Пренатальная дифференцировка и иннервация вкусового рецепторного аппарата языка человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат наук Куртова, Анастасия Игоревна

• Куртова, Анастасия Игоревна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Куртова, Анастасия Игоревна

1.1. Актуальность темы.......................................................................................5

1.2. Цель и задачи исследования........................................................................7

1.3. Положения, выносимые на защиту.............................................................8

1.4. Научная новизна...........................................................................................8

1.5. Научно-практическая значимость...............................................................9

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................11

11.1. Строение дорсальной поверхности языка млекопитающих.................11

II. 1.1. Характеристика сосочков языка млекопитающих..........................11

Н.1.2.Структура и функции вкусовых луковиц.........................................15

11.2. Иннервация языка человека и млекопитающих.....................................17

11.3. Развитие вкусового аппарата языка млекопитающих...........................20

И.3.1.Формирование языка в фило- и эмбриогенезе.................................20

И.3.2. Эмбриональное развитие иннервации языка...................................24

II.3.3. Онтогенез вкусовых луковиц и сосочков млекопитающих...........28

11.3.3.1. Развитие вкусовых луковиц и сосочков человека.......................30

11.3.3.2. Развитие вкусовых луковиц и сосочков грызунов.......................34

11.4. Заключение.................................................................................................38

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................................................41

III. 1. Характеристика материала......................................................................41

III.2. Методы исследования..............................................................................42

111.2.1. Методы гистологического исследования.......................................42

111.2.2. Методы иммуногистохимического исследования.........................42

111.2.3. Методы электронномикроскопического исследования................44

2

Ш.2.4. Методы микроскопического исследования гистологических и иммуногистохимических препаратов.............................................................45

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ..........................................................................................54

1У.1. Развитие языка человека с 3-й по 7-ю неделю эмбриогенеза.............54

IV. 1.1. Гистологическая дифференцировка эпителия языка....................54

IV. 1.2. Формирование нервного аппарата языка.......................................61

14.2. Морфогенез и иннервация вкусовых луковиц и сосочков языка плодов человека.................................................................................................70

1У.З. Оценка пролиферативной активности эпителия языка плодов человека с помощью маркеров Кл67 и РСЫА................................................86

ГУ.4. Выявление эпителиальных транскрипционных факторов в процессе дифференцировки вкусовых центров языка человека..................................91

ГУ.4.1. Экспрессия 8ох2 в эпителии языка плодов человека...................91

Г/.4.2. Экспрессия №иго01 в эпителии языка плодов человека.............94

IV.5. Онтогенез реснитчатых клеток в эпителии ротовой полости эмбрионов и плодов человека..........................................................................96

V. ОБСУЖДЕНИЕ........................................................................................103

V. 1. Эмбриональное развитие иннервации языка человека......................103

У.2. Формирование вкусовых примордиев в эпителии языка человека ... 105

У.З. Развитие вкусовых сосочков человека..................................................108

У.4. Пролиферативная активность клеток вкусовых луковиц и эпителия языка человека с 3-й по 21-ю неделю внутриутробного развития............113

У.5. Сравнительная характеристика экспрессии транскрипционных факторов 8ох2 и Кеиго01 в эпителии языка плодов человека...................115

У.6. Реснитчатые клетки в эпителии ротовой полости человека и млекопитающих...............................................................................................120

VI. ВЫВОДЫ.................................................................................................125

VII. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ....................................127

1.ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пренатальная дифференцировка и иннервация вкусового рецепторного аппарата языка человека»

1.1. Актуальность темы

Хеморецепторы являются наиболее древними сенсорными

системами позвоночных животных, осуществляющими контроль над

основными жизненными функциями организма. Вкусовой аппарат языка

во многом определяет особенности питания, опосредованно влияет на

массу тела и энергетический обмен млекопитающих. Несмотря на то, что

изучение вкусового анализатора продолжается уже около ста лет,

механизмы дифференцировки вкусовых луковиц в процессе

внутриутробного развития млекопитающих до сих пор не выяснены. В

настоящее время существует несколько гипотез, каждая из которых имеет

экспериментальные подтверждения. Классическая точка зрения

основывается на нейрогенной дифференцировке вторичных сенсорных

органов, к которым также относятся вкусовые луковицы позвоночных

(Zelena J., 1994). Эксперименты с повреждением нервов языка

хирургическим (I-Iosley М. et al., 1987; Nagato Т. et al., 1995; Sollars S.I.,

2005) и химическим путем (Morris-Wiman J. et al., 1999b) показывают, что

вкусовые луковицы млекопитающих развиваются только при наличии в

эпителии языка интактных афферентных нервных окончаний. Зависимость

вкусового аппарата от иннервации также подтверждается клиническими

данными; у человека при некоторых неврологических расстройствах

наблюдается отсутствие или деградация вкусовых сосочков (Axelrod F.B.,

Gold-von Simson G., 2007; Gardiner J. et al., 2008; Rubin В. Y., Anderson S.L.,

2008). В процессе эмбрионального развития человека зачатки вкусовых

луковиц появляются только после проникновения нервных окончаний в

эпителий языка (Witt М., Reutter К., 1996, 1998), что также подтверждает

нейрогенную гипотезу. Однако исследования развития вкусовой системы

амфибий показали, что формирование вкусовых луковиц может

происходить без участия иннервации (Barlow L.A. et al., 1996; Barlow L.A.,

Northcutt R.G., 1997). При этом дифференцировка клеток вкусовых

5

луковиц является результатом местного эпителиально-мезенхимального взаимодействия, осуществляемого с помощью дифференциальной экспрессии сигнальных молекул и транскрипционных факторов (Parker М.А. et al., 2004). На данный момент влияние нервных и эпителиально-мезенхимальных сигналов на эмбриональное развитие вкусового аппарата млекопитающих активно изучается на экспериментальных животных -крысах и мышах (Hall J.M. et al., 1999; Okubo Т. et al., 2006; Thirumangalathu S. et al., 2009). В отличие от человека, морфологически обособленные вкусовые луковицы у грызунов появляются непосредственно перед рождением или в течение неонатального периода после формирования на поверхности языка вкусовых сосочков (Farbman A.I., 1965; Farbman A.I., Mbiene J.P., 1991). В эпителии языка грызунов обнаружено множество факторов и сигнальных молекул, влияющих на дифференцировку клеток эпителиальных и нервных тканей: сигнальная молекула Sonic hedgehog (Shh), костные морфогенетические белки - Вшр 2 и 4, белки семейства Noggin, фактор роста фибробластов FGF8, транскрипционный фактор Sox2 и лиганды сигнальной системы Wnt (Bitgood M.J., McMahon А.Р., 1995; Hall J.M. et al., 1999; Jung И. et al., 1999; Zhou Y. et al, 2006; Okubo Т. et al., 2006). Но, несмотря на активные исследования, определение специфической роли каждого из факторов в регуляции развития вкусовых луковиц грызунов на данный момент затруднено из-за отсутствия маркеров для их клеток-предшественников и раннего морфогенеза сосочков языка, предшествующего их дифференцировке (Krimm R.F., 2007).

Морфологически обособленные зачатки вкусовых луковиц

(вкусовые примордии) у человека появляются в течение эмбрионального

периода развития до формирования сосочков языка (Witt М., Reutter К.,

1996, 1998). Большая часть исследований, проведенных на человеческом

эмбриональном материале, посвящена оценке влияния иннервации на

развитие вкусовых луковиц (Bradley R.M., Stern I.B., 1967; Witt М., Reutter

6

К., 1996, 1998; Тап^эи У., ваэзег Я.Р., 2004). Благодаря раннему появлению морфологически обособленных клеток-предшественников вкусовых луковиц, человек является удачным объектом для изучения влияния нервных и эпителиальных сигналов на дифференцировку вкусового аппарата языка, а полученные результаты могут быть применены к развитию других вторично-чувствующих рецепторов. Однако, активность эпителиальных сигнальных каскадов, определяющих дифференцировку эпителия языка грызунов, у человека остается неизученной. Приведенные выше данные демонстрируют необходимость комплексных исследований механизмов дифференцировки клеток вкусовых луковиц на эмбриональном материале человека.

1.2. Цель и задачи исследования

Целью исследования являлось изучение закладки, раннего эмбрионального развития, иннервации и дифференцировки вкусового рецепторного аппарата языка человека.

В задачи исследования входило:

1. Изучение эмбриональной закладки и первичной морфологической дифференцировки нервного аппарата языка человека, начиная с 4-й недели внутриутробного развития, с помощью иммуногистохимических маркеров к белкам нервной системы ((З3-тубулину, ^Е, 8100).

2. Гистологическое и иммуногистохимическое типирование вкусовых рецепторных комплексов и их предшественников в развитии вкусового аппарата языка человека.

3. Анализ топологических закономерностей распределения дифференцирующихся вкусовых луковиц в эпителии сосочков языка плодов человека.

4. Изучение морфогенеза вкусовых луковиц и сосочков языка человека с помощью маркеров пролиферации (Кл67, РСМА) и антител к транскрипционным факторам, влияющим на дифференцировку нервных

и эпителиальных клеток (8ох2, КеигоВ1).

7

5. Иммуногистохимическое и электронномикроскопическое исследование реснитчатых клеток эпителия ротовой полости эмбрионов и плодов человека.

1.3. Положения, выносимые на защиту

1. Вкусовые примордии структурно обособляются из эпителия языка эмбрионов человека в конце 6-й недели внутриутробного развития до начала его иннервации. Их ранняя дифференцировка характеризуется локализацией ядер в апикальной области клетки и цитоплазматической экспрессией нейрон-специфического Рз-тубулина.

2. Транскрипционные факторы Бох2 и Ыеиго01 не являются специфическими маркерами ранней дифференцировки вкусовых луковиц человека. 8ох2 выявляется в зонах пролиферации эпителия языка и во вкусовых луковицах с 10-й недели внутриутробного развития, а после 18-й недели только в клетках вкусовых луковиц и прилежащего к ним эпителия. Ыеиго01 обнаружен как в клетках вкусовых луковиц и примордиев, так и в очагах пролиферации эпителия языка человека с 8-й по 21-ю неделю внутриутробного развития.

3. В эпителии ротовой полости эмбрионов и плодов человека, начиная с 7-й недели развития, выявляются реснитчатые клетки. Количество реснитчатых клеток в эпителии языка максимально в период с 10-й по 12-ю неделю внутриутробного развития, в течение которого их локализация не связана с морфогенезом вкусовых сосочков и желез языка.

1.4. Научная новизна

В работе с помощью иммуногистохимических методов детально исследовано формирование нервного аппарата языка эмбрионов человека с 3-й по 7-ю неделю внутриутробного развития. Впервые описано раннее проникновение нервных волокон в мезенхиму языка человека на 4-й неделе, а также формирование язычного нерва на 5-й неделе внутриутробного развития.

В клетках вкусовых примордиев, появляющихся на поверхности языка человека в конце 6-й недели развития, впервые обнаружена апикальная локализация ядер, а также цитоплазматическая экспрессия нейрон-специфического белка р3-тубулина.

