Применение низкоселективных биосенсоров для определения биохимического потребления кислорода и анализа многокомпонентных смесей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Арляпов, Вячеслав Алексеевич

• Арляпов, Вячеслав Алексеевич
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Арляпов, Вячеслав Алексеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Биосенсоры на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов.

1.1.1. Современная концепция биосенсоров.

1.1.2. Биосенсоры па основе микробных клеток.

1.1.3. Особенности строения и метаболизма бактерий Gluconobacter oxydans и перспективы их применения в микробных сенсорах.

1.1.4. Особенности биохимии дрожжевых клеток.

1.1.4.1. Обитая характеристика метилотрофных дрожжей Pichia augusta и метилотрофного обмена.

1.1.4.2. Характеристика дрожжей Arxula adeninovorans.

1.1.5. Методы иммобилизации клеток микроорганизмов.

1.1.5.1. Физические и химические методы иммобилизации клеток.

1.1.5.2. Иммобилизация клеток путем включения клеток в массу носителя.

1.2. Бпосенсоры для определения биохимического потребления кислорода.

1.2.1. Методы анализа БПК.

1.2.2. Метод определения БПК с использованием биосенсора.

1.3. Обработка данных систем биосенсоров.

1.3.1. Методы, применяемые для обработки экспериментальных данных систем биосснсоров.

1.3.2. Искусственные нейронные сети.

1.3.2.1. История развития теории нейронных сетей.

1.3.2.2. Структура, свойства и виды ИНС.

1.3.2.3. Обучение ИНС.

1.3.2.4. Применение ИНС для решения задач, связанных с исследованием и разработкой сенсорных систем.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Применение низкоселективных биосенсоров для определения биохимического потребления кислорода и анализа многокомпонентных смесей»

Экспресс-оценка степени загрязнения объектов окружающей среды органическими соединениями является необходимым компонентом экологического контроля. Учитывая постоянно растущий перечень веществ, поступающих как загрязнители в окружающую среду, эффективным инструментом анализа оказываются методы, основанные на интегральной оценке органических компонентов, а не только на определении содержания индивидуальных веществ. В этой связи значительное внимание уделяется разработке биосенсорных экспресс-методов контроля, значительно повышающих оперативность анализа, снижающих его стоимость и позволяющих выполнить как интегральную оценку загрязненности, так и проводить селективный анализ.

Важной характеристикой степени загрязненности воды легкоокисляемыми органическими веществами является индекс биохимического потребления кислорода (БПК). Традиционная методика определения ВПК требует инкубирования насыщенной кислородом пробы в течение 5, 10 или 20 суток (БПК5, БПКю или БПК?о, соответственно). Отсутствие оперативности существенно снижает ценность традиционной методики. Для оперативного анализа разрабатываются методы оценки БПК, основанные на использовании биосенсорных анализаторов. Биосенсорные анализаторы БПК представляют собой падежные, простые и дешевые аналитические инструменты и с успехом используются для контроля водных экосистем (наряду с традиционными методами определения БПК) за рубежом. В России аналогичные анализаторы в настоящее время промышленно не выпускаются. В мире при создании БПК-сенсоров наиболее часто используют биосенсоры на основе кислородного электрода Кларка и целых клеток микроорганизмов.

Одной из важных проблем в экологии является очистка сгочных вод биотехпологичеекпх производств, в том числе спиртовых производств. Сточные воды спиртовых заводов характеризуются высоким содержанием органических загрязнений, что приводит к гибели естественных экосистем вокруг них. Для таких предприятий не только практически сложно, по и нерационально стремиться к созданию универсального БПК-сенсора. Напротив, целесообразно производить разработку биосенсоров и выбор соответствующих микроорганизмов, которые обеспечивали бы наиболее эффективную детекцию БПК в соответствии с конкретным типом сточных вод, т.е. разрабатывать специализированные БПК-биосенсоры.

