Повышение эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий на основании дифференцированного подхода к выполнению вспомогательного хетчинга тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.01, кандидат наук Ибрагимова Эспет Омарбековна

• Ибрагимова Эспет Омарбековна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Ибрагимова Эспет Омарбековна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1.Роль вспомогательного хетчинга в программах лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий (обзор литературы)

1.1 Актуальность проблемы бесплодия

1.2 Понятие хетчинга

1.3 Причины неудач спонтанного хетчинга

1.4 Показания к проведению вспомогательного хетчинга и его эффективность

1.5 Методы выполнения вспомогательного хетчинга

1.6 Осложнения вспомогательного хетчинга

ГЛАВА 2.Материалы и методы исследования

2.1 Дизайн исследования для задачи

2.2. Дизайн исследования для задач

2.3. Дизайн исследования для задачи-4

2.4 Критерии включения в исследование

2.5 Расчет объема выборки

2.6 Методы исследования

2.6.1 Общеклинические методы исследования

2.6.2. Ультразвуковое исследование органов малого таза

2.6.3 Гормональное исследование

2.6.4 Исследование эякулята

2.6.5 Стимуляция функции яичников и трансвагинальная пункция фолликулов

2.6.6 Морфологическая оценка ооцитов и оплодотворение

2.6.7 Оценка качества бластоцист

2.6.8. Определение наличия спонтанного хетчинга

2.6.9. Изучение экспрессии генов CTSL-2, GATA3, CGB, HLA-G

2.6.10 Перенос эмбрионов в полость матки и ведение посттрансферного

периода

2.7 Статистическая обработка полученных данных

ГЛАВА 3. Предикторы эффективности спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах вспомогательных репродуктивных

технологий

3.1. Роль эмбриональных факторов в генезе неудач спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ

3.2 Роль качества гамет в эффективности спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ

3.3 Роль качества эмбрионов и криоконсервации в эффективности спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ

3.4 Определение клинико-лабораторных факторов, влияющих на эффективность спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ

3.5. Роль эмбриональных факторов (экспрессия генов СТБЬ2, ОЛТЛЗ, СОВ) в генезе неудач спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ

3.6. Модель прогноза эффективности спонтанного хетчинга бластоцист

человека в программах ВРТ

ГЛАВА 4. Исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток в зависимости от наличия и вида

вспомогательного хетчинга

4.1. Клинико-анамнестические данные пациентов

4.2 Лабораторные данные пациентов

4.3. Особенности протоколов стимуляции суперовуляции

4.4. Характеристика оогенеза и раннего эмбриогенеза

4.5. Клинико-лабораторные показания к проведению вспомогательного хетчинга

4.6. Исходы программ ВРТ

80

ГЛАВА 5. Обсуждение полученных результатов

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Преимплантационные эмбрионы человека ранних стадий развития окружены оболочкой, которая носит название блестящей оболочки (от англ. - zonapellucida - ZP)(1). В процессе имплантации эмбрион человека внутри полости матки должен освободиться от ZP, чтобы клетки трофэктодермы (ТФЭ) вступили в непосредственный контакт с люминальным эпителием эндометрия. Выход эмбриона из ZP обозначается термином хетчинг (от англ. hatching - «вылупление»)(2). По имеющимся данным, 50-75% всех морфологически нормальных бластоцист человека не способны к самостоятельному выходу из ZP(2). Отсутствие спонтанного хетчинга является одной из причин неудачи имплантации(З). При затруднении спонтанного хетчинга, а также по ряду принятых показаний (возраст пациентки старше 35 лет, 3 и более неудачные попытки экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) с переносом эмбрионов хорошего качества в анамнезе, изменение морфологии блестящей оболочки, использование криоконсервированных эмбрионов)выполняется процедура вспомогательного хетчинга бластоцист(4,5).В настоящее время большое внимание уделяется генетическим причинам неудач хетчинга.Изучение генов, экспрессирующихся в трофэктодерме бластоцисты, таких как ген катепсинов(СТЗЬ), ген семейства транскрипционных факторов (GATA), Р-субъединицы хорионического гонадотропина (CGB), является перспективным направлением для дальнейших исследований.

Наибольшее распространение в практике программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) получили методы частичного удаленияZP: механический, химический(б) и лазерный хетчинг (7,8). При данных методах оболочка частично надсекаетсяв случайном месте, и

бластоциставыходит из 7Р самостоятельно, затрачивая на это время. Кроме того, данные методы вспомогательного хетчинга несут риск разрыва клеток эмбриобласта,что может способствовать формированию многоплодных беременностей(9).

Принципиально новым подходом к вспомогательному хетчингу является технология ферментативного хетчинга. Преимуществамиданного метода является полное удаление 7Р,что экономит время бластоцисты на вылупление,и не приводит к механическому разделению клеток, формирующих эмбрион, что позволяет проводить профилактику монозиготных беременностей в программахВРТ при переносе одной морфологически нормальной бластоцисты(10).

Согласно имеющимся на сегодняшний день данным, новая эмбриологическая технология полного удаления блестящей оболочки может способствовать увеличению частоты наступления беременности в программахВРТ. Бластоциста без блестящей оболочки сразу после ее переноса в полость матки контактирует с клетками эндометрия в период имплантации, что способствует успешному наступлению беременности.

Степень разработанности темы исследования

Неспособность эмбриона к совершению спонтанного хетчинга может быть одним из факторов, приводящих к отсутствию самостоятельной беременности и неудачам ЭКО. Вспомогательный хетчинг является методикой, разработанной с целью повышения частоты имплантации эмбриона в программах ВРТ (4,11). Однако, в настоящее время не до конца изучены необходимость и показания для проведения вспомогательного хетчинга, а также недоказанной является роль вспомогательного хетчинга в развитии монозиготной беременности в программах ВРТ.

Цель исследования

Целью исследования является изучениеклинико-лабораторных и клеточно-молекулярных предикторов спонтанного хетчинга, а также роли различных видов вспомогательного хетчинга в повышении эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий.

Задачи исследования

1. Оценить роль эмбриональных и клинико-лабораторных данных пациентов программ ВРТ в генезе неудач спонтанного хетчинга бластоцист.

2. Определить клинико-лабораторные показания к вспомогательному хетчингу бластоцист у пациентов с бесплодием в программах ВРТ.

3. Изучить параметры оогенеза и раннего эмбриогенеза в группах с наличием и отсутствием вспомогательного хетчинга бластоцист, а также в группах с частичным и полным удалением зоны пеллюцида.

4. Оценить результаты программ ВРТв зависимости от проведения и вида вспомогательного хетчинга бластоцист.

5. На основании выявленных эмбриональных и клинико-лабораторных предикторов эффективности спонтанного и вспомогательного хетчингаразработать алгоритмприменения вспомогательного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ.

Научная новизна

Были определены эмбриональные и клинико-лабораторные факторы, влияющие на эффективность спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ.

Были выявлены клинико-лабораторные показания для вспомогательного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ.

Была доказана роль полного удаления зоны пеллюцида в повышении эффективности программ ВРТ и снижении риска многоплодной беременности.

Практическая значимость

На основании выявленных эмбриональных и клинико-лабораторных предикторов спонтанного хетчинга была создана формула расчета вероятности эффективности спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ.

На основанииоценки эффективности программ ВРТ в зависимости от проведения вспомогательного хетчинга были определены клинико-лабораторные показания к проведению вспомогательного хетчинга в программах ВРТ.

