Применение siRNA для подавления репродукции респираторного синцитиального вируса, одного из этиологических агентов вирус-индуцированной бронхиальной астмы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат медицинских наук Акимов, Виталий Сергеевич

• Акимов, Виталий Сергеевич
• кандидат медицинских наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Акимов, Виталий Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. РСВ и вирус-индуцированная бронхиальная астма.

1.1.1. Респираторные вирусные инфекции и бронхиальная астма.

1.1.2. Противовирусный иммунитет у человека.

1.1.3. Механизмы ухода вирусов от иммунологического контроля.

1.1.4. Клиническая значимость РСВ-инфекции.

1.1.5. Особенности восприимчивости макроорганизма к РСВ-инфекции.

1.1.6. Связь РСВ-инфекции с бронхиальной астмой. Роль баланса между ТЫ и ТЬ2 типами иммунного ответа.

1.2. Интерференция РНК.

1.2.1. История открытия.

1.2.2. Механизм интерференции РНК.

1.3. Проблема терапии и профилактики РСВ-инфекции и перспективы использования механизма интерференции РНК.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Культуральный штамм вируса и клеточная линия.

2.1.2. Экспериментальные животные.

2.1.3. Основные реактивы, использованные в работе.

2.1.4. Программное обеспечение и аппаратное оборудование, использованное в работе.

2.2. Методы.

2.2.1. Культивирование клеток и вируса.

2.2.2. Трансфекция клеток МА104 siRNA и заражение респираторно-синцитиальным вирусом.

2.2.3. Контроль трансфекции siRNA.

2.2.4. Титрование вируса в культуральной жидкости по ЦПД определением конечной точки.

2.2.5. Определение количества вирусной РНК в культуральной жидкости методом обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green-1.

2.2.6. Концентрирование вируса преципитацией полиэтиленгликолем.

2.2.7. Экспериментальная модель инфекции PCB на мышах.

2.2.8. Титрование вируса в смывах из легких мышей.

2.2.9. Определение количества вирусной РНК в гомогенатах легких мышей методом ОТ и ПЦР-РВ с использованием флуоресцентно-меченного зонда TaqMan Assay.

2.2.10. Статистический анализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Изучение генома PCB.

3.2. Дизайн siRNA против мРНК белка Р PCB.

3.3. Оценка антивирусной активности siRNA против мРНК белка Р PCB в культуре клеток.

3.3.1. Микроскопическая оценка состояния зараженных вирусом клеток, обработанных специфическими и неспецифическими siRNA.

3.3.2. Оценка противовирусной активности siRNA методом титрования.

3.3.3. Оценка противовирусной активности siRNA путем определения в культуральной жидкости количества вирусной РНК методом ПЦР в реальном времени.

3.4. Оценка антивирусной активности siRNA против мРНК белка Р PCB в экспериментальной модели инфекции на мышах.

3.4.1. Титрование вируса в бронхоальвеолярных смывах их легких мышей и патологоанатомическая оценка состояния легких.

3.4.2. Определение количества вирусной РНК в гомогенатах легких методом ПЦР в реальном времени.

3.5. Выявление наиболее эффективных siRNA против мРНК белка Р PCB

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Применение siRNA для подавления репродукции респираторного синцитиального вируса, одного из этиологических агентов вирус-индуцированной бронхиальной астмы»

Актуальность проблемы.

Респираторно-синцитиальный вирус является одним из главных этиологических факторов вирус-индуцированной бронхиальной астмы [10,86]. Доказано, что перенесенная в детском возрасте РСВ-инфекция, приводит к развитию гиперчувствительности дыхательных путей у детей и к развитию бронхиальной астмы в дальнейшей жизни [108]. РСВ-инфекция - одна из главных причин тяжелых заболеваний верхних и нижних дыхательных путей у новорожденных и детей раннего возраста. Инфекция PCB у новорожденных сопряжена с высокой смертностью, что отчасти связано с недостатком эффективных лекарственных средств. Ежегодно в мире в результате заболеваний нижних дыхательных путей, связанных с PCB, умирает несколько миллионов детей младше 5 лет. PCB вызывает инфекцию нижних дыхательных путей в примерно 40% случаев первичного инфицирования [149]. Показано, что PCB является основной причиной заболеваемости и смертности у пожилых людей, взрослых и детей с ослабленным иммунитетом [47,49].

Хорошо известно, что вирусные инфекции являются важными факторами возникновения дыхательной обструкции у больных бронхиальной астмой. Это в первую очередь связано с колонизацией вирусами эпителия дыхательных путей, клетки которого продуцируют большое количество провоспалительных цитокинов и медиаторов, усиливающих воспалительный процесс [56]. Установлено, что у больных атопической бронхиальной астмой респираторная вирусная инфекция усиливает гиперреактивность бронхов [42,46]. По различным данным от 60% до 85% обострений бронхиальной астмы у детей и до 50% обострений бронхиальной астмы у взрослых связаны с респираторными вирусами [58,86,118]. В связи с этим появилось основание для характеристики обострений бронхиальной астмы, ассоциированных с ОРВИ, термином вирус-индуцированная бронхиальная астма.

