием микроорганизмов /Автореферат докторской диссертации. М. 2000.

4. Богатырева Т.Г., Иордан Е.П., и др. Способ предотвращения заболевания хлеба картофельной болезнью /Патент на изобретение № 1608849 от 17 июня 1992. Приоритет-29 сентября 1988 г.

5. Богатырёва Т.Г., Прянишникова Н.И., Иордан Е.П. Исследование про-теолитической активности молочнокислых, пропионовокислых бактерий и дрожжей, применяемых в хлебопечении // Межд. журнал Биотехнология у управление. 1994. Т. 1. № 4. С.40 -43.

6. Бонарцева Г.А. Об аэробном метаболизме пропионовокислых бактерий. Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук. М.: МГУ, 1973.

7. Брюхачёва Н.Л., Воробьёва Л.И., Бонарцева Г.А. Об* окислительном фосфорилировании у пропионовокислых бактерий // Микробиология. 1975. Т. 44. № 1. С. 11-14.

8. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Турова Т.П., Кравченко И.К., Быкова С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. // Микробиология. 2002. Т. 71. №4. С. 1-9.

9. Быховский В.Я., Зайцева Н.И. Микробиологический синтез тетрапир-рольных соединений. Итоги науки и техники. М.: ВИНИТИ. Серия:

10. Биологическая химия, 1989. 176 с.

11. Венчиков А.И., Венчиков В.А. Основные приёмы статистической обработки результатов наблюдений в области физиологии. М.: Медицина, 1974. 152 с.

12. Воробьева Л.И. Пропионовокислые бактерии и образование вита MHHaB.2. М.: Издательство Московского университета, 1976. 264с.

13. Воробьёва Л.И. Пропионовокислые бактерии. М.: МГУ, 1995. 235с.

14. Воробьёва Л.И., Аль-Судани С., Краева Н.И. Пероксидаза пропио-новокислых бактерий // Микробиология. 1986. Т. 55. № 5. С. 750- 753.

15. Воронцова К.Е. (а) Влияние пропионовокислых бактерий на жизнедеятельность картофельной палочки // Хлебопекарная и кондитерская промышленность. 1971. № 4. С. 14-17. С. 206-216.

16. Воронцова К.Е. (б) Использование пропионовокислых бактерий в хлебопечении // Хлебопекарная и кондитерская промышленность. 1971. № 6. С. 10-13.

17. Галактионов В.Г. Иммунология (3-е издание). М.: Издательский центр «Академия», 2004. 528 с.

18. Данилова И.В., Богатырева Т.Г., Быковченко Т.В., Рыжкова Е.П., Положительное действие Propionibacterium freudenreichii на рост Sac-charomyces cerevisiae при совместном культивировании // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т.42. №3. С. 326-331.

19. Драчева Л. В. 2007. Антиоксидантная активность пробиотических биоантиоксидантов // Клиническое питание. № 1-2. 39.

20. Драчева Л.В., Короткова Е.И., Дорожко Е.В. Применение вольтаме-рометрического метода при изучении биоантиоксидантов //Пищевая промышленность. 2008. № 4. 28-29.

21. Иконников Н.П., Иордан Е.П., Воробьева Л.И. Выделение нуклеотидов и их производных иммобилизованными клетками Propionibacterium shermanii II Прикл. биохим. и микробиол. 1982. Т. 8. № 1. С. 34-40.

22. Иконников Н.П. Образование органических кислот, нуклеотидов и их производных иммобилизованными клетками Propionibacterium shermanii. Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук. М.: МГУ, 1984.

23. Канопкайте С.И. Кобаламины. Вильнюс: Мокслас, 1978. 144 с.

24. Канопкайте С.И., Рачкус Ю.А. Биохимические и медицинские аспекты кобаламинов (В12). Вильнюс: Academia, 1991. 267с.

