Природные антитела, реагирующие с гистонами: Вероятная роль в патогенезе радиационных нарушений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.01, кандидат биологических наук Абакушин, Дмитрий Николаевич

• Абакушин, Дмитрий Николаевич
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Абакушин, Дмитрий Николаевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Интерфазная клеточная гибель вызванная

радиацией

1.2 Природные антитела

1.3 Антигистоновые антитела_______________________________________25

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Оборудование и принадлежности

2.2 Препараты и реактивы

2.3 Определение концентрации белка

2.4 Фракционирование комплексов гистон-иммуноглобулин

с помощью гель-фильтрации на Сефакрил 8-200____________________________36

2.5 Электрофорез

2.6 Приготовление меченой тритием нативной ДНК____________________________37

2.7 Определение связывания белок-ДНК радиоиммунологическим методом (тест Фарра)

2.8 Определение антигистоновых антител методом твердофазного иммуноферментного анализа

2.9 Идиотипирование препаратов иммуноглобулинов

2.10 Определение связывания иммуноглобулинов с ДНК

методом твердофазного иммуноферментного анализа

2.11 Определение связывания иммуноглобулинов с фосфолипидами методом твердофазного

иммуноферментного анализа

2.12 Действие природных антител и их комплексов с гистонами

на систему свёртываемости крови

2.13 Выделение тимоцитов, их инкубация и окрашивание

2.14 Проточная цитофлуориметрия

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Антигистоновая активность препаратов нормальных иммуноглобулинов и сывороток

крови здоровых индивидуумов

3.2 Действие ионизирующей радиации на изменение антигистоновой, анти-ДЕЖ и антилипополисахаридной активности сывороток крови животных

3.3 Добавление гистонов к препаратам нормальных иммуноглобулинов и сывороткам крови здоровых доноров придает им новые антигенсвязывающие

свойства

3.4 Выделение комплексов иммуноглобулинов с

гистонами и определение их свойств

3.5 Цитотоксичность гистонов и защитная роль

природных антител, реагирующих с гистонами

3.6 Влияние комплексов гистонов с природными

антителами на систему свертываемости крови in vitro

Глава IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Природные антитела, реагирующие с гистонами: Вероятная роль в патогенезе радиационных нарушений»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

В последние годы уделяется значительное внимание природным антителам. Природными называются антитела, циркулирующие в крови здоровых индивидуумов и продуцируемые в отсутствии открытой специфической антигенной стимуляции (Coutinho et al., 1995). Как известно, до 55% всех иммортализованных В-клеток вырабатывают природные антитела (Nakamura et al., 1988). Характерная черта природных антител - их полиспецифичность и способность взаимодействовать с различными заряженными клеточными структурами (Avrameas, Ternynck, 1995). На долю таких полиспецифичных природных антител, способных реагировать с собственными антигенами, приходится до 66% всех IgG, присутствующих в индивидуальных сыворотках крови (Avrameas, Ternynck, 1993). В нормальных физиологических условиях природные антитела связываются с рядом патогенных агентов. Связывание облегчается тем, что поверхность этих агентов, в основном, отрицательно заряжена и несет повторяющиеся антигенные мотивы. Активные сайты природных антител также положительно или отрицательно заряжены. Как правило, природные антитела реагируют с такими антигенами, как ДНК, кардиолипин, белки цитоскелета, ядерные белки. Природные антитела связываются с патогенными агентами, определяя опсонизацию последних и фагоцитоз (Navin et al., 1989). Действительно, по мнению Пьера Грабаря (Grabar, 1975), основной функцией природных антител является освобождение организма от продуктов катаболизма и антигенов, высвобождаемых вследствие клеточной гибели. Это предположение было экспериментально подтверждено в ряде работ (Witz et al., 1984; Chow, Bennet, 1989; Lutz,

1990). С этой точки зрения представляет особый интерес роль природных антител в патогенезе радиационных нарушений, отличительными чертами которых являются клеточный распад, эндотоксинемия. Особый интерес представляют гистоны, являющиеся продуктом распада клеток и обладающие выраженной биологической активностью (Voll et al., 1997). Неисследованным остается вопрос о способах элиминации их из биологических жидкостей. Наряду с этим известно, что имеются природные антитела способные реагировать с гистонами.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является исследование эффектов природных антител, реагирующих с гистонами, на патогенез радиационных нарушений.

В задачи исследования входили:

■ Разработка методов детекции антигистоновых антител, а также метода выделения их искусственных комплексов с гистонами, изучение роли таких комплексов в формировании полиспецифичности природных антител;

■ определение спектра перекрестных реакций антител в комплексе с гистонами и их свойств; влияние на изменения в процессах свертываемости крови;

■ изучение действия ионизирующего излучения на уровень природных антител, реагирующих с гистонами, в сыворотках крови животных;

■ влияние природных антител, реагирующих с гистонами, на цитотоксические свойства гистонов.

Научная новизна.

■ Впервые показано, что природные антитела, реагирующие с гистонами, широко распространены и их можно обнаружить в пуле нормальных человеческих иммуноглобулинов и сыворотках крови здоровых индивидуумов;

■ впервые получены данные о том, что гистон может выполнять роль кофактора и принимать участие в формировании полиспецифичности антител, был выделен искусственный комплекс иммуноглобулинов с гистонами и исследованы его антигенсвязывающие свойства и влияние на систему гемостаза;

■ показано, что после действия ионизирующего излучения происходит уменьшение содержания природных антител, реагирующих с гистонами, в сыворотках крови облученных животных; рассмотрено значение этого феномена в патогенезе радиационных нарушений;

■ показана способность природных антител, реагирующих с гистонами, уменьшать цитотоксические свойства гистонов.

Практическая и теоретическая значимость работы.

Приводимые данные имеют важное значение для понимании механизма регуляции активности природных аутоантител и расширяют представления о способах регуляции гуморального иммунитета, так как показывают возможность кофакторного, опосредованного через гистон, взаимодействия иммуноглобулинов с лигандами и ставят вопрос о роли такого взаимодействия в генезе ряда проявлений радиационных синдромов и патогенезе аутоиммунных заболеваний.

Модификация метода определения антигистоновых антител в человеческих сыворотках крови, разработанная в ходе выполнения работы, применяется в лаборатории радиационной биохимии Медицинского Радиологического Научного Центра РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В препаратах нормальных иммуноглобулинов и сыворотках крови здоровых индивидуумов присутствуют природные антитела, реагирующие с гистонами.

2. Гистон, связываясь с иммуноглобулинами, может выступать в роли кофактора, определяющего способность природных антител реагировать с ДНК, фосфолипидами и пр. Таким образом, можно объяснить полиспецифичность некоторых природных антител.

3. Природные антитела, реагирующие с гистонами, уменьшают цитотоксичность гистонов, которые могут попадать в биологические жидкости вследствие клеточной деструкции, вызванной ионизирующим излучением.

4. Комплексы природных антител с гистонами могут быть причиной нарушения гемостаза и некоторых других проявлений радиационных нарушений.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Интерфазная клеточная гибель вызванная радиацией.

Начальное повреждение молекул, вызванное действием радиации, во всех типах клеток, по-видимому, сходно. Однако клеточная гибель может быть подразделена на два основных типа, интерфазную и репродуктивную. Типичным проявлением действия на организм сравнительно небольших доз ионизирующей радиации является интерфазная клеточная гибель. Особенно важно понимание механизмов и биологического значения интерфазной гибели, определяющей костномозговой синдром. Именно с радиационными изменениями в системе кроветворения чаще всего приходится встречаться на практике, так как при облучении в дозах до 10 Гр в организме развивается типичный костно-мозговой синдром. Опустошение костного мозга начинается тотчас после облучения и неуклонно продолжается, достигая минимума, что соответствует его регенерации у выживших особей.

Интерфазная гибель характерна для неделящихся клеток, таких как малые лимфоциты, молодые ооциты; и медленно делящихся клеток, таких как клетки печени, нервные клетки, ретикулоэндотелиальные клетки в составе лимфатических узлов и тимуса. Интерфазная гибель некоторых клеточных популяций наступает от воздействия небольших доз радиации в течение нескольких часов, для нее характерна несигмоидальная кривая выживания, и она не связана с клеточным делением.

Интерфазная гибель также известна под другими названиями, такими как немитотическая гибель, гибель без деления, и немедленная гибель (Тго\уе11, 1966). Различают три типа интерфазной гибели. Первый тип - интерфазная гибель неделящихся клеток и/или клеток с

ограниченной способностью к делению, таких как малые лимфоциты и тимоциты. Такая гибель встречается после облучения клеток малыми дозами радиации (несколько десятков Рад). Второй тип - интерфазная гибель неделящихся клеток, таких как зрелых нервных или мышечных клеток, и медленно делящихся клеток, таких как клетки печени. Гибель этих клеток встречается только после облучения большими дозами радиации (от нескольких до нескольких десятков КРад). Третий тип, который, возможно, подобен второму типу, является интерфазной гибелью делящихся клеток, таких как, например, культивируемых клеток млекопитающих, после облучения большими дозами радиации. Иногда выделяют четвертый тип, при котором делящиеся клетки погибают в интерфазе через несколько часов после облучения в дозах в несколько сотен Рад, то есть, перед первым митозом и после одного или несколько митозов. Несмотря на гибель в интерфазе, этот четвертый тип все же не относят к интерфазной гибели и рассматривают как один из типов репродуктивной клеточной гибели.

Понимание механизмов интерфазной гибели очень важно для радиобиологии, так как эта форма гибели имеет определяющее значение в радиационно-индуцированной гибели животных. Так опустошение костного мозга при развитии костно-мозгового синдрома вызвано интерфазной гибелью малых лимфоцитов и тимоцитов, а другой тип гибели, известный как "гибель центральной нервной системы", прежде всего вызван интерфазной гибелью нервных клеток.

Большинство лимфоцитов гибнет в интерфазе при малых дозах радиации и их гибель сопровождается различными биохимическими изменениями, в том числе высвобождением ядерных компонентов: хроматина, нуклеосом, гистонов. Так, при облучении крыс общей дозой 10 Гр, максимальное уменьшения содержания гистонов, а также ДНК и глобулинов в ядрах тимоцитов и клеток селезенки наблюдается через 24

часа после воздействия радиации.

В тимоцитах in vitro и in vivo после облучения дозами от 5 до 15 Гр происходят следующие биохимические изменения (Okada, 1970).

Через 0-1 час наблюдаются следующие изменения: потеря клеточного и ядерного К, высвобождение гистонов из ядра, уменьшение клеточного и ядерного NAD (никатинамидадениндинуклеотид), снижение ядерного фосфорилирования, вязкости ДНК, митохондриального окислительного фосфорилирования, уменьшение лабильного фосфата или АТФ в клетках и ядре; увеличение вязкости белков ДНК, увеличение ядерного белкового синтеза, увеличение экстрагируемой или растворимой ДНК, ядерных групп SH, лактации, а также появление пикнотических ядер.

Через 1-2 часа происходит снижение ядерного белкового синтеза, уменьшение количества внутриклеточных рибонуклеозидов и дезоксирибозидов, внутриклеточных и ядерных ферментов.

Через 2-4 часа можно зафиксировать уменьшение скорости потребления кислорода.

Одним из важных проявлений интерфазной гибели клетки наблюдаемых в этот период времени является нарушение проницаемости ее мембран. Клеточные, ядерные, и митохондриальные мембраны, и т.д., разделяют клетку и играют важная роль в регулировании клеточных функций. Нарушение проницаемости любой мембраны может приводить к смещению молекул от одного компартмента к другому, таким образом нарушая различные метаболические процессы. Серьезные повреждения такого типа могли бы вызывать интерфазную гибель.

Биохимические изменения, которые происходят в клетке после облучения ведут к повреждениям трех основных мембранных системах - (1) в ядерных мембранах - к потере К+ и высвобождению гистонов и

других ферментов из ядра; (2) в митохондриальных мембранах - к подавлению окислительного фосфорилирования; и (3) в клеточных мембранах - к уменьшению клеточного К+, и нуклеозидов.

В 1952 году появились сведения о том, что общее облучение тела крыс подавляло митохондриальное окислительное фосфорилирование в клетках селезенки. В 1957 появились данные о том, что низкие дозы радиации быстро подавляли фосфорилирование в ядрах клеток тимуса и селезенки. Депрессия ядерного фосфорилирования является важной причиной гибели клетки: В эту пользу свидетельствует то, что ядерное фосфорилирование подавляется при облучении только в радиочувствительных клетках, в которых наблюдается интерфазная клеточная гибель, но не в радиорезистентных клетках, таких как клетки печени, почек и некоторых лимфосарком (Klouwen et al., 1966); лучевое подавление ядерного фосфорилирования можно обнаружить раньше чем любое другое биохимическое изменение, включая снижение уровня NAD и депрессии митохондриального окислительного фосфорилирования (Klouwen et al., 1966).

Установлено, что все биохимические повреждения в облученных лимфоцитах являются до некоторой степени связанными, и формируют дефектный цикл, который дезорганизует структуру и функцию клеток и вызывает их гибель.

Однако, необходимо подчеркнуть, что некоторые из наиболее важных вопросов, связанных с механизмом интерфазной гибели все еще ждут ответа. Производство облученным лимфоцитом меньшего количества АТФ, чем необходимо для его потребности, или уменьшение фосфорилирование в ядрах и митохондриях in vitro являются ли действительно причинами или только признаками интерфазной гибели? Вызывается ли немедленная депрессия инкорпорации радиоактивных предшественников уменьшением скорости синтеза ДНК, изменениями в

метаболизме предшественников, или деградацией ДНК, разбавляющей пулы предшественника? Являются ли повреждения, которые нарушают синтез ДНК в клетках находящихся не в Б-фазе такими же как в клетках, находящихся в Б-фазе? Каково значение таких повреждений во многих малых лимфоцитах, которые находятся не в Б-фазе и представляют большую часть клеток, гибнущих в интерфазе в лимфоидных органах? Как репарация ДНК связана с интерфазной гибелью? Почему лимфоциты чаще гибнут в интерфазе, чем другие неделящиеся клетки, например, клетки печени? Можно ли объяснить эти различия меньшим количеством митохондрий и меньшим количеством цитоплазмы в лимфоцитах?