К преимуществам биосенсоров можно отнести: короткое время ответа, портативность, удобство в работе, а также отсутствие специальных требований к приготовлению исследуемого образца. Микроорганизмы - доступный биологический материал. Клетки микроорганизмов легко воспроизводятся, культивируются и поддерживаются в чистой культуре. В некоторых случаях они обеспечивают жизнеспособность и активность ферментных систем в течение нескольких лет. Вместе с тем, для микробных сенсоров характерна низкая субстратная специфичность — чувствительность к большому количеству веществ, что является преимуществом для интегральной оценки степени загрязнения, но недостатком для селективного анализа.

Наряду с определением интегральных показателей качества воды важным является одновременное определение содержания отдельных компонентов в водных средах. Существует несколько подходов повышения селективности биосенсоров. Один из способов селективной детекции компонентов может заключаться в получении интегральных характеристик смеси с помощью низкоселективных анализаторов и использовании математических методов обработки данных с целью определения вклада, вносимого отдельными компонентами. Различные хемометрические методы, включая применение искусственных нейронных сетей (ИНС), успешно используются в аналитической химии для обработки сигналов химических сенсоров. Однако для применения в области биосенсорики данные методы не развиты. Следует отметить, что биосенсоры, предназначенные для экологического контроля стоков биотехнологических производств, можно использовать и для мониторинга ферментационных процессов на этих производствах. Это позволит сократить затраты на оборудование и увеличить экономическую отдачу предприятия. Так, дифференциальная оценка содержания нескольких компонентов на различных стадиях позволяет оптимизировать технологический процесс брожения и снижать материальные затраты, приводя в соответствие качество исходного сырья с качеством применяемых ферментов и дрожжевой биомассы. Одновременно снизится экологическая нагрузка на окружающую среду. Следует отметить, что существующие методы определения содержания спиртов и углеводов эффективно применяются для контроля качества готовой продукции, но не могут быть использованы для экспресс-оценки содержания указанных компонентов в ферментационных средах. Одной из важнейших особенностей биосенсоров, обеспечивающейся сменой рецепторных элементов, является возможность применения одного анализатора для различных аналитических целей. Таким образом, создание универсального биосенсорного анализатора со сменными биорецепторными элементами для определения БПК и анализа многокомпонентных смесей в современных условиях является важной задачей для биотехнологических производств.

Работа выполнялась при частичной поддерэ/ске гранта Федерального агентства по образованию РНП 2.1.1.7789. и ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 гг.», госконтракт № 02.512.11.2010. Автор работы является победителем конкурса программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в 2008 г. (г. Пущино).

Цель работы:

Разработка химико-биологических основ применения низкоселективных микробных биосенсоров для экспресс-оценки БПК и мониторинга биотехнологических процессов и создание на этой базе макета универсального биосенсорного анализатора.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:

• Разработать стабильные и воспроизводимые биорецепторные элементы биосенсоров на основе различных способов иммобилизации клеток микроорганизмов.

• Охарактеризовать биокатализаторы на основе целых клеток микроорганизмов по их субстратной специфичности для использования в качестве основы рецепторного элемента биосенсора.

• Разработать модификацию макета биосенсора гфоточно-инжекционного типа для экспресс-анализа БПК. Определить его аналитические и метрологические характеристики.

• Оптимизировать конфигурации искусственных нейронных сетей для снижения ошибки определения компонентов при анализе двух-, трех- и четырехкомпонентных смесей.

• Разработать модификацию макета многоканального биосенсора проточно-инжекционного типа на основе неселективных клеток микроорганизмов для селективного анализа многокомпонентных смесей.

Научная новизна

Впервые показан эффект изменения субстратной специфичности уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans при иммобилизации в различные носители, что имеет существенное значение при создании биосенсорных систем для анализа многокомпонентных смесей.

Показано, что применение уксуснокислых бактерий G. oxydans и метилотрофных дрожжей Р. augusta как основы рецепторного элемента биосенсора для определения БПК стоков пищевых и ликероводочных производств позволяет получать данные с высокой корреляцией к стандартному методу.

