Применение белкового сплайсинга для получения рекомбинантных полипептидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Степаненко, Василий Николаевич

• Степаненко, Василий Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Степаненко, Василий Николаевич

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Глава 1.

Интеины: механизм, распространение, эволюция и применение.

1.1. Введение.

1.2. Особенности первичной структуры интеинов.

1.3 Механизм белкового сплайсинга.

1.3.1 Канонический механизм белкового сплайсинга.

1.3.2 Белковый транс-сплайсинг.

1.3.3 Автопроцессинг белков Hedgehog семейства.

1.3.4 Белковый сплайсинг в интеинах, содержащих нетипичные аминокислоты в консервативных доменах.

1.4 Факторы, влияющие на реакцию белкового сплайсинга.

1.5 Эндонуклеазные домены интеинов. 28 1.5.1 Особенности первичной структуры. 28 1.5.2. Хоуминг интеинов.

1.6 Распространение и эволюция интеинов.

1.7 Применение белкового сплайсинга в биотехнологии.

1.7.1 Экспрессионные системы на основе интеинов для очистки и модификации рекомбинантных белков.

1.7.2 Реакция лигирования синтезированных белков.

1.7.3 Белковый транс-сплайсинг и применение составных интеинов в биотехнологии.

1.7.4 Применение интеинов для посттрансляционной активации белков. 47 1.7.5. Перспективы применения интеинов для очистки рекомбинантных белков и пептидов в промышленных масштабах.

Глава 2.

Применение интеиновых систем для получения рекомбинантных полипептидов.

2.1 Введение.

2.2 Использование интеиновых систем для получения рекомбинантных полипептидов с N-концевым серином на примере тимозина-al.

2.2.1 Применение векторных систем на основе See VMA интеина.

2.2.2 Применение векторных систем на основе мутантного Cys(l)/Ala(l) See VMA интеина.

2.2.3 Создание и применение модифицированного Ssp DnaB мини-интеина.

2.3 Использование Ssp DnaB мини-интеина для получения рекомбинантных полипептидов с N-концевым гистидином. 69 2.3.1. Применение Ssp DnaB мини-интеина для получения рекомбинантого глюкагона. 69 2.3.2 Оптимизация третьего способа получения глюкагона.

2.3.3 Применение Ssp DnaB мини-интеина для получения рекомбинантого оксинтомодулина. 82 2.4 Применение Ssp DnaB мини-интеина для получения рекомбинантого эпидермального фактора роста человека и исследование влияния интеиновой части гибридного белка на рефолдинг целевого полипептида.

Глава 3.

Материалы и методы.

3.1. Реактивы.

3.2. Ферменты.

3.3. Материалы.

3.4. Препараты.

3.5. Олигодезоксирибонуклеотиды.

3.6. Бактериальные штаммы.

3.7. Плазмидные вектора.

3.8. Лабораторное оборудование.

3.9. Буферы и растворы.

3.10. Методы.

3.10.1. Электрофорез белков в ПААГ.

3.10.2. Приготовление компетентных клеток и их трансформация.

3.10.3. Определение концентрации белка.

3.10.4. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле.

3.10.5. Отбор рекомбинантов при помощи гибридизации на нитроцеллюлозных мембранах.

3.10.6. Секвенирование плазмидной ДНК по методу Сенгера.

3.10.7. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

3.10.8. Амплификация ДНК in vitro.

3.10.9. Извлечение ДНК из геля.

3.10.10. Молекулярное клонирование.

3.10.11. Выделение гибридного белка в растворимой форме.

3.10.12. Расщепление гибридного белка на хитиновом сорбенте.

3.10.13. Получение гибридного белка в виде телец включения.

3.10.14. Солюбилизация телец включения.

3.10.15. Расщепление гибридного белка в растворе.

3.10.16. Препаративное получение глюкагона.

3.10.17. Ренатурация и автокаталитическое расщепление hEGF. 110 Первая схема: 110 Вторая схема: 112 Выводы. 113 Благодарности. 114 Список литературы.

Список сокращений

Amp - антибиотик ампициллин

АТР - аденозин-5'-трифосфат

БисАА (BisAA) - бисакриламид

БСА (BSA) - бычий сывороточный альбумин

ГБ - гибридный белок

ТА1, Та1 -тимозин альфа

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН (SDS) - додецилсульфат натрия

ДТТ (DTT) - 1,4-дитиотриэтол

Ssp DnaB - DnaB геликаза из штамма РСС6803 Synechocystis sp.