С помощью ядерных пролиферативных маркеров ¥л67 и РСКА установлено, что клетки вкусовых луковиц и примордев человека с 6-й по 15-ю неделю внутриутробного развития обладают пролиферативной активностью.

В эпителии языка человека впервые исследована экспрессия транскрипционных факторов Бох2 и №иго01. На стадии закладки вкусовых примордиев (конец 6-й недели развития) специфическая экспрессия транскрипционных факторов 8ох2 и КеигоБ 1 в эпителии языка отсутствует. №иго01 обнаружен в зонах пролиферации эпителия языка и в клетках вкусовых луковиц, начиная с 8-й недели и на всех последующих исследованных сроках развития; Бох2 - с 10-й по 15-ю неделю выявлялся как в клетках вкусовых луковиц, так и в очагах пролиферации эпителия языка, а после 18-й недели только в клетках вкусовых луковиц.

Впервые изучено топологическое распределение и иннервация реснитчатых клеток в эпителии ротовой полости эмбрионов и плодов человека.

1.5. Научно-практическая значимость

Результаты работы представляют собой детальное описание формирования вкусового рецепторного аппарата языка человека и дополняют имеющиеся к настоящему моменту сведения. Полученные данные могут быть использованы при экстраполяции результатов исследований дифференцировки вкусовой системы экспериментальных животных на человека, а также при изучении морфогенеза других вторично чувствующих рецепторных органов.

Выявленные цитологические и иммуногистохимические особенности

вкусовых примордиев человека позволят выявлять зоны их первичного

9

обособления на ранних стадиях дифференцировки, протекающих до иннервации и специфической экспрессии транскрипционных факторов 8ох2 и №игоВ1, а также могут быть использованы для типирования клеток-предшественников вкусовых луковиц у экспериментальных животных.

Результаты исследования экспрессии транскрипционных факторов Бох2 и КеигсЮ1, показывают, что в течение эмбрионального и раннефетального периода внутриутробного развития человека возрастает опасность возникновения отклонений в развитии, связанная с нарушением процессов пролиферации и дифференцировки в эпителиальных дериватах ротовой полости. Выявленные особенности экспрессии данных факторов могут быть использованы при изучении механизмов развития онкологических заболеваний ротовой полости человека и их диагностике. Полученные результаты также необходимы для уточнения функций 8ох2 и НеигоБ1 в разных эпителиальных тканях в течение пренатального онтогенеза человека.

Наличие реснитчатых клеток в эпителии ротовой полости эмбрионов и плодов человека необходимо учитывать при изучении развития и патологий эпителиальных дериватов первичной ротовой полости. Формирование описанных в тератологии врожденных кист языка, содержащих клетки с реснитчатыми структурами, может быть следствием нарушения процессов дифференцировки в эпителии языка в течение эмбрионального и раннего фетального периода развития.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ II.1. Строение дорсальной поверхности языка млекопитающих II.1.1. Характеристика сосочков языка млекопитающих

Дорсальная поверхность языка млекопитающих традиционно разделяется на две зоны: тело (передние две трети, передняя часть языка) и корень (задняя треть языка). Границей между телом и корнем языка служит линия, называемая терминальной бороздой, образующая на поверхности языка угол, в вершине которого расположено небольшое углубление, называемое слепым отверстием (Jung Н. et al., 2004).

Слизистая оболочка языка млекопитающих покрыта плоским многослойным эпителием. Базальный слой эпителия образован клетками кубической или призматической формы с овальным ядром и высоким ядерно-цитоплазматическим отношением (Боровский Е.В., Леонтьев В.К., 2001). Клетки базального слоя обладают большой митотической активностью, благодаря которой происходит обновление клеток эпителия (Сапронова Е.А. и др., 2004). При делении клеток базального слоя дочерние клетки, оказывая боковое давление на материнские клетки, выталкивают их в вышележащие слои для дальнейшей дифференцировки (Явишева Т.М. и др., 2000). Подготовка к делению включает в себя синтез ДНК, а также характерных для данного эпителия белков цитокератинов, входящих в состав тонофиламентов (Билич Г. и др., 1999). Состав цитокератинов генетически детерминирован и различается в разных участках ротовой полости (Dhouailly D. et al., 1989). Также экспрессия цитокератинов является маркером дифференцировки эпителиоцитов, т.к. состав цитокератинов изменяется по мере перехода клетки из базального в верхние слои эпителия (Sawaf М.Н. et al., 1991).

На дорсальной поверхности языка собственная пластинка вместе с покрывающим ее эпителием образует выступы, называемые сосочками. У млекопитающих различают четыре типа сосочков: нитевидные,

грибовидные, листовидные и желобоватые (Фалин Л.И., 1963; Быков В.Л., 1999).

Нитевидные сосочки не являются вкусовыми сосочками, т.к. в их эпителии отсутствуют вкусовые луковицы. Они покрывают большую часть дорсальной поверхности языка. Нитевидные сосочки образованы узкими выростами соединительной ткани, покрытыми многослойным эпителием, клетки которого выделяют кератины, подобные кератинам волос (Dhouailly D. et al., 1989). Степень кератинизации дорсального эпителия языка зависит от образа жизни и объектов питания животных. У грызунов, питающихся твердой пищей, и кошачьих, использующих язык для грумминга, дорсальная поверхность языка подвержена сильному ороговению (Iwasaki S., 2002).

Грибовидные сосочки имеют широкую округлую вершину и, как правило, покрыты неороговевающим эпителием (Iwasaki S., 2002). Они расположены на поверхности передних двух третей языка (Рис. 2.1). Количество вкусовых луковиц в эпителии грибовидных сосочков сильно варьирует. Arvidson К. (1979) исследовал 262 вкусовые луковицы на 182 грибовидных сосочках языка человека, при этом 63% сосочков не имели вкусовых луковиц, 26% имели от 1-3 вкусовых луковиц и 10% имели 4 и более вкусовых луковиц. У грызунов в эпителии грибовидных сосочков расположено по одной вкусовой луковице, а общее число грибовидных сосочков на поверхности языка составляет около 90 - у мышей и 180 - у крыс (Oakley В., Witt М., 2004).

Листовидные сосочки образуют 3-8 параллельных складок на боковых поверхностях задней трети языка человека (Фалин Л.И., 1963) (Рис. 2.1). В эпителии латеральных сторон листовидных сосочков млекопитающих расположено множество вкусовых луковиц, составляющее 30% от всех вкусовых луковиц языка (Suzuki Т., 2007).

желобоватый сосочек

листовидный сосочек

грибовидный сосочек

W

ff

л

|—| энтодерма

Рис. 2.1. Дорсальная поверхность и вкусовые сосочки языка человека.

IX - языкоглоточный нерв; VII+V - язычный нерв, образованный волокнами лицевого и тройничного нерва.

Листовидные сосочки хорошо развиты у некоторых млекопитающих, например, у кролика их форма напоминает зубцы крепостной стены (Заварзин A.A., Румянцев A.B., 1946). У человека листовидные сосочки являются рудиментарными структурами и хорошо выражены только у новорожденных (Фалин Л.И., 1963).

Желобоватые сосочки обладают наиболее сложной морфологической

организацией по сравнению с другими сосочками языка млекопитающих. У человека 7-9 желобоватых сосочков образуют на поверхности языка угол вдоль терминальной борозды (Рис. 2.1), у грызунов желобоватый сосочек один и расположен позади слепого отверстия (Jung Н. et ah, 2004). В эпителии стенок желоба желобоватого сосочка расположено от 40 до 150 вкусовых луковиц (Рубашкин В.Я., 1933). Общее количество вкусовых

луковиц во всех желобоватых сосочках языка составляет 40% от всех вкусовых луковиц языка (Suzuki Т., 2007). Соединительная ткань под каждым желобоватым сосочком содержит трубчато-ацинарную серозную слюнную железу - железу Эбнера, протоки которой открываются на дне желоба. Железа Эбнера, помимо слизистого секрета, секретирует липазы, необходимые для расщепления жиров (Hamosh M., BurnsW.A., 1977; Roberts J.M., Jaffe R., 1986), а также растворимые белки, принадлежащие к семейству липокалинов, которые могут играть роль в передаче вкусовых стимулов (Schmale II. et al., 1990; Flower D.R., 1996). Секреция липазы железой Эбнера особенно активна в неонатальном периоде развития, когда для расщеплеиия жиров панкреатической липазы недостаточно (Hamosh M., Hand A.R., 1978).

Поверхность языка характеризуется высокой плотностью соматосепсорных рецепторов. Детальная пространственная информация от поверхности языка генерируется кластерами равномерно расположенных нитевидных сосочков, в каждый из которых заходит небольшой пучок аксонов (Oakley В., Witt M., 2004). У человека развитая механорецепторная система языка может иметь поразительные клинические преимущества. Расположенные на языке в виде сетки 49 стимулирующих электродов способны генерировать потенциалы с уникальными временно-пространственными характеристиками, что может частично компенсировать нарушение чувства ориентации в пространстве, вызванное повреждениями вестибулярных органов и сетчатки или перегрузками у пилотов и космонавтов (Tyler M. et al., 2003). Места с высоким уровнем тактильной чувствительности на языке мыши могут быть визуализированы по экспрессии нейротрофина 3 (NT3) (Farinas I. et al., 1994). На передней части языка активная экспрессия NT3 наблюдается в каждом нитевидном и грибовидном сосочке, а в задней трети языка NT3 экспрессируется как в желобоватых и листовидных сосочках, так и на недавно открытых

соматосепсорных выступах (Fan L. et al., 2004), которые впервые были описаны как пластинки желобоватых сосочков (Nosrat С.A. et al., 1997).

Н.1.2.Структура и функции вкусовых луковиц

Вкусовые луковицы являются периферическими органами вкусового анализатора, которые обеспечивают рецепцию вкусовых стимулов и передачу информации в центральную нервную систему. Вкусовые луковицы имеют округлую или продолговатую форму и образованы 50-100 клетками (Suzuki Т., 2007). Они расположены в толще эпителия и соединены с поверхностью языка вкусовыми порами.

Вкусовые луковицы у млекопитающих также могут быть расположены в эпителии гортани, глотки и мягкого нёба. У грызунов и человека такие вкусовые луковицы появляются после рождения (Lalonde E.R., Eglrtis J.А., 1961; Piarada S., 1994). Несмотря на то, что вкусовые сосочки характерны только для языка, вкусовые луковицы, обнаруженные вне языка, также находятся на небольших поднятиях собственной пластинки (Miller I.J., SpanglerK., 1982).

С начала XX века считалось, что на языке существуют зоны, обеспечивающие восприятие четырех основных вкусов: сладкое, соленое, кислое, горькое. Но с развитием генетики и молекулярных технологий, было показано, что способность к восприятию вкусов определяется совокупностью рецепторов на апикальной поверхности рецепторных клеток, и одна вкусовая луковица способна воспринимать несколько вкусов (Chandrashekar J. et al., 2006). В процессе дальнейших исследований были обнаружены рецепторы к глутамату, обеспечивающие пятый основной вкус, называемый умами, а также рецепторы к молекуле СОг (Huang A.L. et al., 2006).