Расширена возможность применения технологии искусственных неГфонных сетей для обработки сигналов биологических сенсоров. Разработана методика применения ИНС в решении задачи селективной детекции модельных двух-, трех- и четырехкомпонентных систем, содержащих метанол, этанол, фруктозу и глюкозу, выполняемой низкоселективными микробными сенсорами.

Впервые показана возможность применения дрожжевого штамма ЗассИаготусея Ьауапиь ВКМ У-349, характеризующегося активным транспортом фруктозы, как основы одного из рецепторных элементов многоканального биосенсора для селективного определения данного вещества в водных средах.

Практическая значимость

Разработан и апробирован макет многоканального биосенсора проточно-ипжекционного типа для определения содержания глюкозы, фруктозы, метанола, этанола и индекса БПК в водных средах. Метод анализа с использованием разработанного макета биосенсора характеризуется высокой экспрессностью и высокой чувствительностью. Макет многоканального биосенсора может быть использован в научных исследованиях, в учебном процессе и как прототип опытного образца прибора для серийного выпуска.

Работа вносит практический вклад в разработку высокоэффективных аналитических систем на основе биосенсоров. Предложенные методы анализа сигналов биосенсоров значительно повышают селективность анализа при использовании биосепсоров на основе целых клеток микроорганизмов и позволяют в перспективе разрабатывать недорогие и эффективные анализаторы.

Апробация работы и публикации

Результаты работы докладывались на Тульском молодежном инновационном конвенте (г. Тула), 2009 г. (диплом победителя)-, Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (г. Москва, г. Пущпно), 2008 г {диплом победителя); 2-ой Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех - 2008» (г. Москва), 2008 г. (медаль выставки)', XII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии», 2008 г. (диплом за 3 место)-, Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2007 г. (медаль конкурса)-, XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (г. Москва), 2007 г.; IV Международной научной конференции

Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (г. Томск) в 2006 г.; Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология — современные биоаналитические системы, методы и технологии» (г. Пущино), 2006 г. (|диплом лауреата конкурса)', Международной молодёжной научной конференции «XIV Туполевские чтения» (г. Казань), 2006 г. {диплом за 3 место).

По теме диссертации опубликовано 8 статей, 7 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Арляпов, Вячеслав Алексеевич

ВЫВОДЫ

Разработана химическая и биологическая база для создания универсального биосенсорного анализатора как для экспресс-оценки интегрального показателя качества сточных вод, так и для анализа многокомпонентных ферментационных сред биотехнологических производств, что вносит практический вклад в разработку современных высокоэффективных аналитических систем.

На основании сравнительного анализа характеристик распознающих элементов бносенсора на основе иммобилизованных различными способами микроорганизмов выявлено, что лучшим способом получения рецепторных элементов микробного биосенсора является включение в матрицу БСА, сшитого глутаровым альдегидом. Впервые показан эффект изменения субстратной специфичности уксуснокислых бактерий С1исопоЬас{ег охуйат при иммобилизации в различные матрицы, который имеет существенное значение при создании биосенсорных систем для анализа многокомпонентных смесей.

Охарактеризованы биокатализаторы на основе целых клеток микроорганизмов для использования в качестве основы рецепторного элемента биосенсора. Установлено, что применение бактерий 01исопоЪа&ег охуЛат и дрожжей Р1сЫа angusta как основы рецепторного элемента биосенсора для определения БПК стоков биотехнологических производств позволяет получать данные с высокой корреляцией к стандартному методу.

На основании проведенного анализа многокомпонентных смесей расширена возможность применения технологии искусственных нейронных сетей для обработки сигналов биологических сенсоров на примере двух-, трех- и четырехкомпонентных систем, содержащих метанол, этанол, фруктозу и глюкозу. Впервые показана возможность применения дрожжей Засс/гаготусея Ьауапт как основы рецепторного элемента многоканального биосенсора для селективного определения фруктозы в водных средах.