Подходы к терапии вирус-индуцированных обострений заболеваний респираторного тракта недостаточно эффективны [24,149]. На сегодняшний день не существует эффективной вакцины против PCB. В клинической практике для лечения РСВ-инфекции, в том числе тяжелых состояний, таких как бронхиолит и пневмония, обычно используется только симптоматическая терапия. Эффективность рибавирина по результатам последних исследований поставлена под сомнение. Противовирусные средства на основе моноклональных антител обладают очень высокой стоимостью и не доступны для повсеместного клинического применения. Таким образом, во всем мире существует острая потребность в создании нового эффективного средства против респираторно-синцитиальной вирусной инфекции.

В 2006 году лауреатами Нобелевской премии в области физиологии и медицины за открытие интерференции РНК стали американские ученые Эндрю Файр и Крег Мелло [52,53,111]. Интерференция РНК - это РНК-зависимый механизм регуляции экспрессии генов, в котором двухцепочечная рибонуклеиновая кислота ингибирует экспрессию генов с комплементарной нуклеотидной последовательностью. Среди прочих важных функций этот механизм позволяет клетке защищаться от чужеродного генетического материала, прежде всего от вирусов. При попадании в клетку двухцепочечной РНК она разрезается РНКазаШ-подобным ферментом, который называется Dicer, на короткие двухцепочечные РНК длиной 21-23 пары нуклеотидов - siRNA (от англ. small interfering RNA) [20,163]. Эти siRNA включаются в состав сложного эффекторного белкового комплекса RISC (RNAi-induced silencing complex), обнаруживающего и разрушающую мРНК-мишень, соответствующую данной siRNA [106]. Это значит, что введение в клетку siRNA против конкретной мРНК-мишени приводит к сайленсингу соответствующего белка, в том числе и вирусного белка. В связи с этим, возможность разработки нового антивирусного средства специфического действия против PCB на основе механизма интерференции РНК является весьма перспективной.

Цель работы: разработка подхода, основанного на использовании механизма интерференции РНК, для подавления репликации PCB - основного этиологического фактора возникновения бронхиолита у детей, а также причинозначимого фактора, предраспологающего к развитию бронхообструктивного синдрома и бронхиальной астмы, и одной из основных причин вирус-индуцированных обострений бронхиальной астмы у детей и взрослых.

Задачи:

1. Проанализировать геном PCB.

2. Произвести дизайн siRNA против мРНК кандидатного белка-мишени PCB.

3. Оценить антивирусную активность siRNA против мРНК белка-мишени PCB in vitro в культуре клеток.

4. Оценить антивирусную активность siRNA против мРНК белка-мишени PCB in vivo на мышах.

5. Выявить наиболее эффективные siRNA против мРНК белка-мишени PCB.

Научная новизна.

Впервые в Российской Федерации экспериментально изучена возможность использования средств на основе siRNA против вирусов на клеточной модели и на экспериментальных животных.

Проведен дизайн siRNA против мРНК белка Р PCB, спроектированы 6 уникальных экспериментальных образцов siRNA, получивших рабочие названия siOl, si03, si05, si07, si09 и sill, нацеленных к различным участкам мРНК белка Р PCB в пределах открытой рамки считывания.

На модели РСВ-инфекции в культуре клеток МА104 проведена оценка противовирусного действия 6 экспериментальных образцов и препарата смеси этих образцов, названного siMix, при помощи микроскопического наблюдения за состоянием монослоя клеток, методом титрования вируса и определением количества вирусной РНК в культуральной жидкости методом ПЦР в реальном времени по сравнению с неспецифической siRNA к мРНК белка VP4 риновируса 16 серотипа. Подобранные специфические siRNA эффективно подавляют репродукцию PCB в культуре клеток.

Получена экспериментальная модель РСВ-инфекции на мышах BALB/C. На основании полученных данных о противовирусной активности siRNA в культуре клеток, выбраны 3 наиболее эффективные последовательности siRNA (siOl, si03, si07), действие которых испытаны на мышиной модели инфекции PCB. Специфичность действия siRNA контролировали посредством использования siRNA к мРНК белка VP4 риновируса 16 серотипа. Оценку противовирусной активности проводили путем определения количества вирусной РНК PCB в гомогенатах легких мышей методом ПЦР в реальном времени, а также патологоанатомической оценкой состояния легких мышей и при помощи титрования вируса из легочных смывов. Полученные во второй части работы данные согласуются с эффективностью siRNA, полученными нами в культуре клеток.

Проведенные исследования in vitro и in vivo продемонстрировали противовирусную активность испытанных экспериментальных образцов посредством подавления репликации PCB, что дает возможность для создания специфических противовирусных средств на основе механизма интерефернции РНК.

Практическая значимость.

