Поверхности потенциальной энергии и спектры хромофора зеленого флуоресцентного белка: от газовой фазы до белковой матрицы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.17, кандидат физико-математических наук Поляков, Игорь Вадимович

• Поляков, Игорь Вадимович
• кандидат физико-математических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Поляков, Игорь Вадимович

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Структура и спектральные характеристики GFP.

1.2. Экспериментальные исследования хромофора GFP в газовой фазе и водной среде.

1.3. Квантово-химическое моделирование возбужденного состояния хромофора GFP в газовой фазе и водной среде.

1.4. Квантово-химическое моделирование возбужденного состояния хромофора GFP в белковой матрице.

1.5. Комбинированные методы квантвой и молекулярной механики (КМ/ММ).

1.6. Квантово-химические методы расчёта электронных спектров.

2. Моделирование поверхностей потенциальной энергии и оптических спектров хромофора GFP в газовой фазе.

2.1. Исследование поверхности возбужденного состояния S1 хромофора GFP в газовой фазе.

2.2. Моделирование спектров хромофора GFP в газовой фазе.

3. Исследование реакции цис-транс изомеризации хромофора GFP в газовой фазе и в водном окружении.

3.1. Моделирование цис-транс изомеризации хромофора GFP в газовой фазе.

3.2. Исследование цис-транс изомеризации хромофора GFP в водном растворе.

4. Спектральные свойства хромофора GFP в белковой матрице.

4.1. Моделирование структуры и спектров белка дикого типа.

4.2. Исследование влияния мутации S65T на структуру и спектры GFP.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Поверхности потенциальной энергии и спектры хромофора зеленого флуоресцентного белка: от газовой фазы до белковой матрицы»

Открытие и применение белков семейства зеленого флуоресцентного белка (ОБР) привело к лавинообразному всплеску интереса исследователей к этим объектам. Их практическая ценность объясняется возможностью маркировать цветными белками клеточные клоны и затем в буквальном смысле наблюдать за ходом внутриклеточных событий. Биотехнологические перспективы применения цветных белков связаны с многоцветной маркировкой и, в частности, с возможностями наблюдать за межбелковыми взаимодействиями в живых системах. Помимо широкого практического использования, цветные белки и их хромофоры являются интереснейшими объектами, изучению свойств которых посвящено большое число экспериментальных и теоретических работ; однако, множество проблем, связанных с особенностями строения и свойств хромофорных молекул белков семейства вРР в разных окружениях, все еще требует детального исследования.

Хромофор зеленого флуоресцентного белка, 4-(п-гидроксибензилиден)-5-имидазолинон, представляет собой достаточно большую и сложную молекулу, моделирование свойств которой методами квантовой теории становится возможным лишь в последние годы благодаря доступу к современным суперкомпьютерам тера- и петафлопного уровня и прогрессу в развитии программного обеспечения. Численными решениями уравнений квантовой химии и комбинированных подходов квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) удается надежно рассчитывать фрагменты поверхностей потенциальной энергии в основном и возбужденном состояниях молекулярных систем, моделирующих хромофор вРР в газовой фазе, растворе и в белковом окружении. Эти данные необходимы для интерпретации и уточнения результатов выполненных экспериментальных наблюдений и предсказаний свойств новых систем, включая и более эффективные в приложениях варианты цветных белков.

Цель работы - теоретическая интерпретация экспериментальных данных по спектральным свойствам хромофора зеленого флуоресцентного белка в газовой фазе, водном растворе и белке по результатам расчетов поверхностей потенциальной энергии в основном и возбужденном состояниях современными методами квантовой химии. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Рассчитать фрагменты поверхностей потенциальной энергии основного и возбужденных состояний и оценить теоретически положения полос в спектрах хромофора ОБР в различных протонированных формах в газовой фазе.

2. Построить путь цис-транс изомеризации хромофора ОБР в основном состоянии в водном растворе.

3. Предложить уточненные трехмерные модели структур ОБР на основе расчетов методами КМ/ММ.

4. На основании рассчитанных поверхностей потенциальной энергии основного Бо, возбужденного 81 состояний в газовой фазе и в белковой матрице объяснить спектральные свойства хромофора ОБР.

