Получение рекомбинантных белков, содержащих антигенные детерминанты вируса гепатита Е, и создание на их основе диагностических тест-систем тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Алаторцева, Галина Ивановна

• Алаторцева, Галина Ивановна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Алаторцева, Галина Ивановна

лизоцима.................................................................................52

4.1.2. Получение рекомбинантных белков в виде водонерастворимых агломератов.............................................................................54

4.2. Синтез и клонирование фрагментов ДНК, кодирующих

участки белков ВГЕ...................................................................56

4.2.1. Клонирование фрагментов ДНК ORF2 вируса гепатита Е............56

4.2.1.1. Синтез и клонирование фрагмента ДНК НЕ40........................56

4.2.1.2. Синтез и клонирование фрагмента ДНК НЕ70........................61

4.2.1.3. Синтез и клонирование фрагмента ДНК НЕ170.......................63

4.2.2. Клонирование фрагмента ДНК ORF3 вируса гепатита Е..............64

4.3. Получение рекомбинантных белков ВГЕ в клетках E.coli..............65

4.3.1. Сравнительное изучение синтеза рекомбинантных полипептидов

в использованных векторных системах..........................................65

4.3.2. Выделение и очистка рекомбинантных полипептидов................66

4.4. Изучение антигенной специфичности полученных рекомбинантных

белков....................................................................................68

4.4.1. Анализ сывороток больных острым вирусным гепатитом из района, эндемичного по гепатиту Е.........................................................68

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение рекомбинантных белков, содержащих антигенные детерминанты вируса гепатита Е, и создание на их основе диагностических тест-систем»

1. ВВЕДЕНИЕ

Вирусные гепатиты в настоящее время являются одной из важнейших проблем инфекционной патологии человека. В первую очередь это относится к парентеральным вирусным гепатитам В и С, однако и энтеральные гепатиты А и Е вносят существенный вклад в эту проблему. Так, например, в развивающихся странах с жарким климатом доля гепатита Е составляет более 50% всех случаев острого гепатита (Purcell R.H. el al. 1988).

Гепатит Е, ранее известный как энтеральный гепатит ни А ни В, в качестве самостоятельной нозологической формы был открыт М.С. Балаяном в 1983 году в опытах с самозаражением (Balayan M.S. et al. 1983). Несмотря на сходство клинических проявлений с другими вирусными гепатитами, заболевание, вызываемое этим вирусом, характеризуется рядом особенностей. В числе этих особенностей взрывной характер эпидемических вспышек, которые могут охватывать десятки и даже сотни тысяч человек, отсутствие хронических форм заболевания, поражение в основном лиц молодого и среднего возраста, выраженная сезонность подъема заболеваемости. Заражение наиболее часто происходит через употребление контаминированной воды и значительно реже, чем при гепатите А, при контакте с заболевшими, поэтому редкими являются случаи семейной очаговости заболевания в эндемичных районах и при завозе инфекции в неэндемичные районы не происходит ее распространения. Особенностью гепатита Е является также высокая частота развития фульминантного гепатита у беременных со смертностью достигающей 20-30%.

Гепатит Е диагносцируется в более, чем 60% всех случаев фулминантного гепатита ни А ни В (Ыапс1а 8.К. е/ а1. 1994).

Неизученным является факт присутствия антител к вирусу у населения развитых стран с умеренным климатом. Относительно высокая (1-3%) частота серопозитивности при отсутствии эпидемической заболеваемости не имеет аналогии с другими энтерально передающимися вирусными инфекциями. Кроме того, антитела к этому вирусу достаточно часто обнаруживаются у регулярных доноров крови, отстраненных от донорства в связи с повышением уровня трансаминаз, медицинских работников, наркоманов, больных хроническими гепатитами В и С, первичной гепатоклеточной карциномой, циррозом печени. Необычно высокая частота обнаружения антител к вирусу гепатита Е у больных хроническим аутоиммунным гепатитом (до 46%) сочетается с тяжелым поражением печени быстро прогрессирующим в цирроз, что позволяет предположить, что заражение вирусом гепатита Е может быть пусковым механизмом аутоиммунного процесса.

В последние годы участилась миграция населения из районов эндемичных по гепатиту Е в центральные области России и вследствие этого возрос риск завоза этой инфекции. Этот факт, а также случаи обнаружения антител к вирусу у лиц, проживающих в неэндемичных районах, в условиях отсутствия эпидемиологического процесса свидетельствуют о необходимости изучения распространения вируса на территории России и природы феномена присутствия антител в различных группах населения неэндемичных районов. Эти вопросы невозможно изучать без надежных и доступных в экономическом отношении диагностических препаратов.

К моменту начала данной работы в нашей стране тест-систем для выявления антител к вирусу гепатита Е не было, поэтому целью настоящей работы была разработка тест - систем для выявления антител к ВГЕ, предназначенных для диагностики вызываемой этим вирусом инфекции и проведения сероэпидемиологических исследований.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

- провести анализ антигенной структуры белков вируса гепатита Е и определить в их составе антигенно-значимые участки, способные индуцировать образование антител;

синтезировать олигонуклеотиды, соответствующие фрагментам вирусного генома, кодирующим выбранные участки вирусных антигенов;

клонировать собранные из синтезированных олигонуклеотидов фрагменты генома ВГЕ в бактериальной системе;

создать патентно-чистую векторную систему экспрессии рекомбинантных генов в клетках Е. coli для получения препаративных количеств рекомбинантных антигенов;

- используя разработанную векторную систему, получить бактериальные штаммы - продуценты рекомбинантных белков, содержащих антигенные детерминанты ВГЕ, и выделить рекомбинантные антигены в препаративных количествах;

- иммунологическими методами подтвердить специфичность полученных рекомбинантных антигенов и изучить их диагностическую значимость;

- создать на основе рекомбинантных антигенов диагностические тест-системы для обнаружения антител к вирусу;

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Особенности эпидемиологии и этиологии гепатита Е. 2.1.1.Эпидемиология гепатита Е.

Гепатит Е, ранее известный как энгеральный гепатит ни А ни В, занимает особое место среди вирусных гепатитов. Как и гепатит А, это заболевание относится к кишечным инфекциям, однако имеет ряд специфических отличий. Эпидемические вспышки заболевания носят взрывной характер и могут достигать крупных масштабов, таких как, например, первая документированная эпидемия в Дели, Индия, в 1955 году, охватившая десятки тысяч человек (Viswanathan R. 1957), и эпидемия в Китае в 1986-88гг., во время которой было зарегистрировано сотни тысяч случаев заболевания (Zhuang Н. et ей.. 1991). В настоящее время установлено, что вирус гепатита Е отвечает за крупные вспышки энтерального гепатита в странах с жарким климатом: Индии, странах центральной и юго-восточной Азии, Африки и на территории Мексики (Bradley D.W. 1992, Wong D.C. et ей.. 1980). Более 50% случаев острого гепатита в развивающихся странах относят на долю гепатита Е (Таблица 1). Замечен факт практически одновременного возникновения масштабных эпидемий на разных территориях: вспышки в Киргизии и Казахстане в 1955-1956 гг. произошли одновременно с эпидемией в Индии, крупная эпидемия в Ташаузской области Туркменистана в 1977 году - почти одновременно с крупными эпидемиями в Хорезмской области Узбекистана и Кызыл-Ордынской и Чимкентской областях Казахстана (Фаворов М.О. и др. 1996). Отмечен ряд крупных эпидемий заболевания в среднеазиатских странах - бывших республиках СССР, являющихся гиперэндемичными по гепатиту Е: вспышки в 1955-56 гг. (10812 случаев) и 1987г. (32000 случаев) в Киргизии, в 1985-86гг. (около 20000 случаев) в Ташаузской области Туркмении, в 1986 г. в Кашкадарьинской области Узбекистана (7000 случаев) (Wong D.C., et al.. 1980, Фаворов М.О. и др. 1996).

Таблица 1. Частота обнаружения антител к ВГЕ при обследовании больных ОВГ (Балаян М.С. 1994)

Страна Отношение числа серопозитивных к числу обследованных лиц Диагноз

Индия, Кашмир 32/45 71% Подозрение на гепатит Е

Индия 52/227 22,9% Острый гепатит

Индонезия 79/89 88% Подозрение на гепатит Е

Тайвань 6/27 22,2% Гепатит ни А ни В ни С

Египет 17/140 12,1% Спорадический острый гепатит

Сомали 46/181 25% Гепатит среди французских солдат

Судан 29/32 90,6% Подозрение на гепатит Е

Турция 4/63 6,3% Спорадический острый гепатит

Таджикистан 64/64 100% Подозрение на гепатит Е

Туркмения 69/76 90,7% и

Киргизия 70/80 87,5% и

Мексика 82/101 81,2% и

Кения 118/151 78,1% и

Узбекистан 18/23 78,3% и

Россия 14/88 15,9% Острый гепатит у военнослужащих

Характерной чертой эпидемиологии гепатита Е является выраженная сезонность подъема заболеваемости. В жарких странах максимальный подъем заболеваемости приходится на сезон дождей или вскоре после него, что связывают с возможностью попадания нечистот в источники водоснабжения (Солодовников Ю.П., Гасанов И.Ю. 1995). Для Средней Азии и северного Китая характерен подъем заболеваемости в осенне-зимний период (Балаян М.С. 1995). В межэпидемический период в эндемичных районах спорадические случаи регистрируются в течение всего года. По некоторым данным в Африке более 60% спорадических случаев острого энтерального гепатита ни А ни В приходится на долю гепатита Е (ШосЬе М.

et al. 1995). В Индии доля спорадических случаев гепатита Е составляет 44% всех случаев острого гепатита у взрослых и 24% - у детей ( Tandon B.N. et al. 1984).

В развитых странах Европы и в США регистрируются отдельные случаи заболевания, которые, как правило, являются результатом завоза инфекции из эндемичных очагов (Tandon B.N. et al.. 1994, Johansson P.J.H., Mushawar I.K. 1995, Skidmore S.J . et al. 1991). Описаны завозные из Азии случаи заболевания в Норвегии (Skaug К. et al. 1994), случаи острого гепатита Е в Германии у людей заразившихся во время пребывания в тропических странах (Trautwein С. et al.. 1995). В Бельгии гепатит Е в основном диагностируется у лиц, часто совершающих поездки в эндемичные страны и у рабочих и дипломатов из развивающихся стран (Vrackx R. 1995). Клиническая картина завозных случаев заболевания, зарегистрированных в индустриально развитых странах, была типичной для инфекции, вызываемой ВГЕ, случаев контактной передачи не отмечено. Неожиданным было выявление в неэндемичных странах довольно значительного числа серопозитивных в отношении ВГЕ лиц( Таблица 2). Антитела IgG к ВГЕ регулярно обнаруживаются у здоровых людей с частотой 1-3%. Такая относительно высокая частота выявления антител к вирусу при отсутствии даже спорадических случаев заболевания не имеет аналогии с другими энтерально передающимися вирусными инфекциями. Более высокая частота обнаружения антител к ВГЕ наблюдается среди больных с различной патологией печени (Федорова O.E. 1996), а также при некоторых заболеваниях не связанных с первичным поражением печени, у регулярных доноров крови, у медицинских работников и у больных, подвергавшихся гемодиализу или длительному лечению препаратами крови. Чрезвычайно высокой (46%) оказалась частота выявления антител IgG к ВГЕ у больных с хроническим аутоиммунным гепатитом, быстро прогрессирующим в цирроз (Sylvan P.E. et al. 1995). Полагают, что в определенных случаях инфекция ВГЕ может быть пусковым

Таблица. № 2. Частота обнаружения антител к ВГЕ у населения различных регионов (Balayan M.S. 1997).

Регион Количество обследованных Серопозитивность,

образцов сывороток %

Эндемичные страны:

Китай 2112 20,2

Тайвань 384 10,7

Индия 250 4,0

Тайланд 783 2,8

Гонг Конг 355 16,1

Таджикистан 934 8,5

Киргизия 173 4,6

Турция 1350 5,9

Чили 594 7,4

Бразилия 61 4,9

Неэндемичные

страны:

Великобритания 1500 1,0

Германия 972 2Д

Франция 1007 0,9

Испания 775 2,2

Нидерланды 1275 1Д

Бельгия 394 1,5

Италия 1889 2,6

Россия 168 1,2

Украина 1721 0,5

США 386 2,1

Австралия 279 0,4

Израиль 1416 2,6

механизмом развития аутоиммунного процесса. Существует несколько гипотез объяснения наличия антител к ВГЕ в здоровой популяции и у больных с различными

заболеваниями, но при отсутствии острого гепатита. Полагают, что этот феномен может объясняться циркуляцией нераспознанного инфекционного агента, способного индуцировать образование антител, дающих перекрестные реакции с ВГЕ, или наличием ситуации, когда один и тот же вирус способен вызывать разные патологические состояния в разных климатических зонах (Федорова O.E. 1999).