Ультраструктурные исследования вкусовых луковиц выявили

несколько типов клеток, впервые описанных Murray R.G. в 1973 году.

Клетки I типа имеют удлиненные ядра и секреторные гранулы в

15

цитоплазме, во вкусовой луковице они выполняют опорную функцию. Клетки I типа экспрессируют blood group Н antigen, ассоциированный с мембраной карбогидратный компонент, и глутамат-аспарат транспортер (GLAST), обычно присутствующий в клетках глии (Pumplin D.V. et al., 1999; Lawton D.M. et al., 2000). Клетки I типа имеют пластинчатые отростки, распространяющиеся вокруг других типов клеток (Pumplin D.V. et al., 1997). Эти свойства сближают клетки I типа с клетками глии. Поэтому помимо опорной функции некоторые исследователи предполагают участие клеток I типа в выведении медиаторов и изоляции рецепторных клеток вкусовой луковицы (Pumplin D.V. et al., 1997).

Клетки II типа имеют вытянутую форму и большие округлые ядра, их базальные части контактируют с базальной мембраной, а апикальные заходят во вкусовую пору. Апикальная плазмолемма клеток II типа формирует микроворсинки. Синаптических контактов с нервными волокнами у данного типа клеток не обнаружено, однако, с базальными частями клеток II типа иногда контактируют интрагеммальные нервные окончания (Marettova Е., Maretta М., 2012). Клетки II типа содержат белки, вовлеченные в передачу вкуса такие как а-густдуцин (а-gustducin) и фосфолипаза С02 (phospholipase Ср2), а также белки вкусовых рецепторов, включая IP3R3 и TRPM5 (Clapp T.R. et al., 2001, 2004; Miyoshi M.A. et al., 2001; Perez C.A. et al., 2002; Zhang Y. et al., 2003). Совокупность обнаруженных рецепторов и вторичных мессенджеров показала, что клетки II типа содержат все элементы системы рецепции для трех основных вкусов: сладкого, горького и умами (Yang R. et al., 2000).

Клетки III типа морфологически практически не отличаются от

клеток II типа. Но, в отличие от клеток II типа, они образуют

синаптические контакты с нервными волокнами и экспрессируют SNAP25

(Yang R. et al., 2000), NCAM (Takeda M. et al., 1992, 1999; Nelson G.M.,

Finger Т.Е. 1993) и серотонин (Huang Y.G. et al., 2005). Наличие синапсов

говорит о ключевой роли этих клеток в передаче информации из вкусовой

16

луковицы. Клетки III типа содержат рецепторы к кислому и молекуле С02 (Huang A.L. et al., 2006).

Клетки IV типа (базальные клетки) - это небольшие клетки округлой формы, расположенные в базальной части вкусовой луковицы. Они считаются недифференцированными предшественниками остальных типов клеток вкусовой луковицы, некоторые авторы также предполагают у этих клеток глиальную функцию (Bigiani А., 2001; Miura II. et al., 2004). Однако, как и остальные клетки вкусовых луковиц, базальные клетки находятся в постмитотической фазе клеточного цикла (Miura II. et al., 2006).

Иногда выделяют клетки V типа, или перигеммальные клетки. Они имеют серповидную форму и расположены на периферии вкусовой луковицы (Marettova Е., Maretta М., 2012). Некоторые из них контактируют с перигеммальными нервными волокнами (Krstic', 1991). Они обладают митотической активностью и являются источником для обновления клеток вкусовых луковиц (Hirota М. et al., 2001; Miura II. et al., 2004).

Все типы клеток вкусовых луковиц, как и другие эпителиальные клетки, обновляются с течением времени. Средний срок жизни клеток вкусовой луковицы прежде оценивался в 10 дней (Farbman A.I., 1980). По последним данным 60% клеток вкусовых луковиц имеют среднюю продолжительность жизни 2 дня, а 40% клеток, среди которых рецепторные клетки, живут до трех недель (Hamamichi R. et al., 2006).

II.2. Иннервация языка человека и млекопитающих

Нервный аппарат языка имеет сложное строение и образован ветвями пяти черепно-мозговых нервов: тройничного (V), лицевого (VII), языкоглоточного (IX), подъязычного (XII) и блуждающего (X).

Моторная иннервация мышц языка осуществляется волокнами подъязычного нерва (XII) (Abd-El-Malek S., 1938). Подъязычный нерв проникает в корень языка человека с вентро-латеральной стороны, и в

районе дорсальной поверхности подъязычно-язычной мышцы (т.

17

hyoglossus) распадается на латеральные и медиальные ветви, направляющиеся ко всем мышцам языка (Abd-El-Malek S., 1938; Weddell G. et al., 1940). Помимо XII нерва иннервацию мышц, расположенных вблизи слизистой оболочки языка могут осуществлять волокна лицевого (V) и языкоглоточного (IX) нервов. Например, нижняя и верхняя продольные мышцы (т. longitudinalis inferior, т. longititdinalis superior) иннервируются волокнами XII и V нерва, которые в данных мышцах образуют анастамозы (Mu L., Sanders I., 2010). Моторная иннервация языка человека при сравнении с другими изученными млекопитающими отличается сложностью и высокой плотностью нервных окончаний (Mu L., Sanders I., 1999; McClung J.R., Goldberg S.J., 2000). Наибольшие различия обнаружены в группе поперечно-вертикальных мышц, что связывают с развитием речи (Mu L., Sanders I., 2010).

Сенсорная иннервация языка человека осуществляется язычным нервом, а также язычными ветвями IX и X черепно-мозговых нервов.

Я зычный нерв образован волокнами нижнечелюстной ветви

тройничного нерва (V) и ветви лицевого нерва (VII), называемой

барабанной струной (Zur К.В. et al., 2004). Нижнечелюстная ветвь

тройничного нерва несет афферентные волокна, обеспечивающие общую

чувствительность слизистой оболочки дна ротовой полости, десен нижней

челюсти и передних двух третей языка (Heasman P.A., Beynon A.D., 1986).

В составе барабанной струны находятся секрето-моторные волокна к

подчелюстной и подъязычной слюнным железам и афферентные волокна,

обеспечивающие вкусовую чувствительность слизистой оболочки

передних двух третей языка (Hellekant G., Kasahara Y., 1973). Язычный

нерв входит в язык с латеральной стороны ростральнее линии

желобоватых сосочков (Zur К.В. et al., 2004). Далее он разделяется на

медиальные и латеральные ветви, которые иннервируют переднюю и

среднюю трети слизистой оболочки языка соответственно. Медиальная

зона кончика языка получает билатеральную иннервацию от правого и

18

левого язычного нерва (Zur К.В. et al., 2004). Язычный нерв в языке человека и высших приматов образует множественные анастамозы с волокнами подъязычного нерва (XII) (Fitzgerald M.J.T., Law М.Е., 1958; Fitzgerald M.J.T., Sachithanandan S.R., 1979).

Язычная ветвь языкоглоточного нерва (IX) несет волокна как общей, так и специальной висцеральной чувствительности от поверхности задней трети языка, включая желобоватые и листовидные сосочки (Yamamoto Т., 1975). Основной ствол нерва проникает в язык с каудо-латеральной стороны и под слизистой оболочкой распадается на латеральную и медиальную ветви (Doty R.L. et al., 2009). Медиальная ветвь обычно делится на пять вторичных ветвей, которые направляются к желобоватым сосочкам. Латеральная ветвь дает начало 2-3 вторичным ветвям, которые движутся в ростральном направлении вдоль латерального края языка. Часть этих ветвей иннервирует листовидные сосочки, в то время как несколько ветвей продолжают движение в ростральном направлении, оканчиваясь в средней трети языка (Doty R.L. et al., 2009). Правый и левый языкоглоточные нервы анастамозируют в проксимальной части задней трети языка (Toure' G. et al., 2005). Волокна языкоглоточного нерва в районе желобоватых и листовидных сосочков образуют анастамозы с волокнами язычного нерва, т.е. данные типы сосочков получают иннервацию от IX и VII нервов (Doty R.L. et al., 2009). Подобные анастамозы также обнаружены в языке собаки (Mu L., Sanders I., 1999). Каудальные ветви IX нерва анастамозируют с ветвями блуждающего нерва, который лежит в латеральной язычно-надгортанной складке (Toure' G. et al., 2005).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Куртова, Анастасия Игоревна, 2014 год

: - л;

1 ' ;. ; . . М*- «_, ■»•ц.йЕ:

В

Б

Р

ЯР: - .

Ч'" ь

#

г

: - • • V. \ Ч ' аД " « • 'V,

; Ь

» , 4? Ф

*

* *

г 4* 2 -

А,

Рис. 4.19. Экспрессия №игоВ1 в эпителии языка плодов человека.

А - 8-я неделя развития; Б - 10-я неделя развития; В - 12-я неделя развития; Г, Д - 15-16-я неделя развития; Е - 18-19-я неделя развития. Вкусовые луковицы и примордии отмечены стрелками

1У.5. Онтогенез реснитчатых клеток в эпителии ротовой полости эмбрионов и плодов человека

При исследовании импрегнированных серебром срезов языка плодов

человека возрастом 10-11 недель в апикальном слое эпителия языка были

обнаружены клетки с многочисленными выростами, направленными в

ротовую полость (Рис. 4.20, А). Для уточнения ультраструктуры

апикальной поверхности обнаруженных клеток, дорсальный эпителий

языка плодов человека возрастом 11-12 и 12-13 недель был исследован с

помощью методов электронной микроскопии. На препаратах,

исследованных с помощью сканирующего электронного микроскопа

(СЭМ), виден апикальный слой эпителия языка, состоящий из клеток

полигональной формы. На фоне их гладкой апикальной поверхности

выделяются отдельные клетки с пучками ресничек, направленных в

ротовую полость (Рис. 4.22, А). При исследовании ультратонких срезов

эпителия языка с помощью трансмиссионного электронного микроскопа

(ТЭМ) в апикальном слое также были обнаружены клетки с

многочисленными ресничками. Реснитчатые клетки имеют разнообразную

форму, а кривизна их апикальной поверхности варьирует от плоской до

булавовидной. Всю апикальную поверхность реснитчатых клеток

покрывают многочисленные реснички, направленные в просвет ротовой

полости (Рис. 4.22, Б, В). На поперечных срезах аксонема ресничек состоит

из 9 периферических дублетов микротрубочек и двух центральных

микротрубочек-синглетов (Рис. 4.22, Г). Диаметр ресничек составляет 0,3

мкм. Между ресничками от апикальной поверхности клеток отходят пучки

длинных тонких микроворсинок, диаметром 0,08-0,1мкм (Рис. 4.22, В).

Под плазматической мембраной клеток расположено множество базальных

телец, от которых отходят микротрубочковые и микрофибриллярные

структуры. На полутонких срезах район с базальными тельцами виден как

толстая черная полоса на апикальном конце клетки (Рис. 4.20, Г).

