Применение метода прецизионного измерения сдвигов ЯМР для изучения координационных соединений и ферментов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.01, кандидат физико-математических наук Качурин, Анатолий Маркович

• Качурин, Анатолий Маркович
• кандидат физико-математических наук
• 0

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Качурин, Анатолий Маркович

Список обозначений и сокращений

ВВВДЕНИЕ.

Глава I. СДВИГИ ЯМР И ИХ ФИЗИЧЕСКАЯ ПРИРОДА.

1.1. Понятие сдвига ЯМР. Константа экранирования.

1.2. Химический сдвиг

1.3. Межспиновое взаимодействие и сдвиг

1.4. Диполярный сдвиг

1.5. Контактный сдвиг

1.6. Контактные и псевдоконтактные сдвиги в структурных исследованиях. Шифт-зонды.

1.7. Сдвиги при образовании водородной связи.

1.8. Сдвиги ЯМР и химический обмен

Глава П. ПРЯМЫЕ И КОСВЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР И ПРОБЛЕМА ТОЧНОСТИ ИЗМЕРЕНИЯ СДВИГОВ

2.1. Диапазоны сдвигов и ширина линий при прямом изучении малых молекул.

2.2. Внедрение ЯМР в молекулярную биологию. Принципиальные ограничения метода ЯМР при непосредственном изучении спектров макромолекул

2.3. Двумерная фурье-спектроскопия ЯМР.

2.4. Непрямые исследования с помощью молекул-зондов.

2.5. Измерение статической магнитной восприимчивости веществ в растворе. Метод Эванса.

2.6. Метод детектирующих зондов ЯМР. Уравнения Соломона-Бломбергена.

2.7. Неспецифические и специфические молекулярные зонды.

Краткий обзор

2.8. Оценка сдвигов ЯМР при работе по методу молекул-свидетелей и молекул-зондов. Проблема точности измерений

Глава Ш. ВОЗМОЖНОСТЬ ПРЕЦИЗИОННОГО ИЗМЕРЕНИЯ СДВИГОВ

3.1. Разрешающая способность и стабильность резонансных условий

3.2. Существуют ли разработанные методы прецизионных измерений сдвигов ЯМР? Многочастотный резонанс в спин-связанных системах и метод биений в спиновых генераторах

3.3. Неприменимость приемов обзорной спектроскопии для точного измерения сдвигов

3.4. Влияние формы линии на измерение сдвига.

3.5. Влияние фазового угла детектирования на измерение сдвига.

3.6. Влияние частичного перекрывания линий на измерение сдвигов.*.

3.7. Влияние температуры образца. Требуемая термостабильность и возможности газовых термостатов

Глава 17. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ УСТАНОВКА И МЕТОДИКА ПРЕЦИЗИОННОГО ИЗМЕРЕНИЯ СДВИГОВ.

4.1. Свип-спектрометр с модуляцией поля на звуковой частоте в качестве базы экспериментальной установки

4.2. Следящая система на основе развертывающего модуляционного генератора.

4.3. Термостабилизация образца по сигналу ЯМР лабильных цргтонов.

4.4. Стабильность формы линии в случае коаксиального образца. Устройство для автоматического квадратурного шиммирования поля.

4.5. Функциональная схема установки для прецизионного измерения сдвигов ЯМР.

4.6. Измерения с "внутренним термометром"

4.7. Измерение ширины линии с помощью калиброванного вращения фазы.

Глава У. МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ И МОДЕЛЬНЫЕ ОПЫТЫ.

5.1. Часовая стабильность отсчета резонансной частоты (коаксиальный образец)

5.2. Влияние сборки и разборки коаксиального образца на измерение сдвигов.

5.3. Калибровка по раствору парамагнитной соли.

5.4. Кинетика восстановления растворенного кислорода системой дыхательных коферментов

5.5. Температурная зависимость относительных химсдвигов и константы спин-спинового взаимодействия в молекуле этанола.

5.6. Контактные сдвиги протонов воды в присутствии спиновой метки.

Глава 71. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРЕЦИЗИОННОГО ИЗМЕРЕНИЯ СДВИГОВ

В БИОФИЗИЧЕСКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ.

6.1. Тиолат-анионные комплексы железа и марганца

6.2. "Пурпурный комплекс" оксвдазы д-аминокислот и его диамагнетизм.

6.3. Связывание ионов марганца молекулой тРНК.