На основании выявленных ятрогенных факторов, способствующих нарушению спонтанного, и влияющих на проведение вспомогательного хетчинга, были предложены схемы стимуляции суперовуляции, направленные на повышение эффективности спонтанного хетчинга бластоцист в программах ВРТ.

Была апробирована технология полного удаления зоны пеллюцида, направленная на увеличение эффективности программ ВРТ и снижения риска многоплодной беременности.

Методология и методы исследования

Проведено обследование 309 супружеских пар с бесплодием различного генеза, подписавших добровольное информированное согласие на участие в исследовании, на базе ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И.

Кулакова» Минздрава России. На основании вида и наличия вспомогательного хетчинга бластоцист пациентки были разделены на 2 группы. На втором этапе были изучены 83бластоцисты от супружеских пар, проходящих лечение бесплодия в программах ВРТ и донировавших их для научных исследований. Бластоцисты были поделены на 2 группы в зависимости от наличия спонтанного хетчинга.

Перед началом программы ВРТ всем пациенткам проведено полное клинико-лабораторное обследование в соответствии с приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации № 107н.

Оценка эмбрионов проводилась согласно классификации Гарднера («модифицированная» классификация D. Gardner). Из специальных методов обследование исследования проводилось оценка экспрессии генов CTSL-2, GATA3, CGB, HLA-G методом ПЦР-РВ, оценка степени зрелости, качества ооцитов, толщины блестящей оболочки, выявление различных дисморфизмов ооцитов, оценка качества эмбрионов и мониторинг хетчинга с определением наличия ТЭО при помощи световой микроскопии.

Положения, выносимые на защиту

1. В программах ВРТ эффективность спонтанного хетчинга связана с качеством полученных бластоцист, что определяется эмбриональными факторами: наличием экстрацитоплазматических дисморфизмов ооцитов и более высокой экспрессией мРНК геновCTSL2,GATA3и CGBбластоцистами/ и клинико-лабораторными данными пациенток:более низким уровнем ФСГ и более редким назначением хорионического гонадотропина в качестве триггера овуляции.

2. При вспомогательном хетчинге в виде полного удаления зоны пеллюцида частота наступления беременности увеличивается в 1,9 раз по сравнению с частичным удалением зоны пеллюцида или его отсутствием, а

риск монозиготной многоплодной беременности снижается в 2 раза по сравнению с отсутствием хетчинга и в 5,7 раз по сравнению с частичным удалением зоны пеллюцида.

3. Показаниями для вспомогательного хетчинга бластоцист в программах ВРТ являются уровень АМГ менее 2 нг/мл и число полученных бластоцист менее 4, что связано с влиянием указанных факторов на качество полученных бластоцист и их способность к спонтанному хетчингу, и имплантации.Отсутствие вспомогательного хетчинга при наличии к нему показаний снижает частоту живорождения в 1,9 раз, а вспомогательный хетчинг при отсутствии к нему показаний увеличивает риск монозиготной многоплодной беременности в 6 раз.

Личный вклад автора

Автор участвовал в выборе темы научной работы, разработке цели и задач исследования, в проведении и интерпретации результатов лабораторных исследований, в обобщении и статистической обработке полученных данных. Автором лично осуществлялось как обследование,так и ведение супружеских пар на всех этапах лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКО/ПЭ).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 - «акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 4 и 5 паспорта акушерства и гинекологии.

Апробация результатов

Работа обсуждена на межклинической конференции отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия имени проф. Б.В. Леонова (09.11.2017г.) и заседании апробационной комиссии ФГБУ «НМИЦАГП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России (13.11.2017г.).

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены и используются в практической работе отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия имени профессора Б.В. Леонова (заведующий - д.м.н., доцент Калинина Е.А.), лаборатории молекулярно-генетических методов (заведующий -к.м.н. Донников А.Е.) ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (директор - академик РАН Сухих Г.Т.). Материалы и результаты исследования включены в лекции и практические занятия для клинических ординаторов и аспирантов ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.

Результаты исследования изложены в 10 научных трудах, из них 3 - в рецензируемых научных изданиях, и 1 - в зарубежном журнале «7у§о1а» (ИФ=1,37).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из оглавления, списка принятых сокращений, введения, обзора литературы, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа представлена на 115 страницах, иллюстрирована 15 рисунками и 18 таблицами. Библиографический указатель включает 15работ на русском языке и 87 работы на английском языке.

Глава 1. РОЛЬ ВСПОМОГАТЕЛЬНОГО ХЕТЧИНГАВ ПРОГРАММАХ ЛЕЧЕНИЯ БЕСПЛОДИЯ МЕТОДАМИ

ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

(обзор литературы)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Повышение эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий на основании дифференцированного подхода к выполнению вспомогательного хетчинга»

1.1. Актуальность проблемы бесплодия

Бесплодие - серьезная проблема репродуктологии, при которой имеется крайне редкое сочетание социального, психического неблагополучия и практически всегда физического нездоровья в семье.Причиной бесплодия, согласно статистическим данным, в 30% случаев является так называемый «женский фактор», в 30% - «мужской фактор», в 25% - сочетание «мужского и женского факторов».В 15% случаев причину бесплодия установить не удаётся. Причины женского бесплодия, как правило,представляют собой отсутствие или нарушение проходимости маточных труб, отсутствие овуляции, а также генитальный эндометриоз(12). Мужской фактор бесплодия является следствиемнарушения сперматогенеза, приводящий к отсутствию или снижениюконцентрации сперматозоидов,снижению подвижности сперматозоидов, повышению доли морфологически аномальных форм, и соответственно, снижению их оплодотворяющей способности. Также бесплодие умужчин может быть связано с нарушением транспорта сперматозоидов посемявыносящим протокам.

Долябесплодных браков в России превышает 15%, что, по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), является критическим уровнем. Отсутствие ребенка в семье приводит к социально-психологическому дискомфорту супругов, конфликтным ситуациям в семье, росту числа разводов и, соответственно, к снижению качества жизни. В настоящее время эффективное лечение бесплодия невозможно

без применения современных методов ВРТ, благодаря которымпроизошла революция в борьбе с бесплодием(13).

Методы ВРТ включают все виды лечения бесплодия, такие как:

-искусственную инсеминацию спермой мужа (партнера) или донора;

-ЭКО и перенос «свежих» или криоконсервированных эмбрионов в полость матки;

- ИКСИ (отангл. ICSI - Intra Cytoplasmic Sperm Injection);

-ПИКСИ (методика дополнительного отбора сперматозоидов для использования их в процедуре ИКСИ);

-донорские программы (донорство ооцитов, донорство спермы);

- суррогатное материнство;

-преимплантационную генетическую диагностику (ПГД) и преимплантационный генетический скрининг (ПГС) наследственных болезней и анеуплоидий de novo(5).

В последние годы, несмотря науспешное развитие методов ВРТ,вопросы повышения эффективности лечения бесплодия в программах ЭКОостаются по-прежнему актуальными. По данным GunbiJ, с соавторами (14), только треть циклов ВРТ приводит к развитию беременности и около четвертииз них- к рождению ребенка. Самым простым подходом к повышению этих показателей является перенос одновременно нескольких эмбрионов, однако, это сопряжено с высокой вероятностью развития многоплодной беременности (15,16).

Основное влияние на частоту имплантации оказывает качество эмбрионов. Многочисленные усилия были направлены на улучшение результативности ВРТ путем оптимизации условий культивирования эмбрионов. Этого добились за счет увеличения времени культивирования эмбрионов до стадии бластоцисты, морфологической оценки качества эмбрионов методом time lapse (непрерывная фотосъемка развития эмбриона до переноса в полость матки), улучшения культуральных сред, внедрения ПГД и ПГС.