See VMA - субъединица А вакуолярной АТФазы из Saccharomyces cerevisiae dNTP - 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат ddNTP - 2',3'-дидезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат

ИПТГ (IPTG) - изопропилтио-Р-Б-галактозид

MESNA - 2-меркаптоэтансульфоновая кислота

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль pGEM-5Zf(") - неэкспрессионная плазмида pTYBl 1 - экспрессионная плазмида, содержащая интеин See VMA pTWINl - экспрессионная плазмида, содержащая интеин Ssp DnaB

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТЕМЕД - К,К,К',Ы'-тетраметилэтилендиамин

Трис - трис(гидроксиметил)метиламин ц-АМФ - циклический аденозин-5'-монофосфат

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ТВ - тела включения

МВР - мальтозо-связывающий белок

Hh - белки Hedgehog семейства

А.К. - аминокислота

А.О. - аминокислотный остаток

EPL - метод лигирования синтезированных белков

X-gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-0-галактопиранозид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Применение белкового сплайсинга для получения рекомбинантных полипептидов»

Получение рекомбинантных полипептидов 1-7 кДа в прокариотических системах, как правило, является довольно сложной задачей. Небольшие полипептиды являются доступной мишенью для клеточных протеаз ввиду отсутствия жесткой третичной структуры. Существует два способа избежать протеолитического расщепления: секреция целевого полипептида в культуральную среду и экспрессия в составе гибридного белка. В случае секреции целевого полипептида в культуральную среду возникает проблема полного отщепления лидерного пептида и концентрирования целевого полипептида из большого объема. В случае экспрессии целевого полипептида в составе гибридного белка основной проблемой становится селективное расщепление пептидной связи с отделением целевого пептида от белка носителя. В настоящее время разработан ряд схем, позволяющих решать эту задачу, в частности с использованием энтерокиназы, фактора X или TEV протеазы. Но это значительно увеличивает затраты на технологию и делает масштабирование экономически нецелесообразным.

Альтернативным решением является использование структур интеинов в составе гибридного белка. Интеины - это белки, способные к автокаталитическому выщеплению из структуры белка-предшественника и сопутствующему лигированию N- и С-фланкирующих белковых фрагментов, так называемых экстеинов [1, 2]. В настоящее время ряд интеинов коммерчески доступен, например, See VMA из Saccharomyces cerevisiae и Ssp DnaB из Synechocestis sp., используемых в настоящей работе.

Целью данной работы являлась разработка биотехнологических методов получения биологически активных полипептидов с использованием структур интеинов.

В качестве объектов нами были выбраны биологически активные полипептиды: тимозин-аь глюкагон, оксинтомодулин и эпидермальный фактор роста человека.

Глава 1.

Интеины: распространение, эволюция, автокаталитический механизм и применение.

1.1. Введение.

Белковый сплайсинг представляет собой посттрансляционный процесс, в результате которого из белка-предшественника удаляется внутренний фрагмент полипептидной цепи (интеин), а последовательности, фланкирующие интеин с обеих сторон (экстеины), лигируются с образованием пептидной связи (рис. 1) [2]. Внутренняя часть полипептида, удаляемая в результате белкового сплайсинга, получила название интеина, а наружные N- и С-концевые части - экстеинов.

Процесс является автокаталитическим и не требует присутствия каких-либо кофакторов или ферментов. Это отличает белковый сплайсинг от посттрансляционного процессинга.