6.4. Изучение конформационных состояний предшественников спиновых меток

6.5. Изучение физико-химических свойств и топографии активного центра растительной пероксидазы

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Применение метода прецизионного измерения сдвигов ЯМР для изучения координационных соединений и ферментов»

Актуальность проблемы. В настоящее время методы радиоспектроскопии находят все более широкое применение в биофизических и биохимических исследованиях. Особенно бурно развивается метод ядерного магнитного резонанса высокого разрешения. Успехи ЯМР опираются на три технических достижения: создание высокопольных сверхпроводящих магнитов-соленовдов с высокой однородностью поля и связанное с этим резкое повышение рабочих частот спектрометров; развитие идей и методов импульсной спектроскопии ЯМР с разделением времен возмущения-прослушивания спиновой системы и фурье-анализом сигналов ЯМР; наконец, широкое внедрение ЭВМ в управление экспериментом. Обусловленный указанными факторами рост чувствительности, разрешающей способности и информативности метода ЯМР позволяет применять его для изучения структуры биома!фомолекул малых (до ~10000 Дальт.) и, в отдельных случаях, средних (до ~50000 Дальт.) молекулярных весов в растворе. Поэтому ЯМР высокого разрешения притягателен для биофизиков, несмотря на то, что в отношении детальности информации метод рентгеноструктурного анализа молекул в кристаллическом состоянии - вне конкуренции. Само по себе развитие ЯМР в значительной степени стимулируется именно требованиями современной молекулярной биофизики, на что постоянно указывается в рекламной периодике ведущих радиоспектроскопических фирм.

Появление данной работы в определенной степени связано с этой тенденцией. Работа посвящена созданию способа повышения точности измерения сдвигов ЯМР и демонстрации новых возможностей в области биофизического эксперимента, появляющихся в связи с существенным увеличением точности измерения сдвига изолированной линии ЯМР.

В спектроскопии ЯМР высокого разрешения значительную часть информации о структуре молекул получают именно из значений сдвига линий ЯМР, под которым, в общем, понимают положение линии на частотной абсциссе спектра относительно эталонной линии. Сдвиг обусловлен тремя основными причинами: диамагнитной экранировкой ядер электронами; сверхтонким диполярным и фермиевским взаимодействием ядер с неспаренными электронами парамагнитных центров; эффектами объемного макроскопического диамагнитного экранирования, связанного с геометрией образцов (составных, например, коаксиальных). Информация, извлекаемая из значений сдвига, может касаться типа химического окружения данного ядра, характера взаимодействия молекул, расстояния ядра от парамагнитного центра, скорости химического обмена и типа координации в комплексных соединениях, магнитных свойств исследуемых молекул и т.д. Указав (и обосновав причины), что границей точности измерения сдвигов обычно считают разрешающую способность спектрометра, мы в данной работе определили понятие прецизионного измерения сдвигов как измерение с точностью, существенно превосходящей разрешающую способность спектрометра (гл. I).

Научная новизна пезультатов. Определены области применения ЯМР, в которых прецизионное измерение сдвигов способно предоставить новую информацию. Это, во-первых, измерение слабых вариаций химсдвигов ЯМР малых молекул, вызываемых заторможенными конформационными переходами, термическим возбуждением экранирующих электронов и ваццерваальсовыми взаимодействиями, а также особо точное измерение частот ЯМР в специальных физических экспериментах. Далее, прецизионное измерение сдвигов может оказаться полезным в методе низкомолекулярных детектирующих зовдов ЯМР. Согласно этому методу, свойства и структура макромолекул исследуются косвенно, с помощью изучения ЯМР малых молекул, вступающих с макромолекулой во взаимодействие. При этом отсутствуют проблемы концентрационной чувствительности и анализа спектров, существенные при прямом исследовании макромолекул. Метод зондов применим в случаях, когда прямые наблюдения в принципе невозможны, т.е. при исследовании крупных (более 40000 Дальт.) ма1фомолекул в относительно низкой (менее Ю-4 М) концентрации. Однако при этом измеряемые эффекты (в частности, изменения сдвигов) уменьшаются в отношении, равном отношению концентраций молекулы-объекта и молекулы-зонда. Интересной областью приложения метода прецизионных измерений сдвигов ЯМР может явиться исследование магнитных свойств молекул с помощью измерения статической магнитной восприимчивости веществ в растворе. В двух последних случаях именно прецизионные измерения позволят получить ценную геометрическую и физическую информацию о макромолекулах, поскольку ожидаемые эффекты при умеренных концентрациях макромолекул ( ^ Ю-4 М) зачастую вблизи или ниже уровня разрешающей способности спектрометров (гл. П).

В современной литературе отсутствуют указания на существование разработанного метода прецизионных измерений сдвигов ЯМР. В гл. Ш приводится анализ причин этого, а также тех трудностей, которые следует преодолеть при создании такого метода. Выделяются три подчиненные задачи: во-первых, создать устройство, позволяющее автоматически регистрировать и накапливать значения сдвига данного сигнала. Во-вторых, необходимо стабилизировать температуру образца с точностью, лучшей, чем 0,1 °С. Эта задача осложняется невозможностью ввести обычный датчик температуры во вращающуюся ампулу в процессе эксперимента. В третьих, существенным является контроль за стабильностью формы линии ЯМР. Последняя определяется стабильностью конфигурации магнитного поля в активном объеме образца и стабильностью фазы при синхронном детектировании сигнала. Особенно важно это в случае коаксиальных образцов, применяемых для измерения магнитной восприимчивости.