На сегодняшний день в мире не существует эффективных лекарственных средств для лечения РСВ-инфекции, являющейся основной причиной таких тяжелых состояний как бронхиолит у детей, пневмония у детей и взрослых, а также одной из главных причин вирус-индуцированной бронхиальной астмы. Для решения этой актуальной проблемы в данной работе показана возможность применения механизма интерференции РНК для создания эффективных лекарственных средств сиквенс-специфического действия против PCB.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Акимов, Виталий Сергеевич

выводы

1. Белок Р является успешной мишенью для эффективного подавления PCB при помощи siRNA.

2. siRNA к мРНК белка Р PCB эффективно снижает репликацию PCB in vitro в культуре клеток.

3. siRNA к мРНК белка Р PCB эффективно снижает репликацию PCB in vivo на мышах.

4. Выявлены наиболее эффективные siRNA против мРНК белка Р PCB.

5. siRNA обладает специфическим действием, не оказывает влияния на уровень транскрипции других белков

6. siRNA может использоваться в качестве специфического противовирусного средства, не влияющего на нормально протекающие процессы в клетке.

7. siRNA может применяться в качестве противовирусного средства без специальных средств доставки в чистом виде при эндотрахеальном/ингаляционном введении, что может использовано при создании средств против респираторных вирусов

8. Использование siRNA в качестве противовирусного средства представляется сравнительно простой и недорогой методикой, требующей лишь выбора белка-мишени вируса, знания методики дизайна siRNA и синтеза олигонуклеотидов, который в настоящее время стал доступен.

9. Показана возможность создания эффективного лекарственного средства против PCB, одного из основных этиологических факторов вирус-индуцированной бронхиальной астмы, с использованием механизма интерференции РНК.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Акимов, Виталий Сергеевич, 2008 год

1. Белоусов Ю.Б., Карпов О.И., Леонова М.В., Ефременкова О.В. Клинико-экономическая оценка средств, применяемых для профилактики и лечения ОРВИ. Качественная клиническая практика, спецвыпуск "Профилактика и лечение ОРВИ", 2002, с. 24.

2. Вирусология. Методы. Пер. с англ. Под. ред. Б. Мейхи. М., Мир, 1988, 344 с.

3. Коростовцев Д.С., Макарова И.В. Смертность при бронхиальной астме у детей. Материалы по Санкт-Петербургу за 24 года. Аллергология, 1999, №1, с. 19-26.

4. Петров Р.В., Хаитов P.M. Исскуственные антигены и вакцины. М., Медицина, 1988, с. 228.

5. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М., Мир, 2000, с. 305-315.

6. Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию вивариев. Утверждены Главным Государственным санитарным врачом, от 06.04.1973. № 1045-73.

7. Семенов Б.Ф., Хозинский В.В. Аутоиммунитет при вирусных инфекциях. Итоги науки и техники. Вирусология, 1993, т. 26, с. 5-44.

8. Слепушкин А.Н., Власова Л.Н. Профилактика гриппа и ОРВИ. РМЖ, 2001, т. 9, с. 16-17.

9. Федосеев Г.Б., Трофимов В.И. Бронхиальная астма. СПб, 2006. 308 с.

10. Ю.Хаитов М.Р., Алексеев Л.П., Трофимов Д.Ю., Болдырева М.Н., Петрова Т.В., Яковлева К.П. Изучение роли респираторных вирусов в этиологии и патогенезе бронхиальной астмы. Иммунология, 2003, т. 24, № 2, с. 96-99.

11. П.Холмер А.Ф. Новые препараты для лечения инфекционных заболеваний. Провизор, 2005, № 10.

12. Чучалин А.Г. Национальная программа «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика». РМЖ, 1998, т. 2, № 2.

13. А1рег С.М., Doyle W.J., Skoner D.P. et al. Prechallenge antibodies: moderators of infection rate, signs, and symptoms in adults experimentally challenged withrhinovirustvpe 35.Xarvngoscope. 1996, v .106, p. 1298-l 305

14. American Academy of Pediatrics Committee on Infectious Diseases. Reassessment of the indications for ribavirin therapy in respiratory syncytial virus infections. Pediatrics, 1996, v. 97(1), p. 137-140.

15. Bacon K.B., Premack B.A., Gardner P., Schall T.J. Activation of dual T cell signalling pathways by the chemokine RANTES. Science, 1995, v. 269, p. 17271730. .

16. Barik S. Development of gene-specific double-stranded RNA drugs. Ann Med, 2004, v. 36(7), p. 540-51.

17. Barr F.E., Pedigo H., Johnson T.R., Shepherd V.L. Surfactant protein-a enhances uptake of respiratory syncytial virus by monocytes and U937 macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol, 2000, v. 23, p. 586-592.

18. Bennett C.F., Cowsert L.M. Application of antisense oligonucleotides for gene functionalization and target validation. J Curr Opin Mol Ther, 1999, v. 1(3), p. 359371.

19. Bernstein E., Caudy A.A., Hammond S.M. et al. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature, 2001, v. 409, p. 363-366.