При определении иммунной прослойки среди населения эндемичных стран установлено, что даже в странах с высокой заболеваемостью она редко превышает 15% ( Таблица 2), что ниже этого показателя (100%) для гепатита A (Balayan M.S. et al.. 1994).

К настоящему времени установлено, что фекально-оральный механизм передачи возбудителя является основным способом распространения этой инфекции среди людей. Заражение наиболее часто происходит через употребление контаминированной воды или пищи и значительно реже, чем при гепатите А, при контактах с заболевшими, поэтому при заносе инфекции в неэндемичные районы не происходит ее распространения. Отсутствие контактной передачи в эндемичных районах может объясняться низкой выживаемостью вируса, в неэндемичных районах - высоким уровнем санитарно-гигиенического состояния, исключающим возможность распространения инфекции (Balayan M.S. 1997). Однако при очевидной водной природе эпидемий гепатита Е, динамика и территориальное распределение этой инфекции часто не совпадают с аналогичными характеристиками таких типично водных по главному пути передачи инфекций, как дизентерия Флекснера и брюшной тиф. В ходе расследования масштабной эпидемии гепатита Е в 1985 году в Ташаузской области Туркменистана не было отмечено повышения заболеваемости этими бактериальными инфекциями. Полагают, что этот факт объясняется высокой фильтрующейся способностью возбудителя гепатита Е - вируса гепатита Е, которая позволяет ему, в отличие от бактерий, легко проникать через слои почвы,

являющиеся естественным бактериальным фильтром, в грунтовые воды, используемые в качестве питьевых источников (Солодовников Ю.П. 1987).

В ходе изучения крупных эпидемических вспышек выявлена еще одна особенность инфекции: в отличие от гепатита А заболевание преимущественно регистрируется не у детей, а у лиц молодого и среднего возраста (15-40 лет) при наличии у них иммунитета к вирусу гепатита А. Случаи распространения инфекции среди детей и пожилых людей выявляются реже. Редкими также являются случаи семейной очаговости заболевания.

Особенностью гепатита Е является также высокая частота развития фульминантного гепатита у беременных со смертностью, достигающей 20-40% (Bradley D.W. 1990). Обследование детей, родившихся от матерей, инфицированных в третьем триместре беременности, показало наличие вертикальной передачи ВГЕ с высокой частотой заболеваемости и смертности новорожденных (Khuroo M.S. et al. 1995). Показано, что гепатит Е является причиной более, чем 60% всех случаев фульминантного гепатита ни А ни В (Nanda S.K. et al. 1994).

Эндемичными по гепатиту Е являются регионы жаркой климатической зоны с низким санитарно-гигиеническим уровнем, в частности, с отсутствием центрального водоснабжения и канализации. Заболеваемость выше у сельского населения, чем у городского, выше в низменных районах, чем в высокогорных (Балаян М.С. 1995, Pujol F.H. et al.. 1994). Вопрос о существовании природного резервуара инфекции является одним из невыясненных вопросов эпидемиологии гепатита Е. Есть данные о возможном вовлечении диких грызунов (Каретный Ю.В. и др. 1993) и обезьян (Arankalle V.A. et al.. 1994) в распространение гепатита Е. Обнаружение у домашних свиней в ряде районов США вируса гепатита Е, а также чувствительность многих лабораторных животных (крыс, свиней, овец, различных приматов) к вирусу,

показанная в опытах по экспериментальному инфицированию, позволяют предположить о существовании животных-переносчиков этой инфекции (Balayan M.S. et al. 1990, BradleyD.W. et al 1987, Clayson E.T. et al. 1996, Mannerat Y. et al. 1996, Meng X.J. et al. 1997). Это предположение подтверждается обнаружением большого количества серопозитивных особей в популяциях крыс городских и сельских ареалов на территории США, которое достигает 90% на Гавайях, 77% в штате Мэриленд и 44% -в штате Луизианна (Kabrane-Lazizi Y. et al. 1999).

2.1.2. Этиология гепатита Е

Доказательство фекально-орального способа передачи инфекции и идентификация возбудителя заболевания - вируса гепатита Е - были осуществлены в 1983 году М.С.Балаяном с соавторами в опытах по самозаражению материалом от больных из Средней Азии (Balayan M.S. et al. 1983). При этом наблюдалась клиническая картина острого гепатита без появления антител к вирусу гепатита А. Электронно-микроскопическое исследование фекалий выявило наличие вирусоподобных частиц серологически отличных от вируса гепатита А. В дальнейшем в ходе экспериментов по заражению волонтеров и лабораторных животных (приматов различных видов, домашних свиней, ягнят) содержащими вирус образцами фекалий больных из эпидемических очагов была показана возможность воспроизведения клинической картины заболевания и подтвержден фекально-оральный способ передачи инфекции (Bradley D.W. el al. 1987, Усманов Р.К.идр. 1994).

2.1.2.1. Морфологические особенности вируса гепатита Е.

К настоящему времени достаточно подробно изучены физико-химические свойства вируса гепатита Е. Установлено, что морфологически вирус представляет собой сферическую частицу диаметром 27-34 нм, состоящую из идентичных белковых субъединиц и не имеющую наружной оболочки (Bradley D.W. et al. 1987). Такие вирусоподобные частицы обнаруживаются в образцах стула, желчи и печени больных гепатитом Е людей (Chanhan A. et al. 1993) и экспериментально-инфицированных лабораторных животных (Усманов Р.К. и др. 1994). Этиологическая связь вирусоподобных частиц этого размера с энтерально-передающимся гепатитом ни А ни В была подтверждена также в опытах по изучению гуморального иммунного ответа при заражении приматов: вирусные штаммы, изолированные во время эпидемий в Киргизии, индуцировали образование антител реагирующих с вирусными изолятами другого географического происхождения (Arankalle V.A. et al. 1993). Вирионы вируса гепатита Е не устойчивы к высоким концентрациям солей, в частности к CsCl. Зональное центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы позволяет получить частично очищенные препараты вируса. Коэффициент седиментации вируса составляет 183 S. При равновесном центрифугировании в градиенте тартрата калия в глицерине препаратов вируса, выделенных от пациентов во время вспышки в Мексике, плавучая плотность составила 1,29 г/мл (Bradley D.W. et al. 1998). По своим физико-химическим свойствам вирус гепатита Е сходен с представителями семейства калицивирусов.

2.1.2.2. Структура генома вируса гепатита Е.

Изучение организации генома вируса гепатита Е усложнялось трудностями его культивирования in vitro, коротким периодом вирусемии и присутствием большого количества дефектных частиц в клинических образцах. Обнаружение в вирусных изолятах, выделенных из желчи инфицированных обезьян, большого количества интактных вирионов (Bradley D.W. 1990) позволило получить источник вируса для клонирования вирусного генома.

В качестве материала для синтеза комплементарной ДНК была использована экстрагированная из желчи экспериментально инфицированных обезьян циномолгус геномная РНК вируса гепатита Е штамма Бирма. Затем кДНК клонировали в бактериофаге X gt 10 (Reyes G.R. et al. 1990). Таким образом был получен первый клон ЕТ 1.1, содержащий EcoRl-фрагмент вирусспецифической ДНК размером 1.3 тысяч пар оснований. ДНК клона ЕТ 1.1 специфически гибридизовалась с кДНК, полученными при использовании экстрактов фекалий людей заболевших гепатитом Е во время вспышек в Мексике, Пакистане, Сомали, Центральной Азии и на Борнео.

В следующем году А. Там с соавторами сообщили о клонировании и определении последовательности нуклеотидов полноразмерного генома вируса гепатита Е штамма Бирма (Tam A.W. et al. 1991). Олигонуклеотиды соответствующие концевым последовательностям вирусспецифического фрагмента клона ЕТ 1.1 были использованы в качестве гибридизационных зондов при изучении библиотеки кДНК, полученной на основе содержащей вирусные частицы желчи. Рестрикционное картирование показало, что вирусспецифический фрагмент клона ЕТ 1.1 содержался в самом большом идентифицированном клоне BET 6-1. Такая же стратегия была применена при использовании олигонуклеотидов соответствующих концевым последовательностям клона BET 6-1 для скрининга библиотек кДНК,

ОКРЗ

М | У|Рг|Р| X | Н | ~

ояп

1

ОКГ2

Ро1уА

Рис. 1. Структура генома вируса гепатита Е

Неструкрурные белки: М - метилтрансфераза У - домен У

Рг - папаин-подобная цистеиновая протеаза

X - домен X

Н - хеликаза

II - РНК - полимераза

^ - гипервариабельный район

ОК¥2

Структурный белок/белки Белок с неизвестной функцией

OR.Fl

полученных при использовании олиго-сГГ-затравок и методом случайных затравок на матрице РНК, выделенной из ткани печени обезьян циномолгус, инфицированных штаммом Бирма ВГЕ. В обеих библиотеках содержались коллекции перекрывающихся фрагментов кДНК, соответствующих полному геному вируса.

Другой метод идентификации клонированных фрагментов ДНК был основан на иммуноскрининге библиотеки кДНК, для получения которой был использован материал из образцов фекалий, отобранных от больных во время вспышки в Мексике (Yarbouugh P.O. et al. 1991, Yin S. et al. 1994). Рекомбинантные полипептиды синтезировали в виде фрагментов вирусных белков слитных с р-галактозидазой и выявляли в реакции с сыворотками реконвалесцентов от других вспышек гепатита Е. В результате исследований были отобраны два полипептида -406.3-2 и 406.4-2, с использованием которых в печени инфицированных обезьян циномолгус были выявлены еще две вирусспецифические полиаденилированные РНК размером 2,0 и 3,7 тысяч оснований. Наличие этих информационных РНК свидетельствует о существовании субгеномных РНК в репликативном цикле вируса. При трансляции этих РНК синтезировались белки, которые взаимодействовали с парными сыворотками от больных и реконвалесцентов из разных регионов мира и от инфицированных обезьян.

Геном вируса гепатита Е представлен одноцепочечной РНК позитивной полярности размером около 7,5 тысяч оснований. На 3'-конце геномной РНК содержится участок поли-А. Геном вируса состоит из трех открытых рамок считывания (ORF) (Рис. 1). Первая - ORF1 - длиной 5 тысяч оснований локализуется в 5'-концевой области геномной РНК, содержит участок связывания с нуклеозид трифосфатами и кодирует неструктурные белки, в частности РНК-зависимую РНК-полимеразу. Вторая открытая рамка считывания - ORF2 - расположена в З'-концевой

области геномной РНК, имеет размер около 3 тыс оснований и кодирует основной

структурный белок. В пределах ORF2 находится вирусспецифическая часть клона 406.3-2, содержащая иммунодоминантный эпитоп. Предполагают, что ORF2 является основным элементом геномной организации ВГЕ. Исследование синтеза структурных белков ВГЕ в клетках животных показали, продуктом гена ORF2 является белок с молекулярной массой 88 kD , который синтезируется в виде предшественника и затем расщепляется с образованием зрелого белка вирусной оболочки (Jameel S.M. et al 1996). В пользу предположения о структурной функции белка pORF2 свидетельствует его способность к агрегации с образованием вирусоподобных частиц при синтезе в бакуловирусной системе (Tsarev S.A. et al 1992). Третья открытая рамка считывания - ORF3 - состоит из 369 нуклеотидов и перекрывает одним нуклеотидом ORF1 и 368 нуклеотидами - ORF2 (Reyes G.R. et al. 1990). Функция белков, кодируемых ORF3 окончательно не ясна, но известно, что они содержат полипептид с высокой иммунореактивностью, который находится в составе второго иммунодоминантного клона - 406.4-2 (Tarn A.W. et al 1991 ,Yarbouugh P.O. et al. 1991). Исследования последних лет показали, что продуктом ORF3 (pORF3) является негликозилированный белок с молекулярной массой 13,5 kD, который при анализе субклеточных фракций обнаруживается связанным с цитоскелетом и эта связь отсутствует у делеционных мутантов вируса с удаленным N-концевым гидрофобным доменом (с 1 по 32 аминокислотные остатки). Доказано, что pORF3 фосфорилирован в положении Ser80 (Ser79 в случае индийских изолятов) у всех штаммов вируса, кроме мексиканского. Существует предположение, что фосфорилирование pORF3 может играть регуляторную роль в сборке вирусных частиц (Zafrullah М. et al. 1997).