Базальные тельца ресничек образованы 9 периферическими триплетами

96

микротрубочек. Под базальными тельцами ресничек расположены большие скопления митохондрий.

При использовании иммерсионных объективов, реснитчатые клетки были обнаружены в эпителии ротовой полости у всех исследованных эмбрионов и плодов человека, начиная с 7-й недели развития. На 7-й неделе внутриутробного развития реснитчатые клетки обнаружены в поверхностном слое эпителия задней половины свода первичной ротовой полости. Плотность расположения реснитчатых клеток увеличивается в каудальном направлении и достигает максимального значения (2-3 реснитчатых клетки на 10 клеток поверхностного слоя эпителия) в задней части свода первичной ротовой полости. Нервных окончаний, подходящих к реснитчатым клеткам, выявлено не было, но наблюдалась иммунопозитивная реакция на №Е в цитоплазме реснитчатых клеток. В эпителии языка эмбрионов данного возраста реснитчатые клетки не обнаружены.

На 8-й неделе пренатального развития реснитчатые клетки присутствуют в эпителии задней части свода первичной ротовой полости (в среднем 2-3 реснитчатых клетки на 10 клеток поверхностного слоя эпителия), а также небольшие группы реснитчатых клеток обнаружены на вентральной стороне нёбных отростков, внутренней поверхности щёк и дорсальной поверхности задней трети языка. Результаты подсчета реснитчатых клеток в эпителии языка на разных сроках развития представлены в табл. 4.2 и на Рис. 4.21. На 9-й неделе редкие единичные реснитчатые клетки встречаются в эпителии языка и задней части нёба, образовавшегося при срастании нёбных отростков. Тела реснитчатых клеток сохраняют иммунопозитивность к ИБЕ, хотя в клетках, расположенных на языке, реакция выражена слабее (Рис. 4.20, Ж). Нервных волокон, ассоциированных с реснитчатыми клетками, выявлено не было.

На 10-11-й неделе количество реснитчатых клеток в эпителии задней части нёба и внутренней поверхности щёк остается прежним, а в поверхностном слое эпителия языка резко возрастает (в среднем по 3-5 клеток на 10 клеток поверхностного слоя эпителия). Пространственное распределение реснитчатых клеток в эпителии дорсальной поверхности языка представлялось случайным, и не было связано с появляющимися на этой стадии вкусовыми сосочками; реснитчатые клетки были обнаружены как на поверхности сосочков, так и в углублениях между ними. На медиальной части дорсальной поверхности языка чаще встречаются единичные реснитчатые клетки, а также группы из 2-3-х клеток, расположенных рядом. На латеральных частях дорсальной поверхности языка реснитчатые клетки чаще расположены большими группами. Несколько крупных округлых клеток с ресничками обнаружены внизу латеральной поверхности языка, где эпителий языка переходит в эпителий дна ротовой полости. На данной стадии развития реснитчатые клетки имеют разнообразную, иногда неправильную форму. На гистологических препаратах, окрашенных по Маллори, реснитчатые клетки часто отличаются по окраске от окружающего их эпителия, причем их цитоплазма может быть как базофильной, так и ацидофильной (Рис. 4.20, Б, В). Тела реснитчатых клеток на данной стадии иммунопозитивны к И8Е. К некоторым реснитчатым клеткам подходят ответвления внутриэпителиальных нервов, образующие рядом с ними вздутия (Рис. 4.20, Д). Иногда одиночные реснитчатые клетки расположены рядом с вкусовыми луковицами, и в таком случае они иннервируются нервными окончаниями из перигеммального сплетения вкусовой луковицы (Рис.4.20, Е).

К 12-й неделе развития число реснитчатых клеток в задней части

нёба резко сокращается (в среднем 1 реснитчатая клетка на 10 клеток

поверхностного слоя эпителия), а к 14-й неделе остаются только

единичные клетки, расположенные рядом с протоками нёбных желез. В

98

эпителии передней части языка, начиная с 13-й недели развития, количество реснитчатых клеток уменьшается. На этой стадии они реже располагаются на вершинах сосочков, и чаще занимают углубления между ними. К 14-15-й неделе количество реснитчатых клеток начинает сокращаться и в задней части языка. Тем не менее, единичные реснитчатые клетки обнаружены в эпителии растущих желобов в желобоватых и листовидных сосочках. Вместе с уменьшением количества реснитчатых клеток слабеет позитивная реакция к ^Е в их цитоплазме, иммунореактивность пропадает к 14-й неделе пренатального развития. Нервных окончаний, ассоциированных с реснитчатыми клетками, после 13-й недели развития, обнаружить не удалось. К 17-й неделе развития реснитчатые клетки остаются только рядом с протоками желез в желобоватых и листовидных сосочках.

Рис. 4.20. Реснитчатые клетки в эпителии ротовой полости плодов человека.

А - эпителий языка, импрегнация серебром, 10-11 неделя. Б, В - эпителий языка, окраска по Маллори, 10-11 неделя Г - эпителий языка, полутонкий срез, окраска толуидиновый синий, 11-12 недель. Д, Е - эпителий языка, реакция на рз-тубулин, 10-11 недель. Ж - эпителий небных отростков, реакция на ИБЕ, 8 недель.

Реснитчатые клетки отмечены стрелками.

Динамика изменил количества реснитчатых клеток в эпителии языка плодов человека с 8-й по 16-ю недею

развития

22 —1-1-■-1->-1-1-1-1-1-

10 11 12 13 14 15 16 недели развития

-а- Среднее

~Г~ Среднее±0,95 Дов. интервал

Рис. 4.21. Динамика изменения количества реснитчатых клеток в эпителии языка плодов человека___

Возраст, № Число реснитчатых клеток на 50 клеток эпителия в 7-ми полях зрения

недели 1 2 3 4 5 6 7

8 6.10 0 1 1 1 0 0 1

9 41 3 3 1 3 2 2 2

10 15.09 13 13 21 21 23 19 17

10 35.09 20 20 16 14 18 16 19

11 16.09 19 14 17 18 11 15 13

11 60.09 12 10 11 10 8 10 9

12 21.08 7 5 6 4 6 5 4

12 26.09 7 3 6 8 3 5 5

13 6.09 11 6 4 7 7 8 6

13 55.09 2 2 3 3 4 3 2

13 40.09 4 2 2 3 2 2 3

14 52.09 2 2 1 3 2 1 2

14 34.09 2 2 3 2 3 1 2

14 5.09 2 1 3 2 4 3 1

15 20.09 2 3 4 5 4 3 3

15 58.09 4 2 3 1 2 2 1

15 31.09 2 2 1 1 1 0 1

16 37.09 0 1 0 1 0 0 0

Табл. 4.2. Результаты подсчета реснитчатых клеток в эпителии языка плодов человека

Рис. 4.22. Электронные микрофотографии реснитчатых клеток языка, 11-12 недель.

А - дорсальная поверхность языка, СЭМ. Б, В - апикальная поверхность реснитчатой клетки, ТЭМ, длина линейки 2 мкм. Г - поперечный срез ресничек, ТЭМ, длина линейки 500 нм.

V. ОБСУЖДЕНИЕ

V. 1. Эмбриональное развитие иннервации языка человека

Формирование чувствительных ганглиев и главных ветвей черепно-

мозговых нервов у эмбрионов человека подробно описано в литературе

(Streeter G.L., 1905, 1908; Gasser R.F., 1967; O'Rahilly R., Müller F., 1984) и

совпадает с результатами нашего исследования. Однако, большая часть

работ, посвященных ранней иннервации языка человека, содержит

противоречивые данные о сроках проникновения афферентных ветвей

черепно-мозговых нервов в язык. Так, в ряде публикаций волокона V, VII

и IX нерва выявлялись в мезенхиме языка человека на 5-й неделе

внутриутробного развития (16-я стадия) (Vij S., Kanagasuntheram R., 1972;

Sataloff R.T., 1990), a в более позднем исследовании языкоглоточный нерв

в языке был обнаружен только на 16-й стадии, а ветви остальных нервов на

17-й стадии развития (Tamatsu Y., Gasser R.F., 2004). Перечисленные

исследования ранней иннервации языка человека выполнены с помощью

техник серебрения, которые в зависимости от условий импрегнации могут

выявлять не все нервные окончания. Кроме того, из-за трудности взятия

материала эмбрионов человека, работы часто проводились на единичных

эмбрионах на отдельных стадиях развития, и их результаты не отражают

хронологию развития иннервации языка в целом. Например, в работе

Tamatsu Y. и Gasser R.F. (2004) было использовано всего 6 эмбрионов на

13-й, 16-й, 17-й, 18-й, 20-й и 23-й стадии развития, и результаты данного

исследования не доказывают отсутствие нервных волокон в языке

эмбрионов на 14-й и 15-й стадии развития, т.к. эти стадии не изучались. В

нашей работе мы исследовали серии срезов 13 эмбрионов с 12-й по 23-ю

стадию развития с помощью антител к р3-тубулину. При этом

иммунопозитивные к Рз-тубулину волокна V, VII, IX и XII нервов

выявляются в мезенхиме языка эмбрионов человека с середины 4-й недели

развития (14-я стадия развития). Время появления нервных волокон в

мезенхиме языка эмбрионов человека совпадает с результатами

103

исследований иннервации языка мышей и крыс, проведенных с помощью методов иммуногистохимии и трассировки нервов. Нервные окончания выявляются в мезенхиме языка крыс на стадии Е13 (Mbiene J.P., Mistretta. С.М., 1997), и на стадии El 1.5 у мышей (Mbiene J.P., 2004), которые соответствуют 14-й стадии внутриутробного развития человека (Hill M.А., 2014).

Слияние волокон язычной ветви тройничного нерва и барабанной струны при образовании смешанного язычного нерва является ключевым событием в развитии чувствительной иннервации передних двух третей языка. По данным литературы волокна барабанной струны достигают места будущего слияния к 18-19-ой стадии развития (6-я неделя) и объединяются с волокнами тройничного нерва в язычный нерв к 20-й стадии (7-я неделя), что совпадает с формированием подъязычного ганглия рядом с главным стволом нерва (SataloffR.T., 1990; Tamatsu Y., Gasser R.F., 2004). В проведенном исследовании удалось показать слияние волокон барабанной струны и язычной ветви тройничного нерва на 15-й стадии развития (5-я неделя), как на фронтальных, так и на сагиттальных срезах эмбрионов. Подъязычный ганглий обнаружен в базальной части языка в конце 18-й стадии развития (6-я неделя), что совпадает с результатами исследования дифференцировки нейронов подъязычного ганглия человека (Crouse G.S., Cucinotta A.J., 1965). При трассировании нервов языка эмбрионов мышей разными флуоресцентными маркерами, показано, что аксоны барабанной струны появляются в ростральных частях языка сразу после его формирования на стадии El 1.5, при этом число волокон барабанной струны превосходит количество волокон тройничного нерва (Mbiene J.P., 2004). При исследовании языка плодов человека на 14-й стадии развития, соответствующей стадии El 1.5 развития мышей (Hill M.А., 2014), идентифицировать волокна барабанной струны в ростральной части языка не удалось из-за большого количества нервных окончаний в

данной зоне. Это не исключает более раннее слияние волокон барабанной струны и язычной ветви тройничного нерва и образование язычного нерва.