Явление белкового сплайсинга было открыто более 10 лет назад практически случайно при исследовании экспрессии дрожжевого гена vmal, кодирующего субъединицу VMA1 вакуолярной АТФазы. Исследование степени гомологии данного гена у различных микроорганизмов неожиданно показало, что у других видов ген vmal кодирует белок с молекулярной массой около 70 кДа, тогда как у дрожжей - это белок с молекулярной массой 119 кДа. При этом для концевых последовательностей дрожжевого гена vmal была характерна высокая степень гомологии с аналогичными последовательностями в генах других микроорганизмов, а в центральной части гомология нарушалась. Частичная делеция в гене vmal у дрожжей приводила к прекращению синтеза полипептида с молекулярной массой 69 кДа, но не 119 кДа. Было выдвинуто предположение о том, что внутренняя аминокислотная последовательность из предшественника с молекулярной массой 119 кДа отщепляется на уровне синтезированного полипептида. Дальнейшие исследования полностью подтвердили эту гипотезу. Так, сдвиг рамки считывания в сегменте гена vmal, кодирующего центральную часть полипептида и отсутствующую в зрелом белке, приводил к прекращению синтеза белка на рибосомах из-за возникновения в мРНК новых терминирующих кодонов трансляции. Подобное не происходило, если бы центральная часть про-мРНК гена vmal удалялась в результате сплайсинга. Кроме того, скрининг клеточных лизатов антителами к центральной части полипептида, отсутствующей в зрелой субъединице, показал наличие белкового продукта с предсказанной молекулярной массой 50 кДа. Он присутствовал в количественном соотношении 1:1 к функционально активному УМА -полипептиду с молекулярной массой 69 кДа. Это указывало на то, что последовательность РНК центральной части гена транслируется на рибосомах и соответствующая часть полипептида-предшественника удаляется уже посттрансляционно. Эти, а также ряд других результатов, позволили утверждать - помимо альтернативного сплайсинга ДНК и сплайсинга мРНК существует третий вариант сплайсинга - белковый [1,3].

Изучение механизма белкового сплайсинга раскрыло чрезвычайно сложный автокаталитический процесс, который не требует ни кофакторов, ни вспомогательных ферментов. Важным аспектом белкового сплайсинга является то, что реакции лежащие в его основе встречаются и в других формах белкового процессинга: от расщепления пептидной связи до связывания с небелковыми субстратами. Некоторые из этих особенностей могут быть результатом сходящейся эволюции, но, по крайней мере, автопроцессинг белков семейства Hh является, бесспорно, эволюционно родственным белковому сплайсингу. Особо стоит отметить, что элементы белкового сплайсинга обнаружены только в одноклеточных организмах, где их распространение имеет все признаки паразитических генетических элементов, тогда как близко родственные белки семейства Hh обнаружены только у животных, где они выполняют крайне необходимую регуляторную функцию в раннем эмбриональном развитии. Понимание эволюции и функции интеинов осложняются тем, что большинство интеинов включает в себя эндонуклеазы рестрикции, что превращает интеины в своего рода паразитические элементы за счет горизонтального переноса интеин-кодирующих областей, возможно - даже между видами [2].

Хотя обнаружено только около 100 потенциальных случаев белкового сплайсинга (и множество интеиноподобных последовательностей, как способных, так и не способных к белковому сплайсингу), они встречаются на всех трех уровнях жизни (археа, бактерии и эукариоты) наводя на мысль о эволюционно древнем происхождении этих доменов [3].

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Степаненко, Василий Николаевич

Выводы

1. Осуществлен химико-ферментативный синтез и клонирование в E.coli в составе экспрессионных векторов pTYBll, TWIN1 искусственных ДНК, кодирующих пептиды медицинского назначения: тимозин-al, глюкагон, оксинтомодулин и эпидермальный фактор роста человека.

2. Разработаны подходы к получению рекомбинантных полипептидов содержащих N-концевой серин (гистидин) с использованием систем белкового сплайсинга.

3. Созданы штамм-продуценты ER2566/pER-Thyml; ER2566/pER-Thym2; ER2566/pER-Thym3; ER2566/pER-Gl; ER2566/pER-Oxm; ER2566/pER-hEGF и оптимизированы условия ферментации, обеспечивающие высокий уровень продукции следующих рекомбинантных белков: гибриды интеинов See VMA, See VMA(Cys/Ala) и Ssp DnaB(Gln) с тимозином-al человека, гибриды интеина Ssp DnaB с глюкагоном, оксинтомодулином и эпидермальным фактором роста человека.

4. Разработан Zn-зависимый способ переключения сплайсинга See VMA интеина на автокаталитическое расщепление с получением тимозина-al.

5. Исследован процесс ренатурации эпидермального фактора роста человека в составе гибридного с интеином Ssp DnaB белка. Показана независимость этого процесса от структуры интеиновой части.

6. Разработан лабораторный регламент получения рекомбинантного глюкагона человека.

7. Получены опытные партии тимозина-al, глюкагона, оксинтомодулина и эпидермального фактора роста человека.