5. Предсказать влияние точечных мутаций на спектр ОБР в белковой матрице. Научная новизна результатов:

1. Методами квантовой химии высокого уровня точности в рамках единой расчетной схемы рассмотрены все формы хромофора ОБР.

2. Уточнена интерпретация спектра анионной формы хромофора ОБР в газовой фазе. Показано, что энергия ионизации аниона хромофора ОБР в газовой фазе меньше, чем энергия оптически разрешенного перехода тг-7г*.

3. В рамках континуальной и дискретной моделей растворителя исследована цис-транс изомеризация хромофора ОБР в воде.

4. На основании расчетов комбинированными методами квантовой механики -молекулярной механики (КМ/ММ) построены трехмерные модели ОБР.

5. По результатам расчетов методом КМ/ММ фрагментов поверхностей потенцильной энергии основного и возбужденного состояний модельных белковых систем сопоставлены теоретические и экспериментальные спектры поглощения и флуоресценции ОБР для наиболее важных форм белка. Предложена новая интерпретация превращений ОБР при фотовозбуждении. Личный вклад диссертанта заключается в сборе и анализе литературных данных, постановке задач, разработке путей решения поставленных задач, проведении вычислений методами квантовой химии, комбинированными методами квантовой механики и молекулярной механики, интерпретации результатов, подготовке публикаций и докладов по теме диссертационной работы.

Научная и практическая значимость данной работы заключается в том, что полученные результаты позволяют детализировать механизмы фотохимических реакций хромофора зелёного флуоресцентного белка в газовой фазе, растворах и белковой матрице. Результаты данной работы могут быть применены для прогнозирования свойств новых перспективных вариантов флуоресцентных белков.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на международной конференции «Ломоносов» (Москва, 2011), Международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино 2008), VIII, IX и X ежегодных международных молодежных конференциях «Биохимическая физика» ИБХФ РАН-ВУЗы (Москва 2008, 2009, 2010) , Симпозиумах «Современная химическая физика» (Туапсе 2009, 2010), 7-й Всероссийской конференции «Молекулярное моделирование» (Москва, 2011), 2-й и 3-й Международных конференциях «Суперкомпьютерные системы и их применение» (Минск 2008, 2010).

Результаты опубликованы в 18 печатных изданиях, в том числе в 7 статьях в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень журналов ВАК РФ и в 11 тезисах докладов на конференциях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка цитируемой литературы из наименований. Работа изложена на 95 страницах машинописного текста, включает 90 рисунков и 10 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Математическая и квантовая химия», Поляков, Игорь Вадимович

Выводы

1. Рассчитанные рельефы поверхностей потенциальной энергии возбужденного состояния хромофора вРР согласуются с наблюдаемым экспериментально отсутствием флуоресценции анионной формы в газовой фазе. Для всех протонированных состояний хромофора вРР показаны пути колебательной релаксации через конические и псевдопересечения поверхностей основного и возбужденного состояний.

2. Показано, что вертикальная энергия ионизации анионной формы хромофора вРР в газовой фазе (2.4 эВ) меньше, чем энергия возбуждения п-п* (2.6 эВ). Наблюдаемый экспериментально малоинтенсивный широкий пик в спектре поглощения анионной формы хромофора с максимумом при 2.59 эВ можно отнести к фотоотрыву электрона.

3. Показано, что спектр модельного соединения, использованного для имитации нейтральной формы хромофора вРР в газовой фазе, соответствует катионной форме. Полоса поглощения нейтрального хромофора в газовой фазе в действительности сдвинута в сторону меньших длин волн относительно белка.

4. Построены профили реакции цис-транс изомеризации хромофора ОРР в основном электронном состоянии в газовой фазе и водной среде. Для анионной формы хромофора значительное снижение барьера в воде по сравнению с газовой фазой связано с сольватацией переходного состояния.

5. Предложенные по результатам расчетов методом КМ/ММ трехмерные модели структур белка с различными состояниями хромофора уточняют параметры известных структур в базе данных РОВ.