Качество эмбрионов напрямую зависит от качества гамет, участвующих в оплодотворении. Так, идеальный зрелый ооцит должен иметь однородную цитоплазму, одно полярное тельце, адекватную толщину блестящей оболочки и перивителлинового пространства (17). В ряде исследований была выявлена отрицательная корреляция между наличием некоторых дисморфизмов ооцитов, скоростью оплодотворения и качеством полученных эмбрионов (18).Также наблюдается прямая связь между качеством эмбрионов и качеством спермы. Согласно рекомендациям ВОЗ 2010 года образец спермы считается нормальным, если он соответствует следующим критериям: объем эякулята 1,5 мл и более, общее количество сперматозоидов 39 млн. и более, концентрация сперматозоидов 15 млн. и более в 1 мл эякулята, общая подвижность сперматозоидов 40% и более, наличие сперматозоидов с прогрессивным движением 32% и более, наличие сперматозоидов с нормальной морфологией не менее 4%(19).

1.2. Понятие хетчинга

Повышение результативности ВРТ невозможно без изучения механизмов регуляции имплантации. Наступление беременности во многом зависит от трех составляющих: рецептивности эндометрия, функционально полноценного эмбриона, способного к имплантации,и доставки эмбриона к зоне имплантации(20).

Во время преимплантационного развития млекопитающих эмбрион находится внутри гликопротеиновой оболочки, которая носит название зона пеллюцида (блестящая оболочка)(4).Блестящая оболочка - внешняя оболочка ооцита, конгломерат из гликопротеинов, синтезируемых и секретируемых растущимооцитом и клетками гранулезы, который утолщается по мере роста ооцита. Внорме толщина прозрачной оболочки варьирует от 10 до 31 мкм и не зависитот диаметра цитоплазмы.При

утолщении прозрачной оболочки может нарушаться проникновение сперматозоида в клетку. Известно, чтолучше всего оплодотворяются ооциты, имеющие толщину прозрачной оболочки не более 18,6 мкм. На развитие эмбриона после проведения оплодотворения методом ИКСИ толщина прозрачной оболочки влияния неоказывает(21).

Выход бластоцисты из зоны пеллюцида- важный и завершающий этап преимплантационного развития. Неспособность эмбриона к выходу из зоны пеллюцида может быть одним из факторов, приводящих к нарушению имплантации, что ведет к снижению репродуктивной эффективности (7). Выход эмбриона из блестящей оболочки обозначают термином хетчинг.Предполагалось, что этот процесс обусловлен механическими периодическими сокращениями и набуханиями бластоцисты, однако затем было доказано, что в хетчинге также играют роль лизирующие факторы, выделяемые как самой бластоцистой, так и эндометрием.

В условиях in vitroхетчинг происходит на 5-6-й день развития путем разрыва оболочки и выхода бластоцисты через образовавшуюся щель. Разрыв оболочки связан с двумя факторами: 1) клетки трофэктодермы выделяют протеолитический фермент катепсин, растворяющий участок зоны пеллюцида, 2) бластоциста увеличивается в размерах и механически разрывает зону пеллюцида. В условиях in vivo могут действовать дополнительные факторы, приводящие к растворению блестящей оболочки, что способствует более быстрому и эффективному хетчингу.

1.3. Причины неудач спонтанного хетчинга

Далеко не все бластоцисты способны осуществить хетчинг, даже если зона пеллюцида надорвана. Бластоциста затрачивает определенное время (от нескольких часов до суток), чтобы освободиться из надорванной

оболочки. Длительный или неудачный хетчинг может быть фактором, снижающим частоту наступления беременности в программах ЭКО.

По данным литературы,на неэффективность хетчингаоказывают влияние такие факторы, кактолщина блестящей оболочки,изменениеее структуры и отсутствие дифференцировки клеток трофобласта(22,23).В циклах ВРТ часто можно наблюдать появление ооцитов и эмбрионов с нарушенной зоной пеллюцида - уплотнением, деформацией и изменениемее строения.Было показано, что утолщение или затвердевание зоны пеллюцида провоцируется средой культивирования(24)или криоконсервацией эмбрионов(25).Использование витрифицированных-размороженных эмбрионов позволяет снизить риск развития синдрома гиперстимуляции яичников и других осложнений проведения стимуляции овуляции ввиду отсутствия необходимости проведения повторных циклов стимуляции суперовуляции.

Технологии криоконсервации гамет и эмбрионов также постоянно развиваются. Это позволило увеличить процент жизнеспособных после разморозки эмбрионов с 40% до 80-90%, что способствовало внедрению метода в клиническую практику(26,27).СойссЫо и соавторы в своем исследовании показали, что витрификация не влияет на оплодотворение и раннее эмбриональное развитие (частота оплодотворения в группах свежих и витрифицированных-размороженных ооцитов составила 81,9% и 81 ,4%, соответственно, р>0,05)(28). Существует мнение, что криоконсервация может приводить к снижению частоты оплодотворения за счет утолщения блестящей оболочки(25), но эту проблему в клинической практике можно решить при помощи ИКСИ.

Основным вопросом остается влияние криоконсервации эмбрионов на потенциал к имплантации и постимплантационному развитию, которое должно привести к рождению здорового ребенка. Исследователи показали, что витрификация не приводит к снижению частоты имплантации. Частота имплантации при переносе витрифицированных и не подвергавшихся

витрификации эмбрионов отличного качества составила 41,6% и 44,3%, соответственно (р>0,05)(29).

Развитие эмбриона in vitro, предположительно, происходит медленнее, чем in vivo, поэтому и хетчинг при проведении экстракорпорального оплодотворения потенциально может происходить медленнее. Эмбрион при культивировании in vitro находится в субоптимальных условиях, поскольку состав культуральных сред не идентичен содержимому полости маточных труб и матки. Вследствие этого может происходить изменение конфигурации блестящей оболочки.

Группа ученых из Дании провела исследование, посвященное влиянию метода оплодотворения (инсеминация ооцитов in vitro или ИКСИ) на протекание хетчинга и клинический результат ЭКО(ЗО). Исследователи выделили два типа хетчинга: с предшествующей пенетрацией блестящей оболочки трофэктодермальными отростками (ТЭО)и без таковой. В первом случае выход бластоцисты происходил через постепенно расширяющееся отверстие блестящей оболочки, во втором - наблюдался быстрый и обширный разрыв блестящей оболочки со стремительной экспансией бластоцисты. Было показано, что использование метода ИКСИ ведет к развитию хетчинга по первому типу (97,7% всех наблюдений по сравнению с 55,8% в группе без ИКСИ, p<0,001). Также авторы показали, что при оплодотворении методом ИКСИ хетчинг начинается раньше, чем без ИКСИ (95,9 часов по сравнению 99,7 часов после оплодотворения, p<0,001). При этом как метод оплодотворения, так и тип спонтанного хетчинга не оказывал влияния на частоту наступления беременности (p=0,72).

Процесс хетчинга бластоцисты человека был изучен in vitro с использованием методики морфокинетического наблюдения, однако сравнение полученных результатов затруднено по причине различий в используемом оборудовании, культуральных средах и условиях культивирования.

Известно, что в период, предшествующий хетчингу, происходит транспорт жидкости в полость бластоцисты, приводящий к повышению гидростатического давления. В результате блестящая оболочка истончается, что является важным для нормального протекания процесса хетчинга(31).Что касается времени наступления самостоятельного хетчинга, в исследовании Menezes и соавторов(32)хетчинг наблюдался во временном промежутке 120-148 часов после оплодотворения.