За гибелью лимфоцитов следуют промежуточные и отдаленные последствия действия радиации. Лизосомальные ферменты в клетках ретикулярной ткани и макрофагах остаются активизированными и разрушают нуклеиновые кислоты и белки лимфоцитов. Погибшие лимфоциты удаляются с помощью фагоцитоза и затем исчезают полностью. Таким образом, клеточный состав лимфоидного органа сильно изменяется, что связано с действием различных факторов.

Остается неясным вопрос о механизмах дезорганизации ядерного материала в клетках гибнущих в интерфазе под действием облучения. Рябченко Н.И. и др. показано, что такой ингибитор белкового синтеза, как циклогексимид, ингибирует распад хроматина и деградацию ДНК, а также снижает уровень повреждения ультраструктуры ядер в облученных клетках (Александрова др., 1988; Иванник и др., 1976; Иванник и др., 1980).

Таким образом, три основных фактора, то есть снижение синтеза АТФ, изменение мембранной проницаемости и распад ядра, как полагали ранее, так или иначе вовлечены в процесс гибели клетки. Однако выяснения механизма интерфазной гибели требует дальнейших

исследований.

Не вызывает сомнений, что молекулярный механизм интерфазной гибели во многом схож с механизмом, вызывающим апоптоз (Crompton, 1998). Возможно, под влиянием ионизирующих излучений, как и других повреждающих агентов, реализуется заложенная в лимфоцитах генетическая программа интерфазной гибели. Поэтому проблема апоптической гибели клеток является одной из наиболее важной для выяснения механизмов интерфазной гибели.

В соответствии с современными представлениями, митохондрии, производящие энергию клеточные органеллы, играют центральную роль в генезе апоптоза, или программированной клеточной гибели (Zhivatovsky et al., 1998).

Недавно были очищены три фактора, активирующие апоптотические протеазы (Apaf-1-З). Один из них, Apaf-2, был идентифицирован как цитохром С. Предположили, что митохондрия могла выделять цитохром С и это является важной причиной развития апоптоза. Наоборот, Bcl-2 играет подавляющую роль в транслокации цитохрома С, и предотвращает активацию цитозольных каспаз и развитие апоптоза.

Авторы использовали технику микроинъекций для того, чтобы ввести цитохромом С в различные типы клеток (адренокортикальные Y-1 опухолевые клетки, нормальные эпителиальные клетки почек крысы (NRK), мышиные зародышевые Swiss ЗТЗ фибробласты и крысиные промиелоцитические IPC-81 клетки). Во всех этих системах, цитохром С был способен вызывать в клетках апоптоз, который имел характерную дозовую зависимость, а также являлся каспаз-зависимым. Гибель клеток наступала через 30-45 минут после инъекции.

Оказалось, что клетки, гиперэкспрессирующие Bcl-2 являлись более устойчивыми к введения цитохрома С. Вероятно, что защитная

роль Bcl-2, локализованного в митохондриях, связана с предотвращением утечки цитохрома С из митохондрий. Микровведение цитохрома С в клетку заменяет потребность в выходе этого белка из митохондрий. Однако, клетки гиперэкспрессирующие Bcl-2 были также защищены от апоптоза, индуцированного введением цитохрома С. Это можно объяснить тем, что Bcl-2 не ограничен исключительно митохондриальной мембраной, следовательно некоторые анти-апоптотические свойства могут проявляться и вне митохондрий.

Особого обсуждения заслуживает вопрос о биологических эффектах, связанных с выходом в межклеточное пространство продуктов распада ядра. Имеются данные о токсических свойствах, которыми обладают гистоны.

В 1998 году было показано, что продукты апоптоза, возникающего под действием ионизирующего излучения, являются причиной развития в организме различных аутоиммунных процессов (Mevorach et al., 1998).

Было показано, что гистон цитотоксичен, а также может обусловливать цитотоксические и патогенные свойства ряда субстанций. Показано, что гистоны увеличивают мембранную ионную проницаемость и цитотоксичны для клеток кишечного эпителия (Kleine et al., 1995). Под действием гистона Н1 может также происходить диссоциация цитохрома С из липосом (Rytomaa, Kinnunen, 1996), который в свою очередь сам, как было приведено выше, способен активизировать запуск апоптоза.

Наряду с этим было показано, что существует популяция Т-лимфоцитов, относящихся к Т-хелперам, которая является гистон-специфичной и после обработки ее аутологичным апоптотическим клеточным материалом или очищенными гистонами стимулирует продукцию различных антител, в том числе к двунитевой ДНК, играющим важную роль в генезе аутоиммунных заболеваний (Voll et al.,

1997).

Какова же судьба попавших в межклеточное пространство продуктов распада?

Известно, что в крови здоровых индивидуумов присутствуют так называемые природные антитела, одной из функций которых, по мнению П. Грабаря, является связывание и удаление из организма различных продуктов катаболизма (Grabar, 1975; Grabar, 1983). Как считает этот автор, природные антитела играют важную роль в защите организма от его собственных продуктов распада, обладающих токсическими свойствами. Одним из основных продуктов распада ядра при интерфазной гибели клетки, вызванной действием ионизирующей радиации, как указывалось, являются гистоны, высвобождение которых наступает в самые ранние сроки после облучения.

1.2 Природные антитела.

Природными называются антитела, циркулирующие в крови здоровых индивидуумов и продуцируемые в отсутствие открытой специфической антигенной стимуляции (Coutinho et al., 1995). Термин "природные аутоантитела" впервые применил Бойден, который суммировал более ранние сообщения об аутоактивности в сыворотках здоровых индивидуумов (Boyden, 1965). Первоначально, присутствие этих антител связывали с неизвестными антигенными триггерами или субклиническими инфекциями. Однако, теперь широко известно, что природные антитела формируются независимо от присутствия антигена. Природные аутоантитела IgM, IgG и IgA классов, реагирующие с различными сывороточными белками, клеточной поверхностью и внутриклеточными структурами, обнаружены у здоровых индивидуумов. По литературным данным до 55% всех иммортализованных вирусом Эпштейн-Барра В-клеток секретируют природные антитела IgM, IgG и IgA типов, реагирующие с разнообразными собственными и чужеродными антигенами (Nakamura et al., 1988).

Так, в плазме и сыворотке крови здоровых людей были обнаружены антитела, реагирующие с тубулином, актином, тироглобулином, миоглобином, фетуином, трансферрином, альбумином, цитохромом С и коллагеном (Guilbert et al., 1982; Avrameas et al., 1983), фибробластами, ДНК (Rubin, Carr, 1979; Mach et al., 1984), а также со структурами тканей центральной и периферической нервной системы (How et al., 1985; Hoffman, Madsen, 1990; Hanly, Hong, 1993). По-видимому, в сыворотке крови здоровых людей могут быть обнаружены природные аутоантитела практически к любому антигену, и при этом природные аутоантитела могут иметь как высокую авидность, сходную

со специфичностью аутоантител, определяемых при аутоиммунных заболеваниях, так и низкую, отличающуюся от таковой при патологиях.

Нет никаких существенных различий между природными аутоантителами и природными антителами, так как природные антитела, реагирующие с различными чужеродными антигенами, также были способны связывать собственные антигены (Dighiero et al., 1987). По меньшей мере 20% всех иммуноглобулинов можно отнести к полиреактивным природным антителам (Berneman et al., 1992).

Примечательно, что спектры природных антител в различных сыворотках крови здоровых людей индивидуальны и могут быть отчасти уподоблены "отпечаткам пальцев". Так, с помощью иммуноблоттинга было продемонстрировано, что все сыворотки крови как здоровых людей, так и больных системной красной волчанкой, содержат природные антитела, распознающие значительное количество белков из гомогенатов ткани надпочечников, мозга, сердца, почек, печени, легких и тимуса крысы, а также из клеток HeLa, причем некоторые из полос были тканеспецифичными (Shapiro et al., 1991). Индивидуальность спектра природных антител и природных аутоантител была устойчива во времени и практически не менялась на протяжении полугода, а для нескольких исследованных сывороток была идентична в течение 4-8 лет по отношению к антигенам клеток HeLa. Интересно, что индивидуальность спектров природных антител была выражена даже в сыворотках крови близнецов, что позволяет предположить их нестрогую генетическую детерминированность (Francoeur, 1988; Francoeur, 1989). При кратковременных заболеваниях спектры природных антител в сыворотках крови одних и тех же людей не менялись, а в случае развития у одного пациента аутоиммунного васкулита картина претерпела изменения (Shapiro et al., 1991).

Столь широкая распространенность и индивидуальная

выраженность природных антител как здоровых, так и больных, страдающих аутоиммунными заболеваниями, свидетельствует, по-видимому, о многочисленности В-клеток-антителопродуцентов, способных секретировать природные антитела.

Опыты на клетках in vitro в целом соответствовали данным, полученным в экспериментах на животных in vivo. При сравнении частот появления клеток, способных производить антитела, реагирующие с ДНК, у здоровых и аутоиммунных мышей было показано, что приблизительно один из 500 спленоцитов может синтезировать антитела, реагирующие с ДНК (Pisetsky, Caster, 1982).

Эти результаты свидетельствуют о том, что клетки селезенки как аутоиммунных, так и нормальных мышей способны производить природные аутоантитела, что в свою очередь говорит, по-видимому, о том, что аутоиммунный процесс связан не с перепроизводством популяций клеток, продуцирующих природные аутоантитела, а с нарушением механизмов активации и/или регуляции их синтеза.

Вопрос о взаимосвязи антител, выявляемых при патологических состояниях, и природных аутоантител представляет несомненный интерес и является предметом исследований. Возможно, эти два типа антител в общем случае являются различными по свойствам иммуноглобулинами, однако, в ряде случаев они, вероятно, взаимосвязаны и, возможно, имеют общее происхождение.

Несомненно, существуют ситуации, когда природные аутоантитела и патологические аутоантитела не имеют существенных различий. Так было показано, что аутоантитела, реагирующие с ДНК, выделенные из сывороток крови нормальных людей, способны перекрестно реагировать с рядом антигенов (белки, полисахариды, фосфолипиды) и имеют идиотипические маркеры, аналогичные маркерам аутоантител, связывающим ДНК и характерных для системной красной волчанки

(Madaio et al, 1986).

Важной особенностью природных антител является их полиспецифичность. Эксперименты, проведенные на моноклональных антителах, продуцированных гибридомами, продемонстрировали, что антитела, реагирующие с ДНК, были полиспецифическими, имели распространенные идиотипические маркеры, а гены, кодирующие их, имели немутировавшие сегменты, аналогичные сегментам генов индуцированных антител (Rubin et al., 1984; Naparstek et al., 1986; Schwartz, 1986). В ряде других исследований на моноклональных антителах, полученных от мышей с индуцированными аутоиммунными расстройствами, была показана полиреактивность антител по отношению к тканям различных органов. Показано, что лимфоциты, синтезирующие такие антитела, исходно принадлежат к нормальному спектру В-клеток здорового организма (Satoh et al., 1983; Notkins, Prabhakar, 1986).

Действительно, многочисленные исследования свидетельствуют о полиспецифичности природных аутоантител, способных связывать антигены, имеющие структурно похожие, но не идентичные эпитопы (Lafer et al., 1981; Koike et al., 1982; Avrameas et al., 1983; Brinkman et al., 1989; Naparstek et al., 1990). Важная характерная черта - способность реагировать как с собственными, так и чужеродными антигенами (Avrameas et al., 1983; Avrameas 1988; Tomer, Shoenfeld 1988; Schwartz, Datta 1989).

Эксперименты показали, что полиреактивность обусловлена Fab фрагментом (Poncet et al., 1988). С другой стороны, возможно, полиреактивность природных аутоантител связана с образованием иммунных комплексов (Brinkman et al., 1989). Как утверждают авторы, формирование иммунных комплексов обуславливает

полиспецифичность в иммунологических реакциях. Например,

моноклональные анти-ДНК антитела, после обработки ДНК-азой перекрестно реагировали с гистонами, а после удаления иммунных комплексов, теряли способность связывать гистоны, но сохраняли способность связывать ДНК. Авторы предполагают, что анти-ДНК антитела могут связывать также и комплексы ДНК с гистонами в кровяном русле.

Однако кросс-реактивность определяется и у тщательно аффинно-очищенных антител.

Механизм(ы) полиреактивности природных аутоантитела до конца не ясен(ы). Несколько исследований показали, что природные аутоантитела могут реагировать с углеводными или гликолипидными детерминантами на антигене (Feizi 1985, Hayakawa et al., 1990, Poncet et al., 1988). Подобные углеводные структуры могли бы быть экспрессированы на различных антигенах, так что природные антитела реагируют со структурно схожими эпитопами. Было предложено четыре возможных механизма: (1) - присутствие множественных паратопов на молекуле антитела позволяет реагировать с различными антигенными детерминантами (эпитопами); однако, аффинность различных эпитопов к их паратопам может быть идентична или различна; (2) - паратоп антитела реагирует специфично с определенным антигеном, а связывание с другими антигенами определяется белок-белковыми взаимодействиями между функциональными группами антигена и другими, экспонированными на поверхности молекулы антитела, группами; (3) - несколько антигенов связывают неспецифично олигосахаридные остатки молекулы антитела; наличие высокого процента в IgM природных аутоантителах поддерживает эту гипотезу, так как 10-12 % структуры IgM представлена углеводными остатками (по нашему мнению, этот механизм вряд ли можно применить к понятию "полиреактивность", поскольку речь идет о возможности

иммуноглобулинов взаимодействовать с какими-либо соединениями, а не об образовании истинного иммунного комплекса); (4) -неспецифическое связывание различных антигенов с антителом может быть обусловлено различными силами, типа ван-дер-Вальсовых, гидрофобных, и т.д. (Monestier, Bonna, 1988)

Можно предположить, что продукция природных аутоантител и развитие аутоиммунного процесса связаны с существующим в нормальном организме набором аутореактивных В-клеток, который может быть сильно расширен и активирован с помощью поликлональных стимуляторов, например липополисахаридов или протеогликанов (Fournie et al., 1974).