Определены нуклеотидные последовательности геномов штаммов ВГЕ, выделенных во времы вспышек в Бирме, Пакистане, Мексике, Китае, Африке.(Tarn

A.W. et al. 1991, Aye T.T. et al. 1992, Tsarev S.A. et al. 1992, Huang C-C. et al. 1992, Yin S. et al. 1994, Chattarjee R. et al. 1997) а также в странах Средней Азии -бывших республиках СССР. Существует гетерогенность генома штаммов ВГЕ коррелирующая с их географическим происхождением (Yin S. et al. 1994). При этом различные вирусные изоляты группируются в отдельные генотипы, три основных из которых представлены азиатским типом, включающим штаммы вируса выделенные от больных в Бирме, Индии, Китае и Пакистане (генотип 1), мексиканским типом, представленным единственным изолятом, который был выделен в Мексике, (генотип 2) и третьим типом, который объединяет штаммы, выделенные от больных в США (генотип 3) (Yin S. et al. 1994, Aye T.T. el al. 1992, Tsarev S.A. 1992, Huang C-C. et al. 1992). Внутри генотипа вирусов бирманской группы показано более 92% гомологии нуклетидных последовательностей между отдельными штаммами с частотой нуклеотидных замен менее, чем 0,085 на основание, мексиканский штамм имеет не более 76,1% гомологии нуклеотидных последовательностей с вирусами первого генотипа с частотой нуклеотидных замен превышающей 0,3053 на основание, у изолятов третьей группы обнаружено менее 74,3% гомологии нуклеотидных последовательностей с вирусами первого и второго генотипов с частотой замен нуклеотидов более 0, 3295 на основание. Штамм вируса, выделенный от свиней стад среднего запада США (Meng X.J. et al. 1997) наиболее близок по первичной структуре геномной РНК к изолятам, выделенным от людей в США (92% гомологии). С остальными штаммами ВГЕ обнаруженный у свиней штамм имеет только 83-92% гомологии нуклеотидных и 77-82% аминокислотных последовательностей. У всех трех американских изолятов протяженность белка pORF3 составляет 122 аминокислотных остатка, что является результатом делеции трех нуклеотидов (ATG) ORF3 с 3'-конца (Erker J.S. et al. 1999). Азиатские штаммы на основании анализа нуклеотидных последовательностей подразделяют на три

субтипа: первый объединяет штаммы из Юго-Восточной Азии (Бирма и часть Индии), второй - штаммы из Северной и Центральной Азии (Пакистан, Китай, Киргизия, Узбекистан), третий субтип представлен одним из индийских изолятов (Tsarev S.A. et al. 1992, Yin S. et al. 1994). Частота нуклеотидных замен между штаммами одной субгруппы не превышает 0,0476 на основание, между штаммами разных субгрупп эта величина составляет не менее 0,0577 (Erker J.S. et al. 1999). Для исследования генетических связей между штаммами разного географического происхождения проводили сравнительное изучение первичной структуры различных участков генома этих штаммов. Показано, что наиболее консервативным является ген РНК-полимеразы, расположенный на участке генома с 4181 по 4660 нуклеотиды: относительно редкие (0,4-6,9%) замены нуклеотидов не приводят к аминокислотным заменам в кодируемом геном белке у китайских изолятов ВГЕ при сравнении с прототипными пакистанским (SAR-55) и бирманским штаммами. При этом в неструктурных белках китайских изолятов вируса обнаруживается от 1,9 до 10,1%, в структурных - от 0 до 2% замен аминокислот по сравнению с штаммами SAR-55 и Бирма (Yin S. et al. 1993). Наибольшие различия между штаммами выявляются в так называемой гипервариабельной области (Tsarev S.A. 1992, Yin S. et al. 1993), находящейся в пределах с 2001 по 2420 нуклеотиды ORF1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Алаторцева, Галина Ивановна, 2000 год

Наименование Ссылка Источник

pUC18 Yanisch-Perron C.et al. 1985 ИМГ РАН

pEXl - 3 StanleyK.K., Luzio J.P. 1984 ИМГ РАН

pLysS Sdudier F.W. 1991 ИМГ РАН

40

3.1.2. Реактивы.

РОССИЙСКАЯ» I

' 4SÍW0

В работе использованы отечественные и импортные реактивы производства фирм "Merck" (ФРГ), "Fluka" (Швейцария), "Serva" (ФРГ), "Sirma" (США), соответствующие квалификации о.с.ч. Дистиллированную воду дополнительно очищали на системе для очистки воды "E-pure" ("Barnestead", США).

3.1.3.Ферменты.

Эндонуклеазы рестрикции Ват Hl, Pst 1, Xba 1, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1 E.coli, полинуклеотидлигазу фага Т4, полинуклеотидкиназу фага Т4 (фирмы «Boeringer», Австрия) использовали согласно рекомендациям фирмы-изготовителя.

3.1.4. Питательные среды.

Среду LB (1% бактотриптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% хлорида натрия) готовили из реактивов производства фирмы "8егуа"(ФРГ); агаризованную среду LB получали, добавляя бактоагар производства фирмы "Difco" (США) до 1,5 - 2%; также использовали жидкую и агаризованную среду LB с добавлением антибиотиков ампициллина в концентрации 50 - 200 мкг/мл и/или тетрациклина в концентрации 5 -10 мкг/мл.

3.1.5. Сыворотки.

В работе использовали охарактеризованные в различных коммерческих тест-системах 49 сывороток больных гепатитом Е и здоровых людей, которые были предоставлены Лабораторией эпидемиологии и диагностики гепатита Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН. Сыворотки крови дюдей, больных острым вирусныи гепатитом, собирали в течение 1993 г. и в ноябре

1998 г. в инфекционной больнице Дехканабадекого района Кашкадарьинской области Узбекистана - региона, эндемичного в отношении гепатита Е. В этом же районе в мае -июне 1999 г. отобраны сыворотки здоровых доноров. Сыворотки крови от пациентов с серологически подтвержденным диагнозом гепатита А, В или С были получены из инфекционной больницы N1 г. Москвы от больных, госпитализированных в июле 1997 г. и в апреле - июле 1999 г. Были также исследованы сыворотки безвозмездных доноров, полученные в 1995 г. из Адыгейской республиканской станции переливания крови (г. Майкоп); городской станции переливания крови г. Сургут; сыворотки пациентов, поступивших на обследование в родильный дом N4 г. Москва в августе 1997 г.; сыворотки пациентов госпитализированных инфекционную больницу г. Алма-Ата в сентябре 1997 г.; сыворотки пациентов, проходивших плановое обследование в НИИ Вирусных Препаратов РАМН 1998-1999 гг.

3.1.6. Иммуноферментные тест-системы.

НВэ-антиген и анти-НВс ^М в сыворотках больных острым гепатитом из Узбекистана определяли с помощью иммуноферментных диагностических тест-систем, произведенных предприятием «Препарат» (Россия) и биотехнологической компанией «Биосервис» (Россия), 1§М к вирусу гепатита А выявляли радиоиммунным методом с помощью коммерческих наборов производства Ташкентского ИЯФ АН Узбекистана, индикацию антител к вирусу гепатита С проводили с помощью иммуноферментной тест-системы «ГепаСкан» производства биотехнологической компании «Биосервис». В сыворотках больных гепатитом из инфекционной больницы N1 г. Москвы антитела ^М к вирусу гепатита А выявляли при помощи тест-системы фирмы «Рош-Москва», маркеры гепатита В - при помощи наборов для определения НВв-антигена производства фирмы "О^апоп-Текшса" (Голландия), антитела к вирусу гепатита С -при помощи тест-системы "Гепаскан" производства ТОО "Биосервис".

3.1.7. Синтетические пептиды.

Синтетические пептиды, соответствующие фрагментам белков ВГЕ и вируса иммунодефицита человека первого типа были предоставлены д.б.н. Ю.А. Семилетовым (Лаборатория вирусных нуклеиновых кислот и белков НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН).

3.2. МЕТОДЫ 3.2.1. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК. 3.2.1.1. Получение компетентных клеток E.coli.

Компетентную культуру клеток получали в соответствии с описанными методами (Маниатис Т. и др. 1984). После наращивания на среде LB с 50 мкг/мл Ар ночной культурой клеток E.coli в объеме 1 мл засевали в 100 мл бульона LB с ампициллином во флаконы объемом 500 мл и растили при 30°С в термостатируемой качалке («Newbrunswic", США) при частоте вращения 200 об/мин до достижения оптической плотности 0,3-0,4 o.e. при длине волны 560 нм, что соответствовало логарифмической фазе роста культуры клеток E.coli. Культуру охлаждали во льду 20 мин и центрифугировали 10 мин при 4°С при 5000 об/мин на центрифуге J-6B («Beckman», США). Осадки клеток ресуспендировали в половине первоначального объема охлажденного до 4°С стерильного раствора хлористого кальция в концентрации ЮОмМ, инкубировали в ледяной бане 30 мин и вновь центрифугировали, как указано выше.

Клеточный осадок ресуспендировали в 1/25 первоначального объема охлажденного до 4°С ЮОмМ раствора хлористого кальция, содержащего 15% глицерина, разливая по 0,2 мл в стерильные пластиковые пробирки и выдерживали при

0°С в течение ночи. Затем клетки замораживали в жидком азоте или смеси сухого льда с этиловым спиртом и хранили при -70°С.

3.2.1.2. Трансформация компетентных клеток плазмидными ДНК.

Реакцию проводили в стерильных центрифужных пробирках объемом 10 мл. К аликвоте (0,2 мл) компетентных клеток добавляли плазмидную ДНК в объеме 100 мкл (50-100 нг) и инкубировали во льду в течение 60 мин. Затем пробирку переносили в водяную баню с температурой 35°С (для культур, трансформированных плазмидами серии рЕХ и их производными) и с температурой 40° С (для плазмиды р11С18) на 1,5-2 мин и быстро охлаждали во льду до 0°С. К суспензии добавляли 2,7 мл среды ЬВ и инкубировали при температуре оптимальной для роста клеток данного вида (30°С для культур Е.соИ РОР2136, РЬТ90 и 37°С для культур Е.соИ 1М109) в течение часа.

Различные разведения клеток высевали в объеме 0,1 мл на чашки Петри с агаризованной средой ЬВ с необходимым для селекции антибиотиком (например 50 мкг/мл ампициллина) методом растирания и инкубировали при температуре оптимальной для роста клеток данного вида в течение 12-24 часов.

Эффективность трансформации компетентных клеток, полученными обоими методами составляла не менее 105-106 кл/мкг ДНК.

3.2.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

Выделение плазмидной ДНК проводили по методу щелочного лизиса (Маниатис Т. и др. 1984).

Биомассу, выращенную на чашке Петри или полученную после центрифугирования ночной культуры, ресуспендировали в буфере А рН 8,0 (50мМ глюкозы, 25мМ Трис-НСЬ, ЮмМ ЭДТА, 10мг/мл лизоцима). После десятиминутной инкубации при комнатной температуре добавляли буфер В (1% ЭБЭ, 0.2И ЫаОН) в

количестве двух первоначальных объемов, перемешивали, осторожно переворачивая пробирку и оставляли во льду на 10 минут. Затем добавляли 1,5 первоначального объема охлажденного во льду раствора ЗМ ацетата калия pH 5,0 -5,5, перемешивали, интенсивно встряхивая пробирку, и вновь инкубировали во льду 15 минут. Смесь центрифугировали в настольной центрифуге 5415 («Eppendorf», ФРГ) в течение 20 минут при 14000 об/мин. К надосадочной жидкости добавляли 0,7 от ее объема изопропилового спирта, перемешивали и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. ДНК осаждали центрифугированием при 12000 об/мин при комнатной температуре в течение 30 минут. Осадок растворяли в буфере ТЕ (ЮшМ рН7,4 Трис-HCL, ImM рН8,0 ЭДТА), прибавляли 0,7 полученного объема насыщенного раствора ацетата калия и инкубировали 30 минут при -20°С. К супернатанту после отделения осадка центрифугированием в течение 10 минут при 12000об/мин прибавляли 0,7 объема изопропилового спирта и выдерживали 30 минут при комнатной температуре. Плазмидную ДНК осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 10 минут, промывали 70% этиловым спиртом и растворяли в нужном объеме буфера ТЕ. Для удаления примесей РНК в препарате плазмидной ДНК раствор обрабатывали РНК-азой, добавляя 1/20 объема раствора концентрации 2мг/мл и инкубируя в течение 0,51,0 часа при 37°С.

