Пост-транскрипционное редактирование мРНК в Trypanosoma brucei на примере мРНК митохондриальной аденозинтрифосфатазы-6 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Желонкина, Алевтина Геннадьевна

• Желонкина, Алевтина Геннадьевна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Желонкина, Алевтина Геннадьевна

Список принятых сокращений Введение

Практическая ценность работы

Научная новизна работы

Публикации и апробация работы

Вклад автора

Глава 1. Обзор литературы «Пост-транскрипционное редактирование мРНК»

1.1. Виды редактирования

1.2. Трипаносомы - возбудители сонной болезни 15 % 1.3. Особенности клеточной структуры и генома трипаносом

V 1.4. Эволюция редактирования РНК

1.5. РНК, направляющие редактирование мРНК

1.6. Механизм редактирования - модели ранние и модель современная

1.7. Ферменты, катализирущие редактирование мРНК в трипаносомах, образуют комплекс

1.8. Идентификация компонентов ферментативного комплекса редактирования

1.9. Циклы U-делеции и U-вставки

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Реактивы

2.2. Ферменты

2.3. Изотопы 40 ") 2.4. Материалы

2.5. Матрицы, использованные в реакциях ПЦР

2.6. Олигонуклеотиды и олигорибонуклеотиды

2.7. Линия трипаносом

2.8. Среда и условия выращивания Т. brucei 43 ^ 2.9. Антитела для иммуноблотинга

2.10. Растворы

2.11. Методы

2.11.1. Выделение митохондриального экстракта из Т. brucei и его дальнейшая очистка

2.11.2. Конструирование плазмид для трансформации

2.11.3. Проведение трансформации

2.11.4. Характеристика экстрактов с помощью Норзерн и Вестерн блот анализов

• 2.11.5. Получение мРНК и гРНК

V, 2.11.6. Мечение и секвенирование полученных РНК

2.11.7. Полный цикл реакций редактирования

2.11.8. Анализ «затравленного» удлинения праймера

2.11.9. Анализ двух первых стадий в обоих циклах редактирования

2.11.10. Подтверждение формирования дуплекса между мРНК и гРНК

2.11.11. Предрасщепленный анализ редактирования

2.11.12. Проведение анализа аденилирования

2.11.13. Количественный анализ

Глава 3. Результаты и обсуждения

3.1. Критичные элементы гРНК для редактирования мРНК

3.2. Функции РНК-лигаз комплекса редактирования

3.3. Ферментативная активность, относящаяся к одному виду редактирования, может также функционировать в другом виде редактирования 73 3.3.1. DREL может функционировать в процессе U-вставки

3.3.2. Фермент U-вставки (TUTase) функционирует в цикле U-делеции при добавлении UTP ^ 3.4. Заключение

Выводы ■* Список публикаций

Благодарности

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пост-транскрипционное редактирование мРНК в Trypanosoma brucei на примере мРНК митохондриальной аденозинтрифосфатазы-6»

Открытие в конце 80-х годов редактирования РНК еще раз заставило изменить наши взгляды на реализацию генетической информации в клетке, « постулированной Уотсоном и Криком, где закодированная в ДНК информация л транскрибируется в РЖ, которая в свою очередь транслируется в f 0 функциональный белок. Редактированием РНК (editing) называются изменения в последовательности РНК на посттранскрипционном уровне. В настоящее время, РНК-редактирование рассматривается, как сложный процесс генной экспрессии, с помощью которого организм может увеличить число синтезируемых белков без увеличения числа генов в геноме (Simpson, L. и

• Shaw, J., 1989).

При изучении экспрессии гена цитохром оксидазы, а именно субъединицы II в ^ трипаносомах, было впервые замечено, что последовательность РНК, соответствующая этому гену, не совпадает с кодирующей ее ДНК (Benne et al., 1986). С тех пор процессы редактирования были обнаружены у разных эукариот. Редактированию подвергаются РНК разного типа: матричные, транспортные, рибосомальные (Backus et al., 1992; Stuart et al., 1997; Одинцова M.C., Юрина Н.П., 2000; Masanori Kugita et al., 2003; Flomen et al., 2004). Те гены, РНК которых проходят через процесс редактирования, называются криптогенами (Simpson, L. и v# Shaw, J., 1989). Некоторые транскрипты криптогенов подвергаются лимитирующей модификации последовательности, другие - подвергаются такому массивному г изменению, что их кодирующая последовательность становится очевидной только после редактирования.

Целью настоящей работы являлось исследование пост-транскрипционного механизма редактирования мРНК в митохондриях Т. brucei на примере А редактирования пре-мРНК субъединицы-6 аденозинтрифосфатазы (А6). В связи с этим необходимо было решить следующие задачи: ^ 1. Изучить, какие элементы гРНК являются критичными для эффективности процессов редактирования мРНК.