6. По результатам расчетов методом КМ/ММ фрагментов поверхностей потенциальной энергии основного и возбужденного состояний модельных белковых систем сопоставлены теоретические и экспериментальные спектры поглощения и флуоресценции вРР для наиболее важных форм белка. Предложена уточненная интерпретация превращений в структурах вРР при фотовозбуждении.

7. Изменение спектра поглощения дикого типа вБР при точечной мутации Б65Т связано со стабилизацией анионной формы хромофора за счет перестройки сетки водородных связей в хромофор-содержащей области.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Поляков, Игорь Вадимович, 2011 год

1. Tsien R. Y. The Green Fluorescent Protein // Annu. Rev. Biochem. 1998. V. 67. P. 509544.

2. Zimmer M. Green Fluorescent Protein (GFP): Applications, Structure, and Related Photophysical Behavior// Chem. Rev. 2002. V. 102. P. 759-781.

3. Matz M. V., Fradkov A. F., Labas Y. A., Savitsky A. P., Zaraisky A. G., Markelov M. L., and Lukyanov S. A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species.// Nat. Biotechnol. 1999. V. 17. P. 969-973.

4. Labas Y. A., Gurskaya N. G., Yanushevich Y. G., Fradkov A. F., Lukyanov K. A., Lukyanov S. A., and Matz M. V. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family //Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 2002. V. 99. P. 4256-4261.

5. RCSB Protein Data Bank (PDB) // Электронный ресурс URL http://www.rcsb.org/pdb/.

6. Rao B.D., Kemple M.D., Pendergast F.G. Proton nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopic studies of segmental mobility in aequorin and a green fluorescent protein from Aequorea forkalea // Biophys. J. 1980. V. 32. P. 630-632.

7. Ward W. W., Bokman S. H. Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: Physical separation and characterization of the renatured protein // Biochemistry. 1982. V. 21. P. 4535-4540.

8. Cubitt А. В., Heim R., Adams S. R., Boyd A. E., Gross L. A., Tsien R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins // TIBS. 1995. V. 20. P448-455.

9. Heim R., Prasher D. C., Tsien R. Y Wavelength mutations and postranslationalautoxidation of green fluorescent protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. V. 91.1. P. 12501-12504.

10. Dopf J., Horiagon T. M. Deletion mapping of the Aequorea victoria green fluorescent protein// Gene. 1996. V. 173. P. 39-44.

11. LiX., Zhang G., Ngo N., Zhao X., Kain S., Huang C.-C. Deletions of the Aequorea victoria green fluorescent protein define the minimal domain required for fluorescence // J.Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 28545-28549.

12. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W. W., Brasher D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science. 1994. V. 263. P. 802-805.

13. Brejc K.A., Sixma T.K., Kitts B.A., Kain S.R., Tsien R.Y., Ormo M., Remington S.J. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein // Broc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 2306-2311.

14. Jung G., Wiehler J., and Zumbusch A. The Photophysics of Green Fluorescent Protein: Influence of theKey Amino Acids at Positions 65, 203, and 222 // Biophys. J. 2005. V. 88. P. 1932-1947.

15. Elsliger M.-A., Wachter R. M., Hanson G. T., Kallio K, and Remington S. J. Structural and Spectral Response of Green Fluorescent Protein Variants to Changes in Ph // Biochem. 1999. V. 3. P. 5296-5301.

16. Chattoraj M., King B.A., Bublitz G.U., and Boxer S.G. Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein:Multiple states and proton transfer // Broc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 8362-8367.

17. Brejc K.A., Sixma T.K., Kitts B.A., Kain S.R., Tsien R.Y., Ormo M., Remington S.J. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein // Broc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 2306-2311.

18. LUI M. A., Helms V. Proton shuttle in green fluorescent protein studied by dynamic simulations II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 2778-2781.

19. Weber, W.; Helms, V.; McCammon, J.; Langhoff, P. Shedding light on the dark and weakly fluorescent states of green fluorescent proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.1999. V. 96. P. 6177-6182.

20. Andersen L.H., Lapierre A., Nielsena S.B., Nielsen I.B., Pedersen S.U., Pedersen U. V., Tomita S. Chromophores of the green fluorescent protein studied in the gas phase // Eur. Phys. J. 2002. V. 20. P. 597-600.