25. Краева Н.И., Воробьёва Л.И. Супероксиддисмутаза, каталаза и перок-сидаза пропионовокислых бактерий //Микробиология. 1981. Т. 50. № 5. С. 813-817.U

26. Ленгерер И., Древе Г., Шлегель Г. Современная микробиология. Прокариоты (в 2-х томах). М.: Мир, 2005. Т. 1. С. 350, 383 -384.

27. Моргун К.Д., Ведерникова Е.И., Павлюк Р.Ю. Средства борьбы с картофельной болезнью // Хлебопекарная и кондитерская промышленность. 1973. № 11. С. 16 18.

28. Познанская А.А., Корсова Т.Л. //Успехи соврем, биол. 1980. Т. 90. № 1(4). С. 49-50.

29. Познанская А.А. Корсова Т.Л. //Успехи соврем, биол. 1984. Т. 98. № 3(16). С. 382-364.

30. Практикум по микробиологии п/р проф. А.И. Нетрусова. М.: Издательский центр "Академия", 2005. 606 с.

31. Рыжкова Е.П. Кобальт и корриноиды в биологии Propioibacterium freudenreichii. Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук. М.: МГУ, 2003.

32. Рыжкова Е.П. Лекции для студентов 4-го курса каф. микробиологии МГУ (1992-2009).

33. Рыжкова (Иордан) Е.П. Множественные функции корриноидов в биологии прокариотических организмов //Прикл. биохим. и микробиол. 2003. Т. 39. № 2. С. 133-159 (обзор).

34. Скулачев В.П. Кислород в живой> клетке: добро и зло // Природа (естественно-научный журнал РАН). 1997. № 11. С. 26-35.

35. Стикс Г. Всепожирающее пламя // В мире науки (Scientific American). 2007. № 11. С. 18-26.

36. Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д., Ботина С.Г., Нетрусов А.И. Выделение и идентификация низинобразующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis из молока // Прикл. биохим. микробиол. 2006. Т. 42. № 5. С. 560-568.

37. Суворов А.Н. Теоретические аспекты клинического использования пробиотиков // Клиническое питание (Научно-практический журнал). 2007. № 1-2. (243). С. А68.

38. Хамагаева И.С., Качанина Л.М. Кисломолочный напиток «Целебный» //Молочная промышленность. 2005. № 5. С. 66-68.

39. Шакирзянова М.Р., Рузиева В.М., Абдульмянова Л.И., Суйдаметова Э.А., Гулямова Т.Г. Способность некоторых штаммов пропионовокислых бактерий, выделенных в Узбекистане, к синтезу витамина В12 // Микробиология. 2002. Т. 71. № 4. С. 570.

40. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональ161ное питание (в трёх томах). Т. III. Пробиотики и функциональное питание. М.: ГРАНТЪ. 2001. 286 с.

41. Adams М.С., Huang Yang. Probiotic Propionibacterium. United States Patent 7427397 (2008).

42. Ahern W. P., Andrist D. F., Skogerson L. E. Production of fermented whey containing calcium propionate. United States Patent, 4,676,987, April 24, 1984.

43. Al-Zoreky N., Ayres J.W., Sandine W.E. Antimicrobial activity of Micro-gard-against food spoilage and pathogenic microorganisms // J. Dairy Sci. 1991.V. 74. P. 758-763.

44. Ayres J. W. , Sandine W. E., Weber G. H. Preserving foods using metabolites of propionibacteria other than propionic acid // United States Patent 5,096,718, March 17, 1992.

45. Babuchowski A., Laniewska-Moroz L., Warminska-Radyko I. Propionibacteria in fermented vegetables // LAIT. 1999. V. 79. N.l. P. 113-124.

46. Barefoot S. F., Nettles C. G. Antibiosis revisited: bacteriocins produced by dairy starter cultures // J. Dairy Sci. 1993.V. 76. P. 2366-2379.

47. Bodie E. Propionic acid fermentation of ultra-high-temperature sterilized whey using mono- and mixed cultures // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. V. 25. N. 5. P. 434-437.