2. Определить роль белков IV и V основного ферментативного комплекса в обоих циклах редактирования пре-мРНК как при вставке так и при удалении Ui нуклеотидов.

3. Выяснить состоит ли комплекс редактирования из двух физически отдельных субкомплексов, ответственных за катализ либо U-вставки, либо U-делеции, и происходит ли перекрывание ферментативных активностей между двумя отдельными активными центрами комплекса, если таковые существуют.

Актуальность представленной работы, прежде всего, заключается в том, что изучение процесса редактирования мРНК поможет прояснить тонкие механизмы ^ созревания РНК в клетке.

Практическая ценность работы

Так как сложившиеся подходы для борьбы как с человеческим (сонная болезнь), так и животным (болезнь Нагана) трипаносомиазисом потерпели неудачу, определение новых аспектов биохимии и молекулярной биологии трипаносом может способствовать выявлению новых мишеней для создания более эффективных вакцин и поиску лечебных препаратов.

Научная новизна работы Впервые установлены характеристики гРНК, которые являются критичными для направления эффективного редактирования in vitro.

С учетом критичных элементов были сконструированны новые гРНК in vitro, которые способствовали получению высокого выхода редактированного продукта, составившего в этом случае более 60% от нередактированной мРНК, что является значительным увеличением по сравнению с 1% в случае с природной гРНК.

Белки IV и V являются первыми двумя белками основного ферментативного комплекса, роль которых была определена в процессе редактирования пре-мРНК:

- белок IV абсолютно необходим для сшивания РНК в процессе U-делеции, и поэтому был назван DREL (Deletion RNA Editing Ligase - РНК-лигаза для редактирования посредством делеции);

- белок V функционирует специфически в цикле U-вставки, и, следовательно, был назван IREL (Insertion RNA Editing Ligase - РНК-лигаза для редактирования посредством вставки).

- DREL также может заместить IREL в цикле U-вставки при инактивировании с помощью РНК-интерференции гена, ответственного за IREL, тогда как IREL не обладает такой замещающей функцией.

Впервые показано, что TUTase, являясь ферментативной активностью вставочного редактирования, также функционирует в цикле U-делеции при обеспечении физиологического уровня UTP.

Несмотря на то, что процессы U-делеции и U-вставки отличаются на всех трех этапах каждого цикла, впервые было показано, что ферментативная активность, относящаяся к одному виду редактирования, может также функционировать в другом виде редактирования, указывая на то, что белковый комплекс, ответственный за редактирование пре-мРНК в митохондриях Т. brucei, не обладает теми функциональными ограничениями, которые были приняты ранее.

Публикации и апробация работы

По материалам работы опубликованы 6 статей и тезисы 5 докладов. Результаты работы были представлены на нескольких международных конференциях и симпозиумах: "Molecular Parasitology meeting" (Marine Biological laboratory Woods Hole, Massachusetts, USA - in 1999, 2000, 2002), "The Fifth Annual Meeting of the RNA Society" (University of Wisconsin, USA - 2000), "The Sixth Annual Meeting of the RNA Society" (Banff, Alberta, Canada - 2001), "Tetra-State Trypanosome Meeting"

Rockefeller University, USA - 2002, 2003, 2004). А также на трех коллоквиумах Департмента Биологической Химии в Johns Hopkins University, School of Medicine, ^ Baltimore, USA, трижды на семинарах "Parasitology Club" JHU, School of Medicine,

Baltimore, USA и дважды на "Biology Club" в JHU, Homewood, Baltimore, USA. v Вклад автора

Основные эксперименты были проведены автором. Часть работы, связанная с трансформацией клеток в Т. brucei, а именно: приготовление зондов, трансформация и выделение клеточного лизата из клеточных клонов, - была выполнена в сотруднечестве с доктором Ш. О'Хёрном, и Д. JIo (Johns Hopkins University, США).

• Работа выполнена при финансовой поддержке Public Health Service, грант за номером GM34231 от General Medical Science Institute, США.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Желонкина, Алевтина Геннадьевна

выводы.

Выявлены элементы гидРНК, в механизме пост-транскрипционного редактирования мРНК в митохондриях Trypanosoma brucei необходимые для эффективного цикла делеции: якорный дуплекс между 3'-концевым участком мРНК и 5'-участком гидРНК; неспаренные основания, прилегающие к участку редактирования; элементы гидРНК для стабилизации расщепленного 5'-участка пре-мРНК.

Впервые продемонстрировано, что РНК-лигаза для делеционного редактирования (DREL) абсолютно необходима для сшивания мРНК в процессе U-делеции, тогда как РНК-лигаза для вставочного редактирования (IREL) функционирует только в цикле U-вставки.

С помощью РНК-интерференции показано, что DREL может заместить IREL в цикле U-вставки при инактивировании гена, ответственного за IREL, тогда как IREL не обладает такой замещающей функцией.