21. Andersen L. H., Bluhme H., Boyet S., Jurgensen T. J. D., Krogh H., Nielsen I. B., Nielsena S. B., Svendsen A. Experimental studies of the photophysics of gas-phase fluorescent protein chromophores // Phys.Chem.Chem.Phys. 2004. V. 6. P. 2617 2621.

22. Lammich L., Petersen M. A., Nielsen M. B., and Andersen L. H. The Gas-Phase Absorption Spectrum of a Neutral GFP Model Chromophore.// Biophys. J. 2007. V. 92. P. 201-207.

23. Helms V., Winstead C., Langhoff P. W. Low-lying electronic excitations of the Green Fluorescent Protein chromophore // J. Molec. Struct. (Theochem). 2000. V. 506. P. 179189.

24. Bell A. F., He X, Wachter R. M., and Tonge P. J. Probing the Ground State Structure of the Green Fluorescent Protein Chromophore Using Raman Spectroscopy // Biochem.2000. V. 39. P. 4423-4431.

25. He X., Bell A. F., Tonge P. J. Ground state isomerization of a model green fluorescent protein chromophore // FEBSLett. 2003. V. 549. P. 35-38.

26. Vengris M., van Stokkum I. H. M., He X., Bell A. F., Tonge P. J., van Grondelle R., Larsen D. S. Ultrafast Excited and Ground-State Dynamics of the Green Fluorescent Protein hromophore in Solution II J. Phys. Chem. A. 2004. V. 108. P. 4587-4598.

27. Solntsev K. M., Poizat O., Dong J., Rehault J., Lou Y., Burda C., Tolbert L. M. Meta and Para Effects in the Ultrafast Excited-State Dynamics of the Green Fluorescent Protein Chromophores II J. Phys. Chem. B. 2008. V. 112. P. 2700-2711.

28. Toniolo A., Granucci G., Martinez T. J. Conical Intersections in Solution: A QM/MM Study Using Floating Occupation Semiempirical Configuration Interaction Wave Functions II J. Phys. Chem. A. 2003. V. 107. P. 3822-3830.

29. Martin M. E., Negri F., and Olivucci M. Origin, Nature, and Fate of the Fluorescent State of the Green Fluorescent Protein Chromophore at the CASPT2//CASSCF Resolution II J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 5452-5464.

30. Altoe P., Bernardi F., Garavelli M., Orlandi G., and Negri F. Solvent Effects on the Vibrational Activity and Photodynamics of the Green Fluorescent Protein Chromophore: A Quantum-Chemical Study II J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 3952-3963.

31. Olsen S., Smith S. C. Radiationless Decay of Red Fluorescent Protein Chromophore Models via Twisted Intramolecular Charge-Transfer States // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. P.2054-2065.

32. Olsen S., Smith S. C. Bond Selectivity in the Photoisomerisation Reactions of Model GFP and KFP Chromophore Anions II J. Am. Chem. Soc. 2008. V. 130. P. 8677-8689.

33. Voityuk A. A., Michel-Beyerle M.-E., Rosch N. Protonation Effect on the Chromophore of Green Fluorescent Protein. Quantum Chemical Study of the Absorption Spectra. // Chem. Phys. Lett. 1997. V. 272. P. 162-167.

34. Olsen S., Lamothe K., Martinez T.J. Protonic Gating of Excited-State Twisting and Charge Localization in GFP Chromophores: A Mechanistic Hypothesis for Reversible Photoswitching // J. Am. Chem. Soc. 2010. V. 132. P. 1192-1193.

35. Sinicropi A., Andruniow T., Ferre N., Basosi R., Olivucci M. Properties of the Emitting State of the Green Fluorescent Protein resolved at the CASPT2//CASSCF/CHARMM Level // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 1153411535.

36. Yang F., Moss L.G., Phillips G.N. The molecular structure of green fluorescent protein // Nat. Biotech. 1996. V. 14. P. 1246 1251.

37. Zhang R.B., Nguyen M.T., Ceulemans A. A concerted mechanism of proton transfer in green fluorescent protein. A theoretical study // Chem. Phys.Lett. 2005. V. 404. P. 250256.