Mio и Maeda наблюдали хетчинг в донированной бластоцисте через 104 часа после оплодотворения. При этом происходило однократное быстрое сокращение бластоцисты и последующий разрыв блестящей оболочки. Весьпроцессзанималоколо 7,5 часов(33).Полость бластоцисты восстанавливалась в объеме, затем начинался выход бластоцисты из блестящей оболочки. После того как бластоциста выходила из блестящей оболочки более чем наполовину, процесс хетчинга значительно ускорялся.

Среди клеток трофобласта выделены специализированные клетки, отвечающие за первичное разрушение зоны пеллюцида. Морфологически эти клетки отличаются от большей части клеток трофэктодермы, так как они приобретают шаровидную форму и имеют пальцевидные выросты. Данные клетки названы «разрывающими оболочку» клетками (англ. «zona-breaker» cells)(31). Было показано, что они способствуют прободеванию блестящей оболочки.

Разрыв блестящей оболочки, как правило, происходил в области, находящейся на противоположном от внутренней клеточной массы полюсе бластоцисты, однако, в редких случаях, хетчинг возможен в других областях блестящей оболочки (31). «Разрывающие оболочку» клетки, помимо расположения с обеих сторон от блестящей оболочки в зоне предстоящего хетчинга, характеризуются наличием большого числа микроворсинок, лизосом и активной секрецией везикул, взаимодействующих с блестящей оболочкой в области предстоящего хетчинга, что позволяет предположить, что процесс хетчинга зависит как

от механических, так и от химических факторов. Также в этих клетках визуализируются крупные пучки сократительных тонофиламентов, проходящих вдоль разрыва блестящей оболочки наподобие сфинктера или воронки.

Большой интерес исследователей в области изучения патологии биологии развития представляет формирование ТЭО, существование которых было показано для многих видов млекопитающих. ТЭО бластоцисты человека были описаны с использованием морфокинетического наблюдения как пальцевидные цитоплазматические выросты трофэктодермы (34).Высокое содержание актина в ТЭО было показано в экспериментах с использованием иммунофлуоресцентной окраски и конфокальной микроскопии(3,35). Данные исследований ТЭО у человека совпадают с данными, полученными на других видах млекопитающих, и свидетельствуют об участии ТЭО в процессе хетчинга бластоцисты за счет прохождения через блестящую оболочку и инициацию ее разрыва (3). Также в работах высказываются предположения об участии ТЭО в процессе имплантации бластоцисты.

В настоящее время большое внимание уделяется генетическим причинам неудач хетчинга.У человека зона пеллюцида состоит из четырех гликопротеинов, носящих названиеZP1-ZP4(36,37). Аномальная продукция или секреция этих гликопротеинов может приводить к изменению структуры зоны пеллюцида и неспособности связывания с ней сперматозоидов, что приводит к нарушению

оплодотворения.Гликопротеины ZP2, ZP3 и ZP4 могут связываться с капацитирующими сперматозоидами и/или сперматозоидами, вступающими в акросомную реакцию (38).ГликопротеиныZP3иZP4 могутвызыватьакросомнуюреакцию(39).Роль человеческого ZP1 в связывании со сперматозоидами и в провоцировании акросомной реакции не до конца изучена (40). По результатам опытов на мышах, нокаутированных по генам блестящей оболочки, все три мышиных

гликопротеина (ZP1-ZP3), вероятно, необходимы для сохранения структуры зоны пеллюцида, поскольку исключение хотя бы одного из этих гликопротеинов влечет за собой нарушение структуры оболочки (41)или даже её полное разрушение(42,43). В работе Рокку1аЯ.,с соавторами было выявлено, чтополиморфизм генов ZP1-ZP4у женщин в программах ВРТ часто сочетается с различными аномалиями блестящей оболочки (тонкая, толстая, овальная, удвоенная), а полная потеря ZP2 может привести к истончению блестящей оболочки также, как это наблюдается у мышей, нокаутированных по гену ZP2(44).

Роль протеиназ в процессе хетчинга не вызывает сомнений и была доказана в экспериментах с добавлением ингибиторов протеиназ в культуральную среду к бластоцистам, что приводило к полной неспособности бластоцисты к хетчингу(45). В зависимости от вида млекопитающего, в процессе хетчинга принимают участие разные классы протеиназ: сериновые, цистеиновые, металлопротеиназы. На данный момент основным вопросом остается выявление протеиназ хетчинга, специфичных для человека, однако исследования в данной области крайне немногочисленны по этическим соображениям и носят характер предположений и экстраполяций.

Существует гипотеза, что в хетчинге у человека принимает участие стрипсин - протеиназа, отвечающая за процесс хетчинга млекопитающих (46,47). Предполагалось, что данная протеиназа имеет как эмбриональное, так и эндометриальное происхождение. Однако ген стрипсина ISP2 (англ. implantation serine protease 2) у человека является псевдогеном, то есть не имеет продукта. В связи с этим отсутствие у человека функционирующего гена стрипсина позволяет усомниться в этом предположении(48).

Участие цистеиновых протеиназ в хетчинге наиболее подробно изучено на модели сирийского хомячка(49). Эту модель можно считать наиболее удачной, учитывая описанное выше сходство строения блестящей оболочки бластоцист человека и сирийского хомячка. В

экспериментах с использованием ингибиторов протеиназ было показано, что из трех классов цистеиновых протеиназ в хетчинге принимают участие только катепсины. Также было показано, что экзогенное добавление катепсинов L, P или B ведет к полному растворению блестящей оболочки. Экспрессия и синтез катепсинов L и P в период, предшествующий хетчингу, показаны в бластоцисте, в зоне ТЭО также визуализируются катепсины L и P методом иммунофлуоресцентного анализа(49). В человеческом геноме также присутствуют гены катепсинов L (CTSL), B (CTSB) и других. Показана экспрессия катепсина L в клетках трофэктодермы и внутренней клеточной массы(50), темнеменееролькатепсиноввпроцессехетчингаучеловекаокончательнонеоп ределена. Изучение экспрессии, синтеза и экскреции катепсинов бластоцистой является перспективным направлением для дальнейших исследований.

Роль цинковых металлопротеиназ в раннем эмбриональном развитии показана для многих видов позвоночных(51,52).

Особоевниманиеуделяетсясубсемействуастациновыхпротеиназ, ккоторымтакжеотносятсяпротеиназыхетчингапозвоночных: альвеолин (alv), овастацин (ASTL, astacine-likemetallo-endopeptidase), LCE, HCE, нефрозин, UVS.2. У человека из перечисленных генов присутствует только овастацин, который также присутствует у домовой мыши (Mus musculus), с чем связано его подробное изучение(51). Показана роль овастацина в блоке полиспермии у мышей. Овастацин накапливается в кортикальных гранулах ооцита, а затем при слиянии мембраны сперматозоида с оолеммой происходит экскреция кортикальных гранул и расщепление2Р2 под действием овастацина(53). Однако экспрессия овастацина наблюдается не только в ооците, но и в эмбрионе мыши вторых суток культивирования, что свидетельствует о возможном наличии у овастацина иных функций. Учитывая эволюционную связь и схожесть строения овастацина с протеазами хетчинга других видов, логично предположить участие

овастацина в процессах хетчинга человека и мыши(51). Тем не менее, остается необъясненной разобщенность во времени между зарегистрированной экспрессией овастацина и хетчингом. Для изучения участия овастацина в процессах хетчинга у человека необходимы дальнейшие исследования по изучению содержания овастацина в трофэктодерме эмбриона пятых суток культивирования, особенно в «zona-breaker» клетках. Вопрос анализа других протеиназ хетчинга на данный момент остается открытым.