Плазмидная ДНК, выделенная таким образом, обычно не требовала дальнейшей очистки для последующих манипуляций: рестрикции, выделения фрагментов и лигирования.

Препаративное выделение рекомбинантной плазмидной ДНКпроводили по тому же методу, но полученных препарат ДНК затем очищали и концентрировали центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия (Маниатис Т. и др. 1984).

При проведении скрининга большого количества клонов плазмидную ДНК из большого числа образцов выделяли методом кипячения (Маниатис Т. и др. 1984).

3.2.3. Выделение фрагментов ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле.

Электрофоретическое исследование препаратов ДНК проводили по методу, описанному в руководстве (Маниатис Т. и др. 1984). Электрофорез проводили на приборах GNA-100 и GNA-200 («Pharmacia-LKB», Швеция) в геле 0,7-1,0% агарозы с низким эндоосмосом (Agarose ЕЕ, «Sigma», США) в присутствии бромистого этидия (1мкг/мл) в Трис-боратном буфере (0,089М Трис, 0,089М борной кислоты, 0,002М ЭДТА). В качестве маркеров молекулярного веса использовали ДНК бактериофага X, обработанную рестриктазой Pst 1.

После завершения электрофореза гели фотографировали с помощью УФ-трансиллюминатора («Desaga», ФРГ) при длине волны 280нм. Фрагменты плазмидной ДНК после препаративного разделения выделяли из геля с использованием легкоплавкой агарозы (Agarose Low Melting, «Serva», Швеция) методом фенольной экстракции (Маниатис Т. и др. 1984).

3.2.4. Получение и очистка олигодезоксирибонуклеотидов.

Олигодезоксирибонуклеотиды были синтезировани фосфитным триэфирным методом (Gait M.Y. 1984) на ДНК-синтезаторе PS 100 фирмы «Cruachem» (Шотландия), используя реактивы и рекомендации производителя. Очистку олигонуклеотидов проводили с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (Gait M.J. 1984), либо на системе FPLC по рекомендации фирмы «Pharmacia» (Швеция).

3.2.5. Гибридизация рекомбинантной плазмидной ДНК с олигонуклеотимдными зондами.

Приготовление нитроцеллюлозных фильтров-реплик и молекулярную гибридизацию колоний осуществляли согласно методике (Grunstain М. er al.. 1975).

3.2.6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

Определение нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов ДНК проводили по методу Максама-Гилберта (Maxam A.M., Gilbert W.A. 1977) в модификации Чувпило С.А. и Кравченко В.В. (Чувпило С.А., Кравченко В.В. 1983) а также по методу Сэнгера (Sanger F. et al.. 1977).

3.2.8. Компьютерный анализ последовательностей нуклеиновых кислот и белков.

Компьютерный анализ последовательностей белков и нуклеиновых кислот проводили с помощью программных пакетов PC/Gene, вер.6.30, и GenePro, вер.2.3, используя банки данных EMBL 34 и Gene PROT 25.

3.2.9. Электрофорез белков.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили по методу Лэммли (Laemmli U.K. 1970). Электрофорез проводили на приборе производства фирмы «Хеликон» (Россия) в 7,5 % разделяющем SDS - полиактиламидном геле в Трис-глициновом буфере (0,025М Трис, 0,192М глицина, 0,1% SDS). Буфер для приготовления образцов содержал 0,0625М Трис, 2,3% SDS, 1% 2-меркаптоэтанола,

10% глицерина, 0,05% бромфенолового синего. В качестве маркеров молекулярных масс использовали набор белков - маркеров производства фирмы "Sigma» (США).

По завершении электрофореза гель окрашивали в растворе, содержащем 0,1% Кумасси R-250, 10% уксусной кислоты и 25% этилового спирта; несвязавшийся краситель отмывали в нескольких сменах раствора, содержащего 10% уксусной кислоты и 25% этилового спирта. Гель высушивали на приборе для сушки гелей производства фирмы "LKB-Pharmacia" (Швейцария).

3.2.10.Выделение и очистка рекомбинантных полипептидов.

Ночную культуру клеток E.coli, содержащих рекомбинантную плазмиду, разводили в 100 раз средой LB с ампйциллином и выращивали при постоянной аэрации при 30°С. После достижения культурой оптической плотности при 550 нм равной 0,5 индуцировали экспрессию гибридных генов повышением температуры культивирования до 39°С, и затем культуру выращивали при этой температуре в течение 2 часов. Клетки разрушали добавлением к культуре хлороформа, водонерастворимую фракцию, то есть так называемые «тельца-включения», собирали центрифугированием и обрабатывали ультразвуком в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCl pH 8,0 и ЮмМ ЭДТА. Дальнейшую процедуру выделения рекомбинантных полипептидов проводили по ранее описанному методу (Гловер Д. 1989). Очистку рекомбинантных полипептидов осуществляли методом гель - фильтрации. Концентрацию белка в получаемом после хроматографической очистки препарате определяли по методу Варбурга и Христиана (Дарбре А. 1989).

3.2.11. Иммунологические методы:

3.2.11.1. Твердофазный непрямой иммуноферментный метод.

Рекомбинантные белки в концентрации 4 мкг/мл в 10 мМ карбонат-бикарбонатном буфере pH 9,6 сорбировали в лунки 96-луночных полистироловых

планшет («Labsystems», Финляндия) в течение 16 часов при 9°С. Сыворотки разводились в 100 раз в растворе №1, а именно в ОД М фосфатно-солевом буфере рН 7,4, содержащем 0,05 % Твин 20 и 5% приготовленного обработкой ультразвуком лизата культуры E.coli PLT90 в ЮмМ Трис-HCl рН 8,0, и вносили по 100 мкл в лунки планшет с иммуносорбентом. После инкубации при 37°С в течение одного часа лунки планшет пять раз промывали 0,1М фосфатно-солевым буфером с 0,05% Твин 20, и затем вносили в них раствор моноклональных антител к IgG человека, коньюгированных с пероксидазой хрена (фирма «Сорбент-Сервис», Россия). Планшеты с раствором конъюгата выдерживали при 37°С в течение 30 минут. Затем планшеты вновь пятикратно промывали и добавляли субстрат (ортофенлендиамин - пероксидаза хрена) Через 15 минут учитывали результаты анализа, измеряя оптическую плотность содержимого лунок при длине волны 492 нм.

3.3.11.2. Метод иммуноблоттинга.

Иммобилизацию белков на нитроцеллюлозной мембране проводили по ранее описанному методу (Towbin Н. el al. 1979) на оборудовании и по рекомендации фирмы «Pharmacia» (Швеция). По окончании электропереноса контролировали его качество окрашиванием мембран в течение 5 минут 0,2% раствором PONSO S в 3% растворе ТХУ. Несвязавшийся с белками краситель отмывали дистиллированной водой. На фильтре отмечали положение белковых зон. Фильтры промывали три раза по 5 минут буфером TBS-T (20мМ Трис-HCL рН7,5, 150мМ NaCL, 0,05% Твин 20) до полного обесцвечивания. Затем нитроцеллюлозную мембрану с иммобилизованными белками инкубировали в течение 1 часа в блокирующем растворе, содержащем 5% сухого обезжиренного молока в Трис-солевом буфере (20мМ TrisHCL рН7,5, 150mM NaCL) с 0,1% Твин 20. Затем мембрану инкубировали в течении 1 часа при 37°С с содержащей антитела к рекомбинантному антигену человеческой сывороткой в 100-кратном

разведении в буфере ТВ8-Т с 5% лизата бактерий Е.соН РЬТ90. После троекратной промывки в буфере ТВв-Т фильтр инкубировали в растворе конъюгата моноклональных антител к Бс-фрагменту иммуноглобулинов ^О человека с пероксидазой хрена в течение 30 минут при 37°С и вновь отмывали три раза в буфере ТВ8-Т. Реакцию проявляли субстратным раствором (0,04% диаминобензидина и 0,003% Н2О2 в растворе 50мМ Трис-НСЬ рН7,5) в течение 15-20 минут при комнатной температуре без доступа света. Реакцию останавливали, промывая мембрану водой.

3.3.11.3. Конкурентный вариант твердофазного непрямого иммуноферментного метода.

Рекомбинантные антигены в концентрации 4 мкг/мл в 10 мМ карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,4 сорбировали в лунки 96-луночных полистироловых планшет (ЬаЬзуз1етз, Финляндия) в течение 16 часов при +9°С. Перед внесением в лунки планшета с иммуносорбентом сыворотки разводились в 100 раз в растворе №1,

_п

содержащем тот или иной синтетический пептид в концентрации от 2 до 2х 10 мг/мл, и инкубировали в течение 30 мин при +37°С в планшете с предварительно адсорбированным на нем в течение 16 часов при +4°С бычьим сывороточным альбумином в концентрации 0,1 мг/мл. Затем по 100 мкл растворов сывороток переносили в лунки планшета с иммуносорбентом и инкубировали при +37°С в течение 1 часа. Все остальные манипуляции проводили по схеме твердофазного непрямого иммуноферментного анализа.

Описание ряда методов, условий постановки эксперимента, состав питательных сред и растворов приводятся при изложении полученных результатов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 4.1. Получение векторов экспрессии вирусных генов.

В настоящее время при промышленном выпуске диагностических препаратов большое значение придается патентной чистоте входящих в их состав компонентов. Все используемые для экспрессии рекомбинантных антигенов векторные системы запатентованы зарубежными фирмами и могут быть использованы только для научных исследований, поэтому была поставлена задача получения патентно - чистой векторной системы, предназначенной для экспрессии в клетках Е coli рекомбинантных полипептидов.

Для синтеза препаративных количеств рекомбинантных белков в клетках Е. coli нами была выбрана система экспрессии рекомбинантных генов на основе правого промотора бактериофага X. Транскрипция в данной системе регулируется связыванием температуро-чувствительного репрессора бактериофага X, кодируемого мутантным геном clts857, с операторным участком. Когда клетки растут при температуре 30-32°С, репрессор связывается с оператором и блокирует экспрессию. Повышение температуры до 42°С приводит к инактивации репрессора, что позволяет РНК-полимеразе связаться cTipOMOTopoM и начать транскрипцию гена. В результате последующей трансляции могут синтезироваться значительные количества белка.

Рекомбинантные плазмиды pEXl, рЕХ2, рЕХЗ, позволяющие синтезировать рекомбинантные белки во всех трех рамках считывания (Stanley K.K. Luzio J.P. 1984), содержат в 3'-конце гена LacZ полилинкер, в который можно вставить последовательности ДНК для экспрессии. В этих плазмидах Pr промотор фага X обеспечивает экспрессию последовательностей ДНК с образованием продукта, составляющего значительную часть суммарного бактериального белка.

Экспрессируемый белок накапливается в клетках в виде нерастворимых агломератов, так называемых "телец включений".

Векторы семейства рЕХ были выбраны в качестве прототипных плазмид для получения новой векторной системы, преимуществом которой является наличие в опероне экспрессии гена лизоцима. В результате использования такого оперона одновременно с синтезом рекомбинантного белка идет синтез лизоцима, разрушающего полисахаридную оболочку клетки, что существенно упрощает очистку водонерастворимых агломератов рекомбинантного белка.

4.1.1. Конструирование векторов серии pEL5, несущих ген лизоцима.