48. Bougie D., Roland N., Lebeurrier F., Arhan P. Effect of propionibacteria supplementation on fecal Bifidobacteria and segmental colonic transit-time in healthy human subjects source // Scandinavian J. Gastroenterology. 1999. V. 34. N. 2. P. 144-148.

49. Bouton Y., Guyot P., Beuvier E., Tailliez P., Grappin R. Use of PCR-based methods and PFGE for typing and monitoring homofrementative lac-tobacilli during Comte cheese ripening // Int. J. Food Microbiol. 2002. V. 31. P. 59-68.

50. Brede D.A., Faye Т., Johnsborg O., Odegard I., Nes I.F., Holo H. Molecular and genetic characterization of propionicin F, a bacteriocin from Propionibacterium freudenreichii //Appl. Environ. Microbiol. 2004 V. 70. N. 12. P. 73037310.

51. Brede D.A., Faye Т., Stierli M.P., Dasen G., Theiler A., Ness I.F., Meile L., Holo H. Heterologous production of antimicrobial peptides in Propionibacterium freudenreichii I I Appl. Eviron. Microbiol. 2005. V. 71. N. 12. P. 8077-8084.

52. Brock M., Buckel W. On the mechanism of action of the antifungal agent propionate // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. N. 15. P. 3227-3241.

53. Chaia A.P., Zarate G. Oliver G. The probiotic properties of propionibacteria//Lait. 1999. V. 79. N. 1. P. 175-185.

54. Chamba J.-F., Perreard Ё. Contribution of propionic acid bacteria to lypolysis of Emmental cheese // Lait. 2002. V. 82. N. 1. P. 33-44.

55. Charfreitag O., Stackebrandt E. Inter- and intrageneric relationships of the genus Propionibacterium as determined by 16S rRNA sequences // J. Gen. Microbiol. 1989. V. 135. P. 2065-2070.163

56. Chermesh I., Eliakim R. Probiotics and the gastrointestinal tract: Where are we in 2005 // World J. Gastroenterol. 2006. V. 12. N. 6. P. 853-857.

57. Cummins C. S., Johnson J.L. The Genus "Propionibacterium". In: The Prokaryotes. A handbook on habitats, isolation, and identification of bacteria. Starr M.P. et al. (eds). Berlin etc.: Springer, 1981. V. 2. P. 1894-1902.

58. Cummins C. S., Johnson J.L. The Genus "Propionibacterium". In: The Prokaryotes. Second edition. Balows et al. (eds). New York etc.: Springer-Verlag, 1992. V. 2. P. 834-849.

59. Daniels L., Hanson R.S., Phillips J.A. Chemical analysis. In: Methods for general and molecular bacteriology. Gerhardt et al. (eds). Washington DC: American Society for Microbiology, 1994. P. 542-544.

60. Dasen G., Smutny J., Teuber M., Meile L. Classification and identification of propionibacteria based on ribosomal RNA genes and PCR // System. Appl. Microbiol. 1998. V. 21. P. 251-259.

61. De Vries W., Wijck-Kapteijn (van) W.M.C., Stouthamer A.H. Influence of oxygen on growth, cytochrome synthesis and fermentation pattern in propionic acid bacteria // J. Gen. Microbiol. 1972. V. 71. N 3. P. 515-524.

62. Edwards U., Rogall Т., Bloeker H., Ende M.D., Boeettge E.C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes , characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA // Nucl. Acids Res. 1989. V.17. P.7843-7853.

63. El-Ziney M.G., De Meyer H., Debevere J.M. Growth and survival kinetics of Yersinia enterocolitica IP 383 0:9 as affected by equimolar concentrations of undissociated short-chain organic acids // Int. J. Food Microbiol. 1997. V. 34. N. 3. P. 233-247.

64. Faye Th., Brede D.A., et al. Bacteriocins of propionic acid bacteria. 3-rd International Symposium on Propionibacteria, 8-11 July 2001, ETH Zurich, Switzerland. Abstract Book, S-8, P. 16.

