Повышение качества вакцин против гриппа A/H5N1 путем увеличения стабильности гемагглютинина и использования нового донора репродукции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Сергеева, Мария Валерьевна

• Сергеева, Мария Валерьевна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Сергеева, Мария Валерьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Появление высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 и разработка противопандемических вакцин

1.2 Создание вакцинных штаммов для производства вакцин против вирусов гриппа A/H5N1

1.3 Гемагглютинин высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 в составе вакцинных препаратов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы

2.2 Молекулярно-биологические методы

2.3 Вирусологические методы

2.4 Подготовка и характеристика прототипов инактивированных гриппозных вакцин

2.5 Иммунологические и серологические методы

2.6 Работа с животными

2.7 Методы статистической обработки данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Получение и характеристика реассортантов A/H5N1 на основе донора репродукции A/Puerto Rico/8/34 с комбинированным составом генома

3.2 Повышение стабильности гемагглютинина реассортантов H5N1/PR8 путем точечного мутагенеза

3.3 Получение и характеристика реассортанта A/H5N1 на основе нового

универсального донора А/Гонконг/1/68/162/3 5

2

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1. Вирусы, использованные в филогенетическом анализе

Приложение 2. Нуклеотидные последовательности праймеров

Приложение 3. Аминокислотные последовательности НА высокопатогенных вирусов и реассортантов Н5Ш/Р118

Приложение 4. Нуклеотидные последовательности НА реассортантов Н51Ч1/РР8 по данным частичного секвенирования

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БСА - бычий сывороточный альбумин

в/м - внутримышечно

ГАЕ - гемагглютинирующая единица

ЖГВ - живая гриппозная вакцина

ИГВ - инактивированная гриппозная вакцина

и/н - интраназально

ИФА - иммуноферментный анализ

КББ - карбонатно-бикарбонатный буфер

КК - культура клеток

КЭ - куриные эмбрионы

ОП - оптическая плотность

ОТ - обратная транскрипция

н/о - не определяли

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РГА - реакция гемагглютинации

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

ТИД50 - 50% тканевая инфекционная доза

ФБС - фетальная бычья сыворотка

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭИД50 - 50% эмбриональная инфекционная доза

ЭФ - электрофорез

DPBS - Dulbecco modified phosphate buffered saline (ФСБ в модификации Дульбекко, без ионов Са2+ и Mg2+)

НА - hemagglutinin (гемагглютинин) NA - neuraminidase (нейраминидаза)

RCT - reproductive capacity at different temperatures (изменение показателя репродукции при различных температурах)

4

SDS - sodium dodecyl sulfate (додецил сульфат натрия) ts- (фенотип) - temperature sensitive (температурочувствительный) фенотип

ca- (фенотип) - cold-adapted (холодоадаптированный) фенотип

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Повышение качества вакцин против гриппа A/H5N1 путем увеличения стабильности гемагглютинина и использования нового донора репродукции»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы.

Появившиеся впервые в 1997 году в популяции людей высокопатогенные вирусы гриппа птиц A/H5N1 продолжают распространяться из Азии в Европу и Африку, представляя несомненную угрозу для человечества (WHO, 29 August 2013). В настоящее время уже показано, что циркулирующему вирусу достаточно приобрести всего 2-4 мутации в основном поверхностном белке -гемагглютинине (НА), чтобы приобрести способность к аэрозольной трансмиссии среди млекопитающих (Rüssel et al., 2012). Следствием таких мутаций станет появление штамма, способного вызвать масштабные вспышки, эпидемию или даже пандемию. Вакцинопрофилактика является основным механизмом предотвращения широкого распространения гриппозной инфекции. Главным компонентом противогриппозных вакцин и основной мишенью нейтрализующих вирусспецифических антител является вирусный белок НА. Большинство существующих лицензированных вакцин против вируса гриппа A/H5N1 получают на основе реассортантных вирусов, содержащих поверхностные антигены НА и нейраминидазу (NA) от птичьих вирусов, а остальные гены от донора репродуктивности, вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (PR8). В случае возникновения предпандемической ситуации потребуется быстрая наработка вакцины в количестве, необходимом для вакцинации населения всего земного шара. Однако данные реассортанты характеризуются сниженной репродуктивной активностью в куриных эмбрионах (КЭ), являющихся основным субстратом для производства вакцин, и низким содержанием НА в очищенных препаратах (Horimoto et al., 2006, Harvey et al., 2008). Причина этих феноменов до последнего времени оставалась неизвестной. Мы предположили, что одной из причин низкой репродуктивной активности реассортантов может быть несоответствие генов донора репродуктивности и птичьего вируса A/H5N1. Вторым фактором может

являться НА высокопатогенных вирусов гриппа птиц, который характеризуется высоким значением рН активации и отличается по этому параметру от всех вирусов гриппа человека (Scholtissek, 1985). Повышенное значение рН, при котором происходит изменение конформации НА, необходимой для обеспечения слияния вирусной и эндосомальной мембран, непосредственно связано с низкой стабильностью нативной структуры НА (Carr et al., 1997).

В данной работе исследуется возможность использования альтернативного донора для получения реассортантов A/H5N1 для производства гриппозных вакцин и изучается возможность повышения количества нативного НА в препаратах инактивированной вакцины путем понижения рН активации НА и повышения, таким образом, его стабильности.

Цель исследования: Конструирование и изучение репродуктивных свойств реассортантов A/H5N1, полученных на основе различных доноров, и оценка влияния стабильности НА реассортантов A/H5N1 на его содержание в препаратах очищенных вирусов.

Задачи исследования:

1. Конструирование реассортантов, содержащих НА и NA высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1, на основе донора репродуктивное™ A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) с комбинированной структурой генома.

2. Конструирование реассортантов A/H5N1, содержащих мутацию K582I во второй субъединице НА, и оценка влияния данной мутации на стабильность вирусов и содержание нативного НА в инактивированных вакцинных препаратах.

3. Получение реассортантного штамма A/H5N1 на основе нового высокорепродуктивного и холодоадаптированного донора A/T0HK0Hr/l/68/162/35(H3N2).

4. Изучение безопасности и специфической активности прототипов живой (ЖГВ) и инактивированной (ИГВ) вакцин, полученных из

7

реассортантного штамма А/Н5>П на основе донора А/Гонконг/1/68/162/35 (Н3№) в модельных экспериментах на животных.

Научная новизна работы.

В рамках проведенной работы впервые продемонстрировано значение рН активации НА высокопатогенных вирусов гриппа птиц А/Н5№ и стабильности нативной конформации молекулы НА для качества высокорепродуктивных вакцинных кандидатов. Показано значение вышеуказанных параметров на количество полноценного НА в препаратах очищенных инактивированных вирусов.

Впервые в качестве донора внутренних генов для получения А/Н5№ реассортанта был использован холодоадаптированный и высокорепродуктивный штамм А/Гонконг/1/68/162/35 (НЗШ). Показана высокая репродуктивная активность, безвредность, иммуногенность и защитная эффективность полученного реассортанта, что подтверждает возможность использования вируса А/Гонконг/1/68/162/35 в качестве единого донора для производства штаммов для ИГВ и ЖГВ.

Практическая значимость работы.

В рамках проведенной работы определен параметр, а именно, стабильность НА, критически влияющий на качество ИГВ. Показана возможность повышения стабильности НА вирусов гриппа А/Н51Ч1 путем введения модифицирующих мутаций во вторую субъединицу НА.

Сконструированы реассортантные штаммы Аз158/РЯ8 и Киг58/РЯ8, обладающие высокой репродуктивной активностью в КЭ и стабильным НА, которые могут быть использованы для производства ИГВ против потенциально пандемических вирусов гриппа А/Н51Ч1.

Получен реассортант Аб^НК, обладающий помимо высокой репродуктивности, фенотипическими признаками аттенуации, который может быть рекомендован как единый вакцинный кандидат для производства ЖГВ и ИГВ против вирусов гриппа А/Н5Ш.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Использование донора A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) с комбинированной структурой генома при конструировании реассортантов с поверхностными антигенами высокопатогенных вирусов гриппа птиц A/H5N1, выделенных на территории России и Казахстана, обеспечивало преимущество созданных реассортантов перед вакцинным вирусом NIBRG-14 по репродуктивной активности в КЭ.

2. Понижение рН активации НА путем введения точечной мутации К58—>1 в НА2 повысило устойчивость реассортантов A/H5N1 к воздействию кислой среды и повышенной температуры и привело к увеличению содержания нативного и иммунокомпетентного НА в очищенных инактивированных вирусных препаратах.

3. Реассортантный штамм с поверхностными антигенами высокопатогенного вируса A/H5N1, созданный на основе нового донора А/Гонконг/1/68/162/3 5, унаследовал от донора свойства аттенуации и превосходил по репродуктивной активности в КЭ реассортант на основе донора A/Puerto Rico/8/34.

4. Экспериментальные препараты ИГВ и ЖГВ, полученные из реассортантного штамма A/H5N1, созданного на основе донора А/Гонконг/1/68/162/3 5, обладали высокой иммуногенной и протективной активностью у лабораторных животных. Препарат ЖГВ при интраназальном (и/н) введении стимулировал выработку мукозальных вирусспецифических антител, обеспечивая полноценную защиту от инфекции.