Благодарности

Автор благодарен Р. С. Есипову за обучение методам молекулярной биологии и генной инженерии, плодотворные обсуждения и помощь в написании диссертации, А. И. Гуревичу за ценные советы, JI. А. Чуповой и Т. И. Муравьевой за помощь в проведении экспериментов, A. JI. Каюшину и М. Д. Коростелевой за синтез олигонуклеотидов. Отдельная благодарность академику А. И. Мирошникову за научное руководство.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Степаненко, Василий Николаевич, 2006 год

1. Xu М., Southworth М. W., Mersha F. В., Hornstra L. J., Perler F. B. / In vitro protein splicing of purified precursor and the identification of a branched intermediate. / Cell, 1993, 75, 1371-1377.

2. Starokadomskii P. L. / Protein splicing. / Ukr Biokhim Zh., 2005, Jul-Aug, 77(4), 14-29

3. Pietrokovski S. / Modular organization of inteins and C-terminal autocatalytic domains. I Protein Sci., 1998, 7, 64-71.

4. Kawasaki M., Nogami S., Satow Y., Ohya Y., Anraku Y. / Identification of three core regions essential for protein splicing of the yeast Vmal Protozyme. / J. Biol. Chem. 1997, 272, 15668-15674.

5. Jurica M. S., Stoddard B. L. / Homing endonucleases: structure, function and evolution. / Cell. Mol. Life Sci., 1999, 55, 1304-1326.

6. Butler M. I., Gray J., Goodwin T. J., Poulter R. T. / The distribution and evolutionary history of the PRP8 intein./ BMC Evol Biol., 2006, May, 31, 6-42.

7. Belfort M., Roberts R. J. / Homing endonucleases: keeping the house in order. / Nucleic Acids Res., 1997, 25, 3379-3388.

8. Stoddard B. L. / Homing endonuclease structure and function. / Q Rev Biophys., 2005, Feb, 38(1), 49-95

9. Chong S., Xu M. Q. / Protein splicing of the Saccharomyces cerevisiae VMA intein without the endonuclease motifs. / J. Biol. Chem., 1997, 272, 15587-15590.

10. Southworth M.W., Benner J., Perler F.B. / An Alternative Protein Splicing Mechanism for Inteins Lacking an N-terminal Nucleophile. / 2000, EMBOJ. 19, 5019-5026.

11. Telenti A., Southworth M., Alcaide F., Daugelat S., Jacobs W. R., Perler, F. B. / The Mycobacterium xenopi GyrA protein splicing element: characterization of a minimal intein. / 1997, J. Bact. 179, 6378- 6382.

12. Perler F. B. / InBase: the Intein Database. / 2002, Nucleic Acids Res. 30, 383-384.

13. Xu M., Perler F. В., / The mechanism of protein splicing and its modulation by mutation. / EMBO J. 1996,15, 5146 -5153

14. Noren С J., Wang J., Perler F. B. / Dissecting the Chemistry of Protein Splicing and its Applications. / 2000, Angewandte Chemielnt. Ed. 39, 450-466.

15. Xu M., Paulus H., Chong S. / Fusion to Self-Splicing Inteins for Protein Purification. / Methods Enzymol., 2000, 326, 376-418.

16. Klabunde Т., Sharma S., Telenti A., Jacobs W. R., Sacchettini, J. C. / Crystal structure of gyrA intein from Mycobacterium xenopi reveals structural basis of protein splicing. / 1998, Nature Struct. Biol. 5, 31-36.

17. Duan X., Gimble F.S., Quiocho P. / Crystal structure of Pl-Scel, a homing endonuclease with protein splicing activity. / Cell, 1997, 89, 555-564.

18. Kawanishi Y., Iwai K., Ando T. / Determination of C-terminal arginine and asparagines of proteins by catalytic hydrozinolysis. / JBiochem (Tokyo), 1964, 56,314-24.

19. Shao Y., Xu M.-Q., Paulus H. / Protein splicing: Evidence for an N-0 acyl rearrangement as the initial step in the splicing process. / Biochemistry, 1996,35,3810-3815.

20. Paulus H. / Protein Splicing and Related Forms of Protein Autoprocessing. / Annu. Rev. Biochem., 2000, 69,447-496.

21. Shao, Y., Paulus H. / Protein splicing: estimation of the rate of O-N and S-N acyl rearrangements, the last step of the splicing process. / J. Pept. Res., 50, 193-198.

22. Perler F. В., Xu M-Q., Paulus H. / Protein splicing and autoproteolysis mechanisms. / Curr. Opin. Chem. Biol. 1997, 1, 292-299.

23. Kawasaki M., Satow Y., Ohya Y., Anraku Y. / Protein splicing in the yeast Vmal protozyme: evidence for an intramolecular reaction / FEBS Lett., 1997,412,518-520.