Для конструирования плазмид pEL5a, pEL5b, pEL5c плазмиды pEXl, рЕХ2, рЕХЗ гидролизовали рестриктазой Xbal и достраивали по три нуклеотида в липких концах с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 E.coli. Параллельно получали Ват Н1-рестрикт размером 0,6 т.п.н. из плазмиды pLysS ( Studier F.W. 1991), содержащий ген лизоцима бактериофага Т7 и имеющий три нуклеотида, достроенных с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 E.coli в липких концах. Фрагменты плазмид рЕХ1-3 лигировали с фрагментом ДНК, содержащим ген лизоцима бактериофага Т7 (Рис. 2). Лигазной смесью трансформировали клетки E.coli, содержащие в составе генома температурочувствительный ген бактериофага X clts857, а именно клетки штамма PLT90 (Пат 2043409 РФ). Трансформанты пересевали в жидкую среду с ампициллином и выращивали при температуре 30°С. Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды, в которых гены лизоцима и ß - галактозидазы имеют одинаковую полярность, отбирали с помощью анализа на способность к лизису после индукции синтеза белка. Для этого индуцировали экспрессию рекомбинантных белков повышением температуры до 42°С. В клонах, продуцирующих лизоцим, после

индукции белкового синтеза и последующего добавления хлороформа происходит лизис клеток, который обнаруживался по осветлению и увеличению вязкости бактериальной культуры. Из отобранных клонов стандартным способом выделяли плазмиды pEL5a, pEL5b, pEL5c (Пат. 2071501 РФ, Пат. 2071503 РФ, Пат. 2071503 РФ).

Полученные плазмиды дают возможность в условиях термоиндукции синтезировать два вида белков: слитный с ß - галактозидазой рекомбинантный полипептид и лизоцим. Это происходит потому, что место встраивания гена лизоцима, а именно, сайт узнавания рестриктазы ХЪа\, в плазмидах серии рЕХ 1-3 находится между стоп - кодонами и участком терминации транскрипции, и поэтому сначала происходит образование двухцистронной мРНК, с которой затем транслируются независимо рекомбинантный полипептид и лизоцим (Рис. 3).

4.1.2. Получение рекомбинантных белков в виде водонерастворимых агломератов.

Клетки PLT90, содержащие плазмиду pEL5a, pEL5b или pEL5c, высевали в LB-бульон с ампициллином и растили в течение 16 часов при температуре 30°С. Ночную культуру разводили этой же средой в соотношении 1:100 и растили с аэрацией до оптической плотности 0,2 при 550 нм, затем повышали температуру до 42°С для индукции белкового синтеза и растили еще 2 часа. Затем добавляли хлороформ до1% и инкубировали при 37°С еще 1 час. Далее лизат центрифугировали и осадки анализировали с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле. В качестве отрицательных контрольных образцов использовали аналогичным образом обработанные образцы клеток E.coli РОР2136, трансформированных плазмидой рЕХ1, рЕХ2 или рЕХЗ. Электорофорез показал, что при действии синтезируемого в клетках лизоцима происходит разрушение оболочки бактерии и высвобождение водорастворимых клеточных белков в среду, что проявляется в

ослаблении соответствующих полос. В контроле, в случае использования плазмид рЕХ1-3, такого эффекта нет (Рис. 4). Количество белка, содержащегося в «тельцах-включениях» (в данном случае ß - галактозидазы), при использовании обеих векторных систем по данным электрофореза остается неизменным.

4.2. Синтез и клонирование фрагментов ДНК, кодирующих участки белков ВГЕ.

Выбор фрагментов вирусного генома для клонирования в бактериальной системе осуществляли, используя результаты пептидного картирования антигенных детерминант белков pORF2 и pORF3 (Khudyakov Y.E. et al. 1993) и результаты компьютерного анализа профиля гидрофильности белка pORF2 ВГЕ штамма Бирма. Были отобраны фрагмент ORF2,который соотвествует домену в области с 633 по 659 аминокислотных остатков (НЕ40) и фрагмент ORF3, соответствующий участку с 92 по 123 аминокислотные остатки (НЕ60). По результатам компьютерного анализа для клонирования были также отобраны фрагменты ORF2, соответствующие участкам белка с 286 по 344 (НЕ170)и с 403 по 461 (НЕ70) аминокислотные остатки (Рис. 5) (Алаторцева Г.И. и др. 1998).

4.2.1. Клонирование фрагментов ДНК ORF2 вируса гепатита Е.

4.2.1.1. Синтез и клонирование фрагмента ДНК НЕ40.

Для получения фрагмента ДНК, кодирующего антигенно-значимый участок белка pORF2 с 633 по 659 аминокислотные остатки были синтезированы следующие олигодезоксирибонуклеотиды:

рЕЬ5а рЕХ1

12 12

Рис. 4. Электрофорез в 7,5% полиакриламидном геле клеток Е.соИ РЬТ90, трансформированных плазмидами рЕЬ5а и рЕХ1, до (1) и после (2) обработки хлороформом. Стрелкой указано положение Р - галактозидазы.

НЕ60

сЛ 5'-САТСССТТС6ССТТСААС6СТ6СССТТТССАСТСТАС-3'

<12 Ь'-ТСТСССИСАССТТСАСССССИТААСАТСААССТАССТААААаССАСАССТССА-З' г1 3'-ССС6СААТТСТАСТТССАТССАТТТТСАССТСТСС-5' г2-3'-С6ААССССААСТТСССАССССАААССТСАСАТСАСАСССАСТССААСТ-5'

Олигонуклеотид г1 комплементарен внутреннему участку олигонуклеотида 6.2, олигонуклеотнды ё1 и г2 имеют на З'-концах комплементарные друг другу участки длиной в 33 нуклеотида, олигонуклеотнды ¿2 и г2 на 5'-концах имеют участки комплементарности длиной в 15 нуклеотидов. Все четыре олигонуклеотида смешивали, кинировали с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 и затем обрабатывали ДНК-лигазой фага Т4. Собранный таким образом фрагмент ДНК клонировали по участкам узнавания рестриктазами Ват Н1 и Рн1 1 в плазмиду риС18. Полученной рекомбинантной плазмидой трансформировали клетки Е.соИ штамма ЛУП09. Структуру рекомбинантной плазмиды исследовали, анализируя с помощью электрофореза в 2% агарозном геле продукты ее гидролиза рестриктазами Ват Н1 и 1. При электрофорезе выявлялись 2 полосы ДНК длиной около 2680 и 90 пар оснований, что соответствовало размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК. Определение нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК показало (Рис. 6) его соответствие участку ОКР2 ВГЕ, кодирующему фрагмент белка рОКР2 с 633 по 659 аминокислотные остатки. Затем Ват \l\-Pst 1-фрагмент был клонирован в плазмиды рЕХ1 и рЕЬ5а в рамки считывания /? - галактозидазы для получения слитных с Р - галактозидазой рекомбинантных полипептидов. В результате клонирования получены рекомбинантные плазмиды рНЕ40а и рНЕ40. Этими рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки штаммов Е.соИ РОР2136 и РЬТ90 соответственно. Из трансформированных клеток выделяли плазмидные ДНК, которые после обрабатки рестриктазами Ват Н1 и Ря1 1 исследовали методом электрофореза в 2% агарозном геле. Гидролизаты плазмидных ДНК из рекомбинантных штаммов на электрофореграмме имели по две полосы ДНК размерами соотвественно около 5200 и

а) НЕ40:

Ват Н1 ;

5'- вАТСССТТССССТТСААСССТССССТТТССАСТСТАСТСТСССТСАССТТСАСССССТТ ЪСЬ<2ССАЕ<23ТУАЕЪ<2КЪ бЗЗаа -»

Т 1

ААСАТСААССТАССТААААСТСОАСАССТвСА-З' (СЖЕ2) КМКУСКТИЕ

•^■659аа

б) НЕ70:

Ваг|1 Н1

5 ' -вАТССССТААТССАСААССТАСТСТТАААСТТТАТАСТАСТСТТСААААТССТСАССАбСАТ АМСЕРТУКЪУТЗУЕЫА<2<2В 403аа

АААССААТСССТАТСССТСАТСАТАТССАТСТТССАСАААСТССАСТТСТТАТССАбСАТТА КС1А1РН010ЪСЕЗКУУ1<20У

Рэ 1

?1

ТСАТААТСАССАТСААСА6САТССАССТАСТССТАСТССТССТССТАСТАСАТСТвСА-3' (СЖЕ2) 0Ы<2НЕ<20КРТРЗРАРЗКР

—>461аа

в)НЕ170:

5' - ААТТССТАТАСТААТАСАСССТАТАССССТССССТСССССТбТТССАСТТТвСССТССАССТТСАСТТТ ЫЗУТМТРУТСАЪСЬЬОЕАЬОЬЕГ 286аа-^

СССААССТТАСССССвССААСАССААТАСССС6СТСТССССТТАТТССАССАСТ6СТС6ССАСС6ССТТССТ RNLTPGNTNTRVSRYSSTARHRLR

СССС6ТССССАСС6САСТ6СС6А0СТСАССАССАС6ТАА -3' (ORF2) RGADGTAELTTT

—»34 4аа

г) НЕ60:

Ваш Н1

5'- вАТССААТССАССАСАССАСТСАССТССАСТТССАСТСАССАСАССААССССАССАССА

ЫРРОНЗАРЬвУТИРЗАРР 92аа->

Рё^ 1

Т Т СС С Т САС в Т С в ТАСАС С ТАС САСАвС ТАССАС С АС С С С ССТССА-3' (ОБ^З) ЪРНУУОЪРОЬбРКИ

->123аа

Рис.6. Структура клонированных фрагментов ДНК и вирусспецифических участков рекомбинантных полипептидов.

90 пар нуклеотидов для плазмиды рНЕ40а и 6400 и 90 пар нуклеотидов для плазмиды рНЕ40, что соответствовало размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК НЕ40. Полученные плазмиды рНЕ40а и рНЕ40 кодировали гибридные белки с расчетной молекулярной массой около 122 кД, состоящие из 1049 аминокислотных остатков /? - галактозидазы и 27 аминокислотных остатков белка pORF2.

4.2.1.2. Клонирование фрагмента ДНК НЕ70.

Для получения фрагмента ДНК, кодирующего антигенно-значимый участок белка рСЖР2 с 403 по 461 аминокислотные остатки были синтезированы следующие олигодезоксирибонуклеотиды:

а1 5 ' -САТССССТААТССАСААССТАСТСТТАААСТТТАТАСТАСТСТТ-З' а2 5'-СААААТССТСА6САССАТАААС6ААТСССТАТСССТСАТСАТАТС-3' аЗ 5'-6АТСТТССАСАААСТССАСТТСТТАТССАС6АТТАТСАТААТСАССАТ-3' а 4 5'-СААСАССАТССАССТАСТССТА6ТССТССТССТАСТАСАТСТССА-3' д1 3'-СС6АТТАССТСТТ6САТСАСААТТТСАААТА-5' д2 3'-ТСАТСАСААСТТТТАС6АСТССТССТАТТТССТТАСССАТАСССА-5' дЗ 3'-6ТАСТАТАССТАСААССТСТТТСАССТСААСААТАССТССТААТАСТА-5' д4 3'-ТТАСТССТАСТТСТССТАССТССАТСАССАТСАССАССАС6АТСАТСТАС-5'

Олигонуклеотид gl комплементарен внутреннему участку олигонуклеотида а1. У олигонуклеотидов а2 и g2 комплементарны 5'-концевые участки на протяжении 36 нуклеотидов. Олигонуклеотиды аЗ и gЗ, а4 и g4 также имеют на 5'-концах участки комплеметарности, длина которых составляет соответственно 39 и 41 нуклеотидов. Олигонуклеотиды а1, gl, а2, g2 смешивали и кинировали с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4, затем полученные фрагменты двунитевой ДНК сшивали с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Аналогичным образом поступали с

олигонуклеотидами аЗ, g3, а4, g4. Полученные фрагменты ДНК соединяли в один более протяженный фрагмент, обрабатывая их смесь ДНК-лигазой фага Т4. Размер конечного фрагмента ДНК (182 пары нуклеотидов) контролировали методом электрофореза в 2% агарозном геле. Полученный фрагмент ДНК клонировали по участкам узнавания рестриктазами Ват HI и Pst 1 в плазмиду pUC18. Полученной рекомбинантной плазмидой трансформировали клетки E.coli штамма JM109. Структуру рекомбинантной плазмиды исследовали, анализируя с помощью электрофореза в 2% агарозном геле продукты ее гидролиза рестриктазами Ват HI и Pst 1. При электрофорезе выявлились 2 полосы ДНК длиной около 2680 и 180 пар оснований, что соответствует размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК. Определение нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК показало (Рис. 6) его соответствие участку ORF2 ВГЕ, кодирующему фрагмент белка pORF2 с 403 по 461 аминокислотные остатки. Затем Ват \l\-Pst 1-фрагмент был клонирован в плазмиды рЕХ1 и pEL5a в рамку считывания /7 - галактозидазы для получения слитного с Р - галактозидазой рекомбинантного полипептида. В результате были получены рекомбинантные плазмиды рНЕ70а и рНЕ70. Этими плазмидами трансформировали клетки штаммов E.coli РОР2136 и PLT90 соответственно. Из трансформированных клеток выделяли плазмидную ДНК, которую после обрабатки рестриктазами Ват HI и Pst 1 исследовали методом электрофореза в 2% агарозном геле. Гидролизат плазмидных ДНК из рекомбинантных штаммов на электрофореграмме имел по две полосы размерами около 5200 и 180 пар нуклеотидов для плазмиды рНЕ70а и 6400 и 180 пар оснований для плазмиды рНЕ70, что соответствовало размерам векторов и синтезированного фрагмента ДНК НЕ40. Полученные плазмиды рНЕ70а и рНЕ70 кодировали гибридные белки с расчетной молекулярной массой 124 кД, состоящие из 1049 аминокислотных остатков fi - галактозидазы и 59 аминокислотных остатков фрагмента белка pORF2.