Личный вклад автора состоит в самостоятельном планировании и проведении всех лабораторных исследований, анализе и статистической обработке полученных результатов. Автором лично получены высокорепродуктивные реассортантные штаммы A/H5N1, а также апробированы прототипы вакцинных препаратов на их основе. Вклад соавторов заключается в антигенной характеристике вирусов гриппа A/H5N1 с

9

диагностическими постинфекционными сыворотками хорьков, а также в получении электронных микрофотографий очищенных вирусов гриппа.

Внедрение результатов работы.

Сконструированные автором реассортантные штаммы Ast/HK, Ast58/PR8, Kur/PR8, Kur58/PR8 депонированы в Государственную коллекцию вирусов Российской Федерации на базе ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России под номерами 2626, 2734, 2735, 2736 соответственно, штамм Ast/PR8 депонирован в коллекцию микроорганизмов НИИ проблем биологической безопасности Республики Казахстан под номером №M-12-09/D. Реассортантный штамм Ast/PR8 использован для производства моновалентной H5N1 инактивированной цельновирионной вакцины с алюминием «КАЗФЛЮВАК», которая была зарегистрирована в качестве профилактического средства защиты населения в возрасте от 18 до 60 лет от гриппа А подтипа H5N1 (регистрационное удостоверение РК-БП-3№019910 от 28.05.2013).

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы представлены на Международной научной конференции студентов и молодых учёных «Молодёжь — медицине будущего» (Одесса, Украина, 28-29 апреля 2011 года), Международной конференции «The Fourth ESWI Influenza Conference» (Мальта, 11-14 сентября 2011 года), П всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 12 - 14 ноября 2012 года), Конференции молодых специалистов «Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение» (Санкт-Петербург, 2425 октября 2012 года), Международной конференции «Options for the Control of Influenza VIII» (Кейптаун, ЮАР, 5-10 сентября 2013 года).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 1 научный обзор и 5 статей в реферируемых журналах и сборниках научных

10

статей (из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК), 1 заявка на изобретение РФ и 6 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах текста, включая 14 таблиц, 32 рисунка и 4 приложения. Список цитируемой литературы содержит 192 источника. Из них 18 отечественных и 174 иностранных.

Работа поддержана грантом правительства Санкт-Петербурга 2009 года для студентов и аспирантов № 2.6/30-04/083, субсидией правительства Санкт-Петербурга 2012 года для молодых ученых № 34/13-07/5ОМУ, а также грантом ФГБУ «Российский фонд фундаментальных исследований» для молодых ученых № 12-04-31397.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Появление высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 и разработка противопандемических вакцин

Вирусы гриппа А различных подтипов постоянно циркулируют среди диких водоплавающих птиц, не вызывая у своих естественных хозяев признаков серьезного заболевания. Однако вирусы гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 могут приобретать свойство высокой патогенности и широко распространяться, преодолевать межвидовой барьер и поражать не только диких, но и домашних птиц, а также млекопитающих, в том числе человека, вызывая заболевания различной степени тяжести (de Jong M.D, Hien, 2006). Во время первой вспышки высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 на птичьих фермах Гонконга в 1997 году вирус преодолел межвидовой барьер и без предварительной адаптации инфицировал 18 человек, 6 из них со смертельным исходом (Subbarao et al., 1998). Быстрое уничтожение всех домашних птиц в этом районе позволило остановить распространение инфекции. Однако в 2002 году в Гонконге было отмечено возникновение нового антигенного варианта вируса A/H5N1, который в апреле 2005 г. в Китае в районе озера Цинхай вызвал массовую гибель диких птиц, с последующим распространением вируса по всему земному шару (Chen et al., 2006). До настоящего времени вирус продолжает циркулировать среди диких водоплавающих птиц и периодически инфицировать людей (WHO, 2013). По данным Всемирной Организации Здравоохранения при заражении людей вирусами гриппа A/H5N1 отмечается высокий уровень смертности, который на данный момент составляет 59% (WHO, 29 August 2013). Большинство случаев заражения связаны с тесным контактом с больной птицей. Прямая передача вируса от человека к человеку является довольно редким явлением (Katz et al., 1999). Однако потенциальную способность вирусов данного подтипа приобрести крайне опасное свойство -передаваться от человека к человеку, подтверждают исследования полученных

12

в лабораторных условиях мутантных штаммов A/H5N1, способных к аэрозольной трансмиссии среди млекопитающих (Chen et al., 2012, Imai et al., 2012, Herfst et al., 2012). Периодическая циркуляция высокопатогенных вирусов A/H5N1, происходящая на птичьих фермах в непосредственной близости и постоянном контакте с человеком, создает угрозу внедрения в популяцию людей вируса гриппа нового субтипа, к которому отсутствует иммунитет практически у всего населения. Следствием появления нового трансмиссивного варианта вируса A/H5N1 могут стать масштабные вспышки и эпидемии.

Создание защитного иммунного ответа против циркулирующих вирусов гриппа является основным механизмом контроля над распространением гриппозной инфекции. Эффективность предотвращения широкого распространения инфекции и возникновения масштабной эпидемии находится в прямой зависимости от качества применяемых вакцинных препаратов (Киселев и др., 2006, Киселев, 2010). Для профилактики гриппа наиболее широко в настоящее время применяются ИГВ, которые представляют собой суспензию очищенных инактивированных вирионов (цельновирионная вакцина), разрушенного детергентом вируса (сплит вакцины) или очищенных вирусных поверхностных гликопротеинов (субъединичные вакцины). В отдельных странах (Россия, США) используют ЖГВ, которые представляют собой ослабленный вирус, вводимый и/н. ЖГВ индуцирует выработку как противовирусных антител (секреторные и сывороточные антитела), так и клеточного иммунного ответа. Иммунитет, вызванный этими вакцинами, является более длительным и кроссреактивным, чем иммунитет, вызванный инактивированными вирусными препаратами (Сох et al., 2004). Основной субстрат для производства противогриппозных вакцин - КЭ. В процессе репликации высокопатогенных вирусов гриппа птиц эмбрионы погибают, что создает определенную сложность для производства. Поэтому при появлении высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 возникла необходимость

разработки новых концепций конструирования вакцинных штаммов и производства вакцин.

К настоящему времени разработаны и прошли испытания несколько абсолютно новых типов вакцин против высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 - культуральные вакцины, рекомбинантные вакцины, в том числе вирусоподобные частицы, ДНК-вакцины, вакцины на основе векторов.

При производстве культуральных вакцин, для наработки вирусного материала используются лицензированные клеточные линии. Преимуществом такой технологии является возможность культивирования летальных для эмбрионов высокопатогенных штаммов, а также независимость производства от наличия большого количества свободных от патогенов КЭ, что особенно актуально в случае пандемии птичьего вируса гриппа. К настоящему времени уже две адгезивные культуры клеток (КК) используются для производства гриппозных вакцин:- MDCK (Novartis, Швейцария) и Vero (Baxter, Австрия), еще две суспензионные КК находятся в процессе регистрации - PER.C6 (Crucell, Нидерланды, лицензирование ожидается в 2014 году) и ЕВ66 (GSK, Великобритания). Клинические испытания цельновирионной вакцины произведенной на КК Vero из высокопатогенного штамма A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) показали ее безопасность и иммуногенность (Ehrlich et al., 2008).

Рекомбинантные вакцины представляют собой антигены вируса гриппа, полученные экспрессией в клетках насекомых, растений или грибов. Данные вакцины менее реактогенны, технология их производства отличается безопасностью и возможностью быстрой наработки большого количества антигена в короткие сроки. Первые партии рекомбинантной вакцины, состоящей из НА вируса A/Hong Kong/156/97 (H5N1), экспрессированного в клетках Sf9, были готовы уже спустя 2-3 месяца, после второго случая заражения человека высокопатогенным вирусом гриппа A/H5N1 (Treanor et al., 2001). Данная вакцина была одной из первых пандемических вакцин, испытанных на волонтерах. Однако её иммуногенность оказалась весьма

низкой - двукратная иммунизация в высокой дозе (90 мкг НА) приводила к 4-кратным приростам нейтрализующих антител у 50% привитых (Treanor et al., 2001). Использование в качестве антигена химерных молекул эктодомена НА с ковалентно присоединенным фрагментом IgG2a-Fc повысило иммуногенность препаратов рекомбинантного НА в экспериментах на мышах. Причиной усиления иммуногенности, вероятно, была дополнительная активация Fcy-рецепторов (Zaharatos et al., 2011).