Указанные задачи были решены при создании экспериментальной установки для прецизионного измерения сдвигов, функциональная схема которой приведена в гл. 17. Составными элементами установки, созданной на базе серийного свип-спектрометра с модуляцией магнитного поля, стали система автоматического отслеживания сигнала дисперсии ЯМР на основе модуляционного генератора частотной развертки, система точной термосталйилизации образца по термочувствительному сигналу ЯМР лабильных протонов, а также устройство для коррекции формы линии в случае коаксиальных образцов.

В заключительных главах (У, 71) изложены результаты метрологических, модельных и реальных биофизических экспериментов, призванных продемонстрировать работоспособность предложенного метода и экспериментальной установки. Достигнутая точность измерения сдвига до ~ 0,0015 Гц при паспортной разрешающей способности спектрометра ^ 0,24 Гц свидетельствует о хороших потенциальных возможностях метода. При измерении магнитной восприимчивости растворов достигнута точность 3,5*КГ**, что совпадает с возможностями лучших весовых установок. Исследования геометрии активного центра растительной пероксидазы и комплексов транспортной РНК методом детектирующих зоццов показали, что с помощью прецизионных измерений сдвигов даже на спектрометре среднего класса, каким является прибор 35-^81 СтТе$£л 9 возможны исследования биомакромолекул при концентрациях ~ 10"^ М. При использовании спектрометров высшего класса с большей рабочей частотой, более высокой чувствительностью и разрешающей способностью возможности метода прецизионных измерений неизбежно возрастут и позволят, в частности, уверенно работать с растворе рами макромолекул, концентрация которых ^ 10 М.

В целом предлагаемый метод представляется относительно несложным и достаточно надежным, и с успехом может быть применен в исследовательской практике.

Заключение диссертации по теме «Приборы и методы экспериментальной физики», Качурин, Анатолий Маркович

ВЫВОДЫ

1. Определены области применения ЯМР, в которых повышение точности измерения сдвигов увеличит количество и повысит качество физико-химической информации: а) изучение слабых изменений химсдвигов малых молекул под действием температуры и вандерваальсовых взаимодействий; б) особо точное измерение частот ЯМР в специальных физических экспериментах; 'в) непрямое изучение биомакромолекул и комплексных соединений с помощью малых молекул-зондов и молекул-свидетелей, в том числе измерение магнитной восприимчивости веществ в растворе.

2. Сформулировано и обосновано понятие прецизионного измерения сдвигов ЯМР как измерения с точностью, существенно превосходящей разрешающую способность спектрометра ЯМР. Обоснована возможность прецизионных измерений сдвигов. Теоретически и экспериментально изучено влияние на результат прецизионных измерений таких факторов, как способ регистрации сдвига, нестабильность формы резонансной линии, нестабильность температуры образца. Разработаны способы устранения дестабилизирующих факторов.

3. На базе серийного модуляционного спектрометра создана экспериментальная установка для прецизионного измерения сдвигов ЯМР, включающая систему отслеживания резонансной частоты сигнала дисперсии ЯМР, устройство для точной термостабилизации образца, устройство для стабилизации формы линии в случае коаксиального образца. Разработаны методические приемы прецизионного измерения сдвигов в особо сложных случаях: методика последовательного титрования при работе с молекулярными зондами, методика "внутреннего термометра" ШР.

4. В модельных и метрологических опытах достигнуты следующие параметры установки для прецизионного измерения сдвигов ЯМР: а) часовая стабильность отсчета резонансной частоты вещества-свидетеля в случае коаксиального образца - лучше 0,005 Гц {2% разрешающей способности); б) общая точность измерения сдвигов в случае коаксиального образца - на уровне 0,006 Гц, что при измерении магнитной восприимчивости обеспечивает чувствительность 3,5*10"^, на уровне лучших установок для измерения восприимчивости методом торсионного баланса в градиенте магнитного поля; в) максимальная точность измерения сдвига в случае обычного образца достигла 1,5'10 Гц (0,6$ разрешающей способности).

5. Надежность и информативность метода прецизионных измерений сдвигов ШР продемонстрирована, в ряде биофизических экспериментов: а) обнаружены и изучены аномальные магнитные свойства желе-за-Ш в метастабильных тиолат-анионных комплексах; б) доказана диамагнитная природа промежуточного "пурпурного комплекса" оксддазы д-аминокислот; в) изучены некоторые особенности сильного связывания ионов молекулами валовой тРНК; г) изучена кинетика заторможенных конформационных переходов в диаминоацетилалкильных фрагментах молекул - аналогов пипе-ридиновых спиновых меток; д) уточнена геометрия фермент-субстратных комплексов растительной пероксидазы; показано, что ароматические кольца субстрата не находятся в вандерваальсовом контакте с ароматической структурой гема; е) изучена геометрия ацетатного комплекса пероксидазы; ж) изучено равновесие магнитных состояний в галоидных комплексах пероксцдазы.