V.2. Формирование вкусовых примордиев в эпителии языка человека

Первые вкусовые примордии обнаружены в эпителии языка человека

в конце 6-й недели развития (18-19 стадия), а к 7-й неделе (19 стадия) они

покрывают всю его дорсальную поверхность. Большая часть исследований

описывает начало дифференцировки вкусовых примордиев в эпителии

языка человека только с 8-й недели развития, когда в эпителий языка

проникают нервные волокна (Witt М., Reutter К., 1996, 1998; Tamatsu Y.,

Gasser R.F., 2004). Полученные хронологические различия, скорее всего,

являются следствием отсутствия маркеров для клеток вкусовых

примордиев, позволяющих выявлять эти структуры на ранних сроках

развития. Отличительной особенностью обнаруженных в конце 6-й недели

развития вкусовых примордиев от покровного эпителия языка является

удлинение тел клеток, обусловленное поляризацией цитоскелета, и

перемещение ядер в апикальное положение. В ротовой полости эмбрионов

и плодов человека подобные удлиненные клетки с апикально

расположенными ядрами описаны в базальном слое эпителия десен и

твердого неба (Coslet J., Cohen D., 1976). Базальные части этих клеток

имеют цитоплазматические выросты, которые контактируют с

ретикулярными волокнами, пучки которых расположены перпендикулярно

к эпителиальному пласту (Cosle J., Cohen D., 1968). Тем самым

формируются неподвижные относительно дермы жевательные участки

эпителия ротовой полости. Но в случае вкусовых примордиев данная

модель не реализуется. Поляризация цитоскелета и сдвиг ядра из

центрального положения также является одним из признаков

мигрирующих клеток (Ridley A .J. et al., 2003), но миграционный потенциал

клеток вкусовых примордиев не изучен. Таким образом, причины

105

миграции ядер и поляризации цитоскелета в клетках вкусовых примордиев

человека не ясны и требуют дальнейшего изучения. При этом тела клеток

примордиев у изученных эмбрионов иммунопозитивны к р3-тубулину,

который является нейрон-специфическим белком цитоскелета. В

медиальной части зачатка желобоватого сосочка в конце 6-й недели

развития также присутствуют иммунопозитивные к р3-тубулину клетки, но

из-за сильного утолщения эпителия идентифицировать среди них вкусовые

примордии не удалось. К 7-й неделе на апикальной части зачатка

формируется примордий и иммунопозитивная реакция на р3-тубулин

локализуется только в его клетках. Локализация иммунопозитивной

окраски на р3-тубулин совпадает с экспрессией BDNF в эпителии языка

эмбрионов человека на тех же сроках (Nostrat I.V. et al., 2000). На этапе

появления первых примордиев (конец 6-й недели развития) нервных

окончаний, подходящих к их клеткам, выявлено не было. Возможно,

иммунопозитивная реакция на р3-тубулин в их клетках, также как BDNF

(Nostrat I.V. et al., 2000), выявляет начальные стадии их дифференцировки,

которые индуцируются местными межклеточными взаимодействиями,

либо паракринным влиянием нервных окончаний, расположенных под

эпителием языка. При использовании других нейромаркеров (NSE, PGP

9.5) тела клеток вкусовых примордиев человека были к ним

иммунонегативны (Witt М., Reutter К., 1998), что может объяснить более

позднее выявление примордиев в эпителии языка данными авторами. В

зрелых вкусовых луковицах млекопитающих и человека встречаются

единичные иммунопозитивные к нейромаркерам клетки (NSE, PGP 9.5),

предположительно с нейроэндокринной функцией (Yoshie S. et al., 1988;

Astbäck J. et al., 1995). Таким образом, обнаруженные в данном

исследовании единичные иммунопозитивные к NSE клетки,

расположенные во вкусовых примордиях эмбрионов человека на 8-9-й

неделе развития, могут осуществлять нейроэндокринную функцию. Это

предположение подтверждается ультраструктурными исследованиями

106

развивающихся вкусовых луковиц человека. В клетках вкусовых примордиев, начиная с 8-й недели развития, наблюдается образование секреторных везикул, при этом необходимая для рецепции вкуса дифференцировка вкусовых луковиц заканчивается только на 15-й неделе развития (Witt М., Reutter К., 1996). Наличие везикул позволяет рассматривать незрелые вкусовые луковицы как органы с паракринной секрецией (Witt М., Reutter К., 1996), которые способны регулировать морфогенез сосочков языка.

Часть бугорков на поверхности языка человека на 7-8-й неделе внутриутробного развития не является вкусовыми примордиями и представляет собой менее плотные структуры, образованные за счет поляризации клеток как базального, так и апикального слоя эпителия, в которых иммунопозитивная реакция на р3-тубулин отсутствует. По морфологии такие образования сходны со складками эпителия, покрывающего заднюю треть языка. Принято считать, что граница эктодермального и энтодермальиого эпителия в вентральной части ротовой полости млекопитающих проходит по задней трети языка, но ее точное расположение не установлено (Rothova М. et al., 2012). У амфибий было показано, что энтодермальные клетки в процессе эмбрионального развития могут мигрировать в ростральном направлении (Soukup V. et al., 2008). Энтодермальные клетки также были выявлены в эпителии передней трети языка человека, что подтверждает наличие такой миграции у млекопитающих (Zhang С., Oakley В., 1996). Обнаруженные в эпителии эмбрионов человека иммунонегативные к р3-тубулину бугорки обладают морфологическими признаками энтодермальных клеток, хотя это предположение требует дальнейших исследований с применением соответствующих маркеров.

V.3. Развитие вкусовых сосочков человека

Морфогенез вкусовых сосочков у человека начинается на 5-й неделе внутриутробного развития, когда в районе слепого отверстия языка образуется эпителиальная плакода желобоватого сосочка. В эпителии плакоды нервные окончания не обнаружены, но волокна языкоглоточного нерва приближаются к базальной мембране эпителия под основанием плакоды. Полученные результаты совпадают с начальными этапами морфогенеза желобоватых сосочков грызунов, у которых формирование эпителиальных плакод протекает без участия иннервации под влиянием эпителиальных и мезенхимальных факторов дифференцировки (Morris-Wiman J. et al, 1999a; Kim J. et al., 2009). Стадия эпителиальной плакоды у человека описана впервые. Предыдущие исследования развития желобоватых сосочков человека проводились с помощью методов СЭМ, при которых зачаток медиального желобоватого сосочка можно обнаружить только на 6-й неделе внутриутробного развития, когда он приобретает форму бугорка (Witt М., Reutter К., 1997).

Несмотря на отличия в ранней дифференцировке грибовидных и

желобоватых сосочков человека в конце 6-й недели внутриутробного

развития, на 7-й неделе развития на апикальной поверхности сосочков

обоих типов присутствует один вкусовой примордий. К 8-й неделе в

эпителии латеральной поверхности в районе границы тела и корня языка

обнаружены вкусовые примордии, часть из которых иннервируется IX

нервом, а остальные волокнами язычного нерва. Локализация

обнаруженных у эмбрионов примордиев совпадает с положением

листовидных сосочков у взрослых. Смешанная иннервация латеральных

примордиев также позволяет отнести их к листовидным сосочкам, т.к.

чувствительная иннервация листовидных сосочков взрослых людей

осуществляется как волокнами IX нерва, так и волокнами язычного нерва

(Doty R.L. et al., 2009). Несмотря на большое число работ по изучению

грибовидных и желобоватых сосочков человека (Bradley R.M., Stern I.B.,

108

1967; Witt M., Reutter К., 1996, 1997, 1998; Sayed L. et. al, 2005), морфогенез листовидных сосочков языка человека в литературе практически не описан. Листовидные сосочки в онтогенезе человека считаются рудиментарными структурами, закладка которых происходит на поздних сроках развития (Witt М., Reutter К., 1996). Хотя некоторые авторы отмечают начало формирования эпителиальных складок листовидных сосочков на латеральной поверхности языка человека уже на 10-й неделе развития (Hersch М., Ganchrow D., 1980). Обнаружение вкусовых примордиев на латеральной поверхности задней половины языка свидетельствует о более раннем начале морфогенеза листовидных сосочков, чем считалось прежде. Таким образом, результаты проведенного исследования показывают, что зачатки всех типов вкусовых сосочков человека появляются на дорсальной поверхности языка с 5-й по 9-ю неделю развития, и к 8-й неделе для всех формирующихся сосочков обязательно наличие одного вкусового примордия, расположенного на апикальной поверхности зачатка.

С 10-й недели внутриутробного развития человека в сосочках языка начинается формирование эпителиальных эвагинаций, при этом сосочки приобретают характерную для них форму, а в их эпителии выявляются вкусовые луковицы. Дифференцировка вкусовых примордиев во вкусовые луковицы была исследована на грибовидных сосочках человека. С 10-й по 14-ю неделю развития на грибовидных сосочках человека присутствует по одной вкусовой луковице, которые являются потомками клеток вкусовых примордиев (Witt М., Reutter К., 1996), что совпадает с результатами нашего исследования. Также число вкусовых пор на поверхности грибовидных сосочков, несмотря на увеличение их размеров, в течение 1015-й недели остается постоянным (Witt М., Reutter К., 1997). Подсчет вкусовых примордиев и луковиц у эмбрионов и плодов человека показал, что количество вкусовых луковиц на 13-й неделе развития превосходит в

два раза количество вкусовых примордиев на 9-й неделе. Следовательно,

109

эпителий новых грибовидных сосочков, появляющихся после 9-й недели развития, содержит клетки-предшественники вкусовых луковиц. В эпителии языка человека после 10-й недели развития вкусовых примордиев или аналогичных им структур не выявлено, что совпадает с данными других исследований (Witt М., Reutter К., 1998). С 15-й недели развития число вкусовых луковиц в эпителии грибовидных сосочков увеличивается. При этом вкусовые луковицы в одном сосочке расположены вплотную, либо разделены тонким слоем эпителия.

Развитие вкусовых луковиц в желобоватых сосочках человека

начинается с одного вкусового примордия, расположенного на апикальной

поверхности центральной части сосочка. Для зрелых желобоватых

сосочков человека характерно латеральное расположение вкусовых

луковиц в эпителии стенок желоба (Kusakabe Т. et al., 1998). На 10-й

неделе внутриутробного развития в желобоватых сосочках было замечено

разделение апикального примордия в процессе врастания соединительной

ткани в серцевину сосочка. А после 10-й недели вкусовые луковицы в

желобоватых сосочках обнаружены как на апикальной поверхности, так и

в стенках желоба. В литературе существует несколько гипотез,

объясняющих механизм перемещения вкусовых луковиц с апикальной

поверхности желобоватых сосочков в стенки желоба в процессе

внутриутробного развития. По одной из версий апикальные вкусовые

луковицы в процессе развития исчезают и замещаются латеральными (Witt

М., Reutter К., 1997), но тогда не понятна их функция, т.к. все вкусовые

луковицы языка готовы к рецепции только с 15-й недели (Witt М., Reutter

К., 1996). Другие авторы высказали гипотезу, что формирующиеся

вкусовые клетки обладают способностью к миграции и в процессе

развития они перемещаются из апикального положения в стенки желоба

(I-Iirata К., Kanaseki Т., 1989; Hosley М.А. et al., 1987; Zhang С. et al., 1995).