20. Bitko V., Barik S. Phenotypic silencing of cytoplasmatic genes using sequence-specific double-stranded short interfering RNA and its application in the reverse genetics of wild type negative-strand RNA viruses. BMC Microbiol, 2001, v. 1, p. 34.

21. Bitko V., Musienko A., Shulyeva O., Barik S. Inhibition of respiratory viruses by nasally administered siRNA. Nature Medicine, 2005, v. 11, N 1, p. 50-55.

22. Bitko V., Musiyenko A., Barik S. Viral Infection of the Lungs through the Eye. J Virology, 2007, N 1, p. 783-790.

23. Black C.P. Systematic Review of the Biology and Medical Management of Respiratory Syncytial Virus Infection. Respiratory care, 2003, v. 48, № 3, p. 231233.

24. Boyce T.G., Mellen B.G., Mitchel Jr. E.F., Wright P.F., Griffin M. R. Rates of hospitalization for respiratory syncytial virus infection among children in Medicaid. J Pediatr, 2000, v. 137, p. 865-870.

25. Brandenburg A.H., Neijens H.J., Osterhaus A.D. Pathogenesis of RSV lower respiratory tract infection: implications for vaccine development. Vaccine, 2001, v. 19, p. 2769-2782.

26. Bridge A.J., Pebernard S., Ducraux A., Nicoulaz A.L., Iggo R. Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells. Nat Genet, 2003, v. 34, p. 263-264.

27. Busse W.W. Mechanisms and advances in allergic diseases. J Allergy Clin Immunol, 2000, v. 105(6 Pt 2), p. 593-598.

28. Cane P.A. Molecular epidemiology of respiratory syncytial virus. Rev Med Virol, 2001,v,ll(2), p. 103-116.

29. Caplen N.J., Parrish S., Imani F., Fire A., Morgan R.A. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrates and vertebrate systems. Proc Natl Acad Sei USA, 2001, v. 98, p. 9746-9747.

30. Choi E.H., Lee H.J., Yoo T., Chanock S.J. A common haplotype of interleukin-4 gene IL4 is associated with severe respiratory syncytial virus disease in korean children. J Infect Dis, 2002, v. 186, p. 1207-1211.

31. Cianci C., Genovesi E.V., Lamb L., Medina I., Yang Zh. Oral Efficacy of a Respiratory Syncytial Virus Inhibitor in Rodent Models of Infection. Antimicrobial agents and chemotherapy, 2004, p. 2448-2454.

32. Cogoni C, Macino G. Post-transcriptional gene silencing across kingdoms. Genes Dev, 2000, v. 10, p. 638-643.

33. Collins P.L. The molecular biology of human respiratory syncytial virus (RSV) of the genus Pneumovirus. In The Paramyxoviruses, Kingsbury D.W. Plenum Press: New York and London, 1991, p. 103-162.

34. Constant S.L., Bottomly K. Induction of Thl and Th2 CD4+ T cell responses: the alternative approaches. Annu Rev Immunol, 1997, v. 15, p. 297-322.

35. Coyle A.J., Erard F., Bertrand C., Walti S., Pircher H., Le Gros G. Virus Specific CD8+ cells can switch to interleukin 5 production and induce airway eosinofilia. J Exp Med, 1995, v. 181, p. 1229-33.

36. Crowe Jr. J.E., Williams J.V. Immunology of viral respiratory tract infection-ininfancy.Paediatr-RespirRev,2003,-v.-4,p.112-119-.

37. Dabbous I.A., Tkachyk J.S., Stamm S.J. A double blind study of the effects of corticosteroids in the treatment of bronchiolitis. Pediatrics, 1966, v. 37(3), p. 477484.

38. Dall'acqua W.F., Kiener P.A., Wu H. Properties of human IgGls engineered for enhanced binding to FcRn. J Biol Chem, 2006, v. 281(33), p. 23514-23524.

39. Damle N.K., Aruffo A. Vascular cell adhesion molecule 1 induces T-cell antigen receptor-dependent activation of CD4+T lymphocytes. Natl Acad Sci USA, 1991, v. 88, p. 6403-6407.

40. Domachowske J.B., Bonville C.A., Rosenberg H.F. Animal Models for Studying Respiratory Syncytial Virus Infection and Its Long Term Effects on Lung Function. J Pediatr Infect Dis, 2004, v. 23, p. 228-234.

41. Einarsson O., Geba G.P., Zhu Z., Landry M., Elias J.A. Interleukin-11: stimulation in vivo and in vitro by respiratory viruses and induction of airways hyperresponsiveness. J Clin Invest, 1996 , v. 97, p. 915-924.

42. Elbashir S.M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin A., Weber K., Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature, 2001, v. 411, p. 494-498.

43. Elbashir S.M., Lendeckel W., Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs Genes Dev, 2001, v. 15(2), p. 188-200.

44. Elbashir S.M., Martinez J., Patkaniowska A., Lendeckel W., Tuschl T. Functional anatomy of siRNA for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogasierembryp lysate. J EMBO, 2001, v. 20, p. 6877-6888.