Впервые показано, что при обеспечении физиологического уровня UTP TUTase, являясь белком вставочного редактирования, также функционирует и в цикле U-делеции до стадии сшивания.

На примере DREL и TUTase впервые было показано, что ферментативная активность, относящаяся к одному виду редактирования, может также функционировать в другом виде редактирования, указывая на то, что белковый комплекс, ответственный за редактирование пре-мРНК в митохондриях Trypanosoma brucei, не обладает теми функциональными ограничениями, представления о которых были сформулированы до наших исследований.

3.4. Заключение

До нашей работы было известно, что TUTase р57 функционирует только в циклах U-вставки, и не было показано, что хотя бы одна активность целого комплекса редактирования могла функционировать как в U-делеции, так и в U-вставке. Нами были получены результаты, подтверждающие то, что добавление Л

UTP к реакциям U-делеции приводит к образованию более длинных продуктов, т.е. наблюдается эффект UTP. Одной из задач данного исследования было выяснить: возникает ли это явление в результате ингибирования З'-и-экзонуклеазы или активирования TUTase? Мы показали, что эффект UTP осуществляется в участке редактирования U-делеции (Рис. 17D), влияет на модификацию мРНК до стадии Ф сшивания после частичного удаления U нуклеотидов (Рис. 18), и возникает этот эффект UTP в результате активирования TUTase р57, а не ингибирования З'-U-экзонуклеазы. Более того, только функционирующий белок вставочного редактирования - TUTase р57 - добавляет U также в цикле U-делеции. Таким образом, TUTase комплекса редактирования действует не только в U-вставке, но и в U-делеции при редактировании мРНК.

Несмотря на то, что трипаносомы нуждаются в точно редактированном транскрипте, было показано in vivo, что более чем 90% мРНК в Г. brucei является неправильно редактированной (Decker and Sollner-Webb, 1990). Это означает, что редактирование in vivo проходит с высоким уровнем ошибок. Ранее было показано, что частичные продукты делеции способствуют повторному редактированию, пока г точное редактирование не будет достигнуто (Cruz-Reyes and Sollner-Webb, 1996). Необходимость повторного редактирования может замедлить процесс U-делеции (Cruz-Reyes and Sollner-Webb, 1996). Действительно, при исследованиях частично редактированной мРНК в L. tarentolae, было обнаружено, что in vivo точное редактирование делеционного участка происходит дольше, чем редактирование вставочного участка (Sturm and Simpson, 1990). Более того, in vivo блоки нетипичного редактирования часто начинаются в природных участках делеции, где вставлены дополнительные U-нуклеотиды (Sturm and Simpson, 1990). Эти вставки катализируются ферментом TUTase. Добавленные U-нуклеотиды способствуют присоединению гРНК, которая запускает ошибочное редактирование (Sturm et al., 1992; Kable et al., 1996). Давно замеченная, но до сих пор необъясненная ассиметрия процесса редактирования, в котором 90% участков редактирования являются U-вставки и только 10% - U-делеции (Feagin et al., 1988; Blum et al., 1990), вероятно, отображает эволюционное предпочтение первому процессу перед вторым. Возможно, это происходило из-за накопления частичных продуктов, образующихся в результате действия TUTase. Все это позволяет нам заключить, что TUTase процесса U-вставки может также функционировать в процессе U-делеции in vivo.

TUTase может действовать не только после делеционного расщепления и полного удаления U (Рис. 19А,С), но также и до того, как З'-и-экзонуклеаза закончила свое действие (Рис. 19D). После действия TUTase происходит сшивание мРНК. Поскольку частичные продукты U-делеции не обладают точным мостом сшивания, они будут сшиваться лигазой DREL, а не лигазой IREL, которой необходим точный мост сшивания между мРНК с гРНК (Igo et al., 2000, 2002а; Cruz-Reyes et al., 2002). Таким образом, действие TUTase обеспечивает дополнительную стадию, которую РНК субстрат делеции проходит до и после других стадий процесса U-делеции (Рис. 24). Наличие «смешанного» цикла редактирования говорит о том, что вставочный и делеционный субкомплексы не разделяют РНК субстраты. Скорее всего, ферментативный комплекс обеспечивает один эффективный путь редактирования для РНК, в котором белки комплекса редактирования конкурируют за обладание субстратом на основании их кинетических параметрах и/или аффинном связывании.

U-делеция без UTP:

R У

ADP ^ эндо ■RUoh^ v^rnri 3'

-и-экзо

U-делеция с UTP вовлекает TUTase: и банд-IV)

DREL лигаза

N 11

RUoh

TUTase

H 5

П^ГГГГ^

Полный продукт U-делеции банд-IV) XDREL Т лигазг

5'Л лигаза

5'

Частичный продукт U-делеции

U-вставка с UTP:

73'

ADP эндо

RUoh . .