Вирусоподобные частицы образуются при одновременной экспрессии нескольких рекомбинантных вирусных белков, например, НА и M вируса гриппа. Вирусоподобные частицы имеют округлую форму и морфологически похожи на вирионы. Преимуществом вирусоподобных частиц является презентация антигенов в нативной конформации и стимуляция эффективного захвата антигена дендритными клетками (Buonaguro et al., 2006). В доклинических испытаниях вирусоподобные частицы активировали Т-клеточный иммунный ответ 1 типа и превосходили препараты рекомбинантного НА подтипа Н5 по иммуногенности и протективной эффективности (Bright et al., 2008). По итогам I фазы клинических испытаниях вакцина на основе вирусоподобных частиц с антигенами H5N1 проявила относительно высокую иммуногенность и при двукратном введении относительно малой дозы (20 мкг НА) удовлетворяла 2 из 3 критериев СРМР (European Committee for Proprietary Medicinal Products) (Landry et al., 2010).

Использование в качестве вакцинных антигенов высококонсервативных белков вируса гриппа (М2е - эктодомен белка М2, НА2 - вторая субъединица молекулы НА) теоретически может обеспечить защиту от любого возможного варианта вируса, в том числе пандемических вирусов. Недостаток этого подхода состоит в том, что антитела к высококонсервативным антигенам, не нейтрализуют вирус, а только способствуют элиминации инфицированных клеток, что определяет более слабый защитный эффект по сравнению с лицензированными вакцинами. В доклинических испытаниях вакцинного

препарата на основе рекомбинантного М2е была продемонстрирована защита мышей только от гибели, но не от реинфекции летальными вирусами H5N1 (Zhao et al., 2010). Изучается возможность включения нескольких доменов М2е различных штаммов в липосомы, что может повысить защитный эффект препарата (Ernst et al., 2006).

ДНК-вакцины, наряду с вакцинами на основе вирусных векторов используют совершенно другой механизм индукции иммунного ответа. Экспрессия антигена при использовании данного типа вакцин осуществляется в клетках организма, что способствует его презентации в MHC-I комплексе и выработке СТЪ-клеточного ответа (Ulmer et al., 1999). При этом векторные вакцины обеспечивают более эффективную доставку и длительную экспрессию целевой ДНК в клетках. В доклинических испытаниях протестированы Н5 векторные вакцины на основе дефектного по репликации аденовируса, поксвируса, вируса болезни Ньюкасл, альфавируса (Karaca et al., 2005, Sylte et al., 2007, Veits et al., 2006). Ограниченные клинические испытания H5 ДНК-вакцины показали её низкую иммуногенность в отношении индукции антигемагглютинирующих антител (только 50% ответчиков после двукратного введения в дозе 1 мг с адъювантом), однако положительную индукцию длительного Т-клеточного ответа у 75-100% вакцинированных (Smith et al., 2010). Вакцина на основе аденовирусного вектора, несущего ген НА подтипа Н5 обеспечивала эффективную защиту мышей, предотвращая размножение гетерологичного вируса после двух внутримышечных иммунизаций (Hoelscher et al., 2010).

Новые концепции производства противогриппозных вакцин имеют целый ряд вышеперечисленных преимуществ по сравнению с классическими ИГВ и ЖГВ, однако, также и ряд недостатков. Выход вирусного материала при выращивании в КК существенно ниже выхода, получаемого при производстве с использованием КЭ, и в случае пандемической ситуации производство исключительно культуральных вакцин вряд ли сможет обеспечить достаточное

16

количество доз вакцины. Производство рекомбинантного НА способно обеспечить достаточно большое количество материала в короткие сроки, однако его иммуногенность может оказаться слишком низкой. Более иммуногенными и эффективными в испытаниях на животных являются вакцины на основе вирусоподобных частиц и аденовирусных векторов, однако на сегодняшний день отсутствуют данные по эффективности данных типов вакцин «в полевых условиях» - в случае эпидемий при испытаниях на широком круге лиц.

Препаратами с доказанной эффективностью в условиях эпидемий являются на данный момент только классические ЖГВ и ИГВ. Поэтому в случае наступления пандемической ситуации производство ЖГВ и ИГВ, в том числе с использованием КЭ, буде иметь огромное значение для защиты населения от гриппозной инфекции, а разработка эффективных вакцинных штаммов станет первоочередной задачей.

1.2 Создание вакцинных штаммов для производства вакцин против вирусов гриппа A/H5N1

1.2.1 Методы создания штаммов для производства противогриппозных вакцин, штаммы-доноры

Вакцинные штаммы для производства противогриппозных вакцин должны обладать определенными свойствами (фенотипом). Для ЖГВ используют штаммы аттенуированные методом холодовой адаптации или укорачиванием, в том числе полным удалением NS1 белка. Эти вирусы безвредны для человека, но способны активировать формирование специфического иммунитета (Kendal et al., 1981, Александрова, Климов, 1994, Wacheck et al., 2010). Для создания ИГВ используют высокорепродуктивные штаммы, дающие максимальное количество вирусного материала при культивировании в КЭ.

Классический способ получения вакцинных штаммов с заданным фенотипом, впервые примененный КПЬоигпе в 1960 году для получения высокорепродуктивного штамма А/Н2Ы2, был основан на явлении генетической реассортации (КПЬоигпе е1 а1., 1960, КПЬоигпе е1 а1., 1971). Поскольку геном вируса гриппа представлен 8 отдельными сегментами минус РНК, при сочетанной инфекции одной клетки двумя вирусами возможно появление вирусного потомства со смешанным составом генома -реассортантов, которые могут наследовать генные сегменты от обоих родительских штаммов (Ра1езе, 8сЬи1тап, 1976). Схема классической генетической реассортации представлена на рисунке 1.

Рис. 1. Схема классической генетической реассортации. Геном реассортанта с комбинацией типа 2:6: гены поверхностных белков (выделены фиолетовым) унаследованы от одного родительского вируса, гены, кодирующие внутренние и неструктурные белки (выделены голубым) от другого.

Для получения антигенно-актуального штамма с определенным фенотипом наиболее эффективным методом является получение реассортанта с комбинацией генома типа 6:2 (Baez et al., 1980, Johansson et al., 1989, Ghendon et al., 1981, Maassab, Bryant, 1999, Fulvini et al., 2011), в котором гены НА и NA происходят от эпидемического вируса дикого типа, а шесть остальных генов от

Родительские вирусы

Вирус-реассортант

хорошо охарактеризованного штамма-донора с заданным фенотипом. Основным свойством штамма-донора является способность передавать свой фенотип полученным на его основе реассортантам.

Основным недостатком метода классической реассортации является необходимость селекции реассортантов с заданным составом генома 6:2 из массы реассортантов, возникающих при сочетанной инфекции. Отбор реассортантов с определенным составом генома является длительным процессом, требующим многократные пассажи материала в селективных условиях и ряд клонирований. Суммарно получение реассортанта может занимать от 1 до 2,5 месяцев.

Альтернативным подходом к созданию реассортантов для производства противогриппозных вакцин является метод обратной генетики, разработанный Neumann G. et al. (1994). Метод основан на включении 8 генных сегментов вируса гриппа в плазмиды под контролем промотора РНК-полимеразы Poll и последующей трансфекции чувствительных клеток. При совместной котрансфекции с экспрессионными плазмидами, кодирующими белки полимеразного комплекса (РВ2, РВ1, PA, NP) под контролем промотора (3-актина, данный подход обеспечивает эффективную сборку инфекционных вирусных частиц (Neumann et al., 1999, Pleschka et al., 1996, Fodor et al., 1999). Впоследствии метод был модифицирован - были разработаны двунаправленные плазмиды, таким образом, количество необходимых для сборки вируса плазмид было сокращено до 8 (Hoffman et al., 2000, Hoffman et al., 2002). Разработанные, плазмиды pHW2000 кодировали в одном направлении РНК-сегменты вирусов под контролем Poll промотора, а в обратном направлении соответствующие белки под контролем CMV -промотора для PolII (Hoffman et al., 2000). С использованием каждого подхода были получены реассортантные вакцинные кандидаты, содержащие поверхностные антигены эпидемических вирусов и гены внутренних и неструктрурных белков соответствующих штаммов-доноров (Schickli et al.,

2001, Hoffman et al., 2002). Основным достоинством данного подхода является возможность избежать контаминации вакцинного штамма другими патогенами, присутствующими в первичном изоляте, а также быстрота получения вакцинных кандидатов за счет отсутствия необходимости селекции реассортантов с заданным составом генома. К настоящему времени разработана система "multi-segment RT-PCR" (M-RTPCR), позволяющая амплифицировать полный геном вируса гриппа в ходе одной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с универсальными праймерам, что, при использовании специальным образом модифицированных плазмид, позволяет создать готовый вакцинный штамм уже через 9-12 дней после появления нового изолята (Zhou et al., 2009).

Другим преимуществом метода обратной генетики является возможность вносить модификации в геном рекомбинантных вирусов. Единственно возможным подходом к созданию безопасных вакцинных штаммов на основе высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 является модификация сайта расщепления НА и сборка вирусов методом обратной генетики.

Получение методом обратной генетики вирусов с удаленной открытой рамкой считывания белка NS1 позволило создать принципиально новый тип аттенуированных вакцинных штаммов для производства ЖГВ (Egorov et al., 1998). Такие вирусы дефектны по репликации в интерферон-компетентных клетках и организмах. Созданные на их основе вакцины против вирусов гриппа А и В объединяют в себе сильные стороны живой холодоадаптированной и инактивированной вакцин (Ferko et al., 2004, Wacheck et al., 2010, Wressnigg et al., 2009).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Сергеева, Мария Валерьевна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа // СПб.: Изд-во Наука. -1994.