Гипотеза о миграции клеток может объяснить образование новых

вкусовых луковиц в желобоватых и листовидных сосочках, а также

110

Грибовидные сосочки

Неизвестный источник И»

Листовидные сосочки Вкусовые примордии ^^ /СД f

Желобоватые сосочки

Рис. 5.1. Распределение вкусовых луковиц в эпителии развивающихся вкусовых сосочков языка человека.

увеличение количества вкусовых луковиц в грибовидных сосочках после 15-й недели развития, т.к. новые вкусовые луковицы появляются в пределах одного сосочка рядом с уже сформированными. Но механизм появления вкусовых луковиц в новых грибовидных сосочках остается неизвестным и может объясняться как миграцией клеток примордиев, так и наличием в неспециализированном эпителии языка других клеток-предшественников. Топологическое распределение вкусовых луковиц в эпителии разных типов вкусовых сосочков на разных стадиях их морфогенеза представлено на Рис. 5.1.

Вкусовые сосочки человека на всех стадиях развития хорошо иннервированы. Нервное сплетение в желобоватых сосочках появляется на 8-9-й неделе развития, а в грибовидных и листовидных на 10-й неделе. В нервном сплетении желобоватых сосочков человека уже на 10-й неделе

111

и

развития выявляются ганглиоиарные клетки. В желобоватых сосочках крыс появление ганглионарных клеток совпадает с началом формирования желез Эбнера и появлением в эпителии сосочков вкусовых луковиц, что позволяет исследователям спекулировать о влиянии ганглионарных клеток на развитие вкусовых луковиц и желез Эбнера (Sbarbati A. et al., 1999). Результаты исследования развития желобоватых сосочков человека показывают, что появление вкусовых луковиц в эпителии сосочка не зависит от наличия ганглионарных клеток, но данные клетки могут оказывать влияние на дифференцировку желез Эбнера, протоки которых начинают формироваться уже на 10-й неделе развития. Клетки желез Эбнера, помимо слизистого секрета, секретирует липазы, необходимые для расщепления жиров (Hamosh М., Burns W., 1977; Roberts J.M., Jaffe R., 1986), секреция липаз языка особенно активна в неонатальном периоде развития, когда количества панкреатической липазы недостаточно (Hamosh М., Hand A.R., 1978). Эта функция желез Эбнера может объяснять их раннюю закладку и обильную иннервацию. Развитие и функции желез под листовидными сосочками человека в литературе не описаны, но наличие сложного нервного аппарата, включающего ганглиоиарные клетки, может свидетельствовать не только о структурном, но и о функциональном сходстве этих желез с железами Эбнера. Интересно, что клетки желез желобоватых и листовидных сосочков иммунопозитивны к S100. S100 широко применяется как маркер клеток нейро-эктодермального происхождения (Marettova, Maretta, 2004). В центральной нервной системе взрослого человека и других млекопитающих S100, преимущественно, выявляется в глиальных клетках (Liu Н.М. et. al., 1989). Однако, также экспрессия S100 характерна для некоторых секреторных клеток (Lauboeck S., Egerbacher М., 1997; Marettova Е. et al., 2001), в том числе и клеток желез Эбнера млекопитающих (Marettova Е., Maretta М., 2012). Во вкусовых луковицах плодов человека экспрессия S100 не обнаружена, что

связано с отсутствием миелиновых оболочек у интрагеммальных волокон.

112

Однако, SI 00 обнаружен и в некоторых рецепторных клетках. Исследования на рыбе Danio retio выявили две популяции рецепторных клеток: механорецепторные клетки, иммунопозитивные к S100 и хеморецепторные клетки, иммунопозитивные к калретинину и иммунонегативные к S100 (Germ an а" А. et al., 2007), что подтверждает отсутствие реакции на S100 в клетках вкусовых луковиц.

V.4. Пролиферативная активность клеток вкусовых луковиц и эпителия языка человека с 3-й по 21-ю неделю внутриутробного развития

Экспрессия Ki67 и PCNA обнаружена в эпителии языка всех исследованных эмбрионов и плодов человека. До 15-й недели развития распределение иммунореактивных к обоим маркерам ядер совпадало, а после 15-й недели иммунопозитивных ядер к Ki67 было заметно меньше, чем к PCNA. Полученные результаты могут быть объяснены различными функциями данных белков. PCNA участвует не только в пролиферации клеток, но и в репарации ДНК после ее повреждения, что делает данный антиген условно специфичным к клеточному циклу, так как восстановление ДНК может осуществляться в фазе покоя (Bromley М. et al., 1996). Ki67, в отличие от PCNA, не участвует в репарации ДНК, и дает возможность идентифицировать клетки, находящиеся на всех стадиях клеточного цикла, кроме фазы покоя (Go) (Brown D.C., Gatter К.С., 1990; Hall P.A. et al., 1993). Различия в экспрессии Ki67 и PCNA в эпителии языка человека после 15-й недели развития, по-видимому, являются следствием завершения периода активной пролиферации эпителия и выходом части клеток в фазу покоя.

Многочисленные исследования показывают, что клетки зрелых вкусовых луковиц, в т.ч. и клетки IV типа, находятся на постмитотической стадии клеточного цикла и не экспрессируют маркеры пролиферации,

такие как Ki67 и PCNA (Hirota М. et al., 2001; Miura H. et al., 2004).

113

Обновление клеток вкусовых луковиц происходит за счет перигеммальных клеток (клетки V типа), которые обладают митотической активностью (Hirota М. et al., 2001; Miura II. et al., 2004). Такой характер экспрессии маркеров пролиферации обнаружен в эпителии вкусовых сосочков плодов человека, начиная с 15-й недели развития. По данным литературы дифференцировка клеток вкусовых луковиц человека заканчивается на 15-й неделе внутриутробного развития (Witt М., Reutter К., 1996), чем может объясняться характер экспрессии маркеров пролиферации после 15-й недели развития. Однако, до 15-й недели развития в клетках вкусовых примордиев и вкусовых луковиц выявляются иммунопозитивные к Ki67 и PCNA ядра, что говорит о том, что недифференцированные клетки вкусовых луковиц человека способны к пролиферации. При изучении зрелых вкусовых луковиц хомяка и мыши были найдены единичные иммунопозитивные к Ki67 клетки удлиненной формы (Hirota М. et al., 2001). Также есть сообщение о митозах, найденных в зрелых вкусовых луковицах листовидных сосочков кролика (Toyoshima К., Tandler В., 1986). Возможно, в клетках зрелых вкусовых луковиц есть немногочисленная популяция, не выходящая из клеточного цикла в фазу покоя, что подтверждает существование пролиферирующих клеток во вкусовых луковицах во время их развития. С другой стороны, это может быть следствием патологии, т.к. Ki67 может присутствовать в клетках в фазе G0 при нарушении регуляции клеточного цикла (van Oijen M.G. et al., 1998).

Данных по экспрессии Ki67 и PCNA в развивающихся вкусовых

луковицах человека в литературе нет, а интерпретация результатов работ,

проведенных на грызунах, осложнена значительными отличиями

морфогенеза их вкусовых луковиц и сосочков. В течение пренатального

развития мышей локализация маркеров пролиферации в невкусовом

эпителии вкусовых сосочков (Lee M.J. et al., 2006) совпадает с

результатами, полученными в проведенной работе на плодах человека.

Вкусовые луковицы в эпителии языка мышей выявляются после рождения,

114

и их дифференцировке предшествует формирование вкусовых сосочков (Farbman A.I., Mbiene J.P., 1991). По последним данным, клетки-предшественники вкусовых луковиц присутствуют в эпителии плакод вкусовых сосочков мыши на стадии 13.5 (Mbiene J.P., Roberts J.D., 2003; Thirumangalathu S., Barlow L.A., 2009; Thirumangalathu S. et al., 2009). При использовании аналога тимидина бромдезоксиуридина (BrdU), пролиферация в клетках плакод сосочков мышей не обнаружена (Mbiene, Roberts, 2003). BrdU используется для мечения пролиферирующих клеток, находящихся на момент введения BrdU на стадии репликации ДНК (S-фаза) (Ito T. et al., 1998). Поэтому, в отличие от Ki67, он маркирует не все пролиферирующие клетки. Сравнение результатов исследований мышей и человека имеет довольно условный характер, т.к. гомологичность вкусовых примордиев человека и клеток, выявленных в плакодах сосочков мыши, не доказана. Но, т.к. во время дальнейшего внутриутробного развития мышей экспрессия маркеров пролиферации наблюдается во всех клетках базального слоя вкусовых сосочков (Lee M.J. et al., 2006), клетки-предшественники вкусовых луковиц, выявляемые на стадии плакод, также должны пролиферировать.

Обнаруженная в клетках развивающихся вкусовых луковиц пролиферация может косвенно подтвердить миграционную гипотезу образования новых вкусовых луковиц в эпителии вкусовых сосочков.

V.5. Сравнительная характеристика экспрессии транскрипционных факторов Sox2 и NeuroDl в эпителии языка плодов человека

Экспрессия Sox2 и NeuroDl в эпителии языка эмбрионов и плодов

человека изучена впервые. Четкая иммунопозитивная реакция на Sox2 на

ранних стадиях развития человека (до 10-й недели развития) в эпителии

языка не обнаружена, что может быть следствием низкого уровня

экспрессии данного маркера. С другой стороны, полученные результаты

115

могут быть объяснены свойствами эпителия, покрывающего язык в данный период развития. Такой тип эпителия, называемый перидермой, временно покрывает поверхность развивающегося эмбриона млекопитающих (со стадии Е13 по Е17 у мышей (McGowan K.M., Coulombre P.A., 1998; Takaishi M. et al., 1998) и с 8-й по 12-ю неделю развития человека (Witt М., Reutter К., 1996)). Свойства перидермы плохо изучены, но известно, что она экспрессирует множество цитокератинов, что не позволяет выявлять клетки-предшественники с помощью цитокератинов на ранних стадиях развития (Lane E.B. et al., 1985, Byrne С. et al., 1994; Oakley В., Witt M., 2004). Несмотря на нечеткую иммунопозитивную реакцию на Sox2 на ранних стадиях развития, эпителий языка эмбрионов человека в течение этого периода имеет более темную окраску, чем подлежащая мезенхима. В течение раннего развития мышей экспрессия Sox2 наблюдается во всем эпителии языка, но наиболее интенсивная реакция обнаружена в клетках плакод вкусовых сосочков (Okubo Т. et al., 2006, 2009). Независимо от того, является ли слабая иммунопозитивная окраска эпителия языка эмбрионов человека неспецифической перекрестной реакцией, связанной со свойствами перидермы, или отражает низкий уровень экспрессии Sox2, клетки вкусовых примордиев по интенсивности окраски ничем не отличаются от остальных клеток эпителия языка, что говорит об отсутсвии специфичности данного маркера к клеткам вкусовых примордиев.