•■- рТ~П~Т"л3 банд-V) f

IREL лигаза

Щ—RUj-r-T-T-Va'

Полный продукт U-вставки

Рис. 24. Пересмотренная схема механизма редактирования. Левая и правая колонки этой схемы представлены и объяснены на Рис. 7. Средняя колонка является заключением анализа, в котором добавление UTP влияет на циклы U-делеции, генерируя частичные продукты и вовлекая вставочную TUTase в процесс U-делеции. 4

Возможно, TUTase не является единственной активностью комплекса редактирования, которая фукционирует, как в U-делеции, так и в U-вставке. Так например, мы показали, что DREL необходим для сшивания в U-делеции, тогда как IREL эффективно сшивает U-вставку. В то же время, мы показали, что при ^ инактивировании белка IREL с помощью механизма РНК-интерференции, DREL сшивает продукты U-вставки (Рис. 16). В настоящий момент неизвестно, может ли i

DREL сшивать в цикле U-вставки в неповрежденном комплексе, но эта лигаза, возможно, является еще одним компонентом комплекса, который может функционировать в обеих формах редактирования. Также позволительно строить гипотезу, что З'-и-экзонуклеаза, будучи активностью процесса U-делеции, может функционировать в U-вставке для удаления экстра U нуклеотидов, которые могут • быть добавлены ферментом TUTase (Igo et al., 2002b; McManus et al., 2000).

Таким образом, несмотря на то, что в целом процессы U-делеции и U-вставки отличаются на всех трех стадиях каждого цикла, в данной работе впервые было показано, что ферментативная активность, относящаяся к одному виду редактирования, может также функционировать в другом виде редактирования. Это указывает на то, что белковый комплекс, ответственный за редактирование мРНК в митохондриях Т. brucei, не обладает теми функциональными ограничениями, представления о которых были сформулированы до наших исследований.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Желонкина, Алевтина Геннадьевна, 2006 год

1. Дейчман, A.M. (1999) Редактирование РНК // Обзор, 14.

2. Микрюков, К. А. (1993) Зоология // Москва.

3. Одинцова М.С., Юрина Н.П. (2000) Редактирование РНК в хлоропластах и митохондриях растений // Физиология растений, 47: 307-320.

4. Сайт всемирной организации здоровья (W.H.O) // № 259, 2001.

5. Alfonzo, J. D., Blanc, V., Esteves, A. M., Rubio, M. A., and Simpson, L. (1999) С to U editing of the anticodon of imported mitochondrial tRNA(Trp) allows decoding of the UGA stop codon in Leishmania tarentolae // EMBO J., 18(24): 7056-7062.

6. Allen, Т.Е., Heidmann, S., Reed, R., Myler, P.J., Gdringer, H.U., and Stuart, K.• (1998) Association of guide RNA binding protein gBP21 with active RNA editingcomplexes in Trypanosoma brucei И Mol. Cell. Biol., 18: 6014-6022.

7. Alsford S, Wickstead B, Ersfeld K, Gull K. (2001) Diversity and dynamics of the minichromosomal karyotype in Trypanosoma brucei II Mol Biochem Parasitol., 113(1): 79-88.

8. Aphasizhev, R., Aphasizheva, I., Nelson, R., Gao, G., Simpson, A., Kang, X., Falick, A., Sbicego, S., Simpson, L. (2003a) Isolation of a U-insertion/deletion editing complex from Leishmania tarentolae mitochondria // EMBO J., 22(4), 913-924.

9. Aphasizhev, R., Aphasizheva, I., Simpson, L. (2003b) A tale of two TUTases // PNAS, 100(19), 10617-10622.

10. Backus, J.W., Smith, H.C. (1992) Three distinct RNA sequence elements are required for efficient apolipoprotein В (apoB) RNA editing in vitro // Nucleic Acids Res, 20 (22), 6007-14.

11. Bakalara N., Simpson A. M. and Simpson L. (1989) The Leishmania kinetoplast-mitochondrion contains terminal uridylyltransferase and RNA ligase activities // J Biol Chem., 264(31), 18679-18686.

12. Bass, B.M. (1993) RNA editig: New uses for old players in the RNA world. In the RNA world // Gesteland, R. F., Atkins, J. F. (ed), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, p. 383.

13. Benne, R., Van den Berg, J., Brakenhoff, J., Sloof, P., Van Boom, J., and Tromp, M. (1986) Major transcript of the frameshifted coxll gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA // Cell, 46, 819.

14. Bhat, G. J., Koslowsky, D. J., Feagin, J. E., Smiley, B. L., and Stuart, K. (1990) An extensively edited mitochondrial transcript in kinetoplasteds encodes a protein homologous to ATPase subunit 6 // Cell, 61, 885-894.

15. Blom D., de Haan a., van den Berg M., Sloof P., Jirkul M., Lukesl J. and Benne R. (1998) RNA editing in the free-living bodonid Bodo saltans // Nucleic Acids Research, 26(5), 1205-1213.