2. Гармашова Л.М., Полежаев Ф.И., Александрова Г.И. Холодоадаптированный штамм А/Ленинград/134/47/57(H2N2) - специальный донор аттенуации живой гриппозной вакцины для детей и полученные на его основе рекомбинанты // Вопр. вирусол. -1984. - Т. 29. -N1.- С. 28-31.

3. Дешева Ю.А., Лу X., Рекстин А.Р. и др. Прививочные свойства реассортантного холодоадаптированного штамма вируса гриппа A(H5N2) при интраназальном введении мышам // Вопр. вирусол. - 2007. - Т. 52. -№ 4. - С. 2730.

4. Егоров А.Ю., Лисовская К.В. Высокорепродуктивные температурочувствителъные рекомбинанты вируса гриппа А // Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. - Ленинград. - 1986. - С. 117-124.

5. Жилова Г.П., Ермолаева О.М., Орлов В.А. и др. Получение нового вакцинного штамма вируса гриппа А2-Гонконг // Иммунология и специфическая профилактика гриппа у детей. Сборник трудов ВНИИ гриппа под ред. В. И. Иоффе и Г.И. Александровой. - Л.: Министерство здравоохранения СССР. -1971. - С. 166-175

6. Игамбердиев В.М., Яковлева Н.В., Соколов H.H. Обеспечение условий сохранения биологической активности вируса гриппа в процессе его очистки и концентрирования методами центрифугирования // Убитая гриппозная вакцина. Труды института им. Пастера. -1976. - Т. 47. - С. 65-70.

7. Киселев О.И., Блинов В.М., Писарева М.М. и др. Изоляты вируса гриппа подтипа H5N1, выделенные от домашней птицы в Курганской области в 2005 году: молекулярно-генетическая характеристика // Мол. биология. -2006. -№3.-С. 96-100.

8. Киселев О. И. Прогресс в создании пандемических противогриппозных вакцин и технологии их производства // Биотехнология. - 2010. - №2. — С. 117.

9. Киселев О. И., Цыбалова Л.М., Покровский В. И. Состояние разработки вакцин против вируса гриппа H5N1 в мире и России // ЖМЭИ. -

2006.-№5.-С. 28-38.

10. Киселева И.В., Ларионова Н.В., Voeten J.T.M. и др. Ведущая роль генов полимеразного комплекса в аттенуации доноров отечественной живой гриппозной вакцины АиВ // Журн. микробиол. - 2010. -№ 6. - С. 41-47.

11. Кочергин-Никитский КС., Руднева И.А., Тимофеева Т.А. и др. Реассортация и взаимодействие генов при скрещивании низкопатогенного вируса гриппа птиц подтипа Н5 с вирусом гриппа человека // Вопр. вирусол. -

2007. - Т. 52. -Nsl.- С. 23-28.

12. Красилъников КВ., Гамбарян A.C., Машин В.В., Лобастова А.К Иммуногенные и протективные свойства инактивированных и живых кандидатных вакцин против высокопатогенных вирусов гриппа H5N1 // Вопр. вирусол. -2010. - Т. 55. -№ 4. - С. 16-19.

13. Потапчук М.В., Репко И.А., Сергеева М.В. и др. Характеристика реассортантных штаммов вируса гриппа на основе нового донора А/Гонконг/1/68/162/35(H3N2) //Вопр. вирусол. -2012. - Т. 57. -№ 6. - С. 42-46.

14. Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных // Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных».

15. Руднева H.A., Каверин Н.В., Тимофеева Т.А. и др. Оптимизация генного состава реассортантов, содержагцих гемагглютинин вируса гриппа подтипа Н5, и их эффективность в опытах перекрестной иммунной защиты // Вопр. вирусол. - 2008. - Т.53. -№1. - С.24-27.

116

16. Романовская-Романъко Е.А., Ferko В., Вышемирский О.И. и др. Доклинические исследования интраназалъной живой гриппозной H5N1-вакцины с удаленным NS-геном //Вопр. вирусол. - 2011. - Т. 56. -№ 6.- С. 19-22.

17. Султанкулова К. Т., Ажибаева Д. Т., Строчков В.М. и др. Генетический анализ гемагглютинина и нейраминидазы высокопатогенного штамма А/курица/Астана/6/05 (H5N1) вируса гриппа птиц // Биотехнология. Теория и практика. - 2010. -№ 3. - С. 76-81

18. Цыбалова JI.M., Горев Н.Е., Потапчук М.В. и др. Характеристика холодоадаптированного штамма вируса гриппа А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) как потенциального донора аттенуации и высокой репродуктивности // Вопр. вирусол. -2012. - Т. 57. -№ 6. - С. 15-17.

19. Abt М., de Jonge J., Laue M., Wolff Т. Improvement of H5N1 influenza vaccine viruses: influence of internal gene segments of avian and human origin on production and hemagglutinin content // Vaccine. - 2011. - Vol. 29. - N 32. - P. 5153-5162.

20. Alexandrova G.I., Smorodintsev A.A. Obtaining of an additionally attenuated vaccinating cryophyl influenza strain // Rev. Poum. D'Inframicrobiol. -1965. - Vol. 2. -P. 179-189.

21. Amorij J.P., Meulenaar J., Hinrichs W.L. et al. Rational design of an influenza submit vaccine powder with sugar glass technology: preventing conformational changes of hemagglutinin during freezing and freeze-drying // Vaccine.-2007. - Vol. 25. -N35. -P. 6447-6457.

22. Antigenic and genetic characteristics of zoonotic influenza viruses and development of candidate vaccine viruses for pandemic preparedness [Electronic resource] / WHO Consultation and Information Meeting on the Composition of Influenza Virus Vaccines for the Southern Hemisphere 2014, 23-26 September 2013.

Accession mode:

http://www. who. int/influenza/vaccines/virus/201309Ji5h 7h9_vaccinevirusupdate.pdf ,free.

23. Atmar R.L., Keitel W.A. Adjuvants for pandemic influenza vaccines // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 2009. - Vol. 333. - P. 323-344.

24. Avian influenza in humans [Electronic resource] / WHO. - 2013. -Accession mode: http://www, who, int/influenza/human animal interface/avianinfluenza/en/, free.

25. Babiuk S., Skowronski D.M., De Serres G. et al. Aggregate content influences the Thl/Th2 immune response to influenza vaccine: evidence from a mouse model//Med. Virol.-2004. - Vol. 72. -Nl.-P. 138-142.

26. Baez M., Palese P., Kilbourne E.D. Gene composition of high-yielding influenza vaccine strains obtained by recombination // J. Infect. Dis. - 1980. - Vol. 141. -P. 362-365.

27. Barrett P.N., Berezuk G., Fritsch S. et al. Efficacy, safety, and immunogenicity of a Vero-cell-culture-derived trivalent influenza vaccine: a multicenter, double-blind, randomized, placebo-controlled trial //Lancet. - 2011. -Vol. 377. -N9767. -P. 751-759.

28. Beare A.S., Schild G.C., Craig J. W. Trials in man with live recombinants made from A/PR/8/34 (HO N1) and wild H3 N2 influenza viruses // Lancet. -1975. -Vol. 2. -N7938. -P. 729-732.

29. Bernstein D.I., Edwards K.M., Dekker C.L. et al. Effects of adjuvants on the safety and immunogenicity of an avian influenza H5N1 vaccine in adults // J. Infect. Dis.-2008. - Vol. 197. -P. 667-675.

30. Beyer W.E., Palache A.M., de Jong J.C., Osterhaus A.D. Cold-adapted live influenza vaccine versus inactivated vaccine: systemic vaccine reactions, local and systemic antibody response, and vaccine efficacy. A meta-analysis // Vaccine. -2002. - Vol. 20. -P. 1340-1353.

31. Blokhina E.A., Kuprianov VV, Stepanova L.A. et al. A molecular assembly system for presentation of antigens on the surface of HBc virus-like particles// Virology. - 2013. - Vol. 435. -N2.-P. 293-300.

32. Bresson J.L., Perronne C., Launay O. et al. Safety and immunogenicity of an inactivated split-virion influenza A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) vaccine: phase I randomized trial//Lancet. - 2006. - Vol. 367.-N9523.-P. 1657-1664.

33. Bright R.A., Carter D.M., Crevar C.J. et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle//PLoS One. - 2008. - Vol. 3. -P. el 501.

34. Bullough P.A., Hughson F.M., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of influenza hemagglutinin at the pH of membrane fusion // Nature. - 1994. - Vol. 371. -N6492. -P. 37-43.

35. Buonaguro L., Tornesello M.L., Tagliamonte M. et al. Baculovirus-derived human immunodeficiency virus type 1 virus-like particles activate dendritic cells and induce ex vivo T-cell responses // J. Virol. - 2006. - Vol. 80. - P. 91349143.

36. Carr C.M., Chaudhry C., Kim P.S. Influenza hemagglutinin is spring-loaded by a metastable native conformation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997. -Vol. 94. -N26. -P. 14306-14313.