24. Fodor K., Harmat V., Neutze R., Szilagyi L., Graf L., Katona G. / Enzyme:substrate hydrogen bond shortening during the acylation phase of serine protease catalysis. I Biochemistry, 2006, 45(7), 2114-2121.

25. Bobofchak К. M., Pineda A. O., Mathews F. S., Di Cera E. / Energetic and structural consequences of perturbing Gly-193 in the oxyanion hole of serine proteases J JBiol Chem., 2005, 280(27), 25644-25650.

26. Carter P., Abrahmsen L., Wells J. A. / Probing the mechanism and improving the rate of substrate-assisted catalysis in subtilisin BPN'. / Biochemistry, 1991, 30(25), 6142-6148.

27. Fersht A. R. / Enzyme Structure and Mechanism / W. H. Freeman, Reading, 1977

28. Chong S., Williams K. S., Wotkowicz, C., Xu M. Q. / Modulation of protein splicing of the Saccharomyces cerevisiae vacuolar membrane ATPase intein. I JBiol Chem, 1998, 273,10567-10577.

29. Gorbalenya A. E. / Non-canonical inteins. / Nucleic Acids Res. 1998, 26, 1741-1748.

30. Wu H., Hu Z., Liu X. Q. / Protein trans-splicing by a split intein encoded in a split DnaE gene of Synechocystis sp. PCC6803. / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998,95,9226-9231.

31. Liu X. Q., Yang J. / Split-dnaE genes encoding multiple novel inteins in Trichodesmium erythraeum. / J. Biol. Chem., 2003, 278(29), 26315-26318.

32. Caspi J., Amitai G., Belenkiy O., Pietrokovski S. / Distribution of split DnaE inteins in cyanobacteria. / Mol. Microbiol., 2003, 50(5), 1569-1577.

33. Sun W., Yang J., Liu X. Q. / Synthetic two-piece and three-piece split inteins for protein trans-splicing. I J. Biol. Chem., 2004, 279(34), 35281-35286.

34. Shingledecker K., Jiang S., Paulus, H. / Molecular dissection of the Mycobacterium tuberculosis RecA intein: design of a minimal intein and of a trans-splicing system involving two intein fragments. / Gene, 1998, 207, 187195.

35. Southworth M. W., Adam E., Panne D., Byer R., Kautz R., Perler F. B. / Control of Protein Splicing by Intein Fragment Reassembly. / EMBO J., 1998, 17,918-926.

36. Mills К. V., Lew В. M., Jiang S., Paulus H. / Protein splicing in trans by purified N- and C-terminal fragments of the Mycobacterium tuberculosis RecA intein. I Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 3543-3548.

37. Dalgaard J. Z., Moser M. J., Hughey R., Mian I. S. / Statistical modeling, phylogenetic analysis and structure prediction of a protein splicing domain common to inteins and hedgehog proteins. / J. Computational Biol., 1997, 4, 193-214.

38. Koonin E. V. / A protein splice-junction motif in hedgehog family proteins. / Trends Biochem. Sci, 1995, 20,141-142.

39. Porter J. A. et al. / Hedgehog Patterning Activity: Role of a lipophilic modification mediated by the carboxy-terminal autoprocessing domain. / Cell,1996, 86, 21-34.

40. Bumcrot D. A., Takada R., McMahon A. P. / Proteolytic processing yields two secreted forms of sonic hedgehog. / Mol Cell Biol., 1995, 15(4), 22942303. Erratum in: Mol. Cell Biol, 1995, May; 15(5), 2904.

41. Jeong J., McMahon A. P. / Cholesterol modification of Hedgehog family proteins. !J. Clin. Invest., 2002, 110(5), 591-596.

42. Wang S., Liu X. Q. / Identification of an Unusual Intein in Chloroplast ClpP Protease of Chlamydomonas eugametos. / J. Biol. Chem. 1997, 272, 11869-73.

43. Chen L., Benner J., Perler, F. B. / Protein splicing in the absence of an intein penultimate histidine. / J. Biol. Chem., 2000, 275, 20431-20435.

44. Amitai G., Dassa В., Pietrokovski S. / Protein Splicing of Inteins with Atypical Glutamine and Aspartate C-terminal Residues. / J. Biol. Chem., 2004, 279(5), 3121-3131.

45. Pietrokovski S. / Identification of a virus intein and a possible variation in the protein-splicing reaction. / Curr. Biol., 1998, 8, R634-635.