Возможно этим можно объяснить повышение содержания аутоантител у людей с возрастом, относя этот факт к кумулятивному эффекту различных инфекций. Частично расширение спектра природных аутоантител объясняется перекрестными реакциями антител, первоначально синтезированных в ответ на чужеродный антиген. В ряде работ было показано, что некоторые вирусы, бактерии и паразитирующие организмы способны усиливать образование аутоантител. Предполагалось, что по такому пути могут развиваться аутоиммунные заболевания, такие, как системная красная волчанка и др. (Fournie et al., 1974; Izui et al., 1977).

По поводу биологической роли природных аутоантител также существует несколько гипотез.

Хронологически первая концепция, объясняющая роль природных аутоантител, была выдвинута в 70-х годах Пьером Грабарем. Она состоит в том, что аутоантитела представляют собой часть физиологического механизма очистки организма от собственных и чужеродных вредных продуктов (Grabar, 1975). Грабарь рассматривает иммуноглобулины, не как специфичную систему защиты, а скорее как

физиологический механизм для очистки организма от вредных собственных и чужеродных веществ благодаря связыванию природными аутоантителами поврежденных или деградированных аутологичных тканей, что облегчает их опсонизацию и последующий фагоцитоз. В такой ситуации иммуноглобулины, связывающие продукты катаболизма постороннего происхождения, рассматривались как классические антитела, а иммуноглобулины, реагировавшие с продуктами катаболизма собственных структур организма, являлись аутоантителами.

Несколько исследований подтвердили эту гипотезу. Галили и др. сообщили о присутствии в сыворотках здоровых людей природных аутоантител, реагирующих с а-галактозильными остатками человеческих эритроцитов (Galili et al., 1984). Такие антитела играют важную роль при фагоцитозе дефектных эритроцитов. Недавно, было обнаружено, что природные аутологичные IgG участвуют в элиминации стареющих эритроцитов, они формируют иммунные комплексы, которые можно обнаружить в кровообращении (Lutz et al., 1987). Природные аутоантитела могут участвовать в выведении продуктов распада клеток in vivo (Heegaard, 1990). Не так давно показано, что природные IgG анти-кератиновые антитела увеличивают элиминацию кератина после гибели кератиноцитов (Hinter et al., 1987).

Наряду с этим установлено, что природные IgM аутоантитела увеличивают устойчивость животных к росту опухолей и могут оказывать свое защитное действие посредством схожего механизма (Witz et al., 1984; Chow, Bennet, 1989). Известно, что мышиные сыворотки и, возможно, большинство нормальных сывороток содержат природные IgG антитела, которые реагируют с различными антигенами клеточной поверхности, такими как главный комплекс гистосовместимости класса I и II (МНС I; МНС II), CD3, CD4, CD8 и

рецептором Т-клеток (Вегпешап е! а1., 1992). Но в нормальных физиологических условиях эти 1§0 не способны связываться с клеточной поверхностью, и только лизаты клеток или видоизмененные клетки экспрессирующие, по-видимому, дополнительные скрытые эпитопы способствуют связыванию что приводит к элиминации из организма видоизмененных клеток и их продуктов распада.

1.3 Антигистоновые антитела.

До недавнего времени считалось, что антигистоновые антитела можно обнаружить лишь при патологических состояниях и они являются маркерами ряда аутоиммунных заболеваний, в частности, лекарственно-индуцированной системной красной волчанки.

Впервые аутоантитела, реагирующие с гистонами, были обнаружены в сыворотке крови пациентов с системной красной волчанкой в 1960 году (Kunkel et al., 1960).

Существует целый ряд патологических состояний, при которых в сыворотке крови больных обнаруживаются эти аутоантитела, причем в одних случаях сам процесс можно объяснить их присутствием, т.е. он является следствием воздействия аутоантител на организм, а в других аутоантитела могут быть не связаны напрямую с заболеванием, т.е. не являются патогенетическим фактором, но служат маркерами таких болезней.

В случае системных аутоиммунных заболеваний - системной красной волчанки, ревматоидного артрита, болезни Шегрена, склеродермии, полимиозита обнаруживаются аутоантитела, реагирующие (часто перекрестно) с большим набором внутриклеточных и даже внутриядерных антигенов: ДНК, РНК, гистонами, рибонуклеопротеидами, белками центромер, ферментами - РНК и ДНК полимеразами, топоизомеразой, тРНК синтетазой и др. (Koffler et al., 1971; Tan, 1982; Andre-Swartz et al., 1984; Faaber et al., 1984; Eilat, 1985; Darwin et al., 1986; Eilat, 1986; Mamula et al, 1986; Dighiero et al., 1987; Kalunian et al., 1989; Subiza et al., 1989; Minota et al., 1990; Chan et al., 1991). Некоторые из них могут участвовать в патологическом процессе через образование иммунных комплексов, однако в большинстве случаев аутоантитела нельзя напрямую соотнести с патогенетическим

механизмом. В этом случае определение уровней этих аутоантител можно использовать в качестве диагностических маркеров, ассоциированных с определенными клиническими синдромами.

Так, высокий уровень антигистоновых антител обнаружен у людей с лекарственно-индуцированной волчанкой (Fritzler, Tan, 1978; Gohill, Fritzler, 1987; Gohill et al., 1985) или спонтанной системной красной волчанке (Ait-Kaci et al., 1981; Gioud et al., 1982; Costa, Monier, 1983; Costa, Monier, 1986; Konstantinov et al., 1986). Антигистоновые антитела обнаружены у 59% пациентов с системной красной волчанкой (Olhoffer et al., 1997) и способны реагировать со всеми типами гистонов (78,6% с Н2В, 60,7% с HI, 50,0% с НЗ, 35,7% с Н2А и 7,1% с Н4) (Jiang et al., 1992). При лекарственно-индуцированной волчанке выявляют антигистоновые антитела к Hl, (Н3-Н4)2, (Н2А-Н2В)-ДНК (Rubin, 1992; Monestier, Kotzin, 1992), а антитела к (Н2А-Н2В)-ДНК наблюдаются более чем у 90% пациентов и имеют серьёзный патогенетический потенциал (Burlingame, Rubin, 1996) и, несомненно, играют важную роль в патогенезе системной красной волчанки и развитии гломерулонефрита, который является одним из наиболее распространенных осложнений при этом заболевании (Elouaai et al., 1994). Однако лекарственно-индуцированные антигистоновые антитела не обязательно связаны с клиническими проявлениями системной красной волчанки. Так, у 35% больных туберкулезом, подвергнутых лечением изиниазидом, обнаружены антигистоновые IgA антитела. Это типичный лекарственно-индуцированный процесс без проявления заболевания схожего с волчанкой (Vazquez-Del Mercado et al., 1995).

Присутствие антигистоновых антител является биологическим маркером воспалительных процессов при ревматических заболеваниях (Hilliquin, 1995); антигистоновые антитела также обнаружены у пациентов с различными системными ревматическими заболеваниями

(Muller, Van Regenmortel, 1988). 75% детей с ювенильным ревматоидным артритом имели IgM антигистоновые антитела (Leak et al., 1993; Lawrence et al., 1993) и до 72% сывороток крови пациентов с хроническим ювенильным артритом показывали антигистоновую активность (Stemmer et al., 1995). Антигистоновые антитела также находят у пациентов, страдающих ревматоидными артритами, сочетающимися с увеитом (Rosenberg et al., 1996) или с васкулитом (Bernstein et al., 1985).

Антигистоновые антитела обнаружены у 47% пациентов страдающих локализованной склеродермией и 87% пациентов с распространенной очаговой склеродермией (Sato et al., 1993; Sato et al., 1994).

Любопытно, что у 75% пациентов с шизофренией и страдающих болезнью Альцгеймера наблюдался повышенный уровень антигистоновых антител (Chengappa et al., 1992; Spivak et al., 1995). Повышение уровня антигистоновых антител у людей с болезнью Альцгеймера может отражать повреждение проницаемости клеточных мембран и выход ядерных компонентов (Mecocci et al., 1993).

В 81% сывороток крови пациентов с первичным циррозом печени также были обнаружены антигистоновые антитела (Chou et al., 1995).

Повышенный уровень антигистоновых антител у пациентов с болезнью Крона коррелировал с проявлением заболевания (Reumaux et al., 1995).

Обнаружены множественные аутоантитела, в том числе антигистоновые анти-Н2А и анти-Н2В антитела, у пациентов с имплантированной силиконовой грудью (Barmeir et al., 1995) и у женщин с гиперпролактинемией (Buskila et al., 1995).

Антигистоновая активность вместе с общей множественной аутоиммунной реактивностью обнаружена у 55% идиопатически

инфертильных пар (Fichorova et al., 1996).

По наличию антигистоновых антител к Н2В, по мнению некоторых авторов, может производиться диагностика различных форм рака. Так, достоверное отличие от контрольной группы здоровых людей наблюдали у 37% пациентов с раком лёгких, 33% - с раком печени, 50% - с раком поджелудочной железы, 42% - с раком толстой кишки, 78% -с раком цервикального канала (Kamei et al., 1992).

Увеличение антигистоновых антител к Н2В по сравнению с контролем также коррелировало у пациентов с синдромом приобретенного иммунодефицита человека и эти антигистоновые антитела перекрестно реагировали с 18 кД антигеном на поверхности инфицированных или митоген-активированных CD4+ клеток. Возможно, антигистоновые антитела участвуют в разрушении популяции хелперов/индукторов Т-лимфоцитов (Williams et al., 1996).

Повышенный уровень антигистоновых антител выявлен также у здоровых людей старше 65-70 лет (Pandey et al., 1970; Lakatos et al., 1992-93; Xavier et al., 1995).

Антигистоновые антитела находят и у животных. В частности, они были обнаружены у 71% собак с системной красной волчанкой (Monier et al., 1992). Причем при волчанке у собак выявляются антигистоновые антитела к НЗ, Н4, Н2А и HI, но не к Н2В, Н2А-Н2В, (Н2А-Н2В)-ДНК или ДНК. В то время как у людей с системной красной волчанкой выявляются в основном антитела к ДНК и гистонам HI, Н2В и НЗ (Brinet et al., 1988). Антигистоновые IgG, а не анти-ДНК антитела отвечают за патогенез этого заболевания (Monestier et al., 1995).

Антитела к гистонам обнаружены у мышей с реакцией трансплантат против хозяина (Meziere et al., 1994; Portanova et al., 1985; Portanova et al, 1988; Rubin et al., 1990).

Наличие антигистоновых антител y 5% здоровых индивидуумов

позволило авторам предположить, что антигистоновые антитела вероятно принадлежат к природным антителам (Daar, Fabre, 1981; Gockel, Binder, 1985). Например, было обнаружено, что IgM связываются с гистонами как у здоровых людей, так и в гораздо большей степени у пациентов с инфекционным мононуклеозом. В двух группах антигистоновая IgM активность коррелировала с концентрацией IgM в сыворотке. Антигистоновые IgM антитела, по мнению Гарзелли, можно отнести к природным антителам и их увеличение в течение заболевания вызвано индукцией вирусом Эпштейна-Барр поликлональной В-клеточной активации (Garzeiii et al., 1992). Таким образом, наличие антител, реагирующих с гистонами, не обязательно сопутствует клиническим проявлениям системной красной волчанки и ряда других заболеваний. B-лимфоциты периферической крови здоровых доноров после обработки in vitro вирусом Эпштейна-Барр секретировали природные антитела, реагирующие с гистонами. В организме in vivo также может быть продукция антигистоновых антител вследствие поликлональной активации В-клеток без соответствующего антигена, то есть гистона (Garzeiii et al., 1994).

Представляло особый интерес рассмотреть некоторые свойства самих гистонов и возможные их изменения при взаимодействии с антителами. Кроме своего основного свойства - формирования нуклеосом, были исследованы и другие их свойства. Известно, что гистоны обладают слабой иммуногенностью и получение антигистоновых антител простой иммунизацией гистонами затруднительно (Stollar, 1978). Однако при иммунизации мышей ядерными антигенами вырабатываются анти-поликатионные антитела, такие как антигистоновые или анти-фибршшариновые (Monestier et al., 1997). Для получения антигистоновых антител используют комплекс гистонов с РНК или ДНК или нуклеосомные гистоны HI и Н5 в составе

нуклеосом. Антигистоновые антитела могут быть подразделены на те, которые связывают очищенный гистон и, которые реагируют с комплексом ДНК-гистон или интактным гистоновым октамером. Некоторые антитела способны перекрестно реагировать с IgG или со структурами на мембране клетки и могут стимулировать появление LE-клеток (Paul et al 1990).

В ряде работ было показано, что гистон цитотоксичен, а также может обусловливать цитотоксические свойства ряда субстанций. Под действием гистона HI может происходить разрушение липосом и выход из них цитохрома С (Rytomaa, Kinnunen, 1996). Например, цитотоксичность человеческой спермы на клетки эпителия млекопитающих можно объяснить цитотоксическим действием гистонов. Показано, что гистоны из спермы увеличивают мембранную ионную проницаемость клеток кишечного эпителия (Kleine et al., 1995).

Можно предположить, что цитотоксичность высвободившихся гистонов элиминируется связыванием их антигистоновыми антителами, но вполне вероятно, существуют и другие защитные механизмы. Так, у пациентов с болезнью Альцгеймера гистоны связываются специфично и с высокой аффинностью с секретеруемым предшественником ß-амилоидного пептида, тем самым происходит уменьшения цитотоксического действия гистонов (Currie et al., 1997).

Гистоны способны связываться с высокой аффинностью с анионными детерминантами гломерулярной базальной мембраны и принимают непосредственное участие в развитии гломерулонефрита (Schmiedeke et al., 1988; Vanbruggen et al., 1997).

Интересен тот факт, что гистоны могут влиять на систему кроветворения как нормального, так и облученного организма. Было установлено, что гистоны способны воздействовать на кроветворные клетки-предшественники. Показано, что гистоны обладают

способностью снижать повреждающее действие ионизирующей радиации на популяцию колониеобразующих единиц селезенки, стимулируя колониеобразующую активность клеток костного мозга (Семина и др., 1994).