4.2.1.3. Клонирование фрагмента ДНК НЕ170.

Для клонирования кДНК фрагмента ORF2, кодирующего участок белка с 286 по 344 аминокислотные остатки, были синтезированы олигодезоксирибонуклеотиды el, el,e3,e4,fl,f2,f3,f4:

el: 5'-ААТТССТАТА СТААТАСАСС CTATACCGGT GCCCTCGGGC TGTTGGACTT-3' е2: 5'-TGCCCTCGACCTTGAGTTTCGCAACCTTACCCCC-3'

еЗ: 5'-GGGAACACCAATACGCGGGTCTCCCGTTATTCCAGCACGCTCGCCACCGCCTTCG-3' е4 : 5'-TCGCGGTGCGGACGGGACTGCCGAGCTCACCACCACGTAA-3' f1: TTAAGGATATGATTATGTGGGATATGGCCACGGGTGCCCG-5'

f 2 : 3'-ACAACCTGAAACGGGAGCTGGAACTCAAAGCGTTGGAATGGGGGCCCTTGTGGTT-5' f 3: 3'-ATGGCGCCCAGAGGGCAATAAGGTCGTGACGAGCG-5'

f 4 : 3'-GTGGCGGAAGCAGCGCCACGCCTGCCCTGACGGCTCGAGTGGTGGTGCATT-5'

Олигонуклеотиды el, e2, fl, f2 смешивали и кинировали с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4, затем полученные фрагменты двунитевой ДНК сшивали с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Таким же образом поступали с олигонуклеотидами еЗ, ß, е4, f4. Полученные фрагменты ДНК соединяли в один более протяженный фрагмент, обрабатывая их смесь ДНК-лигазой фага Т4. Размер конечного фрагмента ДНК (181 пары нуклеотидов) контролировали методом электрофореза в 2% полиакриламидном геле. Полученный фрагмент ДНК клонировали по тупым концам в Sma 1-сайт плазмид рЕХЗ и pEL5c в ориентации, при которой направления считывания ß - галактозидазы и фрагмента белка pORF2 совпадают. Таким образом получены рекомбинантные плазмиды рНЕ170а и рНЕ170, которыми трансформировали клетки штаммов E.coli РОР2136 и PLT90 соответственно. Гидролизат плазмидной ДНК из рекомбинантного штамма на электрофореграмме имел две полосы ДНК размерами около 5200 и 180 пар нуклеотидов для плазмиды НЕ170а и 6400 и 180 пар оснований для плазмиды НЕ 170, что соответствовало размерам векторов и синтезированного фрагмента ДНК НЕ 170. Отбор клонов клеток E.coli, экспрессирующих данный участок

генома, проводили по результатам электрофореза белковых лизатов клеток, содержащих рекомбинантные плазмиды. В клетках, содержащих плазмиду рНЕ170, синтезировался гибридный белок с молекулярной массой окодо125кД, который отсутствовал в клетках, несущих векторную плазмиду со вставкой вирусспецифической ДНК в противоположной ориентации. Определение нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК показало его соответствие участку 01?Р2 ВГЕ, кодирующему фрагмент белка рОКР2 с 286 по 344 аминокислотные остатки (Рис. 6). Полученная плазмида рНЕ170 кодировала гибридный белок с расчетной молекулярной массой 125 кД, состоящий из 1041 аминокислотных остатков [1 - галактозидазы и 59 аминокислотных остатков фрагмента белка рОЫР2.

4.2.2. Клонирование фрагмента кДНК гена ОШ?3 вируса гепатита Е.

Для получения фрагмента ДНК, кодирующего антигенно-значимый участок белка рОЮ^З с 92 по 123 аминокислотные остатки, были синтезированы следующие олигодезоксирибонуклеотиды:

<31 5 ' - в АТ С С ААТ С С АС С Ав АС С АС Т САСС Т С С АС Т Т 6 6 АС Т 6 АС С АС - 3 '

6.2 5 ' -АССААССССАССАССАТТСССТСАССТССТАСАССТАССАСАССТАССАССАССССССТССА-З '

_г1 3'-ААСС6АСТССАССАТСТССАТССТСТССАТССТССТСССССС-5'

г2 3'-СТТАССТССТСТССТСАСТССАССТ6ААССТСАСТССТСТССТТССССТССТС6Т-5'

3'-концевые фрагменты олигонуклеотидов (11 и г2 взаимокомплементары на протяжении 39 нуклеотидов. Олигонуклеотид г1 комплементарен олигонуклеотиду Л2 с 17 по 59 нуклеотиды. Фрагменты й2 и г2 взаимокомплементары в области шестнадцати 5'- концевых нуклеотидов. После кинирования и лигазной обработки смеси олигонуклеотидов полученный фрагмент ДНК клонировали по участкам узнавания рестриктаз Ват Н1 и Pst 1 в плазмиду рИС18.

Определение нуклеотидной последовательности встроенного фрагмента ДНК показало его соответствие участку ORF3, кодирующему фрагмент белка pORF3 с 92 по 123 аминокислотные остатки (Рис.6). Затем Ват Hl - Pst 1-фрагмент был клонирован в плазмиды рЕХ1 и pEL5a в рамку считывания ß - галактозидазы для получения рекомбинантных полипептидов. Полученные плазмиды рНЕбОа и рНЕбО кодировали рекомбинантный белок с расчетной молекулярной массой 122кД состоящий из 1046 аминокислотных остатков ß - галактозидазы и 32 аминокислотных остатков белка pORF3. Этими рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки штаммов Е. coli РОР2136 и PLT90 соответственно. Из трансформированных клеток выделяли плазмидные ДНК, которые после обрабатки рестриктазами Ват Н1 и Pst 1 исследовали методом электрофореза в 2% агарозном геле. Гидролизаты плазмидных ДНК из рекомбинантных штаммов на электрофореграмме имели по две полосы ДНК размерами около 5200 и 107 пар нуклеотидов для плазмиды рНЕбОа и 6400 и 107 пар нуклеотидов для плазмиды рНЕбО, что соответствовало размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК НЕ60.

4.3. Получение рекомбинантных белков ВГЕ в клетках E.coli.

4.3.1. Сравнительное изучение синтеза рекомбинантных полипептидов в использованных векторных системах.

Проведена оценка эффективности синтеза рекомбинантных полипептидов в культуре клеток E.coli PLT90, трансформированных содержащими фрагменты генома ВГЕ рекомбинантными плазмидами на основе векторов pEL5a и pEL5c. Для этого проведено сравнительное исследование наработки рекомбинантных полипептидов НЕ60, НЕ40, НЕ70 в бактериальных культурах на основе данной системы экспрессии и в клетках E.coli РОР2136, трансформированных рекомбинантными плазмидами на основе векторов рЕХ1 и рЕХЗ.

Анализ результатов электрофореза лизатов культур клеток после термоиндукции синтеза белка показал, что использование обеих исследуемых векторных систем обеспечивает примерно одинаковую продукцию рекомбинантных белков.

4.3.2. Выделение и очистка рекомбинантных полипептидов.

Использование векторов рЕЬ5а-с, содержащих ген лизоцима, создает возможность облегчить и сократить процедуру выделения рекомбинантных полипептидов. Поскольку в клетках, содержащих эти плазмиды, в условиях термоиндукции белкового синтеза происходит образование лизоцима, можно разрушать клеточные стенки и выделять содержащие рекомбинантные белки "тельца включения" без предварительного осаждения клеток и обработки клеточной суспензии ультразвуком. При добавления к такой культуре 1% хлороформа и инкубации при 37°С происходит лизис клеток. Зависимость эффективности лизиса от продолжительности инкубации с хлороформом исследовали, измеряя оптическую плотность образцов бактериальной культуры при 550нм. В качестве контроля использовали культуру клеток РОР2136, трансформированных рекомбинантной плазмидами рЕХ1-3 со вставками такого же фрагмента вирусспецифической ДНК. Оптическая плотность падала в 2-2,5 раза в течение 45 минут после добавления хлороформа, затем ее снижение прекращалось. Далее лизат центрифугировали и анализировали белковый состав осадка методом электрофореза в 7,5% ЗББ-полиакриламидном геле (Рис. 4, 7). Анализ полученных результатов показывает, что под действием эндогенного лизоцима в клетках, трансформированных рекомбинантными плазмидами рЕЕ5а-с, происходит разрушение оболочки бактерий и высвобождение клеточных белков в среду, что проявляется в ослаблении белковых полос, которых соответствуют растворимым

.......... ^ | (

Рис. 7. Электрофорез в 7,5% полиакриламидном геле клеток штамма - продуцента белка НЕ40 до (1) и после (2) обработки хлороформом, р - галактозидазы (3), маркеров молекулярных масс: 94кД, 43кД, ЗОкД, 20кД (4).

бактериальным белкам. В случае использования плазмид семейства рЕХ, такого эффекта не наблюдалось. Таким образом, без дополнительных методов разрушения клеточных стенок происходит выделение водонерастворимых агломератов рекомбинантных белков, так называемых «телец включений».

Далее рекомбинантные антигены выделяли по стандартной методике (Гловер Д. 1989), используя метод гель-фильтрации. Наличие во фракциях, собираемых с колонки, рекомбинантных полипептидов определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле по присутствию белковых полос соотвествующих молекулярных масс. Полученные препараты использовали в качестве антигенов при проведении иммуноферментного анализа.

4.4. Изучение антигенной специфичности полученных рекомбинантных белков.

4.4.1. Анализ сывороток больных острым вирусным гепатитом из района эндемичного по гепатиту Е.

Из-за отсутствия охарактеризованных в отношении антител к вирусу гепатита Е сывороток первичный анализ антигенной активности рекомбинантных полипептидов проводили с использованием сывороток больных острым вирусным гепатитом из эндемичного по гепатиту Е района Узбекистана (Алаторцева Г.И. и др. 1999). Исследование антигенной активности рекомбинантных белков осуществляли методом твердофазного иммуноферментного анализа, как описано в "Материалах и методах". Сыворотку считали положительно-реагирующей с рекомбинантным полипептидом, если оптическая плотность при использовании в качестве антигена рекомбинантного белка (ОПрек) более чем в 2 раза превышала оптическую плотность при использовании в качестве антигена /3 - галактозидазы (ОПконтр) и была не менее 0,2. Сыворотки, для которых величина ОПрек превышала ОПконтр в 1,5 - 2 раза, считались сомнительными, а образцы с соотношением ОПрек/ОПконтр менее 1,5

отрицательными. В зависимости от величины ОПрек/ОПконтр их подразделяли на сильно- и слабореагирующие, обозначая «1+» сыворотки, для которых эта величина была более 2, но не превышала 3,5; «2+» - сыворотки, для которых она была более 3,5, но не превышала 5,0; «3+» - сыворотки с ОПрек/ОПконтр более 5,0, но не менее или равным 10,0; «4+» -сыворотки с ОПрек/ОПконтр более 10,0.