65. Fessler D., Casey M.G., Puhan Z. Propionibacteria flora in Swiss raw mil from lowlands and Alps // Lait. 1999 (a). V. 79. P. 201-209.

66. Fessler D., Casey M.G., Puhan Z. Identification of propionibacteria isolated from brown spots of Swiss hard and semi-hard cheeses // Lait. 1999 (b). V. 79. P. 211-216.

67. Frohlich-Wyder M.-T., Bachmann H.-P., Casey M.G. Interaction between propionibacteria and starter/non-starter lactic acid bacteria in Swiss-type cheeesees // Lait. 2002. V. 82. N. 1. P. 1-15.

68. Glatz B.A. The Classical Propionibacteria: their past, present, and future as industrial organisms //Am. Soc. Microbiol. News. 1992. V. 58. N. 4. P. 197-201.

69. Gollop N, Toubia D, Shushan GB, Zakin V. High Production System of the Antibacterial Peptide PLG-1 // Biotechnol. Prog. 2003. V. 19. N. 2. P. 436-439.

70. Heilig H.G., . de Vos W.M (всего 6 авторов) Molecular diversity of Lactobacillus spp. and other lactic acid bacteria in human intestine // Appl. Env. Microbiol. 2002. V. 68. N. 1. P. 114-123.

71. Herve C., Fondrever M., Cheron F., Barlow-Huber F. , Jan G. Transcarboxylase mRNA: a marker which evidences P. freudenreichii survival and metabolic activity during its transit in the human gut // Int. J. Food Microbiol. 2007. V. 113. N. 3. P. 1303-314

72. Holo H., Faye Т., Brede D.A., Nilsen Т., 0degard I., Langsrud Т., Brendenhaug J., Nes I.F. Bacteriocins of propionic acid bacteria // Lait. 2002. V. 82. P. 59-68.

73. Hugenholtz J., Hunik J., Santos H., Smid E. Nutraceutical production by propionibacteria// Lait. 2002. V. 82. N 1. P. 103-112.

74. Isawa K., Hojo К. (всего 9 authors). Isolation and identification of a new bifidogenic growth stimulator produced by Propionibacterium Jreudenreichii ET-3 //Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. V. 66. N. 3. P. 679-681.

75. Jan G., Leverrier P., Roland N. Survival and beneficial effects of propionibacteria in human gut: in vivo and in vitro investigations /З-rd International Symposium on Propionibacteria, ETH Zurich, 8-11 July 2001. Abstract Book. P. 24.

76. Jan G., Leverrier P., Proudy I., Roland N. Survival and beneficial effects of propionibacteria in human gut: in vivo and in vitro investigations // Lait. 2002. V. 82. No l.P. 131-144.

77. Javanainen P.V., Linko Y.Y. Linko P., Propionic acid formation by mixed cultures // Proc. 4-th Eur. Congr. Biotechnol. Amsterdam. June 14-19. 1987. V. 3. Amsterdam etc., 1987. P. 313-316.

78. Jore J.P., van Luijk N„ Luiten R.G., van der Werf M.J., Pouwels P.H. Efficient transformation system for Propionibacterium Jreudenreichii based on a novel vector //Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. N. 2. P. 499-503.

79. Kaur P. Survival and growth of Bacillus cereus in bread. J. Appl. Bacterid. 1986. V. 60. N. 6. P. 513-516.

80. Kekkonen R.A.Korpela R. (всего 10 авторов). Probiotic intervensionhas strain-specific anti-inflammatory effects in healthy adults // World J. Gastroenterol. 2008. V. 14. N. 13. P. 2029-2036.

81. Lan A., Bruneau A., . Jan G. (всего 9 авторов) Survival and metabolic activty of selected strains of Propionibacterium freudenreichii in the gastrointestinal tract of human microbiota-associated rats // Br. J. Nutr. 2007.1. V. 97. N. 4. P. 714-724.