После 10-й недели внутриутробного развития человека начинается

активный морфогенез сосочков языка. При этом высокий уровень

экспрессии Sox2 наблюдается с 10-й по 15-ю неделю развития в клетках

вкусовых луковицах, а также в неспециализированном эпителии языка.

Наибольшее количество иммунопозитивных к Sox2 ядер локализовано в

базальном слое эпителия, а также в растущих базальных частях сосочков,

т.е. в местах активной пролиферации и дифференцировки эпителиальных

клеток. В течение развития сосочков мышей высокий уровень экспрессии

116

Sox2 наблюдается в апикальных частях грибовидных сосочков, в то время как в эпителии нитевидных сосочков уровень экспрессии поддерживается на низком уровне (Okubo Т. et al., 2006, 2009). Результаты исследования экспрессии Sox2 у человека показывают, что с 10-й по 15-ю неделю Sox2 регулирует дифференцировку всего эпителия языка, включая морфогенез вкусовых сосочков. При помощи гипоморфных мутаций у мышей было показано, что если уровень экспрессии Sox2 достигает только 20% от нормы, эпителиальные плакоды сосочков формируются, но зрелые вкусовые сосочки и луковицы отсутствуют (Okubo Т. et al., 2006). При повышенной экспрессии Sox2 у мышей наблюдается увеличения количества грибовидных сосочков, а не вкусовых луковиц (Okubo Т. et al., 2006), что подтверждает роль Sox2 в морфогенезе вкусовых сосочков.

Влияние Sox2 на дифференцировку клеток-предшественников

вкусовых луковиц является спорным вопросом. Во вкусовых сосочках

взрослых мышей Sox2 экспрессируется только в клетках вкусовых луковиц

и в клетках эпителия, окружающего их (Suzuki Y., 2008). Такая

локализация экспрессии наблюдается в эпителии языка человека после 18-

й недели внутриутробного развития. Данные, полученные на мышах и

человеке, показывают, что Sox2 принимает участие в процессах

регенерации в зрелых вкусовых луковицах, а также регулируют

дифференцировку их клеток в течение плодного периода развития.

Экспрессия Sox2 во вкусовых луковицах взрослых мышей зависит от

наличия чувствительных нервных окончаний (Suzuki Y., 2008). При этом у

человека высокий уровень экспрессии обнаружен только после 10-й

недели развития, когда нервные окончания в эпителии языка уже

присутствуют. Поэтому участие данного фактора в индукции

дифференцировки клеток вкусовых примордиев человека сомнительно.

Результаты немногочисленных исследований экспрессии Sox2 в других

органах эмбрионов человека свидетельствуют о межвидовых различиях,

которые необходимо учитывать при эксраполяции результатов

117

исследований экспериментальных животных на человека. Например, при развитии половых клеток в гонадах у эмбрионов мышей наблюдается экспрессия Sox2, а у эмбрионов человека она отсутствует (Perrett R.M. et al., 2008).

Экспрессия NeuroDl обнаружена у всех исследованных эмбрионов и плодов человека, начиная с 8-й недели внутриутробного развития. На ранних стадиях развития (до 10-й недели) иммунопозитивные ядра выявлялись во всех слоях эпителия, в. т.ч. в клетках вкусовых примордиев. После 10-й недели развития иммунопозитивная реакция была локализована в клетках вкусовых луковиц, в базальном слое эпителия, а также в базальных частях сосочков. У мышей иммунопозитивная реакция на NeuroD была обнаружена в клетках зрелых и развивающихся вкусовых луковиц и не присутствовала в клетках неспециализированного эпителия, но при этом в данной работе эпителий языка исследовался только с 3-го дня после рождения (стадия РЗ) (Suzuki Y .et al., 2002). С помощью методики ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR) экспрессия NeuroD была обнаружена в эпителии первичной кишки мышей на стадии образования сомитов (Wells J.M., Melton D.A., 2000). Также экспрессия NeuroDl наблюдается в клетках протоков поджелудочной железы эмбрионов человека, начиная с 8-й недели развития (Кривова Ю.С. и др., 2013). Приведенные выше результаты исследований и экспрессия NeuroDl в эпителии языка эмбрионов и плодов человека показывают, что в течение эмбрионального развития NeuroDl участвует в дифференцировке эпителия в разных районах пищеварительной системы.

Развитие клеток вкусовых луковиц мышей характеризуется

экспрессией транскрипционного фактора Mashl, запускающего программу

дифференцировки, включающую NeuroD (Cau Е. et al., 1997; Seta Y.et al.,

1999). Исследования развивающихся и зрелых вкусовых луковиц мышей

выявили экспрессию NeuroD в клетках удлиненной формы, находящихся

на более поздней стадии дифференцировки, чем базальные клетки

118

вкусовой луковицы (Suzuki Y. et al., 2002). Во вкусовых луковицах плодов человека с 10-й недели развития имуннореактивные ядра расположены как в удлиненных клетках, так и в базальных клетках округлой формы. Однако, реакция в ядрах удлиненных клеток была более интенсивной, что, по-видимому, отражает начавшуюся в них дифференцировку.

Так как в течение 10-15-й недели внутриутробного развития человека большая часть ядер базального слоя эпителия языка иммунопозитивна к NeuroDl, Sox2 и маркерам пролиферации PCNA и Ki67, в клетках базального слоя наблюдается коэкспрессия данных маркеров. Полученные результаты отличаются от картины экспрессии этих факторов в нервной системе. Экспрессия NeuroDl в клетках головного мозга и нервных ганглиев запускает нейрональную дифференцировку; при этом только небольшая часть NeuroDl-экспрессирующих клеток сохраняет способность к делению, т.е. экспрессия NeuroDl выводит клетки в фазу покоя (Lee J.E. et al., 2000; Puligilla С. et al., 2010; Boutin C. et al., 2010). В клетках коры головного мозга Sox2 подавляет экспрессию NeuroDl, поэтому коэкспрессия данных маркеров наблюдается редко (Gao Z. et al., 2009; Kuwabara Т. et al., 2009). Исходя из этих данных, колокализация Sox2, NeuroDl, Ki67 и PCNA в одной клетке невозможна. Однако, в обонятельном эпителии мышей Sox2 выявляется в большей части NeuroDl-позитивных клеток базального слоя, a NeuroDl-позитивные клетки также экспрессируют маркеры пролиферации Ki67 и PCNA (Packard A. et al., 2011), что соответствует экспрессии данных маркеров в эпителии развивающегося языка плодов человека. Результаты данных исследований свидетельствуют о том, что на данный момент мы далеки от понимания механизмов действия и функций Sox2 и NeuroDl в разных органах и на разных стадиях развития млекопитающих.

V.6. Реснитчатые клетки в эпителии ротовой полости человека и млекопитающих

В результате проведенного исследования установлено, что реснитчатые клетки в эпителии ротовой полости человека появляются на 7-й неделе внутриутробного развития и достигают своего максимального количества в период с 10-й по 12-ю неделю развития. В онтогенезе человека подробно эти клетки не описаны, но в литературе присутствуют отрывочные сведения, подтверждающие наличие этих клеток в эпителии развивающегося языка человека. При изучении дифференцировки вкусовых луковиц плодов человека с помощью методов электронной микроскопии исследователями были отмечены единичные реснитчатые клетки, реснички которых были направлены в полость вкусовых пор (Witt M., Reutter К., 1996, 1997). Наличие реснитчатых клеток не характерно для зрелых вкусовых луковиц человека, поэтому авторы рассматривали их как один из вариантов дифференцировки апикального аппарата клеток вкусовых луковиц, который исчезает в процессе дальнейшего развития (Witt M., Reutter К., 1997).

У млекопитающих существует две разновидности строения

аксонемы ресничек: девять микротрубочек-дублетов окружают

центральную пару микротрубочек-синглетов (9+2), или центральная пара

микротрубочек отсутствует (9+0) (Satir Р., Christensen S., 2007). Реснички

со строением 9+2, называемые вторичными ресничками, обладают

подвижностью, их количество в эпителиальной клетке может достигать

нескольких сотен. Строение аксонемы типа 9+0 встречается в одиночно

расположенных ресничках, называемых первичными ресничками. Чаще

всего они представляют собой неподвижные специализированные

сенсорные структуры, встречающиеся в клетках сетчатки глаза, почечных

канальцев, эпифиза, щитовидной железы (Moller M., 1974; Martin A. et

al.,1988; Satir P., Christensen S., 2007; Louvi A., Grove E., 2011). Подвижные

вторичные реснички характерны для клеток респираторного эпителия,

120

эпителия фаллопиевых труб, эпендимоцитов желудочков головного мозга млекопитающих, где они участвуют в перемещении слизи или жидкости (Satir Р., Christensen S., 2007). Несмотря на то, что реснитчатый эпителий не типичен для ротовой полости позвоночных, реснитчатые клетки с вторичными ресничками присутствуют на вершинах сосочков языка настоящих лягушек (род Rana), где они образуют кольцо вокруг вкусовых дисков, участвуя в распределении секрета желез языка (Düring M., Anders К.Н., 1976; Iwasaki S., Wanichanon С., 1993). Подобные клетки также были обнаружены на языке птиц подкласса Paleognathae - эму (Croie M.R., Soley J.T. 2010) и нанду (Santos T. et al., 2011), и в желобоватых сосочках языка некоторых млекопитающих - крысы (Toyoshima К., Shimamura А., 1979) и коалы (Kobayashi К. et al., 2003). У взрослого человека единичные клетки с подвижными вторичными ресничками найдены в стенках желобов желобоватых сосочков между выходом протоков желез Эбнера и вкусовыми луковицами (Mattern С. et al., 1970). Строение аксонемы реснитчатых клеток, обнаруженных в ротовой полости у эмбрионов и плодов человека соответствует строению ресничек исследованных взрослых млекопитающих и человека.