46. Xu M., Comb D. G., Paulus H., Noren C. J., Shao, Y., Perler F. B. / Protein splicing: an analysis of the branched intermediate and its resolution by succinimide formation. / EMBO J. 1994, 13, 5517-5522.

47. Poland B. W., Xu M. Q., Quiocho F. A. / Structural Insights into the Protein Splicing Mechanism of Pl-Scel. / J Biol Chem, 2000, 275(22), 1640816413.

48. Ghosh I., Sun L., Xu M. Q. / Zinc Inhibition of Protein Trans-splicing and Identification of Regions Essential for Splicing and Association of a Split Intein. / J. Biol. Chem., 2001, 276, 24051-24058.

49. Nichols N. M., Benner J. S., Martin D. D., Evans Т. C. / Zinc Ion Effects on Individual Ssp DnaE Intein Splicing Steps: Regulating Pathway Progression. !Biochemistry, 2003,42(18), 5301-5311.

50. Perler F. B. / Protein Splicing of inteins and hedgehog autoproteolysis: structure, function and evolution. / Cell, 1998, 92, 1-4.

51. Cooper A. A., Stevens Т. H. / Protein splicing: Excision of intervening sequences at the protein level. / BioEssays, 1993, 15, 667-674.

52. Guhan N., Muniyappa K. / Structural and functional characteristics of homing endonucleases. / Crit Rev Biochem MolBiol., 2003, 38(3), 199-248

53. Brett S. Chevalier, Barry L. Stoddard / Homing endonucleases: structural and functional insight into the catalysts of intron/intein mobility. / Nucleic Acids Res., 2001,29(18), 3757-3774.

54. Hodges R. A., Perler F. В., Noren C. J., Jack W. E. / Protein splicing removes intervening sequences in an archaea DNA polymerase. / Nucleic Acids Res., 1992,20, 6153-6157.

55. Ichiyanagi K., Ishino Y., Ariyoshi M., Komori K., Morikawa K. / Crystal Structure of an Archaeal Intein-encoded Homing Endonuclease PI-PfuL / J. Mol. Biol, 2000,300, 889-901.

56. LaVallie E. R., McCoy J. M. / Gene fusion expression systems in Escherichia coli. / Curr Opin Biotechnol. 1995, 6, 501-506-120

57. IMPACT-CN System: Instructional manual #E6900S. New England Biolabs, Beverly, MA, 2004.

58. Cantor E. J., Chong S. / Intein-mediated rapid purification of Cre recombinase. / Protein Expr. Purif., 2001, 22(1), 135-40.

59. Grzybowska В., Szweda P., Synowiecki J. / Cloning of the thermostable alpha-amylase gene from Pyrococcus woesei in Escherichia coli: isolation and some properties of the enzyme. Mol. Biotechnol., 2004, 26(2), 101-10.

60. Szweda P., Pladzyk R., Kotlowski R., Kur J. / Cloning, expression, and purification of the Staphylococcus simulans lysostaphin using the intein-chitin-binding domain (CBD) system. / Protein Expr. Purif., 2001, 22(3), 467-71.

61. Sun Z., Chen J., Yao H., Liu L., Wang J., Zhang J., Liu J. N. / Use of Ssp dnaB derived mini-intein as a fusion partner for production of recombinant human brain natriuretic peptide in Escherichia coli. / Protein Expr. Purif., 2005, 43(1), 26-32.

62. Hong S., Toyama M., Maret W., Murooka Y. / High yield expression and single step purification of human thionein/metallothionein. / Protein Expr. Purif., 2001, 21(1), 243-50.

63. Ma J., Cooney C. L. / Application of vortex flow adsorption technology to intein-mediated recovery of recombinant human alpha 1-antitrypsin. / Biotechnol. Prog., 2004, 20(1), 269-76.

64. Humphries H. E., Christodoulides M., Heckels J. E. / Expression of the class 1 outer-membrane protein of Neisseria meningitidis in Escherichia coli and purification using a self-cleavable affinity tag. / Protein Expr. Purif, 2002, 26(2), 243-8.

65. Dawson P. E., Muir T. W., Clark-Lewis I., Kent S. B. / Synthesis of proteins by native chemical ligation. / Science, 1994, 266, 776-779.

66. Dawson P. E., Kent S. B. / Synthesis of native proteins by chemical ligation. / Annu. Rev. Biochem., 2000, 69, 923-960.