37. Chen L.M., Blixt O., Stevens J. et al. In vitro evolution of H5N1 avian influenza virus toward human-type receptor specificity // Virology. - 2012. - Vol. 422. -P. 105-113.

38. Chen H., Li Y., Li Z. et al. Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in western China // J Virol. -2006. - Vol. 80. -P. 5976-5983.

39. Cobbin J.C., Verity E.E., Gilbertson B.P. et al. The source of the PB1 gene in influenza vaccine reassortants selectively alters the hemagglutinin content of the resulting seed virus // J. Virol.-2013. - Vol. 87. -N10.-P. 5577-5585.

40. Cox N.J., Kitame F., Kendal A.P. et al. Identification of sequence changes in the cold-adapted, live attenuated influenza vaccine strain, A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) // Virology. -1988. - Vol. 167. -N2.-P. 554-567.

41. Cox R.J., Brokstad K.A., Ogra P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines //Scand. J. Immunol. — 2004. - Vol.59. - P. 1-15.

42. Cumulative number of confirmed human cases for avian influenza A(H5N1) reported to WHO [Electronic resource] / - WHO. - 29 August 2013. -Accession mode: http://www.who.int/influenza/human_animal Jnterface/ENJGIP20130705Cumulativ eNumberH5Nleases 2.pdf free.

43. Daniels R.S., Downie J.C., Hay A.J. et al. Fusion mutants of the influenza virus hemagglutinin glycoprotein // Cell. - 1985. - Vol. 40. -N 2. - P. 431-439.

44. Desheva J.A., Lu X.H., Rekstin A.R. et al. Characterization of influenza A H5N2 reassortant as a candidate for live-attenuated and inactivated vaccines against highly pathogenic H5N1 viruses with pandemic potential // Vaccine. - 2006. - Vol. 24. -N47-48. -P. 6859-6866.

45. Egorov A.Yu., Medvedeva T.E., Polezhaev F.I. et al. Peculiarities of obtaining and characterization of a cold-adapted A/PR/8/34 influenza virus variant // Acta. Virol. - 1984. - Vol. 28-P. 19-25.

46. Ehrlich H.J., Muller M., Oh H.M. et al. A clinical trial of a whole-virus H5N1 vaccine derived from cell culture // N. Engl. J. Med. — 2008. - Vol. 358. - P. 2573-2584.

47. Eichelberger S.L., Sultana I., Gao J. et al. Potency under pressure: the impact of hydrostatic pressure on antigenic properties of influenza virus hemagglutinin // Influenza Other Respi. Viruses. - 2013. — in press.

48. Ernst W.A., Kim H.J., Tumpey T.M. et al. Protection against HI, H5, H6 and H9 influenza A infection with liposomal matrix 2 epitope vaccines // Vaccine. — 2006. - Vol. 24. -P. 5158-5168.

49. Ferko B., Stasakova J., Romanova J. et al. Immunogenicity and protection efficacy of replication-deficient influenza A viruses with altered NS1 genes //J Virol. - 2004. - Vol. 78. -N23.- P. 13037-13045.

120

50. Florent G., Lobmann M., Beare A.S., Zygraich N. RNAs of influenza virus recombinants derived from parents of known virulence for man //Arch. Virol. - 1977.

- Vol. 54. -N1-2. -P. 19-28.

51. Fodor E., Devenish L.J., Palese P. et al. Rescue of influenza A virus from recombinantDNA // J. Virol. - 1999. - Vol. 73. -P. 9679-9682.

52. Fulvini A.A., Ramanunninair M., Le J. et al. Gene constellation of influenza A virus reassortants with high growth phenotype prepared as seed candidates for vaccine production // PLoS One. - 2011. - Vol. 6. -N 6. -P. e20823.

53. Geeraedts F., Goutagny N., Hornung V. et al. Superior immunogenicity of inactivated whole virus H5N1 influenza vaccine is primarily controlled by Toll-like receptor signaling//PLoSPathog. - 2008. - Vol. 4. -P. el000138.

54. Geeraedts F., Saluja V, ter Veer W. et al. Preservation of the immunogenicity of dry-powder influenza H5N1 whole inactivated virus vaccine at elevated storage temperatures // AAPS J. -2010. - Vol. 12. -N2. - P. 215-222.

55. Ghendon Y.Z., Klimov A.I., Alexandrova G.I., Polezhaev F.I. Analysis of genome composition and reactogenicity of recombinants of cold-adapted and virulent virus strains//J. Gen Virol. -1981. - Vol. 53. -N2.-P. 215-224.

56. Golde W.T., Gollobin P., Rodriguez L.L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet // Lab. Anim. (NY). -2005. - Vol. 34. -N9.-P. 39-43.

57. Guidance for industry: clinical data needed to support the licensure of pandemic influenza vaccines. [Electronic resource] / Food and Drug Administration.

- 2007. - Access mode: http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegula torvlnformation/Guidances/Vaccines/ucm091985. pdf, free.

58. Guideline on dossier structure and content for pandemic influenza vaccine marketing authorization application (CPMP/VEG/4717/03). [Electronic resource] / European Committee for Proprietary Medicinal Products. - 30 May 2003. - Access mode:

121

http://www. ema. europa. eu/docs/en GB/document library/Scientific guideline/2009/ 10/WC500003993. vdf, free.

59. Ha Y., Stevens D.J., Shekel J.J., Wiley D.C. H5 avian and H9 swine influenza virus hemagglutinin structures: possible origin of influenza subtypes // EMBO J. - 2002. - Vol. 21. -N5.-P. 865-875.

60. Harvey R., Wheelerb J.X., Wallis C.L. et al. Quantitation of hemagglutinin in H5N1 influenza viruses reveals low hemagglutinin content of vaccine virus NIBRG-14 (H5N1) // Vaccine. - 2008. - Vol. 26. -N51. - P. 65506554.

61. Harvey R., Nicolson C., Johnson R.E. et al. Improved hemagglutinin antigen content in H5N1 candidate vaccine viruses with chimeric hemagglutinin molecules// Vaccine. - 2010. - Vol. 28. -N50. -P. 8008-8014.

62. Harvey R., Guilfoyle K.A., Roseby S. et al. Improved antigen yield in pandemic H1N1 (2009) candidate vaccine viruses with chimeric hemagglutinin molecules//J. Virol.-2011. - Vol. 85. -N12. -P. 6086-6090.

63. Hatta Y, Hatta M., Bilsel P. et al. An M2 cytoplasmic tail mutant as a live attenuated influenza vaccine against pandemic (H1N1) 2009 influenza virus // Vaccine.-2011. - Vol. 29. -N12. -P. 2308-2312.

64. Hayat M.A. Principles and Techniques of Electron Microscopy / Biological applications. 4-th ed. - Cambridge University Press. - 2000.

65. Herfst S., Schrauwen E.J., Linster M. et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets // Science. -2012. - Vol. 336. -N 6088. - P. 1534-1541.

66. Herlocher M.L., Clavo A.C., Maassab H.F. Sequence comparisons of AJAA/6/60 influenza viruses: mutations which may contribute to attenuation // Virus Res. - 1996. - Vol. 42. -N1-2. -P. 11-25.

67. Herlocher M.L., Maassab H.F., Webster R.G. Molecular and biological changes in the cold-adapted "master strain" A/AA/6/60 (H2N2) influenza virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1993. - Vol. 90. -N13. -P. 6032-6036.

122

68. Hoelscher M. A., Gar g S., Bangari D.S. et al. Development of adenoviral-vector-based pandemic influenza vaccine against antigenically distinct human H5N1 strains in mice //Lancet. -2006. - Vol. 367. -P. 475-481.

69. Hoffmann E., Krauss S., Perez D. et al. Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines // Vaccine. - 2002. - Vol. 20. - P. 3165-3170.

70. Hoffmann E., Neumann G., Kawaoka Y. et al. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2000. - Vol. 97.-Nil.-P. 6108-6113.

71. Horimoto T., Kawaoka Y. Biologic effects of introducing additional basic amino acid residues into the hemagglutinin cleavage site of a virulent avian influenza virus// Virus Research. - 1997. - Vol. 50. -P. 35-40.

72. Horimoto T., Murakami S., Muramoto Y. et al. Enhanced growth of seed viruses for H5N1 influenza vaccines // Virology. - 2007. - Vol. 366. - N 1. - P. 2327.

73. Horimoto, T., Takada, A., Fujii, K. et al. The development and characterization of H5 influenza virus vaccines derived from a 2003 human isolate // Vaccine. - 2006. - Vol. 24. -P. 3669-3676.

74. Huckriede A., Bungener L., ter Veer W. et al. Influenza virosomes: combining optimal presentation of hemagglutinin with immunopotentiating activity // Vaccine.-2003. - Vol. 21. -N9-10. -P. 925-931.