82. Lehto E.M., Salminen S. // Bioscience Microflora. 1997. V. 16. P. 13-17.

83. Lind, H., Jonsson H., Schnurer J. Antifungal effect of dairy propionibac-teria contribution of organic acids. // Int. J. Food Microbiol. 2005. V. 98. № 1. P. 157-165.

84. Lind H., Sjugren J., Gohil S, Kenne L.J., Broberg A. Antifungal compounds from cultures of dairy propionibacteria type strains // FEMS Microbiol. Lett. 2007. V. 271. N. 2. P. 310-315.

85. Majehrzak R., Duszkiewicz W., Lewczuk J., Kijewska A. // Technologia Poino-Spotywecza. 1977. V. 12. P. 23-36.

86. Marshall D.L., Odame-Darkwah J.K. Mechanism of inhibited growth of Bacillus pumilus by Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii II Int. J. Food Microbiol. 1994. N. 1. P. 11-22.

87. Merry R. J., Davies D. R. Propionibacteria and their role in the biological control of aerobic spoilage in silage // Lait. 1999. V. 79, N. 1. P. 149-164.

88. Mori H.,. Kaneko Т. (всего 8 авторов) Isolation and structural identification of bifidogenic growth stimulator produced by Propionibacterium freudenreichii // J. Dairy Sci. 1997. V. 80. P. 1959-1964.

89. N. Van Luijk, .Meile L. (всего 10 авторов) Genetics and molecularbiology of propionibacteria // Lait. 2002. v. 82. N. 1. P. 45-58.

90. Nomoto K. Prevention of infections by probiotics // J. Biosci. Bioengi-neering. 2005. V. 100. N 6. P. 583-592 (review).

91. Odame-Darkwah J.K., Marshall D.L., Interactive behavior of Saccharo-myces cerevisiae, Bacillus pumilus and Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. /Vint. J. Food Microbiol. 1993. V. 4. P. 259-269.

92. Ouwehand A.C., Suomalainen Т., Tolkko S., Salminen S. In vivo Adhesion of propionic acid bacteria to human intestional mucus // Lait. 2002. V. 82. N. l.P. 123-130.

93. Pattison TL, Lindsay D, Von Holy A. In vitro growth response of bread-spoilage Bacillus strains to selected natural antimicrobials // J. Basic Microbiol. 2003. V. 43. N. 4. P. 341-347.

94. Pelshenke, 1950. Цитировано no: Spicher G. Baked goods. In: Biotechnology. Food and Feed Production. Weinheim: Verlag Chemie, 1983. V. 5. P. 15-20.

95. Pelshenke P. Wissenschaftliche und technische Fortschritte bei der Beklmflung von Brotkrankheiten // Brot und Geback. 1954. H. 2. S. 27-32.ч

96. Рере О., Blaiotta G., Moschetti G., Greco Т., Villani F. Rope-producing strains of Bacillus spp. from wheat bread and strategy for their control by lactic acid bacteria // Appl. Env. Microbiol. 2003. V. 69. N. 4. P. 2321-2329.

97. Pratt J.M. Coordination chemistry of the В i2 dependent isomerase reaction. In: «В|2» V. 1 (Chemistry), ed. D. Dolphin. John Willey & Sons. 1982. Ch. Ten. P. 325-392. 348-349.

98. Pritchard G.G., Asmundson R.V. Aerobic electron transport in Propionibacterium shermanii. Effects of cyanide // Adv. Microbiol. 1980. V. 126. P. 167-173.

99. Pritchard G.G., Wimpenny J.W.T., Morris H.A., Levis M.W.A., Hughes D.E. Effects of oxygen on Propionibacterium shermanii grown in continuous culture //J. Gen. Microbiol. 1977. V. 102. N 1. P. 223-233.

100. Riedel K.-H. J., Wingfield B.D., Britz T.J. Justification of the "classical" Propionibacterium species consept by analysis of the 16S ribosomal RNA genes" // System. Appl. Microbiol. 1994. V. 17. P. 536-542.