Особенно необходимо подчеркнуть действие гистонов на систему свертываемости крови. Так, гистон Н1 увеличивает время свертывания крови. Этот эффект ингибируется добавлением антигистоновых антител или сыворотки пациента с антифосфолипидным синдромом. Предполагают, что гистоны, высвобождающиеся при разрушении клеток, обладают антикоагулянтной активностью (КЬет оХ а1., 1996). Известно, что также влияет на систему свертывания крови и полилизин (ЫиЫт & а1., 1953).

Возможно, гистоны могут выполнять некоторые регуляторные и даже гормональные функции. Так известно, что 90 кД белок теплового шока ИярЯО может реагировать с гистонами (Сзегте1у е! а1., 1997) и кошапероны являются также гистон-связывающими белками (ВопагсН е1 а1., 1995). Гистоны могут выполнять роль гормонов и стимулировать выход тиреотропина из гипофизарных клеток (Brown е1 а1., 1997). Показано, что гистон Н4, но не гистон Н2, схож по действию с инсулином, стимулирует инсулиновый рецептор и выход глюкозы (Ьо^егБ е! а1., 1996), а взаимодействие С-терминального домена инсулинового рецептора с гистоном модулирует активность рецепторной киназы (Вагоп е1 а1., 1995).

В последнее время появились работы, где наблюдали ингибирование роста раковых клеток введением иммунного конъюгата с гистоном. Только моноклональные антитела против клеток рака легкого в комплексе с гистоном, но не сами антитела, ингибируют синтез РНК и пролиферацию раковых клеток (11ак:о'шс282и1с2ушка е! а1., 1996). Установлено, что антигистоновые антитела реагируют перекрестно с

поверхностью опухолевых, но не нормальных клеток (Iakoubov et al., 1995).

Здесь следовало бы рассмотреть также некоторые свойства непосредственно антигистоновых антител.

Кроличьи анти-хроматиновые антитела как и волчаночные аутоантитела распознают сходные эпитопы на молекуле гистона Н1 (Morino et al., 1995). Сыворотки пациентов с системной красной волчанкой способны реагировать не только с гистонами, но и с синтетическими пептидами входящими в состав гистонов (Muller et al., 1989).

Большое количество работ посвящено различному действию антигистоновых антител на клетки. Уже упоминалось, что гистоны связываются с гломерулярной мембраной. Известно, что происходит выборочное накопление антигистоновых антител в гломерулярной мембране у мышей NZB/NZW Fi (Minota et al., 1996). Предполагается, что антигистоновые антитела связывают комплекс ДНК-гистон-коллаген и посредством этого взаимодействуют с гломерулярной мембраной (Bernstein et al., 1995), Антигистоновые антитела связываются с В-клеточными эпитопами как у здоровых людей, так и у пациентов с ювенильным ревматоидным артритом (Mecheri et al., 1993; Stemmer et al., 1995).

В крови in vivo антигистоновая активность может ингибироваться различными белковыми компонентами, которые могут играть защитную роль против как высоко-аффинных анти-Н1 антител у пациентов с системной красной волчанкой, так и природных, низко-аффинных антигистоновых антител (Bustos et al., 1994). Человеческие полиреактивные IgM моноклональные антитела также блокируют активность IgG аутоантител к гистонам и ДНК (Melero et al., 1997).

Приведенные нами в литературном обзоре сведения о широком

распространении антител, реагирующих с гистонами, о выходе гистонов из поврежденных радиацией клеток и наличие у них токсических свойств позволяют поставить ряд вопросов, нуждающихся в тщательном исследовании.

Так, необходимо установить образуются ли иммунные комплексы между антителами и гистонами, изменяются ли свойства гистонов и антител после образования комплекса, могут ли иметь какое-либо значение в патогенезе радиационных нарушений комплексы антител и гистонов. Данные вопросы и являлись предметом нашего исследования.

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Оборудование и принадлежности.

- рН-метр "Orion Research ЕА 940";

- адсорбционометр автоматический "Titertek Multiskan 310 С";

- весы аналитические "Sartorius R160P";

- коллектор фракций "LKB 7000 Ultrorac";

- колонки хроматографические "Bio-Rad";

- лазер аргон ионный "Enterprise 621" фирмы "Coherent, CA";

- мешалка магнитная "Kika-mini-MR";

- микродозаторы автоматические ёмкостью от 5 до 5000 мкл;

- насосы перистальтические: "LKB bromma 2132 Microperpex, 2115 Multiperpex";

- планшеты иммунологические из полистирола: "Nunc F96", "Labstar F96";

- прибор для отмывки панелей "Titertek Flow Lab. 77-251-00";

- прибор для проточной цитофлуориметрии "FACS Vantage" фирмы "Becton Dickinson Immunocytometry Systems";

- прибор жидкостно-сцинтиляционного счёта "LKB wallac 1217 RackBeta";

- спектрофотометр "Beckman DU-65", "ДТ-86";

- термоциркулятор водяной "LKB 2219 Multitemp II";

- центрифуги "Janetzki T-23", "VEB MLW K-70-D".

2.2 Препараты и реактивы.

"5

- Н-тимидин ("Изотоп", Россия);

- L-a-фосфатидил-Е-серин из бычьего мозга (Sigma, США);

- L-a-фосфатидилинозитол из бычьей печени (Sigma);

- L-a-фосфатидилхолин (L-a-лецитин) тип V-E из желтка (Sigma);

L-a-фосфатидилхолин тип III-B из бычьего мозга (Sigma); акриламид (LKB, Швеция);

альбумин бычий сывороточный, фракция 5 (Sigma);

бис-акриламид (Amresco, США);

гаммаглобулин бычий (Serva, Германия);

гистон III-S (HI) из телячьего тимуса (Sigma);

гистон VIII-S (НЗ) из телячьего тимуса (Sigma);

гистон VII-S (Н2Ь) из телячьего тимуса (Sigma);

гистон VI-S (Н2а+Н4) из телячьего тимуса (Sigma);

гистон тотальный (15 кД) из телячьего тимуса (Calbiochem, США);

глицерин (Serva);

глицин (Reanal, Венгрия);

ДНК тимуса теленка (Sigma);

додецилсульфат натрия (Amresco, США);

желатин (Sigma);

инсулин, человеческий рекомбинантный из дрожжей (Sigma); кардиолипин (дифосфатидилглицерол) из бычьего сердца (Sigma); конъюгаты антител к Ig, IgG и IgM с пероксидазой (Sevac, Чехия); краситель Hoechst 33258 (Sigma); Кумасси бриллиантовый голубой СВВ R-250 (Serva); липополисахарид W Е. coli 0111:В4 (Difco Laboratories, США); липополисахарид W S. typhimurium (Difco Laboratories); натрий додецилсульфат (Koch-Light Laboratories Ltd., США); нуклеаза SI (Boehringer-Mannheim, Германия); орто-фенилендиамин (Calbiochem); препараты нормальных человеческих гамма- или иммуноглобулинов (Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Россия); пропидиум иодид (Sigma);

- протеиназа К (Boehringer-Mannheim, Германия);

- Сефакрил S-200 (Serva);

- твин-20 (Serva);

- Трис (трис[гидроксиметил]аминометан) (Serva);

- фильтры картонные 24-мм (Filtrak, Германия);

- этилендиаминтетрауксусная кислота (Serva).

Некоторые реактивы указаны также в описаниях конкретных методик.

2.3 Определение концентрации белка.

Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм, используя коэффициент экстинкции 12,5 для Ig, или цветной реакцией с бихиноиновой кислотой в присутствии солей меди при длине волны 562 нм. В последнем случае использовали коммерческий набор "ВСА Protein Assay Kit" (Pierce, США), согласно инструкции производителя. В качестве стандарта использовали прилагаемый раствор БСА.

2.4 Фракционирование комплексов гистон-иммуноглобулин с помощью гель-Фильтрации на Сефакрил S-200.

Уравновешивали колонку 1,5 см х 70 см с Сефакрил S-200 (Pharmacia, Швеция) фосфатно-солевым буферным раствором ФСБ, рН 7,2, содержащим 0,02 % азида натрия со скоростью потока 10 мл/час, используя перистальтический насос. Все процедуры производили при 4°С. Навеску тотального препарата гистона 5 мг растворяли в 0,05 М НС1 и затем в дистиллированной воде до концентрации 2,5 мг/мл, титровали разведенным NaOH до рН 7,2. 0,1 мл нормальных человеческих иммуноглобулинов (100 мг/мл) преинкубировали с 1 мл раствора гистонов (2,5 мг/мл) в течение 1 часа при 4°С и наносили на

колонку. Элюировали ФСБ, рН 7,2, содержащим 0,02 % азида натрия со скоростью потока 35 мл/час. Собирали фракции с помощью "LKB 7000 Ultrorac" коллектора (по 4 мл), выявляя белок по поглощению при длине волны 280 нм. Определяли концентрации белка в полученных фракциях с помощью "ВСA Protein Assay Kit" (Pierce, США). Анализировали полученные фракции методом твердофазного иммуноферментного анализа. Хранили полученные препараты при 4°С.

2.5 Электрофорез.

Препараты белков разделяли электрофоретически в вертикальных блоках полиакриламидного геля с линейным градиентом акриламида 722%, метиленбисакриламид 1.40, в присутствии додецилсульфата натрия в соответствии с методом Лэммли (Laemmli, 1970), используя электрофоретическое оборудование фирмы LKB (Швеция). При этом применяли следующие растворы и условия: белки наносили в буфере образца, содержавшем 40 мМ Трис-НС1, 10 мМ ЭДТА, 4% додецилсульфат натрия, 20% глицерина, рН 8,0. Использовали концентрирующий гель состава 3% акриламид, сшивка 1:40. Использовали электродный буфер, содержащий 192 мМ глицин, 25 мМ Трис-НС1, 0,1% додецилсульфат натрия с рН 8,3. Подавали напряжение 150 В в течение 18 ч. Камеру для электрофореза термостатировали при 4°С. После разделения гель фиксировали 1 ч в смеси 25% изопропанола, 10% уксусной кислоты, окрашивали 0,1% раствором Кумасси голубого R-250 в фиксирующем растворе в течение 3 ч и затем удаляли несвязавшийся краситель в смеси 10% изопропанола и 7% уксусной кислоты.

2.6 Приготовление меченой тритием нашивной ДНК.

Для введения тритиевой метки в ДНК использовали тимидин-

зависимый штамм Escherichia coli W31110 thy , выращивая его на жидкой питательной среде, не содержащей компонентов нуклеиновых кислот (Difco, США), содержавшим 200 мБк Н-тимидина на 1 л среды. Бактерии инкубировали 20 ч при 37°С, собирали центрифугированием и промывали трижды ФСБ. Для выделения нативной ДНК использовали модифицированный метод Мармура (Marmur, 1961). К осадку добавляли 5 мл раствора, содержавшего 1% додецилсульфата натрия, 1 М NaCl, 50 мМ ЭДТА, 1 мМ N-этилмалеимида, 0,2 мг протеиназы К и инкубировали 2 ч при 37°С. После инкубации препарат депротеинизировали трехкратной экстракцией равным объемом смеси хлороформ-изопропанол (24:1), центрифугировали в течение 30 мин при 3000xg и осаждали ДНК из верхнего слоя жидкости двойным объемом абсолютного этанола, инкубируя 2 ч при -25°С. После центрифугирования (30 мин, 3000xg, 4°С) осадок промывали 70% холодным этанолом и ресуспендировали в 0,1 М натрий-ацетатном буфере, содержащем 5 мМ ZnCl2, pH 4,4.

Нативную ДНК получали, обрабатывая препарат ДНК нуклеазой S1, с последующей очисткой гель-фильтрацией на колонке 2,4 см х 40 см с Сефарозой 2Б, уравновешенной стандартно-солевым раствором. Собирали фракции по 1 мл. Фракции, выходившие в свободном объёме и имевшие высокую радиоактивность, объединяли и очищали дополнительно фильтрацией через нитроцеллюлозные фильтры. Хранили препараты ДНК в замороженном состоянии при -25°С.

2.7 Определение связывания белок-ДНК уадиоиммунологическим

методом (тест Фаруа).

Для определения связывания белок-ДНК использовали радиоиммунологический анализ по Фарру (Wold et al., 1968), включающий осаждение иммунных комплексов с помощью

насыщенного раствора сульфата аммония в присутствии соосадителя.

о

Нужные объемы растворов белка, ФСБ, 75 нг Н-ДНК (-7000 имп/мин, -25000 распад/мин) и 50 мкл 16 мг/мл раствора бычьего гаммаглобулина смешивали (конечный объем смеси 0,5 мл) и инкубировали 1 ч при 37°С. После инкубации добавляли 0,5 мл насыщенного при 4°С раствора сульфата аммония, выдерживали 1 ч при 4°С, отделяли осадок центрифугированием в течение 30 мин, 3000xg при 4°С, удаляли супернатант, а осадок промывали полунасыщенным раствором сульфата аммония и вновь центрифугировали в тех же условиях. Осадок растворяли в 100 мкл деионизованной воды, наносили на 24-мм картонные фильтры (Filtrak, Германия), высушивали и измеряли радиоактивность в толуольном сцинтилляторе на счётчике "RackBeta 1217" (LKB wallac, Швеция).

2.8 Определение антигистоновых антител методом

твердофазного иммуноферментного анализа.