16. Blum B, Bakalara N, and Simpson L. (1990a) A model for RNA editing in kinetoplastid mitochondria: "guide" RNA molecules transcribed from maxicircle DNA provide the edited information // Cell, 60(2): 189-98.

17. Blum В., and Simpson, L. (1990b) Guide RNAs in kinetoplastid mitochondria have a nonencoded 3' oligo(U)tail involved in recognition of the preedited region // Cell, 62: 391-397.

18. Blum, В., Sturm, N.R., Simpson, A.M., Simpson, L. (1991) Chimeric gRNA-mRNA molecules with oligo(U) tails covalently linked at sites of RNA editing suggest that U addition occurs by transesterification // Cell, 65(4): 543-550.

19. Borst P. (1986) Discontinuous transcription and antigenic variation in tiypanosomes // Annu Rev Biochem., 55: 701-32.

20. Burgess, M., Heidmann, S., Stuart, K. (1999) Kinetoplast RNA editing does not require the terminal 3' OH of the gRNA terminus but can inhibit in vitro U insertion //RNA, 5: 883-892.

21. Byrne E.M., Cornell G.J., Simpson L. (1996) Guide RNA-directed uridine insertion RNA editing in vitro // EMBO J., 15(23): 6758-6765.

22. Casey T.M., Dufall K.G, Arthur P.G. (1999) An improved capillary electrophoresis method for measuring tissue metabolites associated with cellular energy state // Eur J Biochem., 261(3): 740-745.

23. Cavalier-Smith T. (1997). Cell and genome coevolution: facultative anaerobiosis, glycosomes and kinetoplastan RNA editing // Trends Genet., 13: 6-9.

24. Cech, T. (1991) RNA editing: world's smallest introns? I I Cell, 64: 667-669.

25. Cross G.A.M. (1975) Identification, purification and properties of clone-specific glycoprotein antigens constituting the surface coat of Trypanosoma brucei II Parasitology, 71: 393-417.

26. Cross G.A.M. (1990) Glycolipid anchoring of plasma membrane proteins // Annu. Rev. Cell Biol., 6: 1-39.

27. Cruz-Reyes J., and Sollner-Webb B. (1996) Trypanosome U-deletional RNA editing involves guide RNA-directed endonuclease cleavage, terminal U exonuclease, and RNA ligase activities//PNAS, 93(17): 8901-8906.

28. Cruz-Reyes J, Rusche LN, Sollner-Webb B. (1998a) Trypanosoma brucei U insertion and U deletion activities co-purify with an enzymatic editing complex but are differentially optimized //Nucleic Acids Res. 26(16): 3634-3639.

29. Cruz-Reyes J., Rusche L.N., Piller K.J., Sollner-Webb B. (1998b) T. brucei RNA editing: adenosine nucleotides inversely affect U-deletion and U-insertion reactions at mRNA cleavage // Mol Cell., 1(3): 401-409.

30. Cruz-Reyes, J., Zhelonkina, A. G., Rusche, L., and Sollner-Webb B. (2001) Trypanosome RNA Editing: Simple Guide RNA Features Enhance U Deletion 100Fold // Mol. Cell. Biol., 21: 884-892.

31. Cruz-Reyes, J., Zhelonkina, A., Huang, C., and Sollner-Webb, B. (2002) Distinct functions of two RNA ligases in active T. brucei RNA editing complexes // Mol. Cell Biol., 22: 4652-4660. The first two authors are co-first authors.

32. Das, A. and Bellofatto, V. (2003) RNA polymerase II-dependent transcription in trypanosomes is associated with a SNAP complex-like transcription factor // PNAS, 100(1): 80-85.

33. Decker, C.G., Sollner-Webb, B. (1990) RNA editing involves indiscriminate U changes throughout precisely defined editing domains // Cell, 61: 1001-1011.

34. Donelson, J., Gardner, M., and El-Sayed, N. (1999) More surprises from Kinetoplastida // PNAS, 96: 2579-2581.

35. Drozdz M, Palazzo SS, Salavati R, O'Rear J, Clayton C, Stuart K. (2002) TbMP81 is required for RNA editing in Trypanosoma brucei И EMBO J., 21(7): 1791-1799.

36. Ernst, N., Panicucci, В., Igo, R.P., Jr., Panigrahi, A.K., Salavati, R., Stuart, K. (2003) TbMP57 is a 3' terminal uridylyl transferase (TUTase) of the Trypanosoma brucei editosome // Mol. Cell., 11: 1525-1536.

37. Estevez A. M., Simpson L. (1999) Uridine insertion/deletion RNA editing in trypanosome mitochondria a review // Gene, 240: 247-260.

38. Fairlamb A.H. (1990) Novel biochemical pathways in parasitic protozoa // Parasitol, 99S: 93-112.

39. Feagin, J. E., Abraham J., and Stuart, K. (1988) Extensive editing of the cytochrome с oxidase III transcript in Trypanosoma brucei II Cell, 53: 413-422.