101. Rolfe D. The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health. //JNutr. 2000 V. 130 (2S Suppl). P.396S-402S. Review.

102. Rossi F. Peptidases of Propionibacterium freudenreichii: occurence and expression in cheese // 3-rd Int. Symp. on Propionibacteria. Zurich, Switzerland. 8th-11th July 2001. Abstract Book. S2. P. 8.

103. Sahl H.-G. Pore formation in bacterial membranes by cationic lantibi-otics. In: Nisin and novel lantibiotics. Ed. by Jung G., Sahl H.-G., Escom, Leiden, The Netherlands, 199LP. 347-358.

104. Schwartz A.C. Anaerobiosis and oxygen consumption of some strains of Propionibacterium and a modified method of comparing the oxygen sensitivity of various anaerobes // Zeitschrift Allgemeine Mikrobiologie. 1973. V. 13. P. 681-691.

105. Schwartz A.C., Sporkenbach J. The electron transport system of the anaerobic Propionibacterium shermanii. Cytochrome and inhibitor studies. // Arch. Microbiol. 1975. V. 102. P. 261-273.

106. Skrinjar M, Danev M, Dimic G. Interactive effects of propionic acid and temperature on growth and ochratoxin a production by Penicillium auran-tiogriseum // Folia Microbiol (Praha). 1995. V. 40. N. 3. P. 253-256.

107. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: A place for DNA-DNA re-association and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994, V. 44. N 4. P. 846-849.

108. Suhr KI, Nielsen PV. Effect of weak acid preservatives on growth of bakery product spoilage fungi at different water activities and pH values // Int. J. Food Microbiol. 2004. V. 95. N. 1. P. 67-78.

109. Suomalainen Т.Н., Mayramakinen A.M., Propionic-acid bacteria as protective cultures in fermented milks and breads. //Lait. 1999. V. 79. № 1. P. 165-174.

110. Tannock G.W. Intestinal microbiota and probiotics /Proc. Int. Symp. on Propionubacteria and Bifidobacteria: dairy and probiotic application. (INRA-STANDA INDUSTRIE, 2004). France. Saint-Malo, June 2st-4th 2004. Session 3-1. Presentation 1400.

111. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Applic. Biosci. 1994. V. 10. P. 569-570.

112. Vinokurov K.S., Elpidina E.N., Oppert В., Prabhakar S., Zhuzhikov D.P., Dunaevevsky Y.E., Belozersky M.A. название // Сотр. Biochem. Physiol. 2006. B145. S. 126-137.

113. Vorobjeva L. Physiological peculiarities of propionibacteria present facts and prospective applications //Science Progress. 2000. V. 83. N 3. P. 277-301.

114. Warminska-Radyko I., Laniewska-Moroz L., Babuchowski A. Possibilities for stimulation of Bifidobacterium growth by propionibacteria // 3-d Int. Symp. on Propionibacteria. Switzerland. 8-11 July 2001. ETH Zurich. Abstract Book. S-13.P. 21.

115. Warminska-Radiko I., Laniewska-Moroz L., Babuchowski A. Possibilities for stimulation of Bifidobacterium growth by propionibacteria // Lait.1732002. V. 82. N. l.P. 113-121.

116. Yamazaki S., Капо К., Ikeda Т., Isawa К., Капеко Т. Mechanistic study on the roles of a bifidogenetic growth stimulator based on physico-chemical characterization // Biochim. Biophys. Acta, General subjects. 1998. V. 1425.N.3. P. 516-526.

117. Ye K.V., Shiojo V., Miyano R., Shimzu K. Metabolic pathway of Propionibacterium growing with oxygen // Biotechnology Progress. 1999. V. 15. N. 2. P. 201-207.

118. Zarate G, Morata de Ambrosini VI, Chaia AP, Gonzalez SN. Adhesion of dairy propionibacteria to intestinal epithelial tissue in vitro and in vivo // J. Food Prot. 2002. V. 65. N 3. P.534-539.