45. Empey D.W., Laitinen L.A., Jacobs L., Gold W.M., Nadel J.A. Mechanisms of bronchial hyperreactivity in normal subjects after upper respiratory tract infection. Am Rev Respi. Dis, 1976, v. 113, p 131-139.

46. Englund J.A., Piedra P.A., Whimbey E. Prevention and treatment of respiratory syncytial virus and parainfluenza viruses in immunocompromised patients. Am J Med, 1997, v. 102, p. 61-70.

47. Escuissato D.L., Gasparetto E.L., Marchiori E., Rocha G.M., Inoue C., Pasquini R. et al. Pulmonary infections after bone marrow transplantation: high-resolution CT findings in 111 patients. AJR Am J Roentgenol, 2005, v. 185, p. 608-615.

48. Falsey A.R., Walsh E.E. Respiratory syncytial virus infection in adults. Clin Microbiol Rev, 2000, v. 13, p. 371-384.

49. Falsey A.R., Hennessey P.A., Formica M.A., Cox C., Walsh E.E. Respiratory syncytial virus infection in elderly and high-risk adults. N Engl J Med, 2005, v. 352, p. 1749-1759.

50. Fearns R., Collins P.L. Role of the M2-1 transcription antitermination protein of respiratory syncytial virus in sequential transcription. J Virol, 1999, v. 73, p. 58525864.

51. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998, v. 391, p. 806-811.

52. Fire A.Z. Gene Silencing by Double-Stranded RNA (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl, 2007, v. 46(37), p. 6966-84.

53. Garcia-Sastre A., Biron C.A. Type I interferons and the virus-hostrelationsip: a lesson in détente. Science, 2006, v. 312, p. 879-882.

54. Geiss G., Jin G. et al. A comprehensive view of regulation of gene expression by double-stranded RNA-mediated cell signaling. J Biol Chem, 2001, v. 276, p. 3017830182.

55. Gern J.E., Busse W.W. The effects of rhinovirus infections on allergic airway responses. Am J Respir Crit Care Med, 1995, v. 152, p. 40-45.

56. Gern J.E., Vrtis R., Kelly E.A., Dick E.C., Busse W.W. Rhinovirus produces nonspecific activation of lymphocytes through a monocyte-dependent mechanism. J Immunol, 1996, v. 157, p. 1605-1612.

57. Gern J.E., Busse W.W. Association of rhinovirus infections with asthma. Clin Microbiol Rev, 1999, v. 12, p. 9-18.

58. GINA-2002 (Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы Национальный институт сердца, легких и крови). Пер. с англ. — Пересмотр 2002,160 е., с. 22-34.

59. Glezen W.P., Taber L.H., Frank A.L., Kasel J.A. Risk of primary infection and reinfection with respiratory syncytial virus. Am J Dis Child, 1986, v. 140, p. 543546.

60. Gonzalez-Reyes L., Ruiz-Arguello M.B. et al. Cleavage of the human respiratory syncytial virus fusion protein at two distinct sites is required for activation of membrane fusion. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, v. 98, p. 9859-9864.

61. Graham B.S., Johnson T.R., Peebles R.S. Immune-mediated disease pathogenesis in respiratory syncytial virus infection. Immunopharmacology, 2000, v. 48, p. 237247.

62. Grishok A., Tabar H., Mello C.C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science, 2000, v. 287, p. 2494-2497.

63. Groothuis J.R., Gutierrez K.M., Lauer B.A. Respiratory syncytial virus infection in children with bronchopulmonary dysplasia. Pediatrics, 1988, v. 82, p. 199-203.

64. Guo S., Kempheus K.J. Par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell, 1995, v. 81, p. 611-620.

65. Guru T. A silence that speaks volumes. Nature, 2000, v. 404, p. 804-808.

66. Hall C.B., Hall W.J., Speers D.M. Clinical and physiological manifestations of bronchiolitis and pneumonia. Outcome of respiratory syncytial virus. Am J Dis Child, 1979, v. 133, p. 798-802.

67. Hamilton A.J., Baulcombe D.C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science, 1999, v. 286, p. 950-952.

68. Hammond S.M., Caudy A.A., Hannon G.J. Post-transcriptional Gene Silencing by Double-stranded RNA. Nature Rev Gen, 2001, v. 2, p. 110-119.

69. Hastings G.Z., Francis M.J., Rowlands D.J., Chain B.M. Epitope analysis of the T cell response to a complex antigen: proliferative responses to human rhinovirus capsids. Eur J Immunol, 1993, v. 23, p. 2300-2305.

70. Hawk C.T., Leary S.L., Morris T.H. Formulary for Laboratory Animals (3rd Edition). Blackwell Publishing, Ames, 2005, 203 pp.

71. Haynes L.M., Moore D.D., Kurt-Jones E.A., Finberg R.W., Anderson L.J., Tripp R.A. Involvement of toll-like receptor 4 in innate immunity to respiratory syncytial virus. J Virol, 2001, v. 15, p. 10730-10737.