При использовании в ИФА в качестве антигена полипептида НЕ40 в 54 из 430 тестированных сывороток выявлены антитела IgG, при использовании в качестве антигена полипептида НЕ60 в 97 сыворотках обнаружены антитела IgG. С рекомбинантным полипептидом НЕ70 прореагировало 82 сыворотки. При исследовании полипептида НЕ170 в ИФА на 110 сыворотках обнаружено только две сомнительно-прореагировавших сыворотки. Таким образом, с наибольшим количеством сывороток прореагировали рекомбинантные полипептиды НЕ40, НЕ60 и НЕ70. Эти белки были отобраны для дальнейшей работы.

Для подтверждающего анализа использовали метод иммуноблотганга, при помощи которого изучали взаимодействие положительно прореагировавших в первичном скрининге сывороток с полипептидами, содержащимися в лизатах клеток пггаммов-продуцентов. Как видно из результатов, представленных на Рис.8, на шпроцеллюлозной мембране с иммобилизованными рекомбинантными полипептидами НЕ40, НЕ60 и НЕ70 окрашивание имеет место в зоне соответствущих молекулярных масс (треки 1, 2) и отсутствует в препарате клеток Ecoli PLT90, трансформированных векторной плазмидой без вставки вирусспецифических последовательностей ДНК, и в случае использования в качестве отрицательного контроля ß - галактозидазы.

Таким образом, нами было показано, что синтезируемые в клетках Ecoli гибридные белки, содержащие слитные с ß- галактозидазой фрагменты белков pORF2 и pORF3 ВГЕ, реагируют в твердофазном иммуноферменшом анализе с сыворотками больных острым вирусным гепатитом из эндемичного по гепатиту Е района. На основании этих результатов было сделано предположение, что данные рекомбинантные полипептиды являются диагностически-значимыми.

А) Б)

а) б) а) б)

1 2 3 4 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Рис. 8. Анализ рекомбинантных белков: А) - а) электрофорез полипептида НЕ40 до (1) и после очистки (2), и полипептида НЕ60 до (3) и после (4) очистки; б) иммуноблоттинг с сывороткой больного ОВГ из эндемичного района: полипептидов НЕ40 (1) и НЕ60 (2) и клеток РЬТ90, трансформированных векторной плазмидой (3); Б) - электрофорез (а) и иммуноблоттинг (б) с сывороткой больного ОВГ из эндемичного района: полипептида НЕ70 (1); клеток штамма-продуцента белка НЕ60 (2); /?-галактозидазы (3). Стрелкой указано положение /?-галактозидазы.

4.4.2. Сравнительное изучение взаимодействия сывороток больных острым вирусным гепатитом из эндемичного района с рекомбннантными и синтетическими антигенами - фрагментами белков ВГЕ.

Несмотря на то, что отобранные рекомбинантные полипептиды взаимодействовали с достаточно большим количеством сывороток больных ОВГ из эндемичного района, на основе полученных результатов невозможно было сделать заключение о специфичности этого взаимодействия, так как в проведенных исследованиях отсутствовал адекватный контроль, который мог бы исключить возможность неспецифического реагирования, связанную с качеством очистки антигенов или с их структурой.

Для изучения антигенной специфичности рекомбинантных полипептидов были проведены сравнительные исследования с использованием синтетических пептидов. В этих экспериментах в качестве положительного контроля использовали ранее охарактеризованный в коммерческой тест-системе синтетический пептид, являющийся фрагментом pORF3 ВГЕ штамма Бирма с 99 по 119 аминокислотные остатки (Семилетов и др. Биоорг. Химия 1995). Исследования проводили методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на 62 сыворотках больных острым гепатитом из эндемичного района Узбекистана с использованием иммуносорбентов на основе рекомбинантных полипептидов и синтетического пептида. В качестве отрицательного контрольного антигена использовали выделенный из клеток E.coli препарат ß - галактозидазы при проведении анализа на рекомбинантном полипептиде. При проведении анализа на синтетических пептидах в качестве контрольного антигена применяли синтетический пептид - фрагмент с 1 по 15 аминокислотные остатки N-концевой части белка Vpr вируса иммунодефицита человека 1 типа с аминокислотной последовательностью MEQAPEDQGPQREPR. На диаграмме, представленной на Рис. 9, указаны количества сывороток прореагировавших с отдельными антигенами в этом

эксперименте. Ни одна из сывороток не дала положительной реакции с ß -галактозидазой.

Как видно из результатов, представленных в таблице 6, 93% сывороток, прореагировавших с рекомбинантным полипептидом НЕ60, и 32% - с НЕ40 оказались положительными по отношению к синтетическому пептиду. Две из тридцати положительно-прореагировавших с рекомбинантными антигенами сывороток (пп 634 и 694) оказались отрицательными в реакции с синтетическим пептидом и, кроме того, наблюдается более высокая интенсивность сигнала при использовании иммуносорбента на основе рекомбинантного антигена НЕ60. Два последних факта могут объясняться большей протяженностью вирусспецифического фрагмента в составе рекомбинантного полипептида НЕ60 по сравнению с синтетическим пептидом или лучшей передачей рекомбинантным антигеном конфигурации эпитопов при сорбции на планшетах. Из 30 сывороток, прореагировавших с полипептидов НЕ60, 20 оказались положительными по отношению к содержащему фрагмент ORF2 рекомбинантному полипептиду НЕ40, при этом регистрируемые значения оптической плотности при постановке реакции с полипептидом НЕ40 были несколько ниже.

Антигенную специфичность полипептида НЕ60 изучали также методом конкурентного ИФА, используя в качестве конкурирующих антигенов синтетические пептиды - фрагменты белка-продукта ORF3 с 99 по 119 аминокислотные остатки ВГЕ штаммов Бирма с аминокислотной последовательностью

PLGVTRPSAPPLPHVVDLLPQL и штамма Мексика, последовательность которого отличается заменами пяти аминокислот: №102 - V на Е, №103 - Т на Е, №112 - Н на Р,. №115 - V на А, №119 - L на Р. В качестве отрицательных конкурирующих антигенов использовали выделенный из клеток E.coli препарат ß - галактозидазы и синтетический пептид - фрагмент белка Vpr вируса иммунодефицита человека 1 типа;

Таблица 6. Взаимодействие синтетических и рекомбинантных антигенов с сыворотками больных острым гепатитом из эндемичного района.

N сыворотки Антигены

Пептид 99-119 ВГЕ НЕ60 НЕ40

штамма Бирма

1 2+ 4+ 3+

9 3+ 4+ 2+

11 4+ 4+ 1+

111 3+ 4+ -

203 1+ 3+ -

396 2+ 4+ -

397 2+ 4+ -

411 4+ 4+ 3+

417 4+ 4+ 2+

423 3+ 4+ -

430 4+ 4+ 1+

436 3+ 4+ 2+

437 3+ 4+ 2+

441 3+ 4+ 1+

443 2+ 4+ 2+

448 4+ 4+ -

500 3+ 4+ 1+

503 2+ 4+ 1+

512 4+ 4+ 2+

513 1+ 3+ 3+

520 4+ 4+ 2+

565 3+ 3+ 2+

567 1+ 4+ 1+

580 2+ 4+ 2+

634 - 2+ 1+

694 - 4+ -

703 2+ 4+ -

721 2+ 4+ -

726 2+ 4+ -

735 3+ 4+ 1+

Всего (+) 28 30 20

% от общего 45,2 48,3 32,2

количества

исследованных

сывороток (п=62)

в качестве положительного конкурирующего антигена - препарат рекомбинантного антигена НЕ60. На Рис. 10 представлен график зависимости связывания антител IgG сыворотки больного ОВГ из Узбекистана от концентрации конкурирующего антигена в разводящем растворе для сыворотки. На графике видно, что при увеличении концентрации конкурирующего антигена в виде пептида-фрагмента белка штамма Бирма или рекомбинантного полипептида НЕ60 подавление связывания антител с рекомбинантным антигеном, сорбированным на поверхности планшет, происходило практически одинаково. Присутствие в растворе для инкубации с сыворотками ß -галактозидазы и синтетического пептида, не содержащего последовательностей ВГЕ, не влияло на взаимодействие сывороток с рекомбинантным полипептидом НЕ60. Добавление к сывороткам синтетического пептида - фрагмента белка штамма Мексика лишь незначительно ингибировало связывание антител.

Чтобы установить статистическую достоверность полученных результатов, полученных в опытах по конкуренции, была сделана попытка ингибирования синтетическими пептидами связывания антител с полипептидом НЕ60 на 15 сыворотках, положительных в отношении полипептида НЕ60 и пептида-фрагмента белка штамма Бирма (Рис. 11). В качестве отрицательного контроля в лунки планшет сорбировали ß - галактозидазу, выделенную из клеток E.coli. Синтетические пептиды добавлялись к сывороткам в концентрации 2 мг/мл, при которой в опытах по изучению зависимости связывания антител IgG от концентрации конкурирующего антигена происходило максимальное снижение регистрируемого сигнала. В присутствии синтетического пептида - фрагмента белка штамма Бирма происходило подавление сигнала в среднем на 76,6±3,4%, а в присутствии пептида мексиканского типа сигнал снижался на 25,3±3,9%. При добавлении к сывороткам в качестве конкурирующего антигена препарата рекомбинантного белка НЕ60 оптическая плотность снижалась в среднем до 13,9±2,9%, то есть, до значений соответствующих отрицательному

lg концентрации конкурирующего антигена

Рис. 10. Нейтрализация связывания антител с антигеном НЕ60 синтетическими пептидами (сыворотка больного ОВГ из Узбекистана):

-érp— gal

пептид ВИЧ1

контролю (9,9±2,9%). Возможное неполное подавление синтетическим пептидом связывания антител с рекомбинантным белком по-видимому связано с наличием дополнительных эпитопов в составе белка НЕ60. Поскольку в исследовании использовались сыворотки среднеазиатского происхождения, более высокая степень подавления сигнала пептидом бирманского типа по сравнения с пептидом мексиканского типа согласуются с ранее полученными данными о антигенном сходстве бирманского и среднеазиатского вариантов ВГЕ и их отличии от мексиканского штамма (Дементьева Е.В., и др. 1997, Ышёуакоу У.Е. е/ а1. 1993).

4.4.3. Изучение специфичности рекомбинантных полипептидов.

С целью исключения вероятности неспецифического реагирования рекомбинантных полипептидов НЕ40 и НЕ60 с сыворотками больных острым вирусным гепатитом (ОВГ) методом непрямого ИФА исследовали взаимодействие этих полипептидов с сыворотками ОВГ из неэндемичного региона, а именно с сыворотками от 40 пациентов инфекционной больницы N1 г. Москвы с лабораторно подтвержденным диагнозом гепатита А, В или С. Исследовано 8 сывороток от больных с хроническими гепатитами В и С, 8 - от больных с острым гепатитом В, 4 - от больных с острым гепатитом С, 18 - от больных с гепатитом А и 2 сыворотки, не содержащих маркеров гепатитов А, В и С. Ни в одной из 40 сывороток больных ОВГ не обнаружено антител к рекомбинантным полипептидам НЕ40 и НЕ60.

Кроме того, исследовано взаимодействие с рекомбинантными антигенами сывороток здоровых людей из различных регионов. В сыворотках 88 пациентов, проходивших обследование в роддоме N4 г. Москвы в августе 1997г., и в полученных в 1995г. сыворотках 68 безвозмездных доноров из станции переливания крови республики Адыгея антител к рекомбинантным белкам не выявлено. В двух из пятидесяти исследованных сывороток безвозмездных доноров, полученных из

городской станции переливания крови г. Сургут, обнаружены антитела к полипептиду НЕ60 в низких титрах (ОПрек/ОПконтр=3). В сыворотках, полученных от 60 пациентов, госпитализированных в инфекционную больницу г. Алма-Ата в сентябре 1997 году антитела к рекомбинантным полипептидам выявлены не были.

4.5. Создание тест-систем для выявления антител к ВГЕ.