67. IMPACT-TWIN System: Instructional manual #E6950S. New England Biolabs, Beverly, MA, 2004.

68. David R., Richter M. P., Beck-Sickinger A. G. / Expressed protein ligation. Method and applications. / Eur. J. Biochem., 2004, 271, 663-677.

69. Alexandrov K., Heinemann I., Durek Т., Sidorovitch V., Goody Roger S., Waldmann H. / Intein-mediated synthesis of geranylgeranylated Rab7 protein in vitro. / J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 5648-5649.

70. Macmillan D., Bertozzi C. R. / New directions in glycoprotein engineering. / Tetrahedron, 2000, 56, 9515-9525.

71. Steven M. Berry, Matt D. Gieselman, Mark J. Nilges, Wilfred A. van der Donk, Yi Lu / An Engineered Azurin Variant Containing a Selenocysteine Copper Ligand. I J. Am. Chem. Soc., 2002, 124(10), 2084-2085.

72. Ulrich Arnold, Matthew P. Hinderaker, Bradley L. Nilsson, Bayard R. Huck, Samuel H. Gellman, Ronald T. Raines. / Protein Prosthesis: A

73. Semisynthetic Enzyme with a , /^-Peptide Reverse Turn. / J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 8522-8523.

74. Xu R., Ayers В., Cowburn D., Muir T. W. / Chemical ligation of folded recombinant proteins: segmental isotopic labeling of domains for NMR studies. /Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 388-393.

75. Wu W., Wood D. W., Belfort G., Derbyshire V., Belfort M. / Intermediated purication of cytotoxic endonuclease ITevI by insertional inactivation and pH-controllable splicing. / Nucleic Acids Res., 2002, 30, 4864-4871

76. Evans Т. C. Jr., Benner J., Xu M. Q. / Semisynthesis of cytotoxic proteins using a modified protein splicing element. / Protein. Sci, 1998, 7, 2256-2264.

77. Evans Т. C. Jr., Benner J., Xu, M. Q. / The cyclization and polymerization of bacterially expressed proteins using modified self-splicing inteins. / J. Biol. Chem., 1999,274, 18359-18363.

78. Xu M. Q., Evans Т. C. Jr. / Intein-mediated ligation and cyclization of expressed proteins. / Methods, 2001, 24, 257-277.

79. Scott C. P., Abel-Santos E., Wall M., Wahnon D. C., Benkovic S. J. / Production of cyclic peptides and proteins in vivo. / Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 13638-13643.

80. Iwai H., Lingel A., Pluckthun A. / Cyclic Green Fluorescent Protein Produced in Vivo Using an Artificially Split Pl-Pful Intein from Pyrococcus furiosus. I J.Biol. Chem. 2001, 276,16548-16554.

81. Horswill A. R., Bencovic S. J. / Cyclic Peptides, a Chemical Genetics Tool for Biologists. / Cell cycle 2005, 4(4), 552-555.-123

82. Ozawa Т., Nogami S., Sato M., Ohya Y., Umezawa Y. / A fluorescent indicator for detecting protein-protein interactions in vivo based on protein splicing. I Anal Chem., 2000, 72(21), 5151-7

83. Paulmurugan R., Umezawa Y., Gambhir S. S. / Noninvasive imaging of protein-protein interactions in living subjects by using reporter protein complementation and reconstitution strategies. / PNAS, 2002, 99(24), 15608-15613.

84. Zeidler M. P., Tan C, Bellaiche Y., Cherry S., Hader S., Gayko U., Perrimon N. / Temperature-sensitive control of protein activity by conditionally splicing inteins. I Nat. Biotechnol., 2004, 22(7), 871-876.

85. Mootz H. D., Blum E. S., Tyszkiewicz А. В., Muir T. W. / Conditional Protein Splicing: A New Tool to Control Protein Structure and Function in Vitro and in Vivo./J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 10561-10569.

86. Buskirk A. R, Ong Y. C., Gartner Z. J., Liu D. R. / Directed evolution of ligand dependence: Small-molecule-activated protein splicing. / PNAS, 2004, 101(29), 10505-10510.

87. Gill R. Т., Delisa M. P., Valdes J. J., Bentley W. E. / Genomic analysis of high cell density recombinant Escherichia coli fermentation and "cell conditioning" for improved recombinant protein yield. / Biotechnol Bioeng., 2001, 72, 85-95.