72. Hemming V.G. Respiratory syncytial virus: a brief history. In: Weisman L.E., Groothuis J.R. Contemporary diagnosis and management of respiratory syncytial virus. Newtown PA: Handbooks in Health Care Co, 2000, p. 7-23.

73. Hoebee B., Rietveld E., Bont L., Oosten M., Hodemaekers H.M., Nagelkerke N.J. et al. Association of severe respiratory syncytial virus bronchiolitis with interleukin-4 and interleukin-4 receptor alpha polymorphisms. J Infect Dis, 2003, v. 187, p. 2-11.

74. Holen T., Amarzguioui M., Wiiger M., Babaie E., Prydz H. Positional effects of short interferning RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor. Nucleic Acids Research. 2002, v. 30(8), p. 1757-1766.

75. Hull J., Thomson A., Kwiatkowski D. Association of respiratory syncytial virus bronchiolitis with the interleukin 8 gene region in UK families. Thorax, 2000, v. 55, p.1023-1027.

76. Hull J., Ackerman H., Isles K., Usen S., Pinder M., Thomson A. et al. Unusual haplotypic structure of IL8, a susceptibility locus for a common respiratory virus. Am J Hum Genet, 2001, v. 69, p. 413-419.

77. Hutvagner G., McLachlan J., Pasquinelli A.E., Balint E., Tuschl T., Zamore P.D. A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA. Science, 2001, v. 293(5531), p. 834-838.

78. Jeffcoate T.N. Vaccine against respiratory syncytial virus. Lancet, 1969, v. 2(7615), p. 311.

79. Johnston S.L. Viruses and asthma. J Allergy, 1998, v. 53, p. 922-932.

80. Johnston S.L., Pattemore P.K., Sanderson G. et al. Community study of role of viral infections in exacerbations of asthma in 9-11 year old children. Br Med J, 1995, v. 310, p. 1225-1228.

81. Kahn J.S. Respiratory syncytial virus vaccine development. Curr Opin Pediatr, 2000, v. 12, p. 257-262.

82. Ketting R.F., Haverkamp T.H., van Luenen H.G., Plasterk R.H. Mut-7 of C. elegans, required for transposon silencing and RNA interference, is a homolog of Werner syndrome helicase and RNase D. Cell, 1999, v. 99, p. 133-141.

83. Ketting R.F., Fischer S.E., Bernstein E., Sijen T., Hannon G.J., Plasterk R.H. Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. Genes Dev, 2001, v. 15(20), p. 2654-2659.

84. Kim D.H., Longo M., Han Y., Lundberg P., Cantin E., Rossi J.J. Interferoniinduction by siRNAs and ssRNAs synthesized by phage polymerase. Nat Biotechnol, 2004, v. 22, p. 321-325.

85. Kong X., Hellermann G.R., Pattoni G., Kumar M., Behera A., Randall T.S., Zhang J., Lockey R.F., Mohapatra S.S. An immunocompromised BALB/c mouse model for respiratory syncytial virus infection. Virology Journal, 2005, v. 2, p. 1-8.

86. Krista M.Ph., Alejandro M., Jin L., Beverly A.H., Genshi Zh. Small interfering RNA molecules as potential anti-human rhino virus agents: in vitro potency, specificity, and mechanism. Antiviral Research, 2004, v. 61, p. 49-55.

87. Lagos-Quintana M., Rauhut R., Lendeckel W., Tuschl T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science, 2001, v. 294, p. 853-858.i5 96.Lahti M., Lofgren J., Marttila R., Renko M., Klaavuniemi T., Haataja R. et al.

88. Lawson P. R., Reid K. B. The roles of surfactant proteins A and D in innate immunity. Immunol Rev, 2000', v. 173, p. 66-78.

89. Lee R.C., Ambrose V. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science, 2001, v. 294, p. 862-864.

90. Legg J.P., Hussain I.R., Warner J.A. et al. Type 1 and type 2 cytokine imbalance in acute respiratory syncytial virus bronchiolitis. Am J Respir Crit Care Med, 2003, v. 168(6), p. 633-639.

91. LeVine A.M., Gwozdz J., Stark J., Bruno M., Whitsett J., Korfhagen T. Surfactant protein-a enhances respiratory syncytial virus clearance in vivo. J Clin Invest, 1999, v. 103, p. 1015-1021.

92. LeVine A.M., Elliott J., Whitsett J.A., Srikiatkhachorn A., Crouch E., DeSilva N. et al. Surfactant protein-d enhances phagocytosis and pulmonary clearance of respiratory syncytial virus. Am J Respir Cell Mol Biol, 2004, v. 31, p. 193-199.

93. Lofgren J., Ramet M., Renko M., Marttila R., Hallman M. Association between surfactant protein a gene locus and severe respiratory syncytial virus infection in infants. J Infect Dis, 2002, v. 185, p. 283-289.

94. Mallia P., Johnston S.L. Respiratory viruses: do they protect from or induce asthma? Allergy, 2002, v. 57, p. 1118-1129.