У взрослых млекопитающих и человека реснитчатые клетки на языке

редки и ассоциированы с протоками желез и вкусовыми луковицами

(Mattern С. et al., 1970; Toyoshima К., Shimamura А., 1979; Kobayashi К. et

al., 2003). На основании такого расположения этих клеток, исследователи

выделяют три основных функции реснитчатых клеток: очищение вкусовых

органов, поддержание циркуляции вкусовых стимулов и увлажнение

вкусовой поры (Toyoshima К., Shimamura А., 1979). В результате нашего

исследования было установлено, что в эпителии ротовой полости плодов

человека реснитчатые клетки имеют более широкую зону

распространения, в течение 10-11-й недели внутриутробного развития они

покрывают дорсальную поверхность языка и заднюю часть нёба. Также

морфогенез вкусовых сосочков и желез языка на ранних этапах

121

пренатального онтогенеза человека (с 9-й по 12-го неделю) не отражается на локализации реснитчатых клеток, которые на данных сроках равномерно распределены в эпителии языка и мягкого нёба. С 13-й недели развития количество реснитчатых клеток в ротовой полости человека начинает сокращаться, а к 17-й неделе они остаются только рядом с протоками желёз в желобоватых и листовидных сосочках, как и у исследованных взрослых млекопитающих и человека (Mattern С. et al., 1970; Toyoshima К., Shimamura А., 1979). Вкусовые луковицы у человека готовы к функционированию к 15-й неделе внутриутробного развития, когда во вкусовой ямке появляется слизь, без которой невозможна вкусовая рецепция, а первые вкусовые поры появляются только на 13-й неделе развития (Witt M., Reutter К., 1996). Исходя из этого, реснитчатые клетки в эпителии языка плодов человека могут участвовать в очищении вкусовой поры только после 13-й недели внутриутробного развития, а необходимость в этом появляется только с 15-й недели развития. Таким образом, функция реснитчатых клеток в ротовой полости человека до 15-й недели развития не связана с обеспечением условий для рецепции вкусовых стимулов.

На 10-11-й неделе внутриутробного развития в эпителии языка

плодов человека обнаружены нервные окончания, ассоциированные с

реснитчатыми клетками. После 13-й недели таких нервных окончаний

обнаружить не удалось, что может быть следствием уменьшения общего

количества клеток и, соответственно, уменьшением вероятности

попадания на срез ассоциированных с ними нервных окончаний. Данные

по иннервации реснитчатых клеток в эпителии языка взрослого человека и

других млекопитающих в литературе отсутствуют, поэтому является ли

наличие иннервации характерным признаком стадии развития реснитчатых

клеток, совпадающей с их наибольшей численностью, установить не

удалось. При иммуногистохимическом исследовании эпителия языка

плодов человека с антителами к NSE наблюдалась позитивная реакция в

122

телах реснитчатых клеток, особенно интенсивная с 8-й по 12-ю неделю развития. Экспрессия NSE является одним из признаков нейроэдокринных клеток (Bonner J. et al., 2000). Таким образом, пик численности реснитчатых клеток сопровождается их иннервацией и иммунопозитивной реакцией на NSE, что может свидетельствовать об участии этих клеток в регуляции дифференцировки клеток окружающего их эпителия.

Согласно данным литературы, реснитчатые клетки обнаружены также в других дериватах первичной ротовой полости - аденогипофизе и щитовидной железе. Так, клетки с подвижными вторичными ресничками встречаются у крысы и человека в промежуточной доле аденогипофиза (Rasmussen А.Т., 1929; Kurosumi К. et al., 1961). В эпителии фолликулов щитовидной железы человека обнаружены клетки с одиночными первичными ресничками, среди которых попадаются вторичные реснички, находящиеся на разных стадиях деградации (Martin А., 1988). Вторичные реснички также находили в течение короткого периода в процессе внутриутробного развития щитовидной железы собаки (Nunez Е.А., Gershon M.D., 1976). Учитывая вышесказанное, можно предположить, что клетки с подвижными ресничками - это необходимая стадия дифференцировки эпителия первичной ротовой полости.

Известно, что первичные реснички могут быть антеннами для

многих сигнальных путей, определяющих миграцию и дифференцировку

клеток (I-Iuangfii D., Anderson K.V., 2005; D'Angelo A., Franco В., 2009; Satir

P. et al., 2010), в т.ч. каскадов Wnt и Shh, регулирующих развитие эпителия

языка (Louvi A., Grove Е., 2011). Ультраструктура и функции ресничек

могут сильно варьировать, а их разделение на первичные и вторичные

довольно условно. Обонятельные рецепторные клетки несут несколько

ресничек, у которых конфигурация микротрубочек в аксонеме 9+2, но они

неподвижны, т.к. в них отсутствует динеин (Jenkins P.M. et al., 2009). В

базальном слое эпителия ротовой полости взрослого человека обнаружены

клетки с одиночными первичными ресничками (9+0), направленными в

123

межклетники (МУагМг^е К., Е1с^80п Я., 1988). Еще один тип реснитчатых клеток обнаружен у эмбрионов мышей в районе гензеновского узелка на 8-м дне внутриутробного развития. Эти реснички имеют строение 9+0, но обладают подвижностью, осуществляя левосторонний ламинарный ток жидкости вокруг тела эмбриона, который играет ведущую роль в формировании закладок билатерально асимметричных органов (Тапака У. е! а1., 2005; ЬБгокалуа N. е1 а1., 2006). Таким образом, строение аксонемы ресничек не всегда свидетельствует о выполняемых ими функциях. Поэтому при обсуждении роли реснитчатых клеток в ротовой полости эмбрионов и плодов человека нельзя исключить их возможную рецепторную функцию, для подтверждения которой требуются дальнейшие исследования.

VI. выводы

\

1. В результате комплексного гистологического и иммуногистохимического исследования ранних эмбриональных закладок вкусовых луковиц обнаружена их автогенетическая дифференцировка. Вкусовые примордии структурно обособляются из эпителия языка до начала его иннервации и дифференциальной экспрессии транскрипционных факторов 8ох2 и №игоБ1.

2. В базальном слое эпителия языка обнаружен феномен перемещения ядер в апикальную область клетки, маркирующий зоны первичного обособления вкусовых примордиев. Морфологическая дифференцировка примордиев сопровождается экспрессией нейрон-специфического р3-тубулина, которая позволяет выявить эмбриональные вкусовые структуры с конца 6-й недели внутриутробного развития человека.

3. Зачатки грибовидных, листовидных и желобоватых сосочков на 9-й неделе развития имеют по одному вкусовому примордию на апикальной поверхности. Вкусовые примордии выявляются с помощью р3-тубулина, а Б100, ^Е и транскрипционные факторы Бох2 и №игоБ1 не проявляют специфичности к данной клеточной популяции.

4. Дифференцировка вкусовых луковиц в пределах одного вкусового сосочка языка происходит разделением эмбриональной закладки на две и более частей или перемещением развивающихся вкусовых луковиц в процессе морфогенеза сосочков. Вкусовые луковицы в грибовидных сосочках, появившихся после 10-й недели развития, мо1ут бь1ть следствием миграции клеток вкусовых примордиев или результатом дифференцировки других эмбриональных источников.

5. Пролиферативная активность клеток вкусовых луковиц и примордиев человека, выявленная при помощи антител к ядерным пролиферативным белкам (Кл67, РСИА), сохраняется с 6-й по 15-ю неделю внутриутробного развития.

6. В эпителии языка плодов человека впервые описана экспрессия транскрипционных факторов Sox2 и NeuroDl. С 10-й по 15-ю неделю развития Sox2 выявляется в зонах пролиферации эпителия языка и во вкусовых луковицах, а после 18-й недели только в клетках вкусовых луковиц и прилежащего эпителия. NeuroDl обнаружен как в клетках вкусовых луковиц и примордиев, так и в очагах пролиферации эпителия языка с 8-й по 21-ю неделю развития.

7. Иммуногистохимическими методами описана динамика проникновения волокон V, VII, IX и XII черепно-мозговых нервов в мезенхиму языка человека. Перечисленные нервы проникают в язык одновременно на 14-й стадии развития (30-32-й день), тогда как язычный нерв (композитная ветвь V и VII нервов) формируется только на 15-й стадии развития (33-36-й день).

8. На поверхности языка и в эпителии ротовой полости плодов человека обнаружены реснитчатые клетки, ультраструктура которых сходна с организацией клеток мерцательного эпителия. Эти клетки выявлены с 7-й по 21-ю неделю внутриутробного развития и представляют собой ранее неизвестную особенность онтогенеза человека.

VII. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алексеев О.Н. Эмбриогенез языка человека // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1991. - Т. 100. - №6. - С. 87-90.

2. Балаболкин М.И., Калинин А.П., Селищева Р.Ф. Дисгенез щитовидной железы. — Ташкент: Медицина. - 1982. — 144 с.

3. Барсукова А.Н., Шаповалова Е.Ю., Юней Г.А., Апухтин Ю.П. Цито- и гистологическая характеристика структурных компонентов, формирующих жаберный аппарат человека в конце 4-ой недели эмбриогенеза // Таврический медико-биологический вестник. - 2011. -Т. 14.-№ 1.-С. 11-14.

4. Билич Г., КатинасГ.С., НазароваЛ.В. Цитология. - СПб.: Деан. - 1999. -112 с.

5. Боровский Е.В., Леонтьев В.К. Биология полости рта. - М.: Медицинская книга, Н. Новгород: НГМА. - 2001. - 304с.

6. Буравков C.B., Черников В.П., Буравкова Л.Б. Простой метод подготовки препаратов для сканирующей электронной микроскопии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2011.-Т. 151. -№3.-С. 356-360.

7. Быков В.Л. Гистология и эмбриология полости рта человека: Учебное пособие. 2-е изд., испр. - СПб.: СпецЛит. - 1999. - 247 с.

8. Гайворонский И.В., Ничипорук Г.И. Анатомия центральной нервной системы Издание 4-е, дополненное и исправленное — СПб.: ЭЛБИ-СПб,-2010. —108с.

9. Данилов Р.К, Клишов A.A., Боровая Т.Г. Гистология человека в мультимедиа. Учебник для студентов медицинских вузов. - СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2004. - 362 с.

10. Заварзин A.A., Румянцев A.B. Курс гистологии. 6-е изд. - М: МЕДГИЗ -1946. -723с.

11. Карлсон Б. Основы эмбриологии по Пэттену: Пер. с англ. - М.: Мир. -1983. -Т.1. -С. 337.

12. Кривова Ю.С., Барабанов В.М., Прощина А.Е., Савельев C.B. Иммуногистохимическое исследование распределения транскрипционного фактора NeuroDl в поджелудочной железе плодов человека // Клиническая и экспериментальная морфология. - 2013. - Т. 2-№6.-С. 37-42.

13.Куликова КВ., Кибардин A.B., Гиучев Н.В, Георгиев Г.П., Ларин С.С. Сигнальный путь Wnt и его значение для развития меланомы // Современные технологии в медицине. -2012. -№3. - С. 107-112.

14. Дашков В.Ф. О трофическом действии языкоглоточного нерва // Известия АН СССР. Серия биологическая. - 1945. - С. 273.

15. Петтен Б. М. Эмбриология человека. Пер. с англ. - М.: Медгиз. - 1959. -183 с.

16. Пинский С.Б., Дворниченко В.В., Ренета O.P. Рак щитовидно-язычного протока // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - № 3. - С. 5-7.

17. Рубашкин В.Я. Основы гистологии и гистогенеза человека. Вып. 1. 4.2. - М.: МЕДГИЗ. - 1933. -162с.

18. Савельев C.B. Стадии эмбрионального развития мозга человека. -М.:ВЕДИ.-2002.- 109 с.