В регуляции хетчинга участвует большое количество разнообразных цитокинов, факторов роста, вторичных мессенджеров, транскрипционных факторов и гормонов(3,54,55). Так, например, добавление гепарин-связывающего эпидермального фактора роста (HB-EGF) к человеческим эмбрионам не только ускоряло формирование бластоцисты, но и приводило к увеличению числа бластоцист, способных к самостоятельному хетчингу(55,56). Аналогичные данные получены на животных моделях для эпидермального фактора роста (EGF), трансформирующего фактора роста бета (TGF-P), лейкемия ингибирующего фактора (LIF)(57,58). Ингибирование циклооксигеназы второго типа (COX-2) или нуклеарного фактора кВ (NFkB) приводит к обратимому ингибированию хетчинга, как и добавление антагониста эстрогенового рецептора a (ER-a)(3).

Роль кальция в регуляции эмбриогенеза не вызывает сомнений. В связи с этим была исследована экспрессия гена KCNN3 (SK3, Ca2+-зависимый К+-канал) в бластоцистах, совершивших нормальный хетчинг in vitro, и в неспособных к хетчингу in vitro бластоцистах(35). Ген KCNN3 присутствует в геноме большого числа видов животных (более 100), его экспрессия в бластоцисте была изучена у человека и на мышиной модели. В то же время, экспрессии генов KCNN1 и KCNN2 в бластоцистах выявлено не было, а экспрессия гена KCNN4 не измерялась. Было показано, что уровень экспрессии гена KCNN3 в человеческих

бластоцистах, неспособных к хетчингу, в два раза ниже, чем в нормальных бластоцистах (p <0,05, n=3), что свидетельствует о важной роли Ca2+-зависимых калиевых каналов в процессе хетчинга. В дальнейшем на мышиной модели были исследованы экспрессия и синтез KCNN3, которые оказались выше в трофэктодерме и увеличивались по мере преимплантационного развития бластоцисты. Было показано, что нокаут гена KCNN3 приводит к снижению синтеза F-актина, участвующего в формировании ТЭО, и нарушениям хетчинга бластоцисты(35). В экспериментах по изучению KCNN3 в других, в том числе опухолевых, тканях человека показано, что KCNN3-опосредованная гиперполяризация приводит к повышению клеточной подвижности(59-61). Возможным механизмом инициации хетчинга у человека является активация SK3.

GATA3 экспрессируется в трофэктодерме эмбриона и отвечает за регуляцию экспрессии гена Cdx2(62). На мышиной модели исследователи показали, что ген GATA3 начинает экспрессироваться на стадии 4 бластомеров и активен в течение всего преимплантационного развития. Нокаут гена GATA3 приводит к выраженному снижению экспрессии Cdx2, что ведет к нарушению бластуляции эмбриона и, следовательно, невозможности формирования бластоцисты. Показано, что ген GATA3 -единственный из шести генов семейства транскрипционных факторов GATA экспрессируется в трофэктодерме, но не в клетках внутренней клеточной массы(63). Таким образом, ген GATA3 - важнейший регулятор преимплантационного эмбрионального развития, наряду с генами Eomes и семейством генов TEAD4(62). В литературе есть данные, подтверждающие роль GATA3 в хетчинге у человека. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток в клетки трофобласта (экспериментальная модель клеток трофэктодермы) сопровождается выраженным увеличением экспрессии GATA3(64).

Суммируя все вышесказанное, можно предположить, что патология процесса хетчинга может быть обусловлена:

•изменением структуры блестящей оболочки;

•изменением ферментосинтетической функции эндометрия и клеток трофобласта;

•отсутствием дифференцировки клеток трофобласта;

•механическим препятствием между блестящей оболочкой и «zona-breaker» cells.

Вероятнее всего, изменение структуры блестящей оболочки, а именно ее утолщение, может приводить не только к отсутствию оплодотворения, но и к неудачам хетчинга. При этом единичные исследования, посвященные неудачам хетчинга у человека, не содержат информации об оценке морфологии зоны пеллюцида ооцитов и эмбрионов, вследствие чего данная гипотеза не имеет экспериментальных данных для подтверждения. Причинами утолщения зоны пеллюцида могут быть как само по себе изменение зоны пеллюцида ооцита, так и замедленное дробление эмбриона, во время которого происходит физиологическое истончение зоны пеллюцида.

Аномальная секреция протеиназ на сегодняшний день является наиболее распространенной гипотезой неудачи хетчинга, подтвержденной экспериментальными данными(45). Известны гены, отвечающие за хетчинг у млекопитающих, и большой интерес представляют исследования, посвященные патогенетическим механизмам аномальной секреции протеаз у человека(65).

Также одной из причин неудач хетчинга может быть отсутствие дифференцировки трофобласта и появление «zona-breaker» cells. Тем не менее, при тщательном анализе данных литературы нами не было найдено публикаций относительно данного феномена.

В исследовании с использованием морфокинетического наблюдения было продемонстрировано нарушение хетчинга вследствие наличия между трофэктодермой и блестящей оболочкой экстраклеток, не участвующих в формировании бластоцисты(31).

1.4. Показания к проведению вспомогательного хетчинга и его

эффективность

Отсутствие спонтанного хетчинга является одной из причин неудачи имплантации. При затруднении спонтанного хетчинга, а также по ряду принятых показаний (возраст пациентки старше 35 лет, 3 и более неудачные попытки ЭКО с переносом эмбрионов хорошего качества в анамнезе, изменение морфологии блестящей оболочки, использование криоконсервированных эмбрионов) выполняетсяискусственное разрушение блестящей оболочки в программах ВРТ -вспомогательный хетчинг(5).

Данная методика была разработана с целью повышения частоты имплантации эмбриона, что объясняется тремяпричинами(11). Во-первых, вспомогательный хетчинг показан в случае невозможности естественного хетчинга, например, при утолщении или затвердевании зоны пеллюцида. Во-вторых, вспомогательный хетчинг ведет к более раннему выходу бластоцисты из зоны пеллюцида, что соответствует сдвигу окна имплантации, часто наблюдаемому в циклах ВРТ. В-третьих, открытие или истончение зоны пеллюцида может приводить к улучшению взаимодействия между бластоцистой и эндометрием посредством метаболитов, факторов роста и других мессенджеров (66).

Согласно данным Кохрановского мета-анализа, проведенного Сагпеу8.К.,с соавторами (4),выполнение вспомогательного хетчинга способствовало увеличению частотынаступления беременности у женщин в циклах ВРТ (ОШ=1,13, 95% ДИ=1,01-1,27).При этом стоит обратить внимание на ограничения данного исследования. Во-первых, только в 9 из 31 включенных в анализ исследований конечной точкой была частота живорождения (255 наблюдений), поэтомунельзя сделать вывод о влиянии проведения процедуры вспомогательного хетчинга на данный

показатель(ОШ=1,03, 95% ДИ=0,85-1,25). Во-вторых, авторы отмечают высокую гетерогенность включенных в анализ исследований.