Все результаты, касающиеся разработки метода прецизионных измерений сдвигов ЯМР и большая часть экспериментальных результатов получены впервые.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Качурин, Анатолий Маркович, 0 год

1. Эмсли Д., Финей Д., Сатклиф J1. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса высокого разрешения. T.I . - М.: Мир, 1968,- 630 с.

2. Эмсли Д., Финей Д., Сатклиф Л. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса высокого разрешения. Т.2 . М.: Мир, 1969,- 468 с.

3. Dickinson W.C. The time average magnetic field at the nucleus in nuclear magnetic resonance experiments. Phys.Rev., 1951, v.81 N5, p. 717 - 731 .

4. Lamb W.E. Internal diamagnetic fields. Phys.Rev., 1941, v.60 N15, p. 817 819 .

5. Керрингтон А., Мак-Лечлан Э. Магнитный резонанс и его применение в химии. М.: Мир, 1970, - 448 с.

6. Ramsey N.F. Chemical effects in nuclear magnetic resonance and in diamagnetic susceptibility. Phys.Rev., 1952, v.86 N2,p. 243 246 .

7. Лундин А.Г., Федин Э.И. Ядерный магнитный резонанс. Основы и применения. Новосибирск: Наука, 1980, 189 с.

8. Дорфман Я.Г. Диамагнетизм и химическая связь. М.: Физмат- -гиз, 1961, - 227 с.

9. Petrakis L., Sederholm С.Н. Temperature-dependent chemical shifts in the NMR spectra of gases. J.Chem.Phys., 1961, v.35 N4, p. 1174 - 1178 .

10. Gutowsky H.S. Isotope effects in high resolution NMR spectroscopy. J.Chem.Phys., 1959, v.31 N6, p. 1683 - 1684 .

11. Альтшуллер С.А., Козырев Б.М. Электронный парамагнитный резонанс. М.: Гос.изд.физ.-мат.лит., 1961, - 368 с.

12. Dwek R.A. Nuclear magnetic resonance (NMR) in biochemistry.- Oxford, Clarendon Press, 1973, 395 ps .

13. Dwek R.A. Nuclear magnetic resonance (NMR) in biochemistry.- Oxford, Clarendon Press, 1973, 395 ps.

14. McConnellHH., Robertson R. Isotropic nuclear resonance shifts.- J.Chem.Phys., 1958, v.29 N6, p. 1361 1365 . H.Jesson J.P. Theory of isotropic nuclear resonance shifts inoctahedral Co2+ systems. J.Chem.Phys., 1967, v.47 N2, p. 579- 581 .

15. Рамзей H. Молекулярные пучки . M.: Издат. иностр. лит., I960, - Ш с.

16. Bloembergen N. Comments on "Proton relaxation times in paramagnetic solutions". J.Chem.Phys., 1959, v.27 N2, p. 595- 596 .

17. Александров И.В. Теория ЯМР. М.: Наука, 1964, - 208 с.

18. Bloembergen N., Morgan L.O. Proton relaxation times in paramagnetic solutions. Effect of electron spin relaxation.- J.Chem.Phys., 1961, v.34 N3, p.842 853 .

19. Wuthricht К., Shulman R.G., Wyluda В.J., Gaughey W.C. Proton magnetic resonance studies of porphyrin iron(III) cyanides.- Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1969, v.62 N3, p. 636 643 .

20. Eaton D.R., Josey A.D., Phillips W.D., Benson R.E. Hyperfine contact shifts and density dystributions in some nickel(II) chelates. -Disc.Farad.Soc.(London), 1962, N34, p.77 87 .

21. Barry C.D., Glasel J.A., North A.C,T., Williams R.J.P., Xavier A.V. Quantitative determination of mononucleotide conformations in solution using lanthanoide ion shift and relaxation NMR probes. - Nature, 1971, v.232 N5308, p. 236 - 245.

22. Barry C.D., Glasel J.A., Dobson C., Williams R.J.P., Xavier A. Lanthanide(III) cations as nuclear magnetic resonance conformation probes: studies on citidine 5'-monophosphate at pH 2.- J.Chem.Sci., Dalton Transactions, 1974, v.16 N6, p. 1765

23. Бреслер C.E. Введение в молекулярную биологию. M.-JI.: Наука, 1966, - 513 с.