75. Imai M., Watanabe T., Hatta M. et al. Experimental adaptation of an influenza H5 HA confers respiratory droplet transmission to a reassortant H5 HAJH1N1 virus in ferrets//Nature. - 2012. - Vol. 486. -P. 420-428

76. Isakova-Sivak I., Chen L.M., Matsuoka Y. et al. Genetic bases of the temperature-sensitive phenotype of a master donor virus used in live attenuated influenza vaccines: A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) // Virology. - 2011. - Vol. 412. -N2.-P. 297-305.

77. Jin H., Lu B., Zhou H. et al. Multiple amino acid residues confer temperature sensitivity to human influenza virus vaccine strains (Flumist) derived

123

from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60 // Virology. - 2003. - Vol. 306. -Nl.-P. 1824.

78. Jin H., Zhou H., Lu B., Kemble G. Imparting temperature sensitivity and attenuation in ferrets to A/Puerto Rico/8/34 influenza virus by transferring the genetic signature for temperature sensitivity from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60 // J. Virol.-2004. - Vol. 78. -N2.-P. 995-998.

79. Johansson B.E., Bûcher D.J., Pokorny B.A. et al. Identification of PR8 Ml protein in influenza high-yield reassortants by Ml-specific monoclonal antibodies// Virology. -1989. - Vol. 171. -P. 634-636

80. Johannsen R., Moser H., Hinz J. et al. Quantification of hemagglutinin of influenza Tween-ether split vaccines by immunodiffusion // Vaccine. - 1985. - Vol. 3. -Suppl. 3. -P. 235-240.

81. de Jong M.D., Hien T.T. Avian influenza A (H5N1) // J. Clin. Virol. -2006. - Vol. 35. -Nl.-P. 2-13.

82. Karaca K., Swayne D.E., Grosenbaugh D. et al. Immunogenicity of fowlpox virus expressing the avian influenza virus H5 gene (TROVAC AIV-H5) in cats //Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 2005. - Vol. 12. -P. 1340-1342.

83. Karron R.A., Talaat K., Luke C. et al. Evaluation of two live attenuated cold-adapted H5N1 influenza virus vaccines in healthy adults // Vaccine. - 2009. -Vol. 27. -N36. -P. 4953-4960.

84. Kalendar R., Lee D., Schulman A.H. FastPCR Software for PCR Primer and Probe Design and Repeat Search // Genes, Genomes and Genomics. - 2009. -Vol. 3.-Nl.-P. 1-14.

85. Katz J.M., Lim W., Bridges C.B. et al. Antibody response in individuals infected with avian influenza A (H5N1) viruses and detection of anti-H5 antibody among household and social contacts // J. Infect. Dis. - 1999. — Vol. 180. - N 6. - P. 1763-1770.

86. Kawaoka Y, Webster R.G. Interplay between carbohydrate in the stalk and the length of the connecting peptide determines the cleavability of influenza virus hemagglutinin//J. Virol.-1989. - Vol. 63. -P. 3296-3300.

87. Keitel W.A., Campbell J.D., Treanor J.J. et al. Safety and immunogenicity of an inactivated influenza A/H5N1 vaccine given with or without aluminum hydroxide to healthy adults: results of a phase I-II randomized clinical trial // J. Infect. Dis. -2008. - Vol. 198. -P. 1309-1316.

88. Kendal A.P., Maassab H.F., Alexandrova G.I., Ghendon Y.Z. Development of cold-adapted recombinant live attenuated influenza A vaccines in the USA and USSR //Antiviral Research. - 1981. - Vol. 1. - P. 339-365.

89. Khurana S., Chearwae W, Castellino F. et al. Vaccines with MF59 adjuvant expand the antibody repertoire to target protective sites of pandemic avian H5N1 influenza virus//Sci. Transl. Med.-2010. - Vol. 2. -N15. -P. 15ra5.

90. Kilbourne E.D., Murphy J.S. Genetic studies of influenza viruses. I. Viral morphology and growth capacity as exchangeable genetic traits. Rapid in ovo adaptation of early passage Asian strain isolates by combination with PR8 // J. Exp. Med. -1960. - Vol. 111.-P. 387-406.

91. Kilbourne E.D., Schulman J.L., Schild G.C. et al. Related studies of a recombinant influenza-virus vaccine. I. Derivation and characterization of virus and vaccine//J. Infect. Dis. -1971. - Vol. 124. -N5.-P. 449-462.

92. Kistner O., Howard M.K., Spruth M. et al. Cell culture (Vero) derived whole virus (H5N1) vaccine based on wild-type virus strain induces cross-protective immune responses // Vaccine. -2007. - Vol. 25. - P. 6028-6036.

93. Klimov A.I., Cox N.J., Yotov W. V. et al. Sequence changes in the live attenuated, cold-adapted variants of influenza A/Leningrad/134/57 (H2N2) virus // Virology. -1992. - Vol. 186. -N2.-P. 795-797.

94. Klimov A. I., Kiseleva IV, Alexandrova G.I., Cox N.J. Genes coding for polymerase proteins are essential for attenuation of the cold-adapted

A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) influenza virus // International Congress Series. -2001. - Vol. 1219. -P. 955-959.

95. Krenn B.M., Egorov A., Romanovskaya-Romanko E. et al. Single HA2 mutation increases the infectivity and immunogenicity of a live attenuated H5N1 intranasal influenza vaccine candidate lacking NS1 // PLoS One. - 2011. - Vol. 6. -N4.-P. el8577.

96. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4// Nature. - 1970. - Vol. 227. -N 5259. -P. 680-685.

97. Landry N., Ward B.J., Trepanier S. et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza //PLoS One. - 2010. - Vol. 5. -P. el5559.

98. Larionova N., Kiseleva I., Dubrovina I. et al. Peculiarities of reassortment of a cold-adapted influenza A master donor virus with influenza A viruses containing hemagglutinin and neuraminidase of avian H5N1 origin // Influenza Other Respi. Viruses. -2011. - Vol. 5. - Suppl. l.-P. 328-394.

99. Levie K., Leroux-Roels I., Hoppenbrouwers K. et al. An adjuvanted, low-dose, pandemic influenza A (H5N1) vaccine candidate is safe, immunogenic, and induces cross-reactive immune responses in healthy adults // J. Infect. Dis. - 2008. -Vol. 198. -P. 642-649.

100. Li S., Liu C., Klimov A. et al. Recombinant influenza A virus vaccines for the pathogenic human A/Hong Kong/97(H5N1) viruses //J. Infect. Dis. - 1999. -Vol. 179. -P. 1132-1138.

101. Li C., Shao M., Cui X. et al. Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China // Biologicals. - 2010. - Vol. 38. -N2.-P. 284-289.

102. Low en A.C., Steel J., Mubareka S. et al. Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model // J. Virol. - 2009. - Vol. 83. -P. 2803-2818.

103. Lu X., Edwards L.E., Desheva J.A. et al. Cross-protective immunity in mice induced by live-attenuated or inactivated vaccines against highly pathogenic influenza A (H5N1) viruses// Vaccine. - 2006. - Vol. 24. -P. 6588-6593.

104. Lu X., Tumpey T.M., Morken T. et al. A mouse model for the evaluation of pathogenesis and immunity to influenza A (H5N1) viruses isolated from humans // J. Virol. -1999. - Vol. 73. -P. 5903-5911.

105. Maassab H. F. Adaptation and growth characterization of influenza virus at 25°C//Nature. -1967.- Vol. 213. -P. 612-614.

106. Maassab H.F., Bryant M.L. The development of live attenuated cold-adapted influenza virus vaccine for humans // Rev. Med. Virol. - 1999. - Vol. 9. - N 4. -P. 237-244.

107. Maeda T., Ohnishi S. Activation of influenza virus by acidic media causes hemolysis and fusion of erythrocytes // FEBS Lett. - 1980. - Vol. 122. — N2. — P. 283-287.

108. Mallick A.I., Parvizi P., Read L.R. et al. Enhancement of immunogenicity of a virosome-based avian influenza vaccine in chickens by incorporating CpG-ODN// Vaccine. -2011. - Vol. 29. -N8.-P. 1657-1665.

109. Matrosovich M., Tuzikov A., Bovin N. et al. Early alterations of the receptor-binding properties of HI, H2, and H3 avian influenza virus hemagglutinins after their introduction into mammals //J. Virol. - 2000. - Vol. 74. -N18. - P. 85028512.

110. Morokutti A., Wolschek M., Ferko B. et al. A novel type of influenza vaccine: safety and immunogenicity of replication-deficient influenza virus created by deletion of the interferon antagonist NS1 //J. Infect. Dis. - 2010. - Vol. 201. -N 3. -P. 354-362.

111. Murakami S., Horimoto T., Ito M. et al. Enhanced growth of influenza vaccine seed viruses in vero cells mediated by broadening the optimal pH range for virus membrane fusion //J. Virol. - 2012. - Vol. 86. -N3. - P. 1405-1410.

112. Nakowitsch S., Wolschek M., Morokutti A. et al. Mutations affecting the stability of the hemagglutinin molecule impair the immunogenicity of live attenuated H3N2 intranasal influenza vaccine candidates lacking NS1 // Vaccine. - 2011. - Vol. 29.-N19. -P. 3517-3524.

113. Neumann G., Watanabe T., Ito H. et al. Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1999. - Vol. 96. -P. 9345-9350.