При проведении стратификационного анализабыло отмечено более значительное увеличение частоты наступления беременности при сравнении пациенток с «плохим»и «нормальным»прогнозом наступления беременности (ОШ=1,49, 95% ДИ=1,19-1,85)и при сравнении пациенток с наличием и отсутствием неудачных попыток ЭКО/ИКСИ в анамнезе (ОШ=1,42, 95% ДИ=1,11-1,81) по сравнению с эффективностью вспомогательного хетчинга в общей когорте пациентов программ ВРТ (ОШ=1,13, 95% ДИ=1,01-1,27)(4). Аналогичное повышение частоты наступления беременности только для пациенток с «плохим» прогнозом наступления беременности было продемонстрировано в мета-анализе MartmsW.P., с соавторами (11). В литературе получены данные об эффективности вспомогательного хетчинга у женщин позднего репродуктивного возраста (более 38 лет), при получении эмбрионов плохого качества, при высоком уровне фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) в крови, переносе эмбрионов после криоконсервации и утолщении зоны пеллюцида более 15 мкм(4,67,68).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ибрагимова Эспет Омарбековна, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Современные представления о компактизации эмбрионов человека в условиях in vitro. / Е.В. Ковальская [и др.] // Технологии живых систем. - 2017. - № 1. - С. 25-35.

2. Хетчинг бластоцисты у человека/ Р.А. Шафеи [и др.] // Онтогенез. - 2017. - № 48(1). - С. 8-20.

3. Cellular and molecular regulation of mammalian blastocyst hatching. / P.B. Seshagiri [et al.]// J. Reprod. Immunol. - 2009. - Vol. 83(1-2). -P. 79-84.

4. Assisted hatching on assisted conception (in vitro fertilisation (IVF) and intracytoplasmic sperm injection (ICSI)) / S. Carney [et al.] // Cochrane Database Syst. Rev. - 2012. - Vol. 12. - P. 2012-2014.

5. Приказ Министерства здравоохранения РФ от 30 августа 2012 г. N 107н "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению". [Электронный ресурс] -2012.- Режим доступа: https://static-1 .rosminzdrav.ru/system/attachments/attaches/000/018/618/original/VRT_poryad ok.PDF?1390392973.

6. Impairment of the hatching process following IVF in the human and improvement of implantation by assisting hatching using micromanipulation / J. Cohen [et al.] // Hum.Reprod. - 1990. - Vol. 5 (1). - P. 7-13.

7. Роль вспомогательного хетчинга в программах лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий: обзор литературы / Э.О. Ибрагимова [и др.] // Гинекология. - 2016. - Т. 18(2). - С. 44-47.

8. Tadir, Y. Laser Effects in the Manipulation of Human Eggs and Embryos for In Vitro Fertilization / Y. Tadir, D.H..Douglas-Hamilton // Methods Cell Biol. - 2007. - Vol. 82(6). - P. 409-431.

9. Does assisted hatching pose a risk for monozygotic twinning in pregnancies conceived through in vitro fertilization? / L.A. Schieve [et al. ] // Fertil. Steril. - 2000. - Vol. 74(2). - P. 288-294.

10. A comparison of four different techniques of assisted hatching / B. Balaban [et al. ] // Hum. Reprod.- 2002. - Vol. 17(5). - P. 1239-1243.

11. Assisted hatching of human embryos: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials / W.P. Martins [et al. ]// Hum.Reprod. Update. - 2011. - Vol. 17(4). - P. 438-453.

12. Современные технологии лечения бесплодия у женщин с оперированными яичниками / К.Г.Серебренникова [и др.] // Международный журнал экспериментального образования. - 2010. - № 9. -С. 115-117.

13. Бесплодный брак. Современные подходы к диагностике и лечению/ Под ред. Г.Т. Сухих, Т.А. Назаренко.- М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. -518 с.

14. Gunby,J. Assistedreproductivetechnologies (ART) inCanada: 2002 resultsfromtheCanadianARTRegister/ J. Gunby, S.Daya// Fertil. Steril. - 2006. -Vol. 86 (5). - P. 1356-1364.

15. Incidence and complications of multiple gestation in Canada: proceedings of an expert meeting / F. Bissonnette [et al.] // Reprod. Biomed. Online. - 2007. - Vol. 14(6). -P. 773-790.

16. Принципы терапии патологии эндометрия у пациенток с бесплодием / К.Г.Серебренникова [и др.] // Клиническая медицина. - 2011. -№ 6. - С. 115-117.

17. Swain, J.E. ART failure: Oocyte contributions to unsuccessful fertilization / J.E. Swain, T.B.Pool // Hum. Reprod. Update. - 2008. - Vol. 14(5).

- p. 431-446.

18. Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome / L. Rienzi [et al.] // Fertil Steril. - 2008. - Vol. 90 (5). - P. 1692-1700.

19. World Health Organization reference values for human semen characteristics/ T.G. Cooper [et al.] // Hum. Reprod. Update. - 2009. -Vol. 16(3).

- P. 231-245.

20. Принципы комплексной оценки и подготовки эндометрия у

пациенток программ вспомогательных репродуктивных технологий/ Л.Н.Кузьмичев [и др.]// Акушерство и гинекология. - 2010. -№ 5. - С. 32-36.

21. Gabrielsen, A. The impact of the zona pellucida thickness variation of human embryos on pregnancy outcome in relation to suboptimal embryo development. A prospective randomized controlled study / A. Gabrielsen, S. Lindenberg, K.Petersen // Hum Reprod. - 2001. - Vol. 16 (10). - P. 2166-2170.

22. Germond, M. Hatching: how to select the clinical indications / M. Germond, M.P. Primi, A.Senn // Ann. N Y Acad. Sci. - 2004. - Vol. 1034. - P. 145-151.

23. Sathananthan, H. Critical evaluation of human blastocysts for assisted reproduction techniques and embryonic stem cell biotechnology / H. Sathananthan, S. Gunasheela, J.Menezes // Reprod. Biomed. Online. - 2003. -Vol. 7 (2). - P. 219-227.

24. DeMeestere, I. Hardening of zona pellucida of mouse oocytes and embryos in vivo and in vitro/ I. DeMeestere, P. Barlow, F. Leroy // Int. J. Fertil. Womens Med. - 1997. - Vol. 42. - P. 219-222.

25. Carroll, J. Freeze-thaw-induced changes of the zona pellucida explains decreased rates of fertilization in frozen-thawed mouse oocytes. / J. Carroll, H. Depypere, C.D.Matthews // J. Reprod. Fertil.- 1990. - Vol. 90 (2). - P. 547-553.

26. Clinical efficiency of oocyte and embryo cryopreservation/ A. Borini [et al.] // Ann. N Y Acad. Sci. - 2008. - Vol. 1127. - P. 49-58.

27. Human embryo cryopreservation: one-step slow freezing does it all? / Y.S. Chong [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. - 2014. - Vol. 31(7). - P. 921-925.

28. Fertilization and early developmental ability of cryopreserved human oocytes is not affected compared to sibling fresh oocytes / G. Coticchio [et al.] // Fertil. Steril. - 2007. - Vol. 88. - P. 340.

29. Zegers-Hochschild, F. Medical and ethical basis for embryo cryopreservation / F. Zegers-Hochschild, J.A. Crosby, S.P.Salas // Rev. médica

Chile. - 2014. - Bd. 142(7). - S. 896-902.

30. Kirkegaard, K. Hatching of in vitro fertilized human embryos is influenced by fertilization method / K. Kirkegaard, J.J. Hindkjaer, H.J. Ingerslev // Fertil. Steril. - 2013. - Vol. 100(5). - P. 1277-1282.

31. Sathananthan, H. Mechanics of human blastocyst hatching in vitro / H. Sathananthan, J. Menezes, S. Gunasheela // Reprod. Biomed. Online. - 2003 -Vol. 7 (2). - P. 228-234.

32. Menezes, J. Video observations on human blastocyst hatching / J. Menezes, S. Gunasheela, H.Sathananthan // Reprod. Biomed. Online. - 2003. -Vol. 7(2). - P. 217-218.