24. Arnold J.Т., Packard М.Е. Variations in absolute chemical shift of nuclear induction signals of hidroxyl groups of methyl alckohol. J.Chem.Phys., 1951, v.19 N12, p. 1608-1609 .

25. Кабачник М.И., Федин Э.И., Морозов Jl.JI., Петровский П.В., Вайсберг М.С., Шипов А.Э.Мастрюкова Т.А. Теоретический анализ спектров ЯМР ассоциат-диастереоизомеров. Докл. Акад. Наук СССР, 1974, т.215 вып.б, с. 1400 - 1403 .

26. Van-Duijnevelt Р.В., Murrel J.N. Some calculation on the hydrogen bond. J.Chem.Phys., 1967, v.46 N5, p. 1759 - 1767 .

27. Гордеев Г.П., Хайдаров Т. Температурная зависимость динамических параметров воды, в кн. Вода в биологических системах и их компонентах. - Л.: Изд.Ленингр.Ун-та, 1983, с. 3-9 .

28. Gutowsky H.S., Saika A. Dissociation, chemical exchange and the proton magnetic resonance in some aqueus electrolytes.- J.Chem.Phys., 1953, v.21 N5, p. 1688 1697 .

29. McConnell H.M. Reaction rates by nuclear magnetic resonance.- J.Chem.Phys., 1958, v.28 N3, p. 430 431 .1 7

30. Swift T.J., Connick R.E. NMR-relaxation mechanisms of 0 in aqueous solutions of paramagnetic cations and the lifetime of water molecules in the first coordination sphere. J.Chem. Phys., 1962, v.37 N2, p. 307 - 320 .

31. Luz Z., Meiboom S. Proton relaxation in dilute solution of cobalt(II) and nickel(II) ions in methanol and the rate of methanol exchange of the solvation sphere. J.Chem.Phys., 1964, v.40 N9, p. 2686 - 2692 .

32. Неронов Ю.И., Барзах A.E., Мухамадиев X. Исследование изотопов водорода методом ЯМР для определения отношения магнитных моментов протон-дейтрон до восьмого знака. Журн.эксп.теор. физики, т.69 вып.6 (12), с. 1872 - 1882 .

33. Неронов Ю.И., Барзах А.Е. Определение методом ЯМР отношения магнитных моментов тритон-протон с погрешностью 10 % .- Журн.Эксп.Теор.Физ., 1977, т.72 вып.5, с. 1658 1669 .

34. Лихтенштейн Г.И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии. М.: Наука, 1974, - 254 с.

35. ЗЭ.Кольтовер В.К. Спиновые метки и зонды в исследованиях модельных и биологических мембран, в сборн. Итоги науки и техники. Серия "Биофизика", т.II, М., 1969, с. 10 - 100 .

36. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды:.оптические свойства и взаимодействие с мембранами, в сборн. Итоги науки и техники. Серия "Биофизика", т.II, М., 1969, с. 101 - 188 .

37. ESR and NMR of paramagnetic species in biological and related systems, ed. by Bertini I. and Drago R.S. Dordrecht, Boston, London, D.Reidel Publ.Comp., 1979 - 425 ps.

38. Satterlee J., Erman J. Proton magnetic resonance studies of cytochrome С peroxidase: pD dependence of isotropically shifted resonances. Arch.Biochem.Biophys., 1980, v.202 N2, p. 608 - 616 .

39. Roy S., Redfield A. Assignement of imino proton spectra of yeast phenilalanine transfer ribonucleic acid. Biochemistry, 1983, v.22 N7, p. 1386 - 1390 .

40. Bruker Report, W-Germany, Bruker-Physik A.G., 1979, N3, p.12- 16 .

41. Маршелл Э. Биофизическая химия, т.2 . М.: Мир, 1981,- 820 с.

42. Уо Д. Новые методы ЯМР в твёрдых телах. М.: Мир, 1978,- 179 с.

43. Aue W.P., Bartholdi Е., Ernst R.R. Two-dimensional spectroscopy. Application to nuclear magnetic resonance. J.Chem. Phys., 1976, v.64 N5, p.2229 - 2246 .

44. Hahn E.L. Spin echoes. Phys.Rev., 1950, v.80 N4, p.580 594.

45. Spin labeling, ed. by Berliner L. New-York, San-Francisco, London, Acad.Press, 1976, -.592 ps.

46. Исаев-Иванов В.В., Исаева-Иванова JI.С., Клейнер А.Р., Одинцов В.Б., Сидоров О.Ю., Фошчёв В.Н. Спектральное разделение1. Jtt оконформационных состояний на спин-меченой тРНК из

47. Молек.Биол., 1983, т.17 вып.2 , с. 362 - 372 .

48. Huestic W.H., Raftery М.А. Use of fluorine-19 nuclear magnetic resonance to study conformation changes in selectively modified ribonuclease S. Biochemistry, 1971, v.10 N7,p. 1181 1186 .