114. Neumann G., Zobel A., Hobom G. RNA polymerase I-mediated expression of influenza viral RNA molecules // Virology. - 1994. - Vol. 202. - P. 477479.

115. Nicholson K.G., Colegate A.E., Podda A. et al. Safety and antigenicity of non-adjuvanted and MF59-adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97 (H5N3) vaccine: a randomized trial of two potential vaccines against H5N1 influenza // Lancet.-2001. - Vol. 357. -P. 1937-1943.

116. Nicolson C., Major D., Wood J.M., Robertson J.S. Generation of influenza vaccine viruses on Vero cells by reverse genetics: an H5N1 candidate vaccine strain produced under a quality system // Vaccine. - 2005. - Vol. 23. - N 22. -P. 2943-2952.

117. Nolan T.M., Richmond P.C., Skeljo M.V et al. Phase I and II randomized trials of the safety and immunogenicity of a prototype adjuvanted inactivated split-virus influenza A (H5N1) vaccine in healthy adults // Vaccine. — 2008. - Vol. 26. -P. 4160-4167.

118. Note for guidance on harmonization of requirements for influenza vaccines (CPMP/BWP/214/96). [Electronic resource] / European Committee for Proprietary Medicinal Products. - 12 March 1997. - Access mode: http://www. ema. europa. eu/docs/en_GB/document library/Scientific_guideline/2009/ 09/WC500003945. pdf, free.

119. Nurpeysova A., Khairullin B., Kassenov M. et al. Preclinical testing of Kazfluvac, a vaccine against pandemic influenza A/HSNlv //J. Pharm. Biomed. Sci. -2011. - Vol. 1. -P. 108-112.

120. Palese P., Schulman JL. Mapping of the influenza virus genome: identification of the hemagglutinin and the neuraminidase genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1976. - Vol. 73. -N6.-P. 2142-2146.

121. Partridge J., Kieny M.P.; World Health Organization H1N1 influenza vaccine Task Force. Global production of seasonal and pandemic (H1N1) influenza vaccines in 2009-2010 and comparison with previous estimates and global action plan targets// Vaccine. - 2010. - Vol. 28. -N30. -P. 4709-4712.

122. Peterson G.L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable // Anal. Biochem. - 1977. - Vol. 83. - N 2. -P. 346-356.

123. Pettersen E.F., Goddard T.D., Huang C.C. et al. UCSF Chimera—a visualization system for exploratory research and analysis // J. Comput. Chem. -2004. - Vol. 25. -N13. -P. 1605-1612.

124. Plant E.P., Liu T.M., Xie H., Ye Z. Mutations to A/Puerto Rico/8/34 PB1 gene improves seasonal reassortant influenza A virus growth kinetics // Vaccine. -2012. - Vol. 31. -Nl.-P. 207-212.

125. Pleschka S., Jaskunas S.R., Engelhardt O.G. et al. A plasmid-based reverse genetics system for influenza A virus // J. Virol. - 1996. - Vol. 70. - P. 41884192.

126. Quan F.S., Kim Y.C., Yoo D.G. et al. Stabilization of influenza vaccine enhances protection by microneedle delivery in the mouse skin // PLoS One. - 2009. - Vol. 4.-N9.-P. e7152.

127. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints//Am. J. Hygiene. - 1938. - Vol. 27. -P. 493-497.

128. Reed M.L., Bridges O.A., Seiler P. et al. The pH of activation of the hemagglutinin protein regulates H5N1 influenza virus pathogenicity and transmissibility in ducks //J. Virol.-2010. - Vol. 84. -N3.-P. 1527-1535.

129. Reed M.L., Yen H.L., DuBois R.M. et al. Amino acid residues in the fusion peptide pocket regulate the pH of activation of the H5N1 influenza virus hemagglutinin protein//J. Virol.-2009. - Vol. 83. -N8. -P. 3568-3580.

130. Robertson J.S., Nicolson C., Harvey R. et al. The development of vaccine viruses against pandemic A(H1N1) influenza // Vaccine. - 2011. - Vol. 29 . -N9.-P. 1836-1843.

131. Roethl E., Gassner M., Krenn B.M. et al. Antimycotic-antibiotic amphotericin B promotes influenza virus replication in cell culture //J. Virol. - 2011. - Vol. 85.-N21.-P. 11139-11145.

132. Rogers G.N., Paulson J.C., Daniels R.S. et al. Single amino acid substitutions in influenza hemagglutinin change receptor binding specificity // Nature. -1983. - Vol. 304. - P. 76-78.

133. Romanova J., Krenn B.M., Wolschek M. et al. Preclinical evaluation of a replication-deficient intranasal DeltaNSlH5Nl influenza vaccine // PLoS One. -2009. - Vol. 4.-N6.-P. e5984.

134. Rudenko L., Desheva J., Korovkin S. et al. Safety and immunogenicity of live attenuated influenza reassortant H5 vaccine (phase I-II clinical trials) // Influenza Other Respi. Viruses. - 2008. - Vol. 2.-N6.-P. 203-209.

135. Rudenko L., Katlinsky A. Evaluation of Russian live attenuated vaccine H5N2 in clinical trials. [Electronic resource] / 3rd WHO meeting on evaluation of pandemic influenza prototype vaccines in clinical trials. - WHO, Geneva. - 15-16 February 2007. - Accession mode: http://www.who, int/entitv/vaccine research/diseases/influenza/160207_Rudenko.pdf, free.

136. Rudneva I.A., Sklyanskaya E.I., Barulina O.S. et al. Phenotypic expression of HA-NA combinations in human-avian influenza A reassortants // Arch. Virol. - 1996. - Vol. 141. -P. 1091-1099.

137. Rudneva I.A., Timofeeva T.A., Shilov A.A. et al. Effect of gene constellation and postreassortment amino acid change on the phenotypic features of H5 influenza virus reassortants //Arch. Virol. - 2007. - Vol. 152. - N 6. - P. 11391145.

138. Ruigrok R.W., Wrigley N.G., Calder L.J. et al. Electron microscopy of the low pH structure of influenza virus hemagglutinin // EMBO J. - 1986. - Vol. 5. -Nl.-P. 41-49.

139. Russell C.A., Fonville J.M., Brown A.E. et al. The potential for respiratory droplet-transmissible A/H5N1 influenza virus to evolve in a mammalian host//Science. - 2012. - Vol. 336. -N6088. -P. 1541-1547.

140. Russell R.J., Kerry P.S., Stevens D.J. et al. Structure of influenza hemagglutinin in complex with an inhibitor of membrane fusion // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2008. - Vol. 105. -N46. -P. 17736-17741.

141. Sambhara S., Kurichh A., Miranda R. et al. Heterosubtypic immunity against human influenza A viruses, including recently emerged avian H5 and H9 viruses, induced by FLU-ISCOM vaccine in mice requires both cytotoxic T-lymphocyte and macrophage function. // Cell Immunol. - 2001. - Vol. 211. - N 2. — P. 143-153.

142. Sato S.B., Kawasaki K, Ohnishi S. Hemolytic activity of influenza virus hemagglutinin glycoproteins activated in mildly acidic environments // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1983. - Vol. 80. -Nil. -P. 3153-3157.

143. Schickli J.H., Flandorfer A., Nakaya T. et al. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates // Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. - 2001. - Vol. 356. -P. 1965-1973

144. Schild G.C., Wood J.M., Newman R.W A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of influenza hemagglutinin antigen. Proposals for an assay

131

method for the hemagglutinin content of influenza vaccines // Bull World Health Organ. - 1975. - Vol. 52. -N2.-P. 223-231.

145. Scholtissek C. Stability of infectious influenza A viruses to treatment at low pH and heating//Arch. Virol. - 1985. - Vol. 85. -P. 1-11.

146. Scholtissek C. Stability of infectious influenza A viruses at low pH and at elevated temperature // Vaccine. - 1985. - Vol. 3. - P. 215-218.

147. Schulman J.L., Palese P. Selection and identification of influenza virus recombinants of defined genetic composition //J. Virol. - 1976. - Vol. 20. - N1. - P. 248-254.

148. Seibert C.W., Rahmat S., Krausel J.C. et al. Recombinant IgA is sufficient to prevent influenza virus transmission in guinea pigs //J. Virol. — 2013. -Vol. 87. -N14. -P. 7793-7804.

149. Skehel J.J., Bay ley P.M., Brown E.B. et al. Changes in the conformation of influenza virus hemagglutinin at the pH optimum of virus-mediated membrane fusion//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1982. - Vol. 79. -P. 968-972.

150. Skehel J. J., Wiley D.C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin // Annu. Rev. Biochem. - 2000. - Vol. 69. - P. 531-569.

151. Smeenk C.A., Wright K.E., Burns B.F. et al. Mutations in the hemagglutinin and matrix genes of a virulent influenza virus variant, AJFM/1/47-MA, control different stages in pathogenesis // Virus Res. - 1996. - Vol. 44. - N 2. - P. 79-95.

152. Smith L.R., Wloch M.K., Ye M. et al. Phase 1 clinical trials of the safety and immunogenicity of adjuvanted plasmid DNA vaccines encoding influenza A virus H5 hemagglutinin // Vaccine. - 2010. - Vol. 28. -P. 2565-2572.