Разработан макет биосенсора проточно-инжекционного типа для экспресс-определения БПК5 па основе рецепторных элементов, полученных с использованием дрожжевых микроорганизмов Агхи/а асЗетпоуогат, РШиа angusta и бактерий С1исопоЬас1ег охуЛат. По своим характеристикам биосенсор не уступает зарубежным аналогам. Разработана модификация макета многоканального биосенсора, позволяющая проводить селективную оценку содержания глюкозы, фруктозы, метанола и этанола в диапазоне концентраций от 1,00 до 5,00 мМ по каждому из компонентов с ошибкой не более 18 %. Разработанный биосенсор может служить прототипом для создания опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.

3.1.7. Заключение

В таблице 6 приведены сводные данные по параметрам разработанных рецепторных элементов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Арляпов, Вячеслав Алексеевич, 2009 год

1. Тернер Э., Карубе И., Уилсон Д. Биосенсоры: основы и приложения. М.: Мир. 1992. -614 с.

2. Эггинс Б. Химические и биологические сенсоры. М.: Техносфера. 2005. 336с.

3. Hendry S. P., Higgins I. J., Bannister J. V. Amperometric biosensors // J Biotechnol. 1990 V. 15. №3. P. 229-266.

4. D'Souza S.F. Microbial biosensors // Biosens Bioelectron. 2001. V. 16. P. 337-353.

5. Karube I. Microbial sensor//J Biotechnol. 1990. V. 15. № 3. P. 255-320.

6. Racek J. Cell-based biosensors. Lancaster. Technomic: Publishing Company, Inc. 1995. 107 p.

7. Gilchrist К. H., Barker V. N., Fletcher L. E., DeBusschere B. D., Ghanouni P., Giovangramdi L. L., Kovacs G. T. A. General purpose, field-portable cell-based biosensor platform // Biosens Bioelectron. 2001. V. 16. P. 557-564.

8. Gray S. A., Shaffer К. M., Shubin Y. S., Stenger D. A., Pancrazio J. J. Design and demonstration of an automated cell-based biosensor // Biosens Bioelectron. 2001. V. 16. P. 535-542.

9. De Ley J., Frateur J. Bergey's manual of determinative bacteriology. Eds. Buchanan H.B., Gibson V.K. Baltimor: Williams and Wilkins Co. 1974. P. 251-253; 276-278.

10. Asai K. Acetic acid bacteria: classification and biochemical activities. Baltimore: Univ. Park Press. 1968. 343 p.

11. Pasteur L. Compt. Rend. Sean. Acad. Sci. 1862. V.54. P. 265.

12. Adachi O., Tayama K., Shinagawa E., Matsushita K., Ameyama M. Purification and characterization of particulate alcohol dehydrogenase from Gluconobacter suboxydans // Agric Biol Chem. 1978. V. 42. № 11. P. 2045-2056.

13. Adachi O., Tayama K., Shinagawa E. Purifi cation and characterization of membrane-bound aldehyde dehydrogenase from Gluconobacter suboxydans II Agric. Biol. Chem. 1980. V.44.N3. P. 503-515.

14. Лойцянская M.C. //Успехи микробиологии. 1966. Т.З. С. 47-73.

15. Buchert J. A xylose-oxidizing membrane-bound aldose dehydrogenase of Gluconobacter oxydans ATTC 621 //Journal of Biotechnology 1991. V. 18. P. 103-114.

16. Kulhanek M. //Adv. Appl. Microbiol. 1989. V. 34. P. 141-181.

17. Kulhanek M., Tadra M. // Folia Microbiol. 1977. V. 25. №. 5. P. 373-376.

18. Buchert J., Viikari L. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988. V. 29. P. 375- 379.

19. Успенская, C.H., Лойцянская M.C. // Микробиология. 1979. Т. 48. № 3. С. 400-405.20