49. Spanier R.F. , Vladimiroff Т., Malinowski E.R. Bulk magnetic susceptibility determined from NMR spinning sideband using coaxial cells. J.Chem.Phys., 1966, v.45 N11, p.4355 - 4357.

50. Evans D. The determination of paramagnetic susceptibility of substances in solution using NMR. J.Chem.Soc.(London), 1959, N6, p. 2003 - 2005 .

51. Калинников В.Т., Ракитин Ю.В. Введение в магнетохимию. Метод статической магнитной восприимчивости в химии. М.: Наука, 1980, - 302 с.

52. Брилл А. Обнаружение свободных радикалов по магнитной восприимчивости, в кн. Свободные радикалы в биологических системах, ред. Блюменфельд Л.А. - М.: Изд.Иностр.Лит., 1963,с. 76 100 .

53. Melamud E., Mildvan A. Magnetic resonance studies of the interaction of and phosphoenolpyruvate with pyruvate kinase. J.Biol.Chem., 1974, v.250 N20, p. 8193 - 8201 .

54. Asakura Т., Reed G.H., Leigh G.S. Solution electron paramagnetic resonance spectra of hemoproteins at room temperature.- Biochemistry, 1972, v.11 N3, p.334 337 .

55. Reuben J., Reed G.H., Cohn M. Note on the distinction between transverse and longitudinal relaxation studies. J.Chem.Phys. 1970, v.52, N3 part 2, p. 1617 .

56. Фаррар Т., Беккер Э. Импульсная и фурье-спектроскопия ЯМР.- М.: Мир, 1973, 164 с.

57. Лениндкер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функции клетки. М,: Мир, 1974 , 956 с.

58. Angerman N.S., Hasinoff В.В., Dunford Н.В., Jordan R.B. Study of the exchange rates of ethanol and water on protoporphyrin IX by NMR line broadening.- Can.J.Chem., 1969, v.471. N 17 , p. 3217 3224 .

59. Luz.Z., Shulman R. Proton magnetic resonance shifts in aqueous solutions of paramagnetic metal ions. J.Chem.Phys., 1965, v.43 N10, p. 3750 - 3756 .

60. King Т.Е. Reconstitution of the respiratory chain. in Advances in Enzymology, founded by Nord P.P., ed. by Meister A., New-York, J.Wiley and Sons, v.28, 1966, p. 155 - 236 .

61. Gupta R.K., Mildvan A.S. Nuclear relaxation studies on human methemoglobin. J.Biol.Ghem., 1975, v.250 N1, p. 246 - 253 .

62. Vuk-Pavlovic's., Benko B. The haem-environment in horseradish peroxidase as seen by proton magnetic relaxation. Biochem. Biophys.Res.Commun., 1975, v.66 N4, p. 1154 - 1159 .

63. Navon G., Shulman R.G., Wyluda B.J., Jamane T. Nuclear magnetic resonance studies of the active site of carboxypeptidase A.- Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1968, v.60 N1, p. 86-91 .

64. Navon G., Shulman R.G., Wyluda B.J., Jamane T. Nuclear magnetic resonance study of the binding of fluoride ions to carboxypeptidase. J.Mol.Biol., 1970, V.51 N1, p. 15 - 30 .

65. Lanir A., Gradstain S., Navon G. Temperature and frequency dépendance of solvent proton relaxation rates in solution of manganese(II) carbonic anhidrase. Biochemistry, 1975, v.141. N2, p. 242 248 .35

66. Ward R.L. CI nuclear magnetic resonance studies of a zinc métalloenzyme carbonic anhydrase. Biochemistry, 1969, v.8 N5, p. 1879 - 1883 •

67. Ward R.L.Zinc environmental differences in carbonic anhydrase isozymes. Biochemistry, 1970, v.9 N12, p. 2447 - 2453 .83«Danchin A. tRNA structure and binding sites for cations.- Biopolimers, 1972, v.11 N7, p. 1317 1333 .

68. Peacock A.R., Richards R.E., Sherard B. Proton magnetic relaxation in solution of E.Coli ribosomal RNA containing Mn^+ions.- Molec.Phys., 1969, v.16 N1, p. 177 188 .

69. Walters J.A.L.I., Greedes H.A.M., Hilbers C.W. On the binding of Mg2+ and Mn2+ to tRNA. Biophys.Chem., 1977, v.7 nN1,p. 147 151 .

70. Lanir A., Navon G. NMR studies of bovine carbonic anhydrase. Binding of sulfonamides to the zinc enzime. Biochemistry, 1971, v. 10 N6, p. 1024- - 1032 .

71. Lanir A., Navon G. Nuclear magnetic resonance studies of carbonic anhydrase. Binding of sulfacetamide to the manganese enzyme. Biochemistry, 1972, v.11 N19, p. 3536 - 3544 .