40. Flomen R, Knight J, Sham P, Kerwin R, MakojfA. (2004) Evidence that RNA editing modulates splice site selection in the 5-HT2C receptor gene // NAR, 32(7), 21132122.

41. Gibson, W., Bailey, M. (2003) The development of Trypanosoma brucei within the tsetse fly midgut observed using green fluorescent trypanosomes // Kinetoplastid Biol. Dis., 2 (1), 1-13.

42. Gilinger, G. and Bellofatto, V. (2001) Trypanosome spliced leader RNA genes contain the first identified RNA polymerase II gene promoter in these organisms // Nucleic Acids Research, 29(7), 1556-1564.

43. Goringer, H.,U., Koller, J., and Shu, H. (1995) Multicomponent complexes involved in kinetoplastid RNA editing // Parasitol. Today, 11,265-267.

44. Gott, J., Visomirski, L., and Hunter, J. (1993) Substitutional and insertional RNA editing of the cytochrome с oxidase subunit 1 mRNA of Physarum polycephalum // J. Biol. Chem., 268: 25483-25486.

45. Gott, J., and Emeson, R. (2000) Functions and Mechanisms of RNA Editing // Ann. Rev. Genet., 34:499-531.

46. Harlow, E., and Lane, D. (1988) Antibodies: a laboratoiy manual // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

47. Harris M.E., Moore D. R., and Hajduk S. M. (1990) Addition of uridines to edited RNAs in trypanosome mitochondria occurs independently of transcription // J Biol Chem., 265(19): 11368-11376.

48. Harris M.E., Decker C., Sollner-Webb В., and Hajduk, S. (1992) Specific cleavage of pre-edited mRNAs in tiypanosome mitochondrial extracts // Mol Cell Biol., 12(6), 2591-2598.

49. Hajduk, S. (1997) Defining the editing 'reaction' // Trends Microbiol., 5, 1-2.

50. Hajduk, S.L., and Sabatini, R.S. (1998) Mitochondrial mRNA editing in Kinetoplastid protozoa. Modification and Editing of RNA // Chapter 21, 377-393.

51. Hoare, C. (1972) The Trypanosomes of mammals: a zoological monograph // Oxford, Blackwell Scientific Pub. p.749.

52. Huang, С., Cruz-Reyes, J., Zhelonkina, A., O'Hearn, S., Wirtz, E. and Sollner-Webb, B. (2001) Roles for the ligases in the RNA editing complex of T. brucei: band IV is needed for U-deletion and RNA repair // EMBO J., 20: 4694-4704.4 k

53. Huang, C.E., O'Hearn, S.F., and Sollner-Webb, B. (2002) Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein // Mol

54. Cell Biol., 22(9): 3194-3203.

55. Igo, R.P., Jr., Palazzo, S.S., Burgess, M.L., Panigrahi, A.K., Stuart, K. (2000) Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of the kinetoplastid insertion RNA editing // Mol. Cell. Biol., 20: 8447-8457.

56. Igo R.P., Jr., Lawson S.D., Stuart K. (2002a) RNA sequence and base pairing effects on insertion editing in Trypanosoma brucei // Mol Cell Biol., 22(5): 1567-1576.

57. Koslowsky D.J., Yahampath G. (1997) Mitochondrial mRNA 3' cleavage/polyadenylation and RNA editing in Trypanosoma brucei are independent events // Mol Biochem Parasitol., 90(1): 81-94.

58. Kapushoc, S., Simpson, L. (1999) In vitro uridine insertion RNA editing mediated by cis-acting guide RNAs II RNA, 5: 656-669.

59. Kapushoc, S.T., Alfonzo, J. D., Rubio, M. A., and Simpson, L. (2000) End processing ^ precedes mitochondrial importation and editing of tRNA in Leishmania tarentolae II

60. The Journal of Biolog. Chem., 275 (48): 37907-37914.

61. Landweber L.F. (1992) The evolution of RNA editing in kinetoplastid protozoa // BioSystems, 28:41-45.

62. Landweber L.F. and Gilbert W. (1994) Phylogenetic analysis of RNA editing: A primitive genetic phenomenon // Proc. Natl Acad. Sci. USA, 91: 918-921.

63. Law, J., Huang, C., O'Hearn, S., and Sollner-Webb, B. (2005) In Trypanosoma brucei RNA editing, band II enables recognition specifically at each step of the U insertion cycle //Mol. and Cell Biol., 25, p. 2785-2794.

64. Lonergan, К. M., and M. W. Gray. (1993) Editing of transfer RNAs in Acanthamoeba castellani mitochondria // Science, 259: 812-816.