Тотальный препарат гистонов из телячьего тимуса (Calbiochem) в концентрации 10 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9,5 наносили на полистироловую планшету для иммуноферментного анализа ("Nunc F96", Дания) по 100 мкл в каждую лунку. Половину лунок на планшете оставляли под карбонатным буфером, рН 9,5 для контроля. Инкубировали в течение ночи при 4°С. Отмывание иммунологических планшет производили промывающим раствором (ФСБ, рН 7,2, содержащий 0,1% твин-20) при помощи устройств для отмывания 4-5 раз. Вносили по 180 мкл в каждую лунку 0,5% раствора желатина в ФСБ, рН 7,2 для блокирования мест неспецифического связывания, инкубировали 2 ч при 37°С, затем отмывали промывающим раствором. Раститровку исследуемых антител производили многоканальным дозатором методом последовательных двукратных разведений в

растворе для разведений и инкубации (ФСБ, рН 7,2, содержащий 0,5% желатин и 0,1% твин-20). Инкубировали 1 ч при 37°С, затем планшеты отмывали промывающим раствором. Готовили раствор конъюгата антител к ^О, ^М или с пероксидазой хрена в растворе для разведений и инкубации с рабочим разведением, вносили по 100 мкл в каждую лунку. Инкубировали 1 ч при 37°С, отмывали планшеты промывающим раствором. Добавляли по 100 мкл в каждую лунку раствора субстрата (0,01% Н2О2; 0,5 мг/мл о-фенилендиамин; 0,05 М цитрат-фосфатный буфер, рН 5,0) и инкубировали 30-45 мин при 37°С в месте, защищенном от прямых лучей света. Через 30-45 мин после внесения субстрата ферментативную реакцию останавливали, добавляя в каждую лунку 50 мкл 1 М Н2804. Первоначально результаты реакции учитывали визуально, убеждаясь в том, что фоновая реакция в контрольных лунках чётко отличалась от реакции в других лунках. Для точного учёта результатов интенсивность окрашивания оценивали на автоматическом адсорбционометре со светофильтром на 492 нм ("Тйейек МиШэкап 310 С", Финляндия). По результатам проведённого анализа строили графики зависимости оптической плотности в лунках (рассчитывали средние арифметические значения оптической плотности в парных лунках, учитывая показания фона для каждого значения оптической плотности) от концентрации внесённого при раститровке препарата.

2.9 Идиотипиуование препаратов иммуноглобулинов.

Определение идиотипической принадлежности фармакопейных препаратов иммуноглобулинов и их фракций связавшихся с гистоном проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, используя мышиные моноклональные антитела к идиотипам 31 и 8.12. Моноклональные антитела были любезно предоставлены доктором

Бетти Даймонд (отдел микробиологии и иммунологии, колледж медицины Альберта Эйнштейна, США). Препараты иммуноглобулинов в концентрации 20 мкг/мл наносили непосредственно на полистироловую планшету ("Nunc F96", Дания) или на уже иммобилизованный препарат тотального гистона (10 мкг/мл) по 100 мкл в каждую лунку. После часовой инкубации при 37°С планшеты отмывали промывающим раствором (ФСБ, рН 7,2, содержащий 0,1% твин-20). Вносили моноклональные антиидиотипические антитела в концентрации 10 мкг/мл. Инкубировали 1 ч при 37°С, затем планшеты отмывали промывающим раствором. Готовили раствор конъюгата антител к мышиным Ig с пероксидазой хрена (Sevac, Чехия) в растворе для разведений и инкубации с рабочим разведением, вносили по 100 мкл в каждую лунку. Инкубировали 1 ч при 37°С, отмывали планшеты промывающим раствором. Добавляли по 100 мкл в каждую лунку раствора субстрата (0,01% Н2О2; 0,5 мг/мл о-фенилендиамин; 0,05 М цитрат-фосфатный буфер, рН 5,0) и инкубировали 30-45 мин при 37°С в месте, защищенном от прямых лучей света. Через 30-45 мин после внесения субстрата ферментативную реакцию останавливали, добавляя в каждую лунку 50 мкл 1 М H2SO4. Интенсивность окрашивания измеряли на автоматическом адсорбционометре со светофильтром на 492 нм ("Titertek Multiskan 310 С", Финляндия).

2.10 Определение связывания иммуноглобулинов с ДНК методом

твердофазного иммуноферментного анализа.

Полистироловые планшеты для иммуноферментного анализа ("Nunc F96", Дания) облучали в дозе 300 КРад у-лучами 60Со на установке "GammaCell" (Канада) для активации поверхности (Киселева, Поверенный, 1987) и покрывали ДНК из тимуса теленка (Sigma), внося в лунки по 100 мкл раствора ДНК (10 мкг/мл в ФСБ, рН 7,2, содержащем

5мМ ЭДТА). Половину лунок на планшете оставляли под ФСБ, рН 7,2 для контроля. Инкубировали в течение ночи при 4°С. Отмывание иммунологических планшет производили промывающим раствором (ФСБ, рН 7,2, содержащий 0,1% твин-20) при помощи устройств для отмывания 4-5 раз. Вносили по 180 мкл в каждую лунку 0,5% раствора желатина в ФСБ, рН 7,2 для блокирования мест неспецифического связывания, инкубировали 2 ч при 37°С, затем отмывали промывающим раствором. Раститровку исследуемых антител или их комплексов с гистонами производили многоканальным дозатором методом последовательных двукратных разведений в растворе для разведений и инкубации (ФСБ, рН 7,2, содержащий 0,5% желатин и 0,1% твин-20). Инкубировали 1 ч при 37°С, затем планшеты отмывали промывающим раствором. Готовили раствор конъюгата антител к IgG или IgM с пероксидазой хрена в растворе для разведений и инкубации с рабочим разведением, вносили по 100 мкл в каждую лунку. Инкубировали 1 ч при 37°С, отмывали планшеты промывающим раствором. Добавляли по 100 мкл в каждую лунку раствора субстрата (0,01% Н2О2; 0,5 мг/мл о-фенилендиамин; 0,05 М цитрат-фосфатный буфер, рН 5,0) и инкубировали 30-45 мин при 37°С в месте, защищенном от прямых лучей света. Через 30-45 мин после внесения субстрата ферментативную реакцию останавливали, добавляя в каждую лунку 50 мкл 1 М H2SO4. Интенсивность окрашивания измеряли на автоматическом адсорбционометре со светофильтром на 492 нм ("Titertek Multiskan 310 С", Финляндия). По результатам проведённого анализа строили графики зависимости оптической плотности в лунках (рассчитывали средние арифметические значения оптической плотности в парных лунках, учитывая показания фона для каждого значения оптической плотности) от концентрации внесённого при раститровке препарата.

2.11 Определение связывания иммуноглобулинов с ФосФолипидами

методом твердофазного иммуноферментного анализа.

В лунки иммунологической планшеты ("Кипе Б96", Дания) вносили по 50 мкл этанольного раствора соответствующего фосфолипида (кардиолипин, фосфатидилхолин, фосфатилсерин, фосфатилилинозитол и т.п.) с концентрацией 100 мкг/мл. Половину лунок на планшете оставляли под этанолом без антигена для контроля. Высушивали планшету в течение ночи при 4°С. Отмывание иммунологических планшет производили ФСБ, рН 7,2 при помощи устройств для отмывания 4-5 раз. Вносили по 100 мкл в каждую лунку 0,5% раствора желатина в ФСБ, рН 7,2 для блокирования мест неспецифического связывания, инкубировали 2 ч при 37°С, затем отмывали ФСБ, рН 7,2. Вносили по 50 мкл исследуемых сывороток, антител или их комплексов с гистонами в различной концентрации в ФСБ, рН 7,2 и инкубировали 1 ч при 37°С. Затем планшеты отмывали ФСБ, рН 7,2. Готовили раствор конъюгата антител к или с пероксидазой хрена в ФСБ, рН 7,2 с рабочим разведением, вносили по 50 мкл в каждую лунку. Инкубировали 1 ч при 37°С. Планшеты тщательно отмывали ФСБ, рН 7,2. Добавляли по 50 мкл в каждую лунку раствора субстрата (0,01% Н2О2; 0,5 мг/мл о-фенилендиамин; 0,05 М цитрат-фосфатный буфер, рН 5,0) и инкубировали 15-30 мин при 37°С в месте, защищенном от прямых лучей света. Через 15-30 мин после внесения субстрата ферментативную реакцию останавливали, добавляя в каждую лунку 50 мкл 1 М НгБО^ Интенсивность окрашивания оценивали на автоматическом адсорбционометре со светофильтром на 492 нм ("Тйейек МиШзкап 310 С", Финляндия). По результатам проведённого анализа строили графики зависимости оптической плотности в лунках (рассчитывали средние арифметические значения оптической плотности в парных лунках, учитывая показания фона для

каждого значения оптической плотности) от концентрации внесённого при раститровке препарата.

2.12 Действие природных антител и гистонов на

систему свёртываемости крови.

Влияние природных антител, реагирующих с гистонами, и их комплексов с гистонами на коагуляцию определяли in vitro в тестах ингибиции тромбопластина и каолинового времени свертываемости плазмы крыс линии Вистар в соответствии с рекомендациями З.С. Баркагана (Баркаган, 1988).

Тест ингибиции тромбопластина заключается в следующем: в контрольной пробе к 0,2 мл взвеси тромбопластина с активностью 25-30 сек добавляли 0,1 мл 0,85% раствора NaCl. Смесь инкубировали 5 и 60 мин при 37°С. Затем из этой смеси брали 0,1 мл и смешивали с 0,2 мл 0,27% раствора СаСЬ и 0,1 мл бестромбоцитной плазмы. Определяли протромбиновое время свёртываемости плазмы. В опытной группе тестов вместо 0,85% раствора NaCl добавляли равный объём фракций антител или комплексов природных антител с гистонами (концентрация по белку 0,1 и 0,15 мг/мл).

Для определения каолинового времени к 0,1 мл взвеси каолина в физиологическом растворе (25 мг/мл) добавляли 0,1 мл смеси антител (или их комплексов с гистонами) с плазмой (1:3) и инкубировали 5 мин. Затем добавляли 0,2 мл 0,27% раствора СаСЬ и определяли время свёртывания. Наблюдения каждой пробы повторяли 3 раза, данные статистически обрабатывали.

2.13 Выделение тимоиитов, их инкубаиия и окрашивание.

Клетки выделяли из тимуса молодых крыс (3-4 недельных), гомогенизировали и фильтровали через нейлоновую сетку с диаметром

отверстий 100 мкм, затем отмывали ФСБ, pH 7,2, содержащем 0,5% БСА. Тимоциты (5 105 клеток) инкубировали с 20 мкг нормальных человеческих иммуноглобулинов или с 20 мкг нормальных человеческих иммуноглобулинов прединкубированных с различным количеством гистонов в 0,5 мл ФСБ, pH 7,2, содержащего 0,5% БСА в течение 1 часа при 37°С. Для определения зависимости связывания и клеточной гибели от концентрации добавленных гистонов, тотальный препарат гистонов вносили в количестве 0,001-20 мкг на пробу. После обработки клетки промывали 3 раза ФСБ, содержащем 0,5% БСА, осаждая их центрифугированием при 3000xg в течение 5 мин и ресуспендируя в том же растворе. Тимоциты инкубировали с антителами к человеческим IgG, меченными ФИТЦ (Sigma) в течение 1 часа при 37°С. Затем клетки промывали 3 раза ФСБ, содержащем 0,5% БСА, ресуспендировали в том же растворе и окрашивали с помощью флуорохромов: пропидиум иодида (40 мкг/мл) и красителя Hoechst 33258 (2 мкМ) в течение 10 мин при комнатной температуре. Полученные образцы немедленно анализировали на проточном цитофлуориметре.

2.14 Проточная иитофлуориметрия.

Образцы (см. Выделение тимоцитов, их инкубация и окрашивание.) анализировали на "FACS Vantage" цитофлуориметре (Becton Dickinson Immunocytometry Systems), оснащённым аргон ионным лазером "Enterprise 621 " (Coherent) с длинной волны возбуждения 488 нм (100 мВ). Флуоресценцию ФИТЦ и пропидиум иодида фиксировали, используя фильтры 530/30 нм и 582/42 нм, соответственно. Пять тысяч сигналов анализировали в каждом образце. Данные представляли и обрабатывали с помощью компьютера "Hewlett-Packard 340", используя программу "Lysis II" (Beckton Dickinson).

После выделения на цитограмме светорассеяния с целью исключения обломков и конгломератов клеток была проанализирована цитограмма флуоресценции пропидиум иодида, затем данные записывались для определения фракции клеток, которые включили пропидиум иодид вследствие потери проницаемости плазматической мембраны. Фракция клеток, связывающая антитела и значения флуоресцентной интенсивности меченых клеток оценивали, используя гистограмму ФИТЦ-флуоресценции после исключения клеточных обломков и конгломератов (2ати1аеуа а1, 1997).

Заключение диссертации по теме «Радиобиология», Абакушин, Дмитрий Николаевич

ВЫВОДЫ

1. В препаратах нормальных иммуноглобулинов и сыворотках крови здоровых индивидуумов содержатся природные антитела, способные реагировать с гистонами. Установлено, что в составе этой группы природных антител имеются антитела 31 идиотипа и отсутствуют антитела 8.12 идиотипа.

2. Под действием ионизирующего излучения происходит снижение количества свободно циркулирующих в крови природных антител, реагирующих с гистонами.

3. Связываясь с иммуноглобулинами, гистоны выступают в роли кофактора и придают им способность реагировать с ДНК, фосфолипидами, бактериальными липополисахаридами и пр. Таким образом, полиспецифичность некоторых природных антител может быть обусловлена комплексообразованием между молекулами иммуноглобулина и гистона.

4. Природные антитела, реагирующие с гистонами, уменьшают цитотоксичность гистонов, которые могут попадать в межклеточное пространство вследствие тканевой и клеточной деструкции под действием ионизирующего излучения.

5. Комплексы природных антител с гистонами влияют на процесс коагуляции, увеличивая каолиновое и протромбиновое время свертываемости крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наши исследования были посвящены актуальной проблеме современной радиобиологии и иммунологии - вероятной роли природных антитела в патогенезе некоторых радиационных нарушений.

Важными проявлениями таких нарушений являются массивная клеточная гибель и выход продуктов клеточного распада в межклеточное пространство, бактериальная эндотоксинемия, нарушения процессов свертываемости крови, наблюдаемая в первые сутки характерная постлучевая гипергликемия. Большую роль в связывании и элиминации продуктов клеточного распада играют природные антитела, циркулирующие в крови у нормальных индивидуумов и обладающие полиспецифическими свойствами. Известно, что под действием ионизирующего облучения происходит быстрая интерфазная гибель большинства лимфоцитов и высвобождение гистонов из клеточных ядер. Как известно из литературы, гистоны обладают выраженными токсическими свойствами. Существует вопрос о механизмах элиминации гистонов из межклеточного пространства.