33. Mio, Y. Time-lapse cinematography of dynamic changes occurring during in vitro development of human embryos. / Y. Mio, K.Maeda // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2008. - Vol. 199(6). - P. 660.e1-5.

34. Trophectoderm projections: a potential means for locomotion, attachment and implantation of bovine, equine and human blastocysts. / D.S. Gonzales [et al.] // Hum. Reprod. - 1996. - Vol. 11(12). - P. 2739-2745.

35. Small-conductance calcium-activated K(+) channels 3 (SK3) regulate blastocyst hatching by control of intracellular calcium concentration / Y.-C. Lu [et al.]// Hum Reprod. - 2012. - Vol. 27(5). - P. 1421-1430.

36. Four zona pellucida glycoproteins are expressed in the human / L. Lefievre [et al.] // Hum. Reprod. - 2004. - Vol. 19(7). - P. 1580-1586.

37. Cracking the egg: Increased complexity in the zona pellucida / S.J. Conner [et al.] // Hum. Reprod. - 2005. - Vol. 20 (5). - P. 1148-1152.

38. Relevance of Glycosylation of Human Zona Pellucida Glycoproteins for Their Binding to Capacitated Human Spermatozoa and Subsequent Induction of Acrosomal Exocytosis / S. Chakravarty [et al.]// Mol. Reprod. Dev. - 2008. - Vol. 75. - P. 75-78.

39. Effects of Native Human Zona Pellucida Glycoproteins 3 and 4 on Acrosome Reaction and Zona Pellucida Binding of Human Spermatozoa. / P.C.N. Chiu [et al.] // Biol. Reprod. - 2008. - Vol. 79(5). - P. 869-877.

40. Human zona pellucida glycoproteins: functional relevance during fertilization / S.K. Gupta [et al.] // J. Reprod. Immunol. - 2009. - Vol. 83(1-2). -P. 50-55.

41. Abnormal zonae pellucidae in mice lacking ZP1 result in early embryonic loss / T.L. Rankin [et al.] // Development. - 1999. - Vol. 126(17). - P. 3847-3855.

42. Defective zonae pellucidae in Zp2-null mice disrupt folliculogenesis, fertility and development / T.L. Rankin [et al.] // Development. -2001. - Vol. 128(7). - P. 1119-1126.

43. Mice homozygous for an insertional mutation in the Zp3 gene lack a zona pellucida and are infertile / T.L. Rankin [et al.] // Development. - 1996. -Vol. 122(9). - P. 2903-2910.

44. Sequence variations in human ZP genes as potential modifiers of zona pellucida architecture / R.M. Pokkyla [et al.] // Fertil. Steril. - 2011. - Vol. 95(8). - P. 2669-2672.

45. Nitric oxide regulates blastocyst hatching in mice/ X. Pan [et al.] // Int.J.Clin.Exp.Med. - 2015. - Vol. 8(5). - P. 6994-7001.

46. Гоголевский, П.А. Вспомогательныйхэтчинг: показания, применение, результаты (обзорлитературы). / П.А. Гоголевский // Проблемы репродукции. - 1998. - Т. 4. - C. 10-13.

47. Embryonic hatching enzyme strypsin/ISP1 is expressed with ISP2 in endometrial glands during implantation / C.M. O'Sullivan [et al.]// Mol. Reprod. Dev. - 2002. - Vol. 62(3). - P. 328-334.

48. Implantation serine proteinase 1 exhibits mixed substrate specificity that silences signaling via proteinase-activated receptors / N. Sharma [et al.] // PLoS One. - 2011. - Vol. 6(11). - P. e27888.

49. Role of cathepsins in blastocyst hatching in the golden hamster/ G.V. Sireesha [et al.] // Mol. Hum. Reprod. - 2008. - Vol. 14(6). - P. 337-346.

50. Adjaye, J. Whole-genome approaches for large-scale gene identification and expression analysis in mammalian preimplantation embryos / J.

Adjaye // Reprod. Fertil. Dev. - 2005. - Vol. 17(1-2). - P. 37-45.

51. Identification and characterization of human and mouse ovastacin: a novel metalloproteinase similar to hatching enzymes from arthropods, birds, amphibians, and fish / V. Quesada [et al.] // J. Biol. Chem. - 2004. -Vol. 279(25). - P. 26627-26634.

52. Sterchi, E.E. Meprins, membrane-bound and secreted astacin metalloproteinases / E.E. Sterchi, W. Stocker, J.S.Bond // Mol. Aspects Med. -2008. - Vol. 29(5). - P. 309-328.

53. Ovastacin, a cortical granule protease, cleaves ZP2 in the zona pellucida to prevent polyspermy / A.D. Burkart [et al.]// J. Cell Biol. - 2012. -Vol. 197(1). - P. 37-44.

54. Kane, M.T. Peptide growth factors and preimplantation development / M.T. Kane, P.M. Morgan, C. Coonan // Hum. Reprod Update. -1997. - Vol. 3(2). - P. 137-157.

55. Sargent, I.L. The use of recombinant growth factors to promote human embryo development in serum-free medium / I.L. Sargent, K.L. Martin, D.H.Barlow // Hum. Reprod. - 1998. - Vol. 13 (Suppl. 4). - P. 239-248.

56. Promotion of human early embryonic development and blastocyst outgrowth in vitro using autocrine/paracrine growth factors/ K. Kawamura [et al.]// PLoS One. - 2012. - Vol. 7(11). - P. e49328.

57. Mishra, A. Heparin binding-epidermal growth factor improves blastocyst hatching and trophoblast outgrowth in the golden hamster / A.Mishra, P.B. Seshagiri // Reprod. Biomed. Online. - 2000. - Vol. 1(3). - P. 87-95.

58. Regulation of peri-attachment embryo development in the golden hamster: role of growth factors/ P.B. Seshagiri [et al.] // J. Reprod. Immunol. -2002. - Vol. 53(1-2). - P. 203-213.

59. cAMP-PKA inhibition of SK3 channel reduced both Ca2+ entry and cancer cell migration by regulation of SK3-Orai1 complex / L. Clarysse [et al.] // Pflugers Arch.- Eur. J. Physiol. - 2014. - Vol. 466 (10). - P. 1921-1932.

60. New alkyl-lipid blockers of SK3 channels reduce cancer cell

migration and occurrence of metastasis / A. Girault [et al.] // Curr. Cancer Drug. Targets. - 2011. - Vol. 11(9). - P. 1111-1125.

61. Identification of SK3 channel as a new mediator of breast cancer cell migration. / M. Potier [et al.]// Mol. Cancer Ther. - 2006. - Vol. 5(11). - P. 2946-2953.

62. GATA3 is selectively expressed in the trophectoderm of periimplantation embryo and directly regulates Cdx2 gene expression/ P. Home [et al.] // J. Biol. Chem. - 2009. - Vol. 284(42). - P. 28729-28737.

63. Context-dependent function of regulatory elements and a switch in chromatin occupancy between GATA3 and GATA2 regulate Gata2 transcription during trophoblast differentiation / S. Ray [et al.] // J Biol Chem. - 2009. - Vol. 284(8). - P. 4978-4988.

64. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast / R-H. Xu [et al.] // Nat Biotechnol. - 2002. - Vol. 20 (12). - P. 12611264.

65. Global gene expression of the inner cell mass and trophectoderm of the bovine blastocyst / M. Ozawa [et al.]// BMC Dev. Biol. - 2012. - Vol. 12. - P.

33.