65. Leung, S. S., and Koslowsky D. J. (2001) Interactions of mRNAs and gRNAs involved in trypanosome mitochondrial RNA editing: structure probing of an mRNA bound to its cognate gRNA // RNA, 7(12), 1803-1816.

66. Madison-Antenucci, S., Sabatini, R.S., Pollard, V.W., Hajduk, S.L. (1998) Kinetoplastid RNA-editing-associated protein 1 (REAP-1): a novel editing complex protein with repetitive domains // EMBO J., 17: 6368-6376.

67. Madison-Antenucci S., Hajduk S.L. (2001) RNA editing-associated protein 1 is an RNA binding protein with specificity for preedited mRNA // Mol Cell. 7(4), 879-886.

68. Madison-Antenucci, S., Grams, J., Hajduk, S. L. (2002) Editing machines: the complexities of Trypanosome RNA editing // Cell, 108: 435-438.

69. Masanori Kugita, Yuhei Yamamoto, Takeshi Fujikawa, Tohoru Matsumoto and Koichi Yoshinaga. (2003) RNA editing in hornwort chloroplasts makes more than half the genes functional //Nucleic Acids Res, 31 (9): 2417-2423.

70. Maslov D. A. and Simpson L. (1992) The polarity of editing within a multiple gRNA-mediated domain is due to formation of anchors for upstream gRNAs by downstream editing//Cell, 70: 459-467.

71. Maslov, D. A., Avila, H. A., Lake, J. A., Simpson, L. (1994) Evolution of RNA editing in kinetoplastid protozoa // Nature (London), 369: 345-348.

72. McConville, M.J., Turco, S.J., Ferguson, M.A., Sacks, D.L. (1992) Developmental modification of Lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania majorШpromastigotes to an infections stage // EMBO J., 11: 3593-3600.

73. McManus, M., Adler, В., Pollard, V. and Hajduk, S. (2000) T. brucei guide RNA > poly(U) tail formation is stabilized by cognate mRNA // Mol, Cell Biol. 20: 883-891.

74. McManus, M.T., Shimamura, M., Grams, J., Hajduk, S.L. (2001) Identification of candidate mitochondrial RNA editing ligases from Trypanosoma brucei // RNA., 7(2): 167-175.

75. Missel A., Souza A.E., Norskau G., Goringer H.U. (1997) Disruption of a gene encoding a novel mitochondrial DEAD-box protein in Trypanosoma brucei affects edited mRNAs //Mol Cell Biol. 17(9): 4895-48903.

76. Moore, M., Sharp, P. (1992) Site-specific modification of pre-mRNA: 2' hydroxyl group at the splice site // Science, 256: 992-997.

77. Moore, A., Mercer, J., Dutina, G., Donahue, C., Ryll, T. (1997) Effects of * ® temperature shift on cell cycle, apoptosis and nucleotide pools in CHO cell batchcultures // Cytotech, 23: 47-54.

78. Muller U.F., Lambert L., Goringer H.U. (2001) Annealing of RNA editing substrates facilitated by guide RNA-binding protein gBP21 // EMBO J. 20(6): 1394-13404.

79. O'Hearn, S.F., Huang, C.E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb B. (2003) Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical andmaintains band V ligase, which is nonessential // Mol Cell Biol., 23(21): 7909-7919.

80. Panigrahi, A., Gygi, S., Ernst, N., Igo, R., Stuart, Kf et al (2001) Association of two novel proteins, TbMP52 and TbMP48, with the T. brucei RNA editing complex //

81. Mol. Cell Biol. 21: 380-389.

82. Panigrahi, A., Schnaufer, A., Ernst, K, Salavati, R., Stuart, K. et al (2003) "> Identification of novel components of Trypanosoma brucei editosomes // RNA. 9:484.492.

83. Pays, E., Lips, S., Nolan, D., Vanhamme, L., Perez-Morga, D. (2001) The VSG expression sites of Trypanosoma brucei: multipurpose tools for the adaptation of the parasite to mammalian hosts. Mol. Biochem // Parasitol., 114 (1), 1-16.

84. Pollard, V.W., Harris, M.E., Hajduk, S.L. (1992) Native mRNA editing complexes from Trypanosoma brucei mitochondria // EMBO J., 11(12):, 4429-4438.

85. Read, L.K., Myler, P. J., Stuart, K. (1992) Extensive editing of both processed and preprocessed maxicircle CR6 transcripts in Tiypanosoma brucei // J Biol Chem., 267(2): 1123-8.

86. Rusche L.N., Piller K.J., Sollner-Webb B. (1995) Guide RNA-mRNA chimeras, ® which are potential RNA editing intermediates, are formed by endonuclease and

87. RNA ligase in a trypanosome mitochondrial extract // Mol Cell Biol., 15(6): 29332941.

88. Rusche, L.N., Cruz-Reyes, J., Piller,K.J. and Sollner-Webb,B. (1997) Purification of a functional enzymatic editing complex from Trypanosoma brucei mitochondria // EMBO J., 16: 4069-4081.