Нами установлено, что природные антитела, реагирующие с гистонами, широко распространены, их можно обнаружить в пуле нормальных человеческих иммуноглобулинов и сыворотках крови здоровых индивидуумов. Определен уровень содержания этих антител у группы здоровых мышей до и через сутки после их облучения дозой 4 Гр. В этих условиях проявления интерфазной гибели лимфоидных клеток наиболее выражены. Оказалось, что количество антител, способных реагировать с гистонами, у облученных животных значительно уменьшилось. Наряду с этим сыворотки крови облученных мышей приобрели способность реагировать с ДНК и бактериальными липополисахаридами. Трудно представить, что за 24 часа произошел синтез указанных антител.

Мы предположили, что уменьшение количества антител, реагирующих с гистонами, определяется тем, что часть таких антител уже связало высвободившиеся гистоны, которые, вероятно, и определяют способность антител реагировать с ДНК, липополисахаридами и пр.

Это предположение было проверено в модельных опытах. Действительно было показано, что гистоны образуют достаточно устойчивый комплекс с иммуноглобулинами и придают им новые свойства: способность реагировать с ДНК, бактериальными липополисахаридами, инсулином, влиять на систему свертываемости крови и др.

На основании этих данных мы предположили, что в иммунологических реакциях гистоны могут выполнять функции кофактора, подобные той, которую выполняет {32-гликопротеин I, определяющий взаимодействие антикардиолипиновых антител с кардиолипином.

Было установлено, что природные антитела, реагируя с гистонами, подавляют их цитотоксические свойства, способствуют выведению их из организма. Наряду с этим удалось обнаружить, что иммуноглобулины после взаимодействия с гистонами приобретали способность связываться с интактными тимоцитами. Можно предположить, что следствием такого взаимодействия может быть модификация иммунологического ответа в целом или по отношению к антигену фиксированному на лимфоидных клетках.

На гипотетической Схеме представлены основные моменты вероятного участия природных антител в патогенезе радиационных нарушений.

Под действием радиации происходит высвобождение гистонов,

Схема обладающих цитотоксическими свойствами. Гистоны образуют комплекс с природными антителами, выступая в роли кофактора, придают им полиспецифические свойства. В результате такого взаимодействия природные антитела способны подавлять цитотоксические свойства гистонов. Связывание комплексами иммуноглобулинов с гистонами бактериальных липополисахаридов, вероятно, играет определенное значение в защите организма от проникающих через стенки кишечника бактериальных токсинов.

Возможным отрицательным эффектом образования комплексов природных антител с высвобождаемыми после облучения гистонами может быть обнаруженное нами взаимодействие модифицированных гистонами антител с инсулином. Дисбаланс циркуляции инсулина в крови может быть причиной определенных патологических изменений, в частности гипергликемии. Известно, что коагулопатии, изменения процессов свертываемости крови, являются важнейшим проявлением лучевой болезни и комбинированных лучевых повреждений. Было показано, что комплексы иммуноглобулинов с гистонами способны влиять на систему свертываемости крови in vitro, увеличивая каолиновое и протромбиновое время свертываемости, тем самым подавляя гемостаз и выступая в роли антикоагулянтов.

Таким образом, описаны возможные механизмы участия комплексов гистонов с природными антителами в патогенезе ряда радиационных нарушений. Защитная роль природных антител, реагирующих с гистонами, прежде всего проявляется в снижении цитотоксичности продуктов клеточного распада, одним из которых являются гистоны, их связывании и элиминации. В патогенезе радиационных нарушений необходимо учитывать также возможную роль таких комплексов в развитии эндотоксинемии, постлучевой гипергликемии и коагулопатий. Детальные механизмы участия природных антител и их комплексов с продуктами клеточного распада в патогенезе радиационных нарушений требуют дальнейших исследований.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Абакушин, Дмитрий Николаевич, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Александрова С.Е., Иванник Б.П., Гуляев В.А., Рябченко Н.И. Влияние циклогексимида на морфологические и биохимические изменения хроматина в необлученных и облученных тимодитах крыс // Радиобиол. - 1988. - Т. 28. - №. 2. - С. 213-218.

2. Байсоголов Г.Д., Гуськова А.К., Лемберг В.К., Дощенко В.Н., Еманова Е.А., Либинзон P.E., Ерохин P.A., Хохряков В.Ф., Кирюшкин В.И., Кузнецова З.Ф., Плотникова Л.А., Олипер Т.В. Клиника и патологическая анатомия крайне тяжелых форм острой лучевой болезни у человека (ред. H.A. Краевский, А.К. Гуськова) -М. - 1959. - 155 стр.

3. Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы. - 1988. -М: "Медицина" - С. 48-60.

4. Иванник Б.П., Голубева Р.В., Проскуряков С Я., Рябченко Н.И. Влияние ингибиторов транскрипции и трансляции на репарацию и деградацию ДНК в облученных тимоцитах // Радиобиол. - 1976. - Т. 16. - №. 4. - С. 483-486.

5. Иванник Б.П., Проскуряков С.Я., Рябченко Н.И. Влияние белкового синтеза на процесс репарации ДНК в тканях облученных животных //Радиобиол. - 1980. - Т. 20. - №. 6. - С. 833-837.

6. Киселева В.И., Поверенный A.M. Энзимоиммунологический метод для изучения левовращающих ДНК // Мол. Биол. - 1987. - Т. 21. - С. 1551-1559.

7. Семина О.В., Семенец Т.Н., Цеппецауэр М., Цебецауэр Л., Поверенный A.M. Воздействие гистона на кроветворные клетки-предшественники (КОЕс) нормального и облученного организма // Радиац. Биол. Радиоэкология - 1994. - Т. 34. - №. 4-5. - С. 544-549.

8. Abakushin D.N., Poverenny A.M. Histones interact with

immunoglobulins and give them polyspecificity // Immunol. Lett. -1996. - V. 53. -№. 2-3. - P. 95-99.

9. Ait-Kaci A., Monier J.C., Mamelle N. Enzyme linked immunosorbent assay for antihistone antibodies and their presence in systemic lupus erythematosus sera // J. Immunol. Meth. -1981. - V. 44. - P. 311.

10. Andre-Schwartz J., Datta S.K., Shoenfeld Y., et al. Binding of cytoskeletal proteins by monoclonal anti-DNA lupus autoantibodies // Clin. Immunol. Immunopathol. - 1984. - V. 31. - P. 261-271.

11. Atanassov C., Briand J.P., Bonnier D., Van Regenmortel M.H.V., Muller S. New Zealand white rabbits immunized with RNA-complexed total histones develop an autoimmune-line response // Clin. Exp. Immunol. - 1991. - V. 86. - P. 124-133.

12. Avrameas S., Dighiero G., Lymberi P., Guilbert B. Studies on natural antibodies and autoantibodies // Ann. Immunol. (Inst. Pasteur) - 1983. -V. 134D. - P. 103-113.

13. Avrameas S., ed. Multispecific antibodies // Int. Rev. Immunol. - 1988. -V. 3. - P. 1-146.

14. Avrameas S., Ternynck T. Natural autoantibodies: The other side of the immune system // Res. Immunol. - 1995. - V. 146. - №. 4-5. - P. 235248.

15. Avrameas S., Ternynck T. The natural autoantibodies system: between hypothesis and facts // Mol. Immunol. - 1993. - V. 30. - №. 12. - P. 1133-1142.

16. Barmeir E., Teuber S.S., Lin H.C., Alosacie I., Goddard G., Terybery J., Barka N, Shen B., Peter J.B., Blank M., Gershwin M.E., Shoenfeld Y. Multiple autoantibodies in patients with silicone breast implants // J. Autoimmunity - 1995. - V. 8. - №. 2. - P. 267-277.

17. Baron V., Kaliman P., Alengrin F., Vanobberghen E. Interaction of the C-terminal acidic domain of the insulin receptor with histone modulates

the receptor kinase activity // Europ. J. Biochem. - 1995. - V. 229. - №. l.-P. 27-34.

18. Berneman A., Ternynck T., Avrameas S., Natural mouse IgG reacts with self antigens including molecules involved in the immune response //Eur. J. Immunol. - 1992. - V. 22. - P. 625-633.

19. Bernstein K.A., Divalerio R., Lefkowith J.B. Glomerular binding activity in MRL lpr serum consists of antibodies that bind to a DNA histone type IV collagen complex // J. Immunol. - 1995. - V. 154. - №. 5. - P. 2424-2433.

20. Bernstein R.M., Hobbs R.N., Lea D.J., Ward D.J., Hughes G.R.V. Patterns of antihistone antibody specificity in systemic rheumatic disease // Arthritis Rheum. 1985. - V. 28. - №. 3. - P. 285-293.

21. Bolton S.J., Perry V.H. Histone HI; a neuronal protein that binds bacterial lipopolysaccharide // J. Neurocytol. - 1997. - V. 26. - №. 12. -P. 823-831.

22. Bonardi M.A., Giovanetti E., Legname G., Fossati G., Porro G., Gromo G., Modena D., Marcucci F. Cochaperonins are histone-binding proteins // Biochem. Biophys. Res. Communications - 1995. - V. 206. - №. 1. - P. 260-265.

23. Boyden S.V. Natural antibodies and the immune response // Adv. Immunol. - 1965. - V. 5. - P. 1-28.

24. Brinet A., Fournel C., Faure J.R., Venet C., Monier J.C. Anti-histone antibodies (ELISA and immunoblot) in canine lupus erythematosus // Clin. Exp. Immunol. - 1988. - V. 74. - P. 105-109.

25. Brinkman K., Teraiaat R.M., de Jong J. et al. Cross-reactive binding patterns of monoclonal antibodies to DNA are often caused by DNA/and-DNA Immune complexes // Res. Immunol. - 1989. - V. 140. -P. 595-612.

26. Brown O.A., Sosa Y.E., Goya R.G. Thyrotropin-releasing activity of

histone H2A, H2B and peptide MB35 // Peptides - 1997. - V. 18. - №. 9. -P. 1315-1319.

27. Burlingame R.W., Rubin R.L. Autoantibody to the nucleosome subunit (H2A-H2B)-DNA is an early and ubiquitous feature of lupus-like conditions // Mol. Biol. Reports - 1996. - V. 23. - №. 3-4. - P. 159-166.

28. Buskila D., Berezin M., Gur H., Lin H.C., Alosachie I., Terryberry J.W., Barka N., Shen B., Peter J.B., Shoenfeld Y. Autoantibody profile in the sera of women with hyperprolactinemia // J. Autoimmunity - 1995. - V. 8.-№.3.-P. 415-424.

29. Bustos A., Boimorto R., Subiza J.L., Pereira L.F., Marco M., Figueredo M.A., de la Concha E.G. Inhibition of histone/anti-histone reactivity by histone-binding serum components; differential effect on anti-Hl versus anti-H2B antibodies // Clin. Exp. Immunol. - 1994. - V. 95. - №. 3. - P. 408-414.

30. Chan E.K.L., Imai H., Hamel J.C., Tan E.M. Human autoantibody to RNA polymerase I transcription factor hUBF. Molecular identity of nucleolus organizer region autoantigen NOR-90 and ribosomal RNA transcription upstream binding factor // J. Exp. Med. - 1991. - V. 174. -P. 1239-1244.

31. Chengappa K.N., Carpenter A.B., Yang Z.W., Brar J.S., Rabin B.S., Ganguli R. Elevated IgG anti-histone antibodies in a subgroup of medicated schizophrenic patients // Schizophrenia Res. - 1992. - V. 7. -№. 1. - P. 49-54.

32. Chou M.J., Lee S.L., Chen T.Y., Tsay G.J. Specificity of antinuclear antibodies in primary biliary cirrhosis // Ann. Rheum. Dis. - 1995. - V. 54.-№. 2.-P. 148-151.

33. Chow D.A., Bennet R.D. Low natural antibody and low in vivo tumor resistance, in xid-bearing B-cell deficient mice // J. Immunol. - 1989. -V. 142. - P. 3702-3706.

34. Costa O., Monier J.C. Antihistone antibodies detected by ELISA and immunoblotting in systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis // J. Rheum. - 1986. - V. 13. - P. 722.

35. Costa O., Monier J.C. Detection of antibodies to histones in human systemic lupus erythematosus and in murine lupus like syndromes using microELISA // Ann. Immunol. - 1983. - V. 134C. - P. 365.

36. Coutinho A., Kazatchkine M.D., Avrameas S. Natural autoantibodies // Current Opinion in Immunol. - 1995. - V. 7. - P. 812-818.

37. Crompton N.E.A. Programmed cellular response to ionizing radiation damage // Acta Oncologica. - 1998. - V. 37. - №. 2. - P. 129-142.

38. Csermely P., Miyata Y., Soti C., Yahara I. Binding affinity of proteins to hsp90 correlates with both hydrophobicity and positive charges. A surface plasmon resonance study // Life Sc. - 1997. - V. 61. - №. 4. - P. 411-418.

39. Currie J.R., Chenhwang M.C., Denman R., Smedman M., Potempska A., Ramakrishna N., Rubenstein R., Wisniewski H.M., Miller D.L. Reduction of histone cytotoxicity by the Alzheimer beta-amyloid peptide precursor // Biochimica et Biophysica Acta - Mol. Cell Res. -1997. - V. 1355. - №. 3. - P. 248-258.

40. Daar A.S., Fabre J.W. Organ-specific IgM autoantibodies to liver, heart and brain in man: generalized occurrence and possible functional significance in normal individuals, and studies in patients with multiple sclerosis // Clin. Exp. Immunol. -1981. - V. 45. - P. 37-47.

41. Darwin B.S., Grudier J.P., Klutt C.L., Pisetsky D.S. IgG antinuclear antibodies with crossreactive rheumatoid factor activity // J. Immunol. -1986.-V. 137.-P. 3796-3801.

42. Dighiero G., Kaushik A., Poncet P., Ge X.R. Origin and significance of autoantibodies // Concepts Immunopathol. - 1987. - V. 4. - P. 42-76.