95. Manche L., Green S.R., Schmedt C., Mathews M.B. Interactions between double-stranded RNA regulators and the protein kinase DAI. Mol Cell Biol, 1992, v. 12, p. 5238-5248.

96. Martinez J., Patkaniowska A., Urlaub H. et al. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell, 2002, v. 110, p. 563-574.

97. McBride J.T. Pulmonary function changes in children after respiratory syncytial virus infection in infancy. J Pediatr, 1999, v. 135, p. S28-S32.

98. Meissner H.C., Long S.S. Revised indications for the use of palivizumab and respiratory syncytial virus immune globulin intravenous for the prevention of respiratory syncytial virus infections. Pediatrics, 2003, v. 112, p. 1447-1452.

99. Mello C.C. Return to the RNAi world: rethinking gene expression and evolution (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl, 2007, v. 46(37), p. 6985-94.

100. Message S.D., Johnston S.L. The immunology of virus infection in asthma. Eur Respir J, 2001, v. 18, p. 1-13.

101. Minks M.A., West D.K., Benvin S., Baglioni C. Structural requirements of double-stranded RNA for the activation of 2'-5'-oligo(A) polymerase and protein kinase of interferon-treated HeLa cells. J Biol Chem, 1979, v. 254, p. 10180-10183.

102. Moss E.G., Taylor J.M. Small-interfering RNAs in the radar of the interferon system. Nat Cell Biol, 2003, v. 5, p. 771-772.

103. Moyer S.A., Smallwood-Kentro S., Haddad A., Prevec L. Assembly and transcription of synthetic vesicular stomatitis virus nucleocapsids. J Virol, 1991, v. 65, N5, p. 2170.

104. Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R. Introduction of a chalcone synthase gene into Petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell, 1990, v. 2, p. 279-289.

105. Nicholson K.G., Kent J., Ireland D.C. Respiratory viruses and exacerbations of asthma in adults. Br Med J, 1993, v. 307, p. 982-986.

106. Nykanen A., Haley B., Zamore P.D. ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell, 2001, v. 107, p. 309-321.

107. Paddison P.J., Caudy A., Hannon G.J. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, v. 99(3), p. 1443-1448.

108. Peebles R.S. Jr, Hartert T.V., Sheller J.R. Viral infections in asthma. Compr Ther, 1998, v. 24, p.511-518.

109. Peebles R.S. Jr., Graham B.S. Pathogenesis of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Murine Model. Proc Am Thorac Soc, 2005, v. 2, p. 110-115.

110. Persengiev S.P., Zhu X., Green M.R. Nonspecific, concentration-dependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs). RNA, 2004, v. 10, p. 12-18.

111. Qureshi S.T., Lariviere L., Leveque G., Clermont S., Moore K J., Gros P. et al. Endotoxin-tolerant mice have mutations in toll-like receptor 4 (Tlr4). J Exp Med, 1999, v. 189, p. 615-625.

112. Qureshi S.T., Medzhitov R. Toll-like receptors and their role in experimental models of microbial infection. Genes Immun, 2003, v. 4, p. 87-94.

113. Rimmelzwaan G.F., Osterhaus M.E. Cytotoxic T lymphocyte memory: role in cross-protective immunity against influenza? Vaccine, 1995, v. 13, p. 703-705.

114. Romagnani S. Induction of Thl and Th2 responses. Immunol Today, 1992, v. 13, p. 379-81.

115. Roman M., Calhoun W.J., Hinton K.L. Respiratory syncitial virus infection in infants is associated with predominant Th-2-like response. Am J Respir Crit Care Med, 1997, v. 156, p. 190-195.

116. Ruvkun G. Glimpses of a tiny RNA world. Science, 2001, v. 294, p. 797-799.

117. Schlender J:, Bossert B., Buchholz U., Conzelmann K.K. Bovine respiratory syncytial virus nonstructural proteins NS1 and NS2 cooperatively antagonize alpha/beta interferon-induced antiviral response. J Virol, 2000, v. 74, p. 8234-8242.

118. Sen G.C1 Viruses and interferons. Annu Rev Microbiol, 2001, v. 55, p. 255-81.

119. Sharp P.A., Zamore P.D. RNA Interference. Science, 2000, v. 287, p. 2431-2433.

120. Sharp P.A. RNA Interference-2001. Genes Dev, 2001, v. 15, p. 485-490.

121. Shay D.K., Holman R.C., Newman R.D., Liu L.L., Stout J.W., Anderson L.J. Bronchiolitis-associated hospitalizations among US children, 1980-1996. JAMA, 1999, v. 282, p. 1440-1446.

122. Sledz C.A., Holko M., de Veer M.J., Silverman R.H., Williams B.R. Activation of the interferon system by short-interfering RNAs. Nat Cell Biol, 2003, v. 5, p. 834839.

123. Springer C., Bar-Yishay E., Uwayyed K., Avital A., Vilozni D., Godfrey S. Corticosteroids do not affect the clinical or physiological status of infants with bronchiolitis. Pediatr Pulmonol, 1990, p. 9(3), p. 181-185.