66. Implantation enhancement by selective assisted hatching using zona drilling of human embryos with poor prognosis / J. Cohen [et al.]// Hum. Reprod. - 1992. - Vol. 7(5). - P. 685-691.

67. Hammadeh, M.E. Assisted hatching in assisted reproduction: A state of the art / M.E. Hammadeh, C. Fischer-Hammadeh, K.R. Ali // J. Assist. Reprod. Genet. - 2011. - Vol. 28(2). - P. 119-128.

68. Assisted hatching by partial zona dissection of human pre-embryos in patients with recurrent implantation failure after in vitro fertilization / A. Stein [et al.] // Fertil. Steril. - 2016. - Vol. 63 (4). - P. 838-841.

69. Assisted hatching on assisted conception (IVF and ICSI) / S. Das [et al.] // Cochrane Database Syst. Rev. - 2009. - Vol. 2.

70. A new assisted hatching technique using a piezo-micromanipulator

/ T. Nakayama [et al.] // Fertil. Steril. - 1998. - Vol. 69(4). - P. 784-788.

71. Clinical application of a new assisted hatching method using a piezo- micromanipulator for morphologically low-quality embryos in poor-prognosis infertile patients/ T. Nakayama [et al.] // Fertil. Steril. - 1999. - Vol. 71(6). - P. 1014-1018.

72. A retroprospective study comparing three different assisted hatching techniques / H.L. Feng [et al.] // Fertil. Steril. - 2009. - Vol. 91(Suppl. 4). - P. 1323-1325.

73. Ultrastructural observations of enzymatically treated human blastocysts: zona-free blastocyst transfer and rescue of blastocysts with hatching difficulties / C.Y. Fong [et al.] // Hum. Reprod. - 2001. - Vol. 16(3). - P. 540546.

74. Monozygotic twinning associated with mechanical assisted hatching / A. Hershlag [et al.] // Fertil. Steril. - 1999. - Vol. 71(1). - P. 144-146.

75. Assisted Hatching of Human Embryos / J. Cohen // In Vitro Fert. Embryo Transf. - 1991. - Vol. 8 (4). - P. 179-190

76. The risk of monozygotic twins after assisted reproductive technology: a systematic review and meta-analysis / S. Vitthala [et al.] // Hum. Reprod. Update.- 2009. - Vol. 15 (1). - P. 45-55.

77. Monozygotic twinning in the human is associated with the zona pellucida architecture/ M. Alikani [et al.] // Hum. Reprod.- 1994. - Vol. 9(7). - P. 1318-1321.

78. Intercellular communication in the early human embryo / B. Dale [et al.]// Mol. Reprod. Dev.- 1991. - Vol. 29(1). - P. 22-28.

79. Monozygotic multiple gestation following in vitro fertilization: Analysis of seven cases from Japan / A.Yanaihara [et al.] // J. Exp. Clin. Assist. Reprod. - 2007. - Vol. 4. - P. 2-5.

80. Monozygotic twinning is not associated with zona pellucida micromanipulation procedures but increases with high-order multiple pregnancies / S.E. Elizur [et al.]// Fertil. Steril. - 2004. - Vol. 82(2). - P. 500-501.

81. Monozygotic twinning: an eight-year experience at a large IVF center / J. Knopman [et al.] // Fertil. Steril. - 2010. - Vol. 94(2). - P. 502-510.

82. Сокур, С.А. Оптимизация исходов программ вспомогательных репродуктивных технологий у супружеских пар с повышенным уровнем анеуплоидии в сперматозоидах: дис. ... канд. мед. наук. -М., 2015.

83. International Committeefor Monitoring Assisted Reproductive Technology (ICMART) and the World Health Organization (WHO) revised glossary of ART terminology, 2009 / F. Zegers-Hochschild [et al.] // Fertil. Steril. - 2009. - Vol. 92 (5). - P. 1520-1524.

84. Лечение женского и мужского бесплодия. Вспомогательные репродуктивные технологии / Под ред. В. И. Кулакова, Б. В. Леонова, Л.Н. Кузьмичева. - М.:МИА; 2005. - 592 с.

85. Significance of morphological attributes of the early embryo / L. Rienzi [et al.] // Reprod. Biomed. Online. - 2005. - Vol. 10(5). - P. 669-681.

86. Wassarman, P. Zona pellucida glycoproteins. / P. Wassarman // J. Biol. Chem. - 2008. - Vol. 283(36). - P. 24285-24289.

87. Assisted hatching is it worthwhile? / A. Thurin [et al.] // Hum. Reprod. - 1998. - Vol. 13. - P. 45-49.

88. Is the zona pellucida thickness of human embryos influenced by women's age and hormonal levels? / H. Balakier [et al.] // Fertil. Steril.- 2012. -Vol. 98(1). - P. 77-83.

89. Contribution of the oocyte to embryo quality / M-A. Sirard [et al.] // Theriogenology. - 2006. - Vol. 65(1). - P. 126-136.

90. Исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий у супружеских пар с различными видами патозооспермии у мужчин / Н.В. Долгушина [и др.] // Акушерство и гинекология. - 2013. -№10. - С. 69-75.

91. Реализация программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с агрегатами гладкого эндоплазматического ретикулума в цитоплазме ооцитов / А.Г. Сыркашева [и др.] // Акушерство и

гинекология. - 2016. - № 7. - С. 54-59.

92. Relationship between oocyte abnormal morphology and intracytoplasmic sperm injection outcomes: A meta-analysis / A.S. Setti [et al.] // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. - 2011. - Vol. 159 (2). - P. 364-370.

93. Грубозернистая деструкция цитоплазмы ооцитов в цикле ЭКО/ Н.П. Макарова [и др.] // Акушерство и гинекология. - 2012. - Vol. 8. - P. 103-105.

94. Article Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos / S. Chamayou [et al.]// Reprod. Biomed. Online. - 2006. - Vol. 13(5). - P. 661-667.

95. Coarse granulation in the perivitelline space and IVF-ICSI outcome / J. Farhi [et al.]// J Assist Reprod Genet. - 2002. - Vol. 19(12). - P. 545-549.

96. Факторы риска развития дисморфизмов ооцитов в программах вспомогательных репродуктивных технологий / А.Г. Горшкова [и др.] // Акушерство и гинекология. - 2015. - №5. - С. 66-73.

97. European multicentre prospective randomized study to assess the use of assisted hatching with a diode laser and the benefit of an immunosuppressive/antibiotic treatment in different patient populations / M.P. Primi [et al.] // Hum. Reprod. - 2004. - Vol. 19(10). - P. 2325-2333.

98. A study failing to determine significant benefits from assisted hatching: Patients selected for advanced age, zonal thickness of embryos, and previous failed attempts / W.R. Edirisinghe [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. -1999. - Vol. 16 (6). - P. 294-301.

99. Predicting the chance of live birth for women undergoing IVF: a novel pretreatment counselling tool / R.K. Dhillon [et al.] // Hum. Reprod. -2016. - Vol. 31(1). - P. 84-92.

100. Paternal age and assisted reproductive outcomes in ICSI donor oocytes: is there an effect of older fathers? / R. Begueria [et al.] // Hum. Reprod. -2014. - Vol. 29 (10). - P. 2114-2122.

101. Monozygotic twins and transfer at the blastocyst stage after ICSI. /

da A.L. Costa [et al.] // Hum. Reprod. - 2001. - Vol. 16(2). - P. 333-336.

102. Factors associated with monozygosity in assisted reproductive technology pregnancies and the risk of recurrence using linked cycles / B. Luke [et al.] // Fertil. Steril. - 2014. - Vol. 101 (3). - P. 683-689.