43. Dive C., Gregory C.D., Phipps D.J., Evans D.L., Milner A.E., Wyllie

A.H. // Analysis and discrimination of necrosis and apoptosis (programmed cell death) by multiparameter flow cytometry // Biochem. Biophys. Acta - 1992. - V. 1133. - P. 275-285.

44. Eilat D. Anti-DNA antibodies: problems in their study and interpretation // Clin. Exp. Immunol. - 1986. - V. 65. - P. 215-222.

45. Eilat D. Cross-reactions of anti-DNA antibodies and the central dogma of lupus nephritis // Immunol. Today. - 1985. - V. 6. - P. 123-127.

46. Ellinger F. "Medical Radiation Biology", Thomas, Springfield, Illinois -1957. - p. 354.

47. Elouaai F., Lule J., Benoist H., Appolinaire-Pilipenko S., Atanassov C., Muller S., Fournie G.J. Autoimmunity to histones, ubiquitin, and ubiquitinated histone H2A in NZB x NZW and MRL-lpr/lpr mice. Anti-histone antibodies are concentrated in glomerular eluates of lupus mice // Nephrology, Dialysis, Transplantation. - 1994. - V. 9. - №. 4. - P. 362-366.

48. Emlen W., Holers V.M., Arend W.P., Kotzin B. Regulation of nuclear antigen expression on the cell surface of human monocytes // J. Immunol. - 1992. - V. 148. - №. 10. - P. 3042-3048.

49. Faaber P., Capel P.J.A., Rjike G.P.M., et al. Cross-reactivity of anti-DNA antibodies with proteoglycans // Clin. Exp. Immunol. - 1984. - V. 55.-P. 502-508.

50. Feizi T. Demonstration by monoclonal antibodies that carbohydrate structures of glycoproteins and glycolipids are onco-developmental antigens // Nature - 1985. - V.314. - P. 53.

51. Fichorova R., Nakov L., Baleva M., Nikolov K., Gegova I. Sperm, nuclear, phospholipid, and red blood cell antibodies and isotype RF in infertile couples and patients with autoimmune rheumatic diseases // American J. Reproductive Immunol. - 1996. - V. 36. - №. 6. - P. 309316.

52. Fournie G.J., Lambert P.M., Miescher P.A. Release of DNA in circulating blood and induction of anti-DNA antibodies after injection of bacterial LPS // J. Exp. Med. - 1974. - V. 140. - P. 1189-1194.

53. Francoeur A.M. Antibody fingerprinting: a novel method for identifying individual people and animals // Biotechnol. - 1988. - V. 6. - P. 822-825.

54. Francoeur A.M. Biotechnology in forensic medicine: new ways of fingerprinting // J. Biotechnol. - 1989. - V. 10. - P. 203-208.

55. Fritzler M.J., Tan E.M. Antibodies to histones in drug-induced and idiotypic lupus erythematosus // J. Clin. Invest. - 1978. - V. 65. - P. 560.

56. Galili U., Rachmilevitz E.A., Peleg A. A unique natural human IgG antibody with anti-alpha-galactosyl activity // J. Exp. Med. - 1984. - V. 160. - P. 1519-1531.

57. Galli M., Comfurius P., Maassen C., Hemker H.C., de-Baets M.H., van Bredo-Vriesman P.J.C., Barbui T., Zwaal R.F.A., and Bevers E.M. Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor // Lancet - 1990. - V. 335. - P.1544-1547.

58. Garzeiii C., Incaprera M., Bazzichi A., Manunta M., Rognini F., Falcone G. Epstein-Barr virus-transformed human B lymphocytes produce natural antibodies to histones // Immunol. Lett. - 1994. - V. 39. -№. 3.-P. 277-282.

59. Garzeiii C., Manunta M., Incaprera M., Bazzichi A., Conaldi P.G., Falcone G. Antibodies to histones in infectious mononucleosis // Immunol. Lett. - 1992. -V. 32. -№.2. - P. 111-115.

60. Gerber G.B., Altman K.I. Tissues and Body Fluids in "Radiation Biochemistry" (K.I. Altman, G.B. Gerber, S. Okada, ed.), Academic Press, New York - 1970. - Vol. 2. - p. 396.

61. Gioud M., Ait-Kaci A., Monier J.C. Histone antibodies in systemic lupus erythematosus // Arthr. Rheum. - 1982. - V. 25. - P. 407.

62. Gockel S., Binder W.L. Immunoglobulin class specificity of anti-

histones antibodies // Arthritis Rheum. - 1985. - V. 28 Supl. - P. S58.

63. Gohill J., Cary P.D., Couppez M., Fritzler M.J. Antibodies from patients with drug-induced and idiopathic lupus erythematosus react with epitopes restricted to the amino and carboxyl termini of histone // J. Imminol. - 1985. -V. 135. - P. 3116.

64. Gohill J., Fritzler M.J. Antibodies in procainamide-induced and systemic lupus erythematosus bind the C-terminus of histone 1 // Mol. Immuno. - 1987. - V. 24. - P. 275.

65. Grabar P. Autoantibodies and immunological theories: an analytical review // Clin. Immunol. Immunopathol. - 1975. - V. 4. - P. 453-466.

66. Grabar P. Autoantibodies and the physiologic role of immunoglobulins // Immunol. Today - 1983. - V. 4. - №. 12. - P. 337-340.

67. Guilbert B., Dighiero G., Avrameas S. Naturally occurring antibodies against nine common antigens in human sera // J. Immunol. - 1982. - V. 128. - P. 2779-2788.

68. Hanly J.G., Hong C. Antibodies to brain integral membrane proteins in systemic lupus erythematosus // J. Immunol. Meth. - 1993. - V. 161. - P. 107-118.

69. Hayakawa B.K., Camack C.E., Hyman R., et al. Natural autoantibodies to thymocytes: origin, Vh genes, fine specificities, and the role of Thy-1 glycoprotein // Clin. Exp. Med. - 1990. - V. 172. - 869-878.

70. Heegaard N.H. Immunochemical characterization of interaction between circulating autologous immunoglobulin G and normal human erythrocyte membrane proteins // Biochim. Biophys. Acta - 1990. - V. 1023.-P. 239-246.

71. Hilliquin P. Biological markers in inflammatory rheumatic diseases // Cell. Mol. Biol. - 1995. - V. 41. - №. 8. - P. 993-1006.

72. Hinter H., Romani N, Stanzl U., et al. Phagocytosis of keratin filament aggregates following opsonization with IgG-anti-keratin filament

autoantibodies // J. Invest. Dermatol. - 1987. - V. 88. - P. 176-182.

73. Hoffman S.A., Madsen C.S. Brain specific autoantibodies in murine models of systemic lupus erythematosus // J. Neuroimmun. - 1990. - V. 30. - P. 229-335.

74. How A., Dent P.B., Liao S.K., Denburg J.A. Antineuronal antibodies in neuropsychiatric systemic lupus erythematosus // Arthritis Rheum. -1985.-V. 28.-P. 789-793.

75. Iakoubov L., Rokhlin O., Torchilin V. Anti-nuclear autoantibodies of the aged reactive against the surface of tumor but not normal cells // Immunol. Lett. - 1995. - V. 47. - №. 1-2. - P. 147-149.

76. Izui S., McConahey P.J., Dixon F.J. Increased spontaneous polyclonal activation of B lymphocytes in mice with spontaneous autoimmune disease // J. Immunol. - 1977. - V. 121. - P. 2213-2219.

77. Jiang M., He K., Yan C.L. Study on anti-histone fraction antibodies in patients with rheumatic diseases // Chung-Hua Nei Ko Tsa Chih Chinese J. Internal Med. - 1992. - V. 31. - №. 5. - P. 287-289, 317-318.

78. Kalunian K., Panosian-Sahakian N., Ebling F.M., et al. Idiotypic characteristics of immunoglobulins associated with systemic lupus erythematosus. Studies of antibodies deposited in glomeruli of humans // Arthritis Rheum. - 1989. - V. 32. - P. 513-522.

79. Kamei M., Kato M., Mochizuki K., Kuroda K., Sato S., Hashizume S., Yasumoto K., Murakami H., Nomoto K. Serodiagnosis of cancers by ELISA of anti-histone H2B antibody // Biotherapy - 1992. - V. 4. - №. 1. - P. 17-22.

80. Kheiri S.A., Fasy T.M., Billett H.H. Effects of HI histones and a monoclonal autoantibody to HI histones on clot formation in vitro: Possible implications in the antiphospholipid syndrome // Thrombosis Res. - 1996. - V. 82. - №. 1. - P. 43-50.

81. Kleine T.J., Gladfelter A., Lewis P.N., Lewis S.A. Histone-induced

damage of a mammalian epithelium: The conductive effect // American J. Physiol. - Cell Physiol. - 1995. - V. 37. - №. 5. - P. C1114-C1125.

82. Klouwen H.M., Appelman A.W.M., and Betel I. in "The Cell Nucleus, Metabolism and Radiosensitivity", Taylor & Francis, London - 1966. -p. 295.

83. Koffler D., Carr R., Angello V., et al. Antibodies to polynucleotides in human sera: antigenic specificity and relation to disease // J. Exp. Med. -1971. -V. 134. - P. 294-312.

84. Koike T., Tomioka H., Kumagai A. Antibodies cross-reactive with DNA and cardiolipin in patients with SLE // Clin. Exp. Imminol. - 1982. - V. 50. - P. 298-304.

85. Konstantinov K., Russanova V., Russeva V. Antibodies to histones and disease activity in systemic lupus erythematosus: a comparative study with an ELISA and immunoblotting // Arch. Dermatol. Res. - 1986. - V. 278. - P. 410.

86. Kunkel H.G., Holman H.R., Deicher H.R.G. Multiple "autoantibodies" to cell constituents in systemic lupus erythematosus // Ciba Found. Symp. - 1960.-P. 429-437.

87. Laemmli U.R. Most commonly used discontinuous buffer system for SDS electrophoresis // Nature - 1970. - V. 227. - P. 680.

88. Lafer E.M., Rauch J., Andrzejewski C. Jr. et al. Polyspecific monoclonal lupus autoantibodies reactive with both polynucleotides and phospholipids // J. Exp. Med. -1981. - V. 153. - P. 897-902.

89. Lakatos A., Setalo J., Jobst K., Par A. Relationship of serum antihistone antibody level to the patient's age // Acta Medica Hungarica - 1992-93. -V. 49.-№. 1-2.-P. 91-100.

90. Lawrence J.M., Moore T.L., Osborn T.G., Nesher G., Madson K.L., Kinsella M.B. Autoantibody studies in juvenile rheumatoid arthritis // Seminars in Arthritis Rheum. - 1993. - V. 22. - №. 4. - P. 265-274.

91. Leak A.M., Tuaillon N., Muller S., Woo P. Study of antibodies to histones and histone synthetic peptides in pauciarticular juvenile chronic arthritis // British J. Rheumatol. - 1993. - V. 32. - №. 5. - P. 426-431.

92. Louters L.L., Michele D.E., Pearson J.D. Histone H4 stimulates glucose uptake through the insulin receptor // Biochimie - 1996. - V. 78. - №. 1. - P. 39-45.

93. Lutz H. U. Erythrocyte clearance. Erythroid cells, in "Blood Cell Biochemistry" (J.R. Harris ed.), Plenum Press, New York and London -1990. Vol. 1,-p. 81-120.

94. Lutz H.U., Bussolino F., Flepp R., et al. Naturally occurring anti-band-3 antibodies and complement together mediate phagocytosis of oxidatively stressed human erythrocytes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1987. -V. 84. - P. 7368-7372.

95. Mach P.S., Kharouby M., Lutcher F. et al. The in vitro production of anti-double-stranded DNA antibodies by peripheral blood mononuclear cells from normals and patients with systemic lupus erythematosus // Clin. Exp. Immunol. - 1984. - V. 57. - P. 338-345.

96. Madaio M.P., Hodder S., Schwartz R.S., Stollar B.D. Responsiveness of autoimmune and normal mice to nucleic acid antigens // J. Immunol. -1986. -V. 132. - P. 872-875.

97. Mamula M.J., Fox O.F., Yamagata H., Harley J.B. The Ro/SSA autoantigen as an immunoggen. Some anti-Ro/SSA antibody binds IgG // J. Exp. Med. - 1986. - V. 86. - P. 1889-1901.

98. Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organism//J. Mol. Biol. - 1961. - V. 3. - P. 208-211.

99. Matsuura E., Igarashi Y., Fujimoto M., Ichikawa K., Koike T. Anticardiolipin cofactor(s) and differential diagnosis of autoimmune disease // Lancet - 1990. - V. 336. - P. 177-178.

100. McNeil H.P., Simpson R.J., Chesterman C.N., and Krilis S.A.

Antiphospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid-binding inhibitor of coagulation: beta2-glycoprotein I (apolipoprotein H) // Proc. Natl. Acad. Sci USA - 1990. - V. 87. - P. 4120-4124.

101. Mecheri S., Dannecker G., Dennig D., Poncet P., Hoffmann M.K. Anti-histone autoantibodies react specifically with the B cell surface // Mol. Immunol. - 1993. - V. 30. - №. 6. - P. 549-557.

102. Mecocci P., Ekman R., Parnetti L., Senin U. Antihistone and anti-dsDNA autoantibodies in Alzheimer's disease and vascular dementia // Biological Psychiatry - 1993. - V. 34. - №. 6. - P. 380-385.

103. Melero J., Tarrago D., Nunezroldan A., Sanchez B. Human polyreactive IgM monoclonal antibodies with blocking activity against self-reactive IgG// Scandinavian J. Immunol. - 1997. - V. 45. - №. 4. - P. 393-400.

104. Mevorach D., Zhou J.L., Song X., Elkon K.B. Systemic exposure to irradiated apoptotic cells induces autoantibody production // J. Exp. Med. - 1998. - V. 188. - №. 2. - P. 387-392.

105. Meziere C., Stqckl F., Batsford S., Vogt A., Muller S. Antibodies to DNA, chromatin core particles and histone in mice with graft-vermv-host disease and their involvement in glomerular injury // Clin. Exp. Immunol. - 1994. - V. 98. - P. 287-294.