Как показали результаты экспериментов, описанных в главе № 4, рекомбинантные антигены НЕ40, НЕ60, НЕ70, содержащие фрагменты белков pORF2 и pORF3 ВГЕ, взаимодействуют с 32,2 - 48,3 % сывороток больных ОВГ из эндемичного района, собранных в период ожидаемого сезонного подъема заболеваемости гепатитом Е. Частота выявления антител к ВГЕ соответствует прогнозируемым для данного региона показателям (Солодовников Ю.П., Гасанов И.Ю. 1995, Balayan M.S. et al. 1994). В опытах по сравнительному изучению взаимодействия сывороток больных ОВГ из эндемичного района с синтетическими и рекомбинантными антигенами доказана специфичность связывания рекомбинантных полипептидов с антителами к ВГЕ. На основании этих результатов был сделан вывод о возможности использования полученных рекомбинантных антигенов для создания иммуноферментной тест-системы для выявления антител IgG к ВГЕ в сыворотках крови.

4.5.1. Описание тест-систем для выявления антител к ВГЕ.

Разработанные тест-системы «ВГЕ-скрин» и «ВГЕ-скан» основаны на использовании иммуносорбента, который представляет собой полистироловые или полихлорвиниловые планшеты для иммунологических реакций (по ТУ 6-06-1609-77, ТУ 42-2-42883, ТУ 64-2-375-86), в лунках которых иммобилизована эквимолярная

смесь рекомбинантных полипептидов "НЕ40", "НЕ60", "НЕ70" (заявка на изобретение №98119633 приоритет от 26 октября 1998г., положительное решение по результатам формальной экспертизы) и - в случае тест-системы «ВГЕ-скрин» - контрольный антиген (Каг), который представляет собой синтезированный в E.coli полипептид, содержащий аминокислотную последовательность протективного белка (ß -галактозидазы). В качестве конъюгата использованы моноклональные антитела против иммуноглобулинов человека, связанные с пероксидазой хрена. В тест-системы включены положительный контрольный образец (К+) - сыворотка крови человека содержащая антитела к вирусу гепатита Е - и отрицательный контрольный образец (К-) - сыворотка крови человека не содержащая антител к вирусу гепатита Е. Индикатором иммуноферментной реакции является раствор ортофенилендиамина (ОФД) с перекисью водорода. Подготовлены экспериментально-производственный регламент и временная фармакопейная статья на тест-системы.

Для контроля качества тест-системы брали не менее 20 образцов содержащих антитела к ВГЕ сывороток больных ОВГ из эндемичного района и не менее 20 образцов отрицательных сывороток, в качестве которых использованы сыворотки больных ОВГ из неэндемичного района.

Результаты измерения оптической плотности (ОП) для контрольных образцов считались удовлетворительными, если соотвествовали следующим показаниям:

Среднее значение ОПкк не выше 0,1;

(контроль конъюгата)

Среднее значение ОП в лунках с не выше 0,20;

отрицательной контрольной сывороткой [ОПк-] по каждому из антигенов (АгВГЕ и кАг)

Среднее значение ОП в лунках с не ниже 0,80;

положительной контрольной сывороткой [ОПк+] по АгВГЕ

Среднее значение ОП в лунках с

не выше 0,20;

положительным контролем по Каг

При соблюдении всех этих требований учитывали результаты анализа исследуемых образцов.

В случае тест-системы «ВГЕ-скрин», предназначенной для анализа 46 образцов сывороток, для каждой испытуемой сыворотки определяли величину отношения ОП по АгВГЕ к ОП этой же сыворотки по Каг. Результат испытания считали положительным, если отношение составляло не менее 2,00; результат испытания считали отрицательным, если отношение было менее 2,00.

В случае тест-системы «ВГЕ-скан», предназначенной для анализа 92 образцов сывороток, определяли величину ОПпор. С этой целью для всех отрицательных сывороток панели, содержащей сыворотки больных ОВГ и здоровых доноров из неэндемичного района, вычисляли среднее значение ОПср и среднеквадратичное отклонение (а). Вычисляли пороговое значение ОП (ОПпор): ОПпор = ОПср + Зет (Щиголев Б.М. 1969).

Результат учитывали как положительный, если соответствующее значение ОП в лунке было не меньше ОПпор; результат учитывали как отрицательный, если значение не превышало ОПпор.

Для выявления стабильности специфической активности препарата исследовано 5 экспериментальных серий тест-систем. В результате этих исследований был установлен срок годности тест-систем, который составил 6 месяцев. В течение этого срока воспроизводились значения ОПк+ и ОПк- по каждому из антигенов (АгВГЕ и Каг), ОПкк и специфичность реакции.

4.5.2. Испытание тест-системы «ВГЕ-скрин» на панели сывороток, охарактеризованных в тест-системе производства фирмы «Abbott Diagnostics».

Для оценки адекватности использования разработанных тест-систем для проведения сероэпидемиологичеких исследований изучали сыворотки, ранее охарактеризованные в тест-системе производства фирмы «Abbott-Diagnostics» в Лаборатории эпидемиологии и диагностики гепатита Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН. В исследование также были включены сыворотки больных острым вирусным гепатитом из эндемичного района Узбекистана и положительно-прореагировавшие сыворотки пациентов с неустановленным диагнозом из Москвы. Для проведения этих испытаний была выбрана тест-система «ВГЕ - скрин» как содержащая контрольный антиген. Результаты исследования представлены в таблице 7. Как видно из таблицы, результаты исследования совпадают по 28 из 30 положительных и по 18 из 19 отрицательных образцов в тесте "Abbott Diagnostics". В одном случае (сыворотка N 107) оба теста показали сомнительный результат. Контрольная положительная сыворотка (К+) из Национального института биологических стандартов и контроля (Великобритания) обоими тестами выявляется как положительная. В двух ("1М" и "2М") из трех позитивных в тесте "ВГЕ-скрин" сывороток пациентов из неэндемичного района (г. Москва) без клинических признаков гепатита антитела обнаруживались также и с помощью теста "Abbott Diagnostics" (Алаторцева Г.И. и др. 1999b).

Таблица 7. Выявление антител к вирусу гепатита Е с применением иммуноферментной системы производства фирмы "Abbott Diagnostics" и тест-системы "ВГЕ-скрин".__

Номер сыворотки Abbott Diagnostics ВГЕ-скрин Примечание (кол-во положительных реакций при испытании в 15 тестах, Ghrabrah Т., 1998)

1 - - 1:40 норм, человеческая сыворотка (н.ч.с.)

6 — — Донор крови (1/15)

7 — — Донор крови (1/15)

22 + + 1:20 н.ч.с.

30 - - 1:1280 н.ч.с.

35 + + Донор крови (10/15)

45 + + Смесь сывороток из Бирмы (3-6 мес. после начала инфекции)

50 + + 1:20 н.ч.с.

63 — — Донор крови (7/15)

73 — - 1:160 н.ч.с.

77 — - Донор крови (4/15)

76 + + Донор крови (11/15)

84 — - 1:320 н.ч.с.

85 + + Донор крови (13/15)

87 + + Донор крови (8/15)

89 + + Донор крови (10/15)

92 + + Пациент из Центральной Азии (1,5-2 года после начала инфекции)

94 + + Донор крови(13/15)

100 — - Донор крови (4/15)

102 — — Донор крови (1/15)

106 — — 1:1280 н.ч.с.

107 +/- +/- Донор крови (7/15)

114 - - 1:320 н.ч.с.

117 — - 1:640 н.ч.с.

127 - - 1:640 н.ч.с.

130 + + Донор крови (13/15)

137 - - 1:80 н.ч.с.

138 + + Донор крови (7/15)

143 + + Донор крови (11/15)

146 + - ■ Донор крови (6/15)

147 + - Донор крови (11/15)

152 — - 1:80 н.ч.с.

161 — - Донор крови (0/15)

163 _ — 1:160 н.ч.с.

454 + + Узбекистан-1993

565 + + Узбекистан-1993

530 + + Узбекистан-1993

459 + + Узбекистан-1993

190 + + Узбекистан-1993

185 + + Узбекистан-1993

168 + + Узбекистан-1993

105 + + Узбекистан-1993

61 + + Узбекистан-1998

51 + + Узбекистан-1998

178 + + Узбекистан-1998

152 + + Узбекистан-1998

К+ + + NIBSC UK

1М + + Москва-199 8

2М — + Москва-1998

ЗМ + + Москва-1998

Всего «+»-сыв-к 30 29

4.6. Использование тест-системы «ВГЕ-скрин» для эпидемиологических исследований.

Для проведения клинических испытаний была выбрана тест-система «ВГЕ-скрин», так как использование в ней наряду со специфическими антигенами отрицательного контрольного антигена создает возможность дополнительного подтверждения специфичности реакции. Для оценки пригодности разработанных тест -систем для проведения сероэпидемиологических исследований тест-система «ВГЕ-скрин» была использована при изучении этиологической структуры ОВГ в эндемичном по гепатиту Е районе в периоды сезонного подъема и спада заболеваемости и при оценке иммунного статуса населения эндемичного района в период спада заболеваемости гепатитом Е. Исследована также частота выявления с помощью данной тест-системы антител к ВГЕ в нормальной популяции неэндемичного района, так как известно, что антитела к ВГЕ обнаруживаются у здоровых лиц с частотой 1-3% в странах, которые не являются эндемичными в отношении гепатита Е (Balayan M.S. 1997).

4.6.1. Использование разработанных тест-систем для расшифровки этиологической структуры острых вирусных гепатитов, зарегистрированных в южном Узбекистана в течение 1993года.

С целью изучения возможности использования разработанных тест-систем для эпидемиологических исследований, тест - систему «ВГЕ-скрин» применили для расшифровки этиологической структуры вирусных гепатитов, зарегистрированных в течение 1993 года в Дехканабадском районе Узбекистана. Антитела IgG к ВГЕ выявляли методом непрямого твердофазного ИФА на планшетах с сорбированными

рекомбинантными антигенами НЕ40, НЕ60 и НЕ70 и контрольным антигеном. Исследовали сыворотки крови всех 376 больных острым вирусным гепатитом, поступивших в инфекционную больницу Дехканабадского района в период с 1 января по 31 декабря 1993 года. Острый гепатит А отмечен у 30,3% больных, острый гепатит В - у 37%, антитела к вирусу гепатита С обнаружены у 5,1%, антитела к ВГЕ - у 23% обследованных лиц, включая 36 случаев микст-инфекции: гепатита А и гепатита Е (9,5%) (Рис. 12). Обращает на себя внимание ярко выраженная сезонность заболеваемости гепатита Е: более 80% случаев заболевания зафиксированы в период с августа по декабрь (Рис. 13), что является характерным для гепатита Е (Tsai Y.-F. et al. 1994). В целом, доля гепатита Е составила 23% от общего числа случаев острого вирусного гепатита и 76,9% от случаев гепатита ни А ни В, что соответствует прогнозируемым показателям заболеваемости в эндемичных по гепатиту Е районах, которые по данным нескольких авторов в зависимости от эпидемической ситуации составляют от 22,2% (Tsai Y.-F. et al. 1994) до 70-85% (Balayan M.S. et al. 1994) случаев острого вирусного гепатита и до 92% от общего количества случаев гепатита ни А ни В (Khuroo M.S. et al. 1994). Более 70% случаев обнаружения антител к ВГЕ среди больных ОВГ пришлось на лиц старше 15 лет, что также согласуется с эпидемиологическими особенностями гепатита Е. Рассчитанный показатель заболеваемости гепатитом Е составил 51,7 на 100000 человек населения.

4.6.2. Тестирование сывороток пациентов из эндемичного района, собранных в периоды предполагаемого сезонного подъема и спада заболеваемости.

Исследовано также 192 образца сывороток больных ОВГ, собранных в период предполагаемого подъема заболеваемости, а именно, в ноябре 1998 года, и 392 образца сывороток здоровых доноров, собранных в том же эндемичном районе в период спада заболеваемости - в мае-июне 1999 года.

б/м (1,5%) ГВ+ГА (4,0%)

ГЕ (11,7%)

ГВ+ГЕ (0,8%)

Рис. 12. Доля гепатита Е в этиологической структуре острых вирусных гепатитов в Дехканабадском районе Узбекистана в 1993 г.: ГА - гепатит А, ГВ - гепатит В, ГС -гепатит С, ГЕ - гепатит Е, б/м - гепатит неустановленной этиологии

Из 192 пациентов с ОВГ, госпитализированных в ноябре 1998 года в областную инфекционную больницу г. Карши у 48 из (24%) выявлены антитела к ВГЕ. HbsAg обнаружен у 19, антитела к гепатиту С — у 7 пациентов. Обращает на себя внимание неравномерность территориального распределения случаев выявления антител к ВГЕ. Так