72. Lanir A., Navon G. Interaction of bovine carbonic anhydrase with acetate ions. Biochim.Biophys.Acta, 1974, v.341 N1, p. 65 - 74 .

73. Lanir A., Navon G.NMR studies of two binding sites of acetate ions to manganese(II) carbonic anhydrase. Biochim.Biophys. Acta, 1974, v.341 N1, p. 75 - 84 .

74. Gadian D.G., Radda G.K., Richards R.E. NMR studies on substrate binding to phosphoglucomutase. Biochim.Biophys.Acta, 1974,v.358 N1, p. 57 68 .

75. Leigh J.J.S., Maltempo M.M., Ohlsson P.-I., Paul K.-G. Optical, NMR and EPR properties of horseradish peroxidase and it's donor complexes. FEBS Letters, 1975, v.51 N2, p. 304 - 309 .

76. Paul K.-G., Ohlsson P.-I. Equilibria between horseradish peroxidase and aromatic donors. Acta Chem.Scand., 1978, V.B32

77. E.Coli, in Cancer Enzymology, ed. by Schultz J, Ahmad D.F., New-York, Acad.Press, 1976, p. 123 - 137 .

78. Burns P.D., Luoma G.A., Marshall A,G. Evaluation of base-pairing schemes for E.Coli 5S RNA by 400 MHz proton nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1980, v.96 n"N2, p. 805 - 811 .

79. Tritton T. Ribosome-chloramphenicol interactions: a nuclear magnetic resonance study. Arch.Biochem.Biophys., 1979, v.197, N1, p. 10 - 17 .

80. Villafranca J.J. EPR spectra of Fe(III)-superoxide dismutase with special reference to the electron spin relaxation time of Fe(III). FEBS Letters, 1976, v.62 N2, p. 230 - 236 .

81. WM 500 multinuclear NMR. Bruker-Physik A.G. Publ., 1982 .

82. Freeman R., Gestblom B. Localized saturation effects in nuclear magnetic double resonance. J.Chem.Phys., 1968, v.48 N11, p.5008 - 5020 .

83. Gray K.W., Ozier I. New technique for the measurement of NMR splittings to very high accuracy. Phys.Rev.Letters, 1971, v.26 N4, p. 161. - 165 .

84. ЮЗ.Константинов Ю.С., Смирнов A.M. О некоторых применениях спиновых генераторов в ЯМР спектроскопии. Приборы и техн. эксп., 1972, №5, с. 134 - 135 .

85. Ю4.Константинов Ю.С., Смирнов A.M. О многочастотных колебаниях спинового генератора. Радиотехника и электроника, 1972, т.17 № II, с. 2456 - 2459 .

86. Ю5. Умарходнаев P.M. Об устойчивости спинового генератора боковой полосы, работающего на неоднородно уширенной линии."Радиотехника и электроника, 1974, т.19 № 4, с. 760 765 .

87. Ю6.Владимирский К.В., Лабзов Б.А. Спектрометр, стабилизированный спиновым генератором. Приборы и техн. эксп., 1962, №2, с. 102 - 106 .

88. Ю7.Худсон Д. Статистика для физиков. Лекции по теории вероятности и элементарной статистике. М.: Мир, 1970, - 296 с.

89. Ю8.паунд Р.В. О весе фотонов. Успехи физ. наук, I960, т.72 вып.4, с.673 - 683 .

90. Ю9.Эрнст Р. Повышение чувствительности в спектроскопии магнитного резонанса. I. Анализ метода усреднения во времени. Приборы для научн. исслед., 1965, И2, с. 3 - 10 .

91. Williams G.A., Gutowsky H.S. Sample spinning and field modulation effects in nuclear magnetic resonance. Phys.Rev., 1956, v.104 N2, p. 278- 283 .

92. Андерсон В. Электрические шиммы, в кн. ЯМР- и ЭПР-спект-роскопия. - М.: Мир, 1964, с. 149 - 152 .

93. Сысоева H.A., Степанянц А.У., Бучаченко А.Л. Парамагнитные сдвиги протонов растворителей в присутствии органических радикалов. Журн.структ.химии, 1968, т.9 вып.2, с. 311 - 312.

94. Morishima I., Endo К., Yonezawa Т. Interaction between closed1 13and open-shell molecules. VI. H and ^C contact shifts and molecular orbital studies on hydrogen bond of nitroxide radical. J.Chem.Phys., 1973, v.58 N8, p.3146 - 3159 .

95. Торчинский Ю.М. Сера в белках. М.: Наука, 1977, - 302 с.

96. Hayaishi О. Oxigenases. Ed. by Hayaishi 0., New-York, Acad. Press, 1962, 588 ps.

97. Taylor J.E., Yan J.P., Jin-Liang Wang. The iron(III)-cataly-zed oxidation of cystein by molecular oxygen in the aqueus phase. An example of two-thirds order reaction. J.Am.Chem. Soc., 1966, v.88 N8, p. 1663 - 1667 .