88. Sharma S. S., Chong S., Harcum S. W. / Intein-mediated protein purification of fusion proteins expressed under high-cell density conditions in E. coli. /J. Biotechnol, 2006, 20, 125(1), 48-56

89. McPherson D. Т., Morrow C., Minehan D. S., Wu J., Hunter E., Urry D. W. / Production and purification of a recombinant elastomeric polypeptide, G-(VPGVG) 19-VPGV, from Escherichia coli. / Biotechnol Prog., 1992, 8(4), 347-352.

90. Meyer D. E., Chilkoti A. / Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. / Nat. Biotechnol., 1999, 17(11), 1112-1115.

91. Banki M. R., Feng L., Wood D. W. / Simple bioseparations using selfcleaving elastin-like polypeptide tags. / Nat. Methods, 2005, 2(9), 659-662.

92. Potter M., Madkour M. H., Mayer F., Steinbuchel A. / Regulation of phasin expression and polyhydroxyalkanoate (PHA) granule formation in Ralstonia eutrophaH16. / Microbiology, 2002, 148, 2413-2426.

93. Banki M. R., Gerngross T. U., Wood D. W. / Novel and economical purification of recombinant proteins: intein-mediated protein purification using in vivo polyhydroxybutyrate (PHB) matrix association. / Protein Sci., 2005, 14(6), 1387-1395.

94. Srinivasan S., Barnard G. C., Gerngross T. U. / A Novel High-Cell-Density Protein Expression System Based on Ralstonia eutropha. / Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68(12), 5925-5932.

95. Barnard G. C., McCool J. D., Wood D. W., Gerngross T. U. / Integrated Recombinant Protein Expression and Purification Platform Based on Ralstonia eutropha. I Appl Environ. Microbiol., 2005, 71(10), 5735-5742.

96. Di L., Zhang H. W., Xu L. L. / Use of Ssp dnaB mini-intein as a fusion partner for preparation of recombinant human brain natriuretic peptide. / Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao., 2006 Mar, 22(2), 180-186

97. Hooper J. A., McDaniel M. C., Thurman G. В., Cohen С. H., Schullof R. S., Goldstein A. L. / Purification and properties of bovine thymosin. / Ann.N. Y.Acad.Sci.,\915, 24, 125-127.

98. Ancell C. D., Phipps J., Young L. / Thymosin alpha-1. / Am. J. Health-Syst. Pharm. 2001, 58, 879-885.

99. Коробко В. Г., Болдырева Е. Ф., Филиппов С. А., Беркова Н. П., Добрынин В. Н., Шмелев В. А., Попов С. Г., Евсегнеев С. И., Носова JI. ЮЛ Биоорган .химия. 1992. Т.18. С. 646-659.

100. Wen С., Gan R., Zhu S. / Construction of secretory expression system suitable to express glucagon under the control of PL promoter. / Curr. Microbiol, 2003,47, 180-185

101. Oh G. H., Hahm M. S., Chung В. H. / Use of carboxypeptidase Y propeptide as a fusion partner for expression of small polypeptides in Escherichia coli. I Protein Expr. Purif., 1999, 17, 428-434.

102. Okamoto H, Iwamoto H, Tsuzuki H, Teraoka H, Yoshida N. / An improved method for large-scale purification of recombinant human glucagon. / J Protein Chem., 1995, 14, 521-526.

103. Egel-Mitani M, Andersen AS, Diers 11, Hach M, Thim L, Hastrup S, Vad K. / Yield improvement of heterologous peptides expressed in ypsl-disrupted Saccharomyces cerevisiae strains. / Enzyme Microb Technol, 2000, 26, 671677.

104. Cohen M. A., Ellis S. M., Le Roux C. W., Batterham R. L., Park A., Patterson M., Frost G. S., Ghattei M. A., Bloom S. R. / Oxyntomodulin suppresses appetite and reduces food intake in humans / J. Clin.EndocrinolMetab., 2003, 88, 4696-4701.

105. Dakin C., Gunn I., Small C. J., Edwards С. M., Hay D. L., Smith D. M., Ghattei M. A., Bloom S. R. / Oxyntomodulin inhibits food intake in the rat / Endocrinology, 42, 4244-4250.

106. Hoist J. J. / Enteroglucagon / Annu.Rev.Physiol, 1997, 59, 257-271.

107. Bloom S. R, Polak J. M. / Gut hormones. / Adv.Clin.Chem., 1980, 21, 177-244.

108. Medical World News. 1986 13, № 10, 3589-3593-126