106. Minota S., Jarjour W.N., Roubey R.A.S., et al. Reactivity of autoantibodies and DNA/anti-DNA complexes with a novel 110-kilodalton phosphoprotein in systemic lupus erythematosus and other diseases // J. Immunol. - 1990. - V. 144. - P. 1263-1269.

107. Minota S., Yoshio T., Iwamoto M., Takeda A., Masuyama J., Mimori A., Yamada A., Kano S. Selective accumulation of anti-histone antibodies in glomeruli of lupus-prone lpr mice // Clin. Immunol. Immunopath. - 1996. - V. 80. - №. 1. - P. 82-87.

108. Monestier M., Bonna C. Antibodies possessing multiple antigen

specificities and exhibiting extensive idiotypic cross-reactivity // Int. Rev. Immunol. - 1988. - V. 3. - P. 59-70.

109. Monestier M., Kotzin B.L. Antibodies to histones in systemic lupus erythematosus and drug-induced lupus syndromes // Rheum. Diseases Clinics of North America. - 1992. - V. 18. - №. 2. - P. 415-436.

110. Monestier M., Novick K.E., Karam E.T., Chabanne L., Monier J.C., Rigal D. Autoantibodies to histone, DNA and nucleosome antigens in canine systemic lupus erythematosus // Clin. Exp. Immunol. - 1995. - V. 99. -№. 1. - P. 37-41.

111. Monestier M., Stemmer C., Ong G.L., Muller S. Induction of anti-polycation antibodies in H-2(s) mice by immunization with nuclear antigens // Mol. Immunol. - 1997. - V. 34. - №. 1. - P. 39-51.

112. Monier J.C., Ritter J., Caux C., Chabanne L., Fournel C., Venet C., Rigal D. Canine systemic lupus erythematosus. II: Antinuclear antibodies // Lupus - 1992. - V. 1. - №. 5. - P. 287-293.

113. Morino N., Sakurai H., Yamada A., Yazaki Y., Minota S. Rabbit anti-chromatin antibodies recognize similar epitopes on a histone HI molecule as lupus autoantibodies // Clin. Immunol. Immunopath. - 1995. - V. 77.-№. l.-P. 52-58.

114. Muller S., Bonnier D., Thiry M., Van Regenmortel M.H.V. Reactivity of autoantibodies in systemic lupus erythematosus with synthetic core histone peptides // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. - 1989. - V. 89. -P. 288-296.

115. Muller S., Chaix M.L., Briand J.P., Van Regenmortel M.H.V. Immunogenicity of free histones and of histones complexed with RNA // Mol. Immunol. - 1991. - V. 28. - P. 763-772.

116. Muller S., Van Regenmortel M.H.V. Specificity of anti-histone autoantibodies in systemic rheumatic disease // Internatl. J. Immunopath. Pharmacol. - 1988. - V. 1. - №. 2. - P. 139-148.

117. Nakamura M., Burastero S.E., Ueki Y., Larrick J.W., Notkins A.L., Casali P. Probing the normal and autoimmune B cell repertoire with Epstein-Barr virus // J. Immunol. - 1988. - V. 141. - P. 4165-4172.

118. Naparstek Y., Ben-Yehuda A., Cohen I.R., Bar-Tana R. Cross-reactivity of anti-DNA antibodies // Immunol. Today. - 1990. - V. 11. - P. 388289.

119. Naparstek Y., Schwartz J.A., Manser T. et al. A single germ-line Vh gene segment of normal A/J mice encodes autoantibodies characteristic of systemic lupus erythematosus // J. Exp. Med. - 1986. - V. 164. - P. 614-626.

120. Navin T. R., Krug E. C., Pearson R. D. Effect of immunoglobulin M from normal human serum on Leishmania donovani promastigote agglutination, comlement-madiated killing and phagocytosis by human monocytes //Infect. Immunol. - 1989. - V. 57. - P. 1343-1346.

121. Notkins A.L., Prabhakar B.S. Monoclonal autoantibodies that react with multiply organs. Basis for reactivity // Autoimmunity. - 1986. - V. 475. -P. 123-134.

122. Okada S. Cells in "Radiation Biochemistry" (K.I. Altman, G.B. Gerber, S. Okada, ed.), Academic Press, New York - 1970. - Vol. 1. - p. 366.

123. Olhoffer I.H., Peng S.L., Craft J. Revisiting autoantibody profiles in systemic lupus erythematosus // J. Rheumatol. - 1997. - V. 24. - №. 2. -P. 297-302.

124. Pandey J.P., Fundenberg H.H., Ainsworth S.K., Loadholt C.B. Autoantibodies in healthy subjects of different age groups // Mech. Ageing Dev. - 1970. - V. 10. - P. 399-404.

125. Paul E., Manheimer-Lory A., Livneh A., et al. Pathogenic anti-DNA antibodies in SLE: idiotypic families and genetic origins // Int. Rev. Immunol. - 1990. - V. 5. - P. 295-313.

126. Pereira L.F., Marco F.M., Boimorto R., Caturla A., Bustos A., De la

Concha E.G., Subiza J.L. Histones interact with anionic phospholipids with high avidity; its relevance for the binding of histone-antihistone immune complexes // Clin. Exp. Immunol. - 1994. - V. 97. - №. 2. - P. 175-180.

127. Pisetsky D.S., Caster S.A. Binding specificity of a monoclonal anti-DNA antibody // Mol. Immunol. - 1982. - V. 19. - P. 645-649.

128. Poncet P., Matthes T., Billecocq A., et al. Immunochemical studies of poly specific natural autoantibodies: charge, lipid reactivity, Fab2' fragments activity and complement fixation // Mol. Immunol. - 1988. -V. 25. - P. 981-989.

129. Portanova J.P., Arndt R.E., Kotzin B.L. Selective production of autoantibodies in graft-vs-host induced and spontaneous murine lupus. Predominant reactivity with histone regions accessible in chromatin // J. Immunol. - 1988. - V. 140. - P. 755-760.

130. Portanova J.P., Claman H.N., Kotzin B.L. Autoimmunization in murine graft-vs-host diseases. I. Selective production of antibodies to histones andDNA//J. Immunol. - 1985. - V. 135. - P. 3850-3856.

131. Rakowiczszulczynska E.M., Mcintosh D.G., Lewis P., Smith M.L. Inhibition of cancer cell growth by internalized immuno-histone conjugates // Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals - 1996. - V. 11. -№. 1. - P. 77-86.

132. Reumaux D., Meziere C., Colombel J.F., Duthilleul P., Muller S. Distinct production of autoantibodies to nuclear components in ulcerative colitis and in Crohn's disease // Clin. Immunol. Immunopath. - 1995. - V. 77. - №. 3. - P. 349-357.

133. Rosenberg A.M., Hauta S.A., Prokopchuk P.A., Romanchuk K.G. Studies on associations of antinuclear antibodies with antibodies to an uveito genie peptide of retinal S antigen in children with uveitis // J. Rheum. - 1996. - V. 23. - №. 2. - P. 370-373.

134. Rubin R.L. Autoantibody specificity in drug-induced lupus and neutrophil-mediated metabolism of lupus-inducing drugs // Clin. Biochem. - 1992. - V. 25. - №. 3. - P. 223-234.

135. Rubin R.L., Carr R. Anti-DNA activity of F(ab')2 from normal human serum // J. Immunol. - 1979. - V. 122. - P. 1604-1609.

136. Rubin R.L., Salderas R.S., Tan E.M. et al. Multiple autoantigen binding capabilities of mouse monoclonal antibodies selected for rheumatoid factor activity // J. Exp. Med. - 1984. - V. 159. - P. 1429-1440.

137. Rubin R.L., Tang F.L., Tsay G., Pollard K.M. Pseudoautoimmunity in normal mice: anti-histone antibodies elicited by immunization versus induction during graft-versus-host reaction // Clin. Immunol. Immunopathol. - 1990. - V. 54. - P. 320-332.

138. Rubini J.D.R., Becker E.R., Stahman M.A. Effect of synthetic lysine polypeptides on rabbit blood coagulation // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1953.-V. 82.-P. 321-324.

139. Rytomaa M., Kinnunen P.K.J. Dissociation of cytochrome C from liposomes by histone HI. Comparison with basic peptides // Biochem. -1996. - V. 35. - №. 14. - P. 4529-4539.

140. Sato S., Fujimoto M., Ihn H., Kikuchi K., Takehara K. Clinical characteristics associated with antihistone antibodies in patients with localized scleroderma // J. American Acad. Dermatol. - 1994. - V. 31. -№. 4.-P. 567-571.

141. Sato S., Ihn H., Soma Y., Igarashi A., Tamaki T., Kikuchi K., Ishibashi Y., Takehara K. Antihistone antibodies in patients with localized scleroderma // Arthritis Rheum. - 1993. - V. 36. - №. 8. - P. 1137-1141.

142. Satoh J., Prabhakar B.S., Haspel M.V. et al. Human monoclonal autoantibodies that react with multiply endocrine organs // New Engl. J. Med. - 1983. - V. 309. - P. 217-220.

143. Schmiedeke T.M., Stockl F.W., Weber R., Sugisaki Y., Batsford S.R.,

Vogt A. Histones have high affinity for the glomerular basement membrane. Relevance for immune complex formation lupus nephritis // J. Exp. Med. - 1988. - V. 169. - P. 1879.

144. Schwartz R.S. Anti-DNA antibodies and the problem of autoimmunity // Cell. Immunol. - 1986. - V. 99. - P. 38-43.

145. Schwartz R.S., Datta S.K. Autoimmunity and autoimmune diseases, in: Fundamental Immunology. (W.E. Paul, ed.) New York: Raven Press. -1989. - P. 819-866.

146. Shapiro P.E., McAllister G., Lerner E.A., Lerner M.R. Healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus have unique, pesonspecific spectra of antibodies detectable on immunoblots // Clin. Immunol. Immunopathol. -1991. - V. 59. - P. 129-138.

147. Spivak B., Radwan M., Bartur P., Mester R., Weizman A. Antinuclear autoantibodies in chronic schizophrenia // Acta Psychiatrica Scandinavica - 1995. - V. 92. - №. 4. - P. 266-269.

148. Stemmer C., Tuaillon N, Prieur A.M., Muller S. Mapping of B-cell epitopes recognized by antibodies to histones in subsets of juvenile chronic arthritis // Clin. Immunol. Immunopathol. - 1995. - V. 76. - №. 1 (Pt. 1). - P. 82-89.

149. Stollar B.D. Immunochemical analysis of chromosomal properties. Chapter 7: Serological analyses of histones in "Methods of Cell Biology" Academic Press - 1978. - V. 18. - P. 105-122.

150. Subiza J.L., Caturla A., Pascual-Salcedo D., et al. DNA-anti-DNA complexes account for part of the antihistone activity found in patients with systemic lupus erythematosus // Arthritis Rheum. - 1989. - V. 32. -P. 406-412.

151. TanE.M. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA). Their immunology and medicine // Adv. Immunol. - 1982. - V. 33. - P. 167-240.

152. Tomer Y., Shoenfeld Y. The significance of natural antibodies //

Immunol. Invest. - 1988. - V. 17. - P. 389-424.

153. Trowell O.A. in "Cell and Tissues in Culture" (E.N. Willmer, ed.), Academic Press, New York - 1966. - Vol. 3. - p. 63.

154. Vanbruggen M.C.J., Walgreen B., Rijke T.P.M., Tamboer W., Kramers K., Smeenk R.J.T., Monestier M., Fournie G.J., Berden J.H.M. Antigen specificity of anti-nuclear antibodies complexed to nucleosomes determines glomerular basement membrane binding in vivo II Europ. J. Immunol. - 1997. - V. 27. - №. 6. - P. 1564-1569.

155. Vazquez-Del Mercado M., Casiano C.A., Rubin R.L. IgA antihistone antibodies in isoniazid-treated tuberculosis patients // Autoimmunity -1995.-V. 20.-№. 2.-P. 105-111.

156. Voll R.E., Roth E.A., Girkontaite I., Fehr H., Herrmann M., Lorenz

H.M., Kalden J.R. Histone-specific ThO and Thl clones derived from systemic lupus erythematosus patients induce double-stranded DNA antibody production // Arthritis Rheum. - 1997. - V. 40. - №. 12. - P. 2162-2171.

157. Williams W.M., Whalley A.S., Comacchio R.M., Rosenberg J., Watts R.A., Isenberg D.A., Mccutchan J.A., Morrow W.J.W. Correlation between expression of antibodies to histone H2B and clinical activity in HIV-infected individuals // Clin. Exp. Immunol. - 1996. - V. 104. - №.

I.-P. 18-24.

158. Witz I.P., Yaakubowicz M., Gelernter I., et al. Studies on the level of natural antibodies reactive with various tumor cells during urethane carcinogenesis in BALB/c mice // Immunobiol. - 1984. - V. 166. - P. 131-145.

159. Wold R.T., Young F.E., Tan E.M., Farr R.S. Deoxyribonucleic acid-antibody: a method to detect its primary interaction with deoxyribonucleic acid // Science - 1968. - V. 161. - P. 806-807.

160. Xavier R.M., Yamauchi Y., Nakamura M., Tanigawa Y., Ishikura H.,

Tsunematsu T., Kobayashi S. Antinuclear antibodies in healthy aging people: a prospective study // Mechanisms of Ageing & Development -1995. - V. 78. - №. 2. - P. 145-154.

161. Zamulaeva I.A., Lekakh I.V., Kiseleva V.I., Gabai V.L., Saenko A.S., Shevchenko A.S., Poverenny A.M. Natural hidden antibodies reacting with DNA or cardiolipin bind to thymocytes and evoke their death // FEBS Lett. - 1997. - V. 413. - №. 2. - P. 231-235.

162. Zhivatovsky B., Orrenius S., Brustugun O.T., Doskeland S.O. Injected cytochrome c induces apoptosis //Nature - 1998. - V. 391. - P. 449-450.

163. Zunino S.J., Singh M.K., Bass J., Picker L.J. Immunodetection of histone epitopes correlates with early stages of apoptosis in activated human peripheral T lymphocytes // American J. Pathol. - 1996. - V. 149. - №. 2. - P. 653-663.