124. Sudo K., Watanabe W., Mori S., Konno K., Shigeta S., Yokota T. Mouse model of respiratory syncytial virus infection to evaluate antiviral activity in vivo. Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 1999, v. 10, p. 135-139.

125. Tal G., Mandelberg A., Dalai I., Cesar K., Somekh E., Tal A. et al. Association between common toll-like receptor 4 mutations and severe respiratory syncytial virus disease. J Infect Dis, 2004, v. 189, p. 2057-2063.

126. Taylor G., Stott E.J., Hughes M., Collins A.P. Respiratory Syncytial Virus Infection in Mice. Infection and Immunity, 1984, v. 43(2), p. 649-655.

127. Thompson W.W., Shay D.K., Weintraub E., Brammer L., Cox N., Anderson L.J. et al. Mortality associated with influenza and respiratory syncytial virus in the United States. JAMA, 2003, v. 289, p. 179-186.

128. Tompkins S.M., Lo C.Y., Tumpey T.M., Epstein S.L. Protection against lethal influenza virus challenge by RNA interference in vivo. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, v. 101, p. 8682-8686.

129. Trkpanier P., Payment P., Trudel M. Concentration of Human Respiratory Syncytial Virus Using Ammonium Sulfate, Polyethylene Glycol or Hollow Fiber Ultrafiltration. Journal of Virological Methods, 1981, v. 3, p. 201- 211.

130. Ulevitch R.J., Tobias P.S. Receptor-dependent mechanisms of cell stimulation by bacterial endotoxin. Annu Rev Immunol, 1995, v. 13, p. 437-457.

131. Van Vaerenbergh K. Study of the impact of HIV genotypic drug resistance testing on therapy efficacy. Verh K Acad Geneeskd Belg, 2001, v. 63(5), p. 447-473.

132. Van Schaik S.M., Enhorning G., Vargas I., Welliver R.C. Respiratory Syncytial Virus Affects Pulmonary Function in BALB/c Mice. The Journal of Infectious Diseases, 1998, v. 177, p. 269-76.

133. Venkatesh M.P., Weisman L.E. Prevention and treatment of respiratory syncytial virus infection in infants: an update. Expert Rev Vaccines, 2006, N. 5, p. 261-268.

134. Walter D.M., Mclntire J.J., Berry G., McKenzie A.N., Donaldson D.D., DeKruyff R.H. et al. Critical role for IL-13 in the development of allergen-induced airway hyperreactivity. J Immunol, 2001, v. 167, p. 4668-4675.

135. Webb D.C., McKenzie A.N., Koskinen A.M., Yang M., Mattes J., Foster P.S. Integrated signals between IL-13, IL-4, and IL-5 regulate airways hyperreactivity. J Immunol, 2000, v. 165, p. 108-113.

136. Welliver R.C., Kaul T.N., Putnam T.I., Sun M., Riddlesberger K., Ogra P.L. The antibody response to primary and secondary infection with respiratory syncytial virus: kinetics of class-specific responses. J Pediatr, 1980, v. 96, p. 808-813.

137. Wennergen G., Kristjansson S. Relationship between respiratory syncytial virus brohchiolitis and future obstructive airway diseases. Eur Respir J, 2001, v. 18, p. 1044-1058.

138. Wertz G.M., Howard M.B. et al. The switch from transcription to replication of a negative-strand RNA virus. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1987, v. 52, p. 367-371.

139. Wilson J., Rowlands K., Rockett K., Moore C., Lockhart E., Sharland M. et al. Genetic variation at the ILIO gene locus is associated with severity of respiratory syncytial virus bronchiolitis. J Infect Dis, 2005, v. 191, p. 1705-1709.

140. Wixson S.K., Smiler K.L. Anesthesia and analgesia in rodents. In: Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals, Kohn D.F. et. al. Eds. Academic Press, New York, 1997, p. 165-200.

141. World Health organization. The world health report. 1998, p. 70-71.

142. Wright P.F., Karron R.A., Belshe R.B., Thompson J., Crowe Jr. J.E., Boyce T.G. et al. Evaluation of a live, cold-passaged, temperaturesensitive, respiratory syncytial virus vaccine candidate in infancy. J Infect Dis, 2000, v. 182, p. 1331-1342.

143. Yang S., Tutton S., Pierce E., Yoon K. Specific double-stranded RNA interference in undifferentiated mouse embryonic stem cells. Mol Cell Biol, 2001, v. 21(22), p. 7807-7816.

144. Zambon M. Active and passive immunisation against respiratory syncytial virus. Rev Med Virol, 1999, v. 9, p. 227-236.

145. Zamore P.D., Tuschl T., Sharp P.A. et al. RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell, 2000, v. 101, p. 25-33.

146. Zhang Y., Gilmore X., Xu K., Wyde Ph.R., Mbawuike I.N. An Aged Mouse Model for RSV Infection and Diminished CD8+ CTL Responses 1. Exp Biol Med, 2002, v. 227(2), p. 133-140.