89. Rusche LN, Huang CE, Piller KJ, Hemann M, Wirtz E, Sollner-Webb B. (2001) The two RNA ligases of the Trypanosoma brucei RNA editing complex: cloning the essential band IV gene and identifying the band V gene // Mol Cell Biol., 21(4): 979989.

90. Sabatini R., Hajduk S.L. (1995) RNA ligase and its involvement in guide RNA/mRNA chimera formation. Evidence for a cleavage-ligation mechanism of Trypanosoma brucei mRNA editing // J Biol Chem., 270(13):7233-7240.

91. Schnaufer, A., Ernst, N.L., Palazzo, S.S., O'Rear, J., Salavati, R. and Stuart, K. (2003) Separate insertion and deletion subcomplexes of the Trypanosoma brucei RNA editing complex // Moll. Cell., 12: 307-319.

92. Seiwert, S.D., Stuart, K. (1994) RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro // Science, 266(5182): 114-117.

93. Seiwert S.D., Heidmann S., Stuart K. (1996) Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing // Cell., 84(6): 831-841.

94. Shapiro T.A., EnglundP.T. (1995) The structure and replication of kinetoplast DNA // Annu Rev Microbiol., 49: 117-143.

95. Simpson L. (1986) Kinetoplast DNA in trypanosomid flagellates // Int Rev Cytol., 99,119-79.t

96. Simpson, L., Thiemann, O. #., Savill, N. J., Alfonzo, J. D., and Maslov D. A. (2000). Evolution of RNA editing in trypanosome mitochondria // PNAS, 97 (13), 69866993.

97. Simpson, L., Sbicego, S. and Aphasizhev, R. (2003) Uridine insertion/deletion RNA

98. Ф editing in trypanosome mitochondria: a complex business // RNA, 9: 265-276.

99. Simpson L, Aphasizhev R, Gao G, Kang X. (2004) Mitochondrial proteins andicomplexes in Leishmania and Trypanosoma involved in U-insertion/deletion RNA editing//RNA., 10(2), 159-170.

100. Sollner-Webb (1991) RNA editing // Curr. Opin. Cell Biol, 3, 1056-1061

101. Stich, A., Abel, P.M., Krishna, S. (2002) Human African trypanosomiasis // British Med. Journal, 203-206.

102. Stich, A., Barret, M.P. and Krishna, S. (2003) Waking up to sleeping sickness // TRENDS in Parasitology, 19 (5), 195-197.

103. Stuart, K., Allen, Т. E., Heidmann, S., and Seiwert, S. D. (1997) RNA editing inkinetoplastid protozoa//Microbiol, and Molec. Biol. Reviews, 61 (1): 105-120.

104. Stuart, K, Panigrahi, A.K (2002) RNA editing: complexity and complications // Mol Microbiol., 45(3): 591-596.

105. Sturm, N.R., Simpson, L. (1990) Kinetoplast DNA minicircles encode guide RNAs for editing of cytochrome oxidase subunit III mRNA // Cell., 61(5), 879-884.

106. Sturm, N.R., Maslov, D.A., Blum, В., Simpson, L. (1992) Generation of unexpected editing patterns in Leishmania tarentolae mitochondrial mRNAs: misediting produced by misguiding // Cell, 70(3): 469-76.

107. Traut, T.W. (1994) Physiological concentrations of purines and pyrimidines // Mol Cell Biochem., 140(1): 1-22.

108. Van der Ploeg, L.H.T. (1987) Control of variant surface antigen switching in trypanosomes // Cell, 51: 159-161.

109. Vickerman, K. (1985) Developmental cycle and biology of pathogenic . trypanosomes // Br. Med. Bulletin, 41, 105-114.

110. Vickerman, K., Tetley, L., Hendry, К. A. K„ and Turner, С. M. R. (1988) Biology of African trypanosomes in the tsetse fly // Cell, 64, 109-119.

111. Wang, Z.J., Morris, M.E. Drew, and Englund, P.T. (2000) Inhibition of Trypanosoma brucei gene expration RNA interference using an integratable vector with opposing T7 promoters //J. Biol. Chem., 275: 40174-40179.

112. Wirtz, E., Ноек, M., and Cross, G.A. (1998) Regulated processive transcription of cromatin by T7 RNA polymerase in Trypanosoma brucei II Nucleic Acid Res., 26: 4626-4634.

113. Wirtz, E, Leal, S., Ochatt, С., and Cross, G.A. (1999) A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Mol. Biochem // Parasitol., 99: 89-101.

114. Zhelonkina A.G., O'Hearn S., Law J., Cruz-Reyes J., Huang C., Alatortsev VS., and Sollner-Webb B. (2006) T. brucei RNA editing: action of U-insertional TUTase within U-deletion cycle // RNA. 12(3): 476-487.