98. Hanaki A., Kamide H. Transient intermediates in the copper catalysed oxidation of cystein. Chem.Pharm.Bull., 1974, v.22 N9, p. 2491 - 2498 .

99. Hanaki A., Kamide H. Autooxidation of cysteine catalysed by copper in glycilglycine buffer. Сhem.Pharm.Bull., 1975, v.23 N6, p. 1671 - 1676 .

100. Yang C.S., Huennekens P.M. Iron-mercaptoetanol-inorganic sulfide complex. Possible model for the chromophore of non-heme iron proteins. Biochemistry, 1970, v.9 N10, p. 2127- 2133 .

101. Hoskins B.P., Martin R.L., White A.H. Molecular and cristal structure of a 5-covalent iron(III) complex with spin S =3/2. Nature (London), 1966, v.211 N 5049, p. 627 - 628 .

102. Niarhos D., Kosticas A., Simopulos A., Concovanis D., Philtigstrud P., Coffman R.E. Mossbauer, magnetic susceptibility and EPR studies of intermediate spin iron(III) dithiooxa-lato halides. J.Chem.Phys., 1978, v.69 N10, p. 4411 - 4418.

103. Zahlenwerte und functionen aus physik, Chemie, astronomie, geophysik und technik. Berlin, Springer-Verlag, 1951, Bd.1, teil 3, seite 522 .

104. Wickman H., Klein M., Shirley D. Paramagnetic resonance of Fe^+ in policrystalline ferrichrome A. J.Chem.Phys., 1965, v.42 N6, p. 2113 - 2117 .

105. Вейсблут M. Физика гемоглобина. в кн. Структура и связь,- М.: Мир, 1969, с. II 185 .

106. Go1ding R.M., Tennant W.C., Kanekar C.R., Martin R.L., White A.H. NMR studies of a series of iron(III) dithiocarba-mate complexes.- J.Chem.Phys., 1966, v.47 N6, p. 2688 2693.

107. Рачинский Ф.Ю., Славичевская H.M. Химия аминотиолов. М.-Л.: Химия, 1965, - 295 с.

108. Yagi К. Reaction intermediates of d-amino acid oxidase, -in Flavins and flavoproteins, ed. by Slater E.C., Amsterdam, London, New-York, Elsevier Publ. Сотр., 1966, v.8, p. 210- 225 .

109. Бреслер C.E., Васильева H.H., Казбеков Э.Н. Изучение механизма действия оксидазы д-аминокислот. I. Доказательство свободно-радикального механизма реакции, катализируемой димернойформой фермента. Молек. биология, 1976, т.10 вып.2, с. 260 - 267. .

110. Sussman J.L., Holbrook S.R., V/arrant R.Y/., Church G.M.,

111. D.С.Butterworth, 1964, ps. 139. Yamazaki I., Yokota K. The oxidation states of peroxidase.- Molec. and Cell.Biochem., 1973, v.2 N1, p.39 52 . НО.Магонов C.H., Давыдов P.M., Блюменфельд JI.A., Арутюнян A.M.,

112. Шаронов Ю.А. Спектры поглощения и магнитного кругового дихроизма гемсодержащих белков в неравновесных состояниях.III.Комплексы пероксидазы.-Молек.биология, 1978,т.12 вып.5,с.П91- 97,

113. Maltempo М.М., Ohlsson P.-I., Paul K.-G., Petersson L.,

114. Ehrenberg A. Electron paramagnetic resonance analysis of horseradish peroxidase in situ and after purification.- Biochemistry, 1979, v.18 N14, p. 2935 2941 .

115. Marklud S. Mechanisms of irreversible inactivation of horseradish peroxidase caused by hydroxymethylhydroperoxide.

116. Arch.Biochem.Biophys.» 1973, v.154 N2, p. 614 622 .

117. Tamura M. Optical and magnetic measurements of horseradish peroxidase. II. pH dependence of peroxidase. Biochim.Bio-phys.Acta, 1971, v.243 N2, p. 249 - 258 .

118. Tamura M. Optical and magnetic measurements of horseradish peroxidase. I.Azide complex of peroxidase. Biochim.Biophys. Acta, 1971, v.243 N2, p. 239 - 248 .

119. Wever R., Bakkenist A.R.J. The interaction of mieloperoxidase with ligands as studied by EPR. Biochem.Biophys.Acta, 1980, v.612 N1, p. 178 - 184 .

120. Critchlow J.E., Dunford H.B. Studies on horseradish peroxidase. X. The mechanism of the oxidation of p-cresol, ferro-cianide and iodide by compound II. J.Biol.Chem., 1972, v.247 N12, p. 3714 - 3725 .