38. Vendrell O., Gelabert R., Moreno M., Lluch J.M. A Potential Energy Function for Heterogeneous Proton-Wires. Ground and Photoactive States of the Proton-Wire in the Green Fluorescent Protein II J. Chem. Theor. Comput. 2008. V. 4. P. 1138-1150.

39. O Vendrell O., Gelabert R., Moreno M., Lluch J.M. Operation of the Proton Wire in Green Fluorescent Protein. A Quantum Dynamics Simulation // J. Phys. Chem. B. 2008. V. 112. P. 5500-5511.

40. Jonasson G., Teuler J.-M., Vallverdu G., Merola F., Ridard J., Levy B., Demachy I. Excited State Dynamics of the Green Fluorescent Protein on the Nanosecond Time Scale II J. Chem. Theor. Comput. 2011. V. 7. P. 1990-1997.

41. Jensen F. Introduction to Computational Chemistry. John Wiley & Sons Ltd. 2007. 475 p.

42. Lin H., Truhlar D. QM/MM: what have we learned, where are we, and where do we go from here // Theor. Chem. Acc. 2007. V. 117. P. 185-199.

43. Bakowies D., Thiel W Hybrid Models for Combined Quantum Mechanical and Molecular Mechanical Approaches II J. Phys. Chem. 1996. V. 100. P. 10580-10594.

44. Rosta E., Klahn M., Wars he I A. Towards Accurate Ab Initio QM/MM Calculations of Free-Energy Profiles of Enzymatic Reactions // J. Phys. Chem. B 2006. V. 110. P. 2934-2941.

45. Gordon M.S., Freitag M.A., Bandyopadhyay P., Jensen J.H., Kairys V., Stevens W.J. The Effective Fragment Potential Method: A QM-Based MM Approach to Modeling Environmental Effects in Chemistry II J. Phys. Chem. A 2001. V. 105. P. 293-307.

46. Warshel A., Levitt M. Theoretical studies of enzymatic reactions: dielectric, electrostatic and steric stabilization of the caronium ion in the reaction of lysozyme // J. Mol. Biol. 1976. V. 103. P. 227-249.

47. Hall R.J., Hindle S.A., Burton N.A., Hiller I.H. Aspects of hybrid QM/MM calculations: the treatment of the QM/MM interface region and geometry optimization with an application to chorismate mutase // J. Comput. Chem. 2000. V. 21. P. 1433-1441.

48. Zhang Y., Lee T.-S., Yang W. A pseudobond approach to combining quantum mechanical and molecular mechanical methods II J. Chem. Phys. 1999. V. 110. P. 46-54.

49. Koch W., Holthausen M.C. A Chemist's Guide to Density Functional Theory // Wiley-VCH. 2001. 306 p.

50. Chai J., Head-Gordon M. Systematic optimization of long-range corrected hybrid density functional II J. Chem. Phys 2008. V. 128. P. 084016(1)-084106(15).

51. Adamo C., Barone V. Toward reliable density functional methods without adjustable parameters: The PBE0 model II J. Chem. Phys. 1999. V. 110. P. 6158-6170.

52. Perdew J. P., Burke K, Ernzerhof M. Generalized Gradient Approximation Made Simple II Phys. ReV. Lett. 1996. V. 77. P. 3865-3868.

53. Dunning, T. H. Gaussian Basis Sets for Use in Correlated Molecular Calculations. I. The Atoms Boron through Neon and Hydrogen //J. Chem. Phys. 1989. V. 90. P. 10071023.

54. Morokuma K. New challenges in quantum chemistry: quests for accurate calculations for large molecular systems. // Phil. Trans. R. Soc. Lond. A. 2002. V. 360. P. 1149-1164.

55. Jensen F. Introduction to Computational Chemistry. John Wiley & Sons. 2007. P. 74-77.

56. Day P., Jensen J., Gordon M., Webb S., Stevens W., Krauss M., Garmer D., Bäsch H., Cohen D. An effective fragment method for modeling solvent effects in quantum mechanical calculations II J. Chem. Phys. 1996. V. 105. P. 1968-1986.

57. Gordon M.S., Freitag M.A., Bandyopadhyay P., Jensen J.H., Kairys V., Stevens W.J. The Effective Fragment Potential Method: A QM-Based MM Approach to Modeling Environmental Effects in Chemistry II J. Phys. Chem. A 2001. V. 105. P. 293-307.