153. Steinhauer D A., Wharton S. A., Skehel J. J. et al. Amantadine selection of a mutant influenza virus containing an acid-stable hemagglutinin glycoprotein: evidence for virus-specific regulation of the pH of glycoprotein transport vesicles // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991. - Vol. 88. -P. 11525-11529.

132

154. Stephenson I., Wood J.M., Nicholson K.G. et al. Detection of anti-H5 responses in human sera by HI using horse erythrocytes following MF59-adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97 vaccine// Virus Res. - 2004. - Vol. 103. - P. 91-95.

155. Stray S.J., Air G.M. Apoptosis by influenza viruses correlates with efficiency of viral mRNA synthesis // Virus Res. - 2001. - Vol. 77. - P. 3—17.

156. Subbarao K., Klimov A., Katz J. et al. Characterization of an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness // Science. -1998. - Vol. 279. -P. 393-396.

157. Sugita Y., Noda T., Sagara H., Kawaoka Y. Ultracentrifugation Deforms Unfixed Influenza A Virions // J. Gen. Virol. - 2011. - Vol. 92. - P. 24852493.

158. Suguitan Jr.A.L., McAuliffe J., Mills K.L. et al. Live, attenuated influenza A H5N1 candidate vaccines provide broad cross-protection in mice and ferrets//PLoSMed. - 2006. - Vol. 3. -P. e360.

159. Sun Y., Bi Y., Pu J. et al. Guinea pig model for evaluating the potential public health risk of swine and avian influenza viruses // PLoS One. - 2010. -Vol. 5. -P. el5537.

160. Sylte M.J., Hubby B., Suarez D.L. Influenza neuraminidase antibodies provide partial protection for chickens against high pathogenic avian influenza infection// Vaccine. - 2007. - Vol. 25. -P. 3763-3772.

161. Takada A., Kuboki N., Okazaki K. et al. Avirulent avian influenza virus as a vaccine strain against a potential human pandemic //J. Virol. - 1999. - Vol. 73. -N10.-P. 8303-8307.

162. Talbot H.K., Keitel W., Cate T.R. et al. Immunogenicity, safety and consistency of new trivalent inactivated influenza vaccine // Vaccine. - 2008. - Vol. 26. -N32. -P. 4057-4061.

163. Tamura K., Peterson D., Peterson N. et al. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance,

and Maximum Parsimony Methods // Mol. Biol. Evol. - 2011. - Vol. 28. - N10. - P. 2731-2739.

164. Treanor J.J., Betts R.F., Smith G.E. et al. Evaluation of a recombinant hemagglutinin expressed in insect cells as an influenza vaccine in young and elderly adults//J. Infect. Dis. -1996. - Vol. 173. -P. 1467-1470.

165. Treanor J.J., Campbell J.D., Zangwill K.M. et al. Safety and immunogenicity of an inactivated subvirion influenza A (H5N1) vaccine // N. Engl. J. Med.-2006. - Vol. 354. -P. 1343-1351.

166. Treanor J.J., Wilkinson B.E., Masseoud F. et al. Safety and immunogenicity of a recombinant hemagglutinin vaccine for H5 influenza in humans // Vaccine.-2001. - Vol. 19. -P. 1732-1737.

167. Ulmer J.B., Donnelly J.J., Parker S.E. et al. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein // Science. - 1993. -Vol. 259. -P. 1745-1749.

168. Van Hoeven N., Belser J.A., Szretter K.J. et al. Pathogenesis of 1918 pandemic and H5N1 influenza virus infections in a guinea pig model: antiviral potential of exogenous alpha interferon to reduce virus shedding // J. Virol. - 2009. -Vol. 83. -P. 2851-2861.

169. Vareckova E., Mucha V, Wharton S.A., Kostolansky F. Inhibition of fusion activity of influenza A hemagglutinin mediated by HA2-specific monoclonal antibodies//Arch. Virol. -2003. - Vol. 148. -P. 469-486.

170. Veits J., Wiesner D., Fuchs W. et al. Newcastle disease virus expressing H5 hemagglutinin gene protects chickens against Newcastle disease and avian influenza//PNAS USA.-2006. - Vol. 103. -P. 8197-8202.

171. Wacheck V, Egorov A., Groiss F. et al. A novel type of influenza vaccine: safety and immunogenicity of replication-deficient influenza virus created by deletion of the interferon antagonist NS1 if J. Infect. Dis. - 2010. - Vol. 201. -N 3. -P. 354-362.

172. Wanitchang A., Kramyu J., Jongkaewwattana A. Enhancement of reverse genetics-derived swine-origin H1N1 influenza virus seed vaccine growth by inclusion of indigenous polymerase PB1 protein // Virus Res. - 2010. - Vol. 147. -N 1. -P. 145-148.

173. Watanabe S., Watanabe T., Kawaoka Y. Influenza A virus lacking M2 protein as a live attenuated vaccine // J. Virol. - 2009. - Vol. 83. — Nil. - P. 59475950.

174. Watanabe T., Watanabe S., Kida H., Kawaoka Y. Influenza A virus with defective M2 ion channel activity as a live vaccine // Virology. - 2002. - Vol. 299. -N2.-P. 266-270.

175. Watanabe T., Watanabe S., Kim J.H. et al. Novel approach to the development of effective H5N1 influenza A virus vaccines: use of M2 cytoplasmic tail mutants//J. Virol.-2008. - Vol. 82. -N5.-P. 2486-2492.

176. Webby R.J., Perez D.R., Coleman J.S. et al. Responsiveness to a pandemic alert: use of reverse genetics for rapid development of influenza vaccines // Lancet. - 2004. - Vol. 363. -N9415. -P. 1099-1103.

177. Wei C.J., Xu L., Kong W.P. et al. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus //J. Virol. - 2008. - Vol. 82. -N13.- P. 6200-6208.

178. Weldon W.C., Wang B.Z., Martin M.P. et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin // PLoS One. - 2010. - Vol. 5. -N9.-P. el2466.

179. Wiley D.C., Skehel J.J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus // Annu. Rev. Biochem. - 1987. - Vol. 56. -P. 365-394.

180. Wilson I.A., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution // Nature. -1981. - Vol. 289. -N5796. -P. 366-373.

181. Wood J.M. Developing vaccines against pandemic influenza // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. -2001. - Vol. 356. -N1416. -P. 1953-1960.

182. Wood J.M., Major D., Daly J. et al. Vaccines against H5N1 influenza // Vaccine. - 2000. - Vol. 18. -P. 579-580.

183. Wood J.M., Major D., Newman R.W. et al. Preparation of vaccines againstH5N1 influenza// Vaccine. -2002. - Vol. 20.-Suppl. 2. - P. S84-S87.

184. Wood J.M., Schild G.C., Newman R.W., Seagroatt V. An improved single-radial-immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: application for potency determinations of inactivated whole virus and subunit vaccines//J. Biol. Stand. -1977. - Vol. 5. - N 3. - P. 237-247.

185. Wressnigg N., Voss D., Wolff T. et al. Development of a live-attenuated influenza B DeltaNSl intranasal vaccine candidate // Vaccine. - 2009. - Vol. 27. -N 21. -P. 2851-2857.

186. Wright P. F., Thompson J., Vaughn W.K. et al. Trials of influenza A/New Jersey/76 virus vaccine in normal children: an overview of age-related antigenicity and reactogenicity // J. Infect. Dis. -1977. - Vol. 136. - Suppl. - P. S731-S741.

187. Xiong X., Coombs P. J., Martin S.R. et al. Receptor binding by a ferret-transmissible H5 avian influenza virus //Nature. - 2013. - Vol. 497. - N 7449. - P. 392-396.

188. Zaharatos G.J., Yu J., Pace C. et al. HIV-1 and influenza antigens synthetically linked to IgG2a Fc elicit superior humoral responses compared to unmodified antigens in mice// Vaccine. - 2011. - Vol. 30. - P. 42-50.

189. Zaraket H., Bridges O.A., Duan S. et al. Increased Acid Stability of the Hemagglutinin Protein Enhances H5N1 Influenza Virus Growth in the Upper Respiratory Tract but Is Insufficient for Transmission in Ferrets // J. Virol. - 2013. -Vol. 87. -N17.-P. 9911-9922.

190. Zaraket H., Bridges O.A., Russell C.J. The pH of activation of the hemagglutinin protein regulates H5N1 influenza virus replication and pathogenesis in mice//J. Virol.-2013. - Vol. 87. -N9.-P. 4826-4834.

136

191. Zhao G., Lin Y., Du L. et al. An M2e-based multiple antigenic peptide vaccine protects mice from lethal challenge with divergent H5N1 influenza viruses // Virol. J. - 2010. - Vol. 7. -P. 9.

192. Zhou B., Donnelly M.E., Scholes D.T. et al. Single reaction genomic amplification accelerates sequencing and vaccine production for classical and swine origin human influenza A viruses // J. Virol. - 2009. - Vol. 83. - N19. - P. 1030910313.