58. Granovsky A.A. Firefly version 7.I.G. // URL http://classic.chem.msu.su/gran/firefly/index.html.

59. Ponder J. W. TINKER-Sоftware Tools for Molecular Design. // URL http ://dasher. wustl. edu/tinker/.

60. Nemukhin A. V., Grigorenko B.L., Topol I.A., Burt S.K. Flexible effective fragment QM/MM method: Validation through the challenging tests // J. Comput. Chem. 2003. V. 24. P. 1410-1420.

61. Немухин A.B., Григоренко Б.Л., Грановский A.A. Молекулярное моделирование с программой PC GAMESS: от двухатомных молекул до ферментов // Вестник Моск. Ун-та, Сер. Химия 2004. Т. 45. С. 75-102.

62. Hollas J. M. Modern Spectroscopy II John Wiley & Sons, Ltd 2004. 483 p.

63. Медведев Э.С., Ошеров, B.B. Теория безызлучательных переходов в многоатомных молекулах. Москва: Наука. 1983. 280 с.

64. Foresman J.В., Head-Gordon M., Pople J.A., Frisch M.J. Toward a systematic molecular orbital theory for excited states II J. Phys. Chem. 1992. V. 96. P. 135-149.

65. ChaiJ., Head-Gordon M. Systematic optimization of long-range corrected hybrid density functionals II J. Chem. Phys 2008. V. 128. P. 084016(1)-084106(15).

66. Nakano H., Uchiyama R., Hirao K. Quasi-degenerate perturbation theory with general multiconflguration self-consistent field reference functions // J. Comput. Chem. 2002. V. 23. P. 1166-1175.

67. Granovsky A.A. Extended multi-configuration quasi-degenerate perturbation theory: The new approach to multi-state multi-reference perturbation theory // J. Chem. Phys. 2011. V.134. P. 214113(1)-214113(14).

68. Nemukhin A. V., Bochenkova A. V., Bravaya K.B., Granovsky A.A. Accurate modeling of the So-Si photo-absorption in biological chromophores // Proc. SPIE Int. Soc. Opt. Eng. 2007. V. 6449. P. 64490N1-5.

69. Nemukhin A. V., Topol I.A., Burt S.K. Electronic excitations of the chromophore from the fluorescent protein asFP595 in solutions // J. Chem. Theory Comput. 2006. V. 2. P. 292-299.

70. Das A.K., Hasegawa J.-Y., Miyahara T., Ehara M., Nakatsuji H. Electronic excitations of the green fluorescent protein chromophore in its protonation states: SAC/SAC-CI study HJ. Comput. Chem. 2003. V. 24. P. 1421-1431.

71. Bravaya K.B., Bochenkova A.V., Granovsky A.A., Nemukhin A.V. Modeling of the structure and electronic spectra of green fluorescent protein chromophore // Russ. J. Bhys. Chem. B. 2008. V. 2. P. 671-675.

72. Andersen M., Stiel A.C., Trowitzsch S., Weber G., Eggeling C., Wahl M.C., Hell S. W., Jacobs S. Structural basis for reversible photoswitching in Dronpa // Broc. Natl. Acad. Sei. USA. 2007. V. 104. P. 13005-13009.

73. Nifosi R., Ferrari A., Arcangeli C., Tozzini V., Bellegrini V., Beltram F. Photoreversible Dark State in a Tristable Green Fluorescent Protein Variant // J Bhys Chem B. 2003. V. 107. P. 1679-1684.

74. Bizzarri R., Serresi M., Cardarelli F., Abbruzzetti S., Campanini B., Viappiani C., Beltram F. Single Amino Acid Replacement Makes Aequorea victoria Fluorescent Proteins Reversibly Photoswitchable II J. Am. Chem. Soc. 2009. V. 132. P. 85-95.

75. Luin S., Valerio V., Lanza G., Bizzarri R., Nifosi R., Amat B., Tozzini V., Serresi M., and Beltram F. Raman Study of Chromophore States in Photochromic Fluorescent Proteins II J. Am. Chem. Soc. 2009. V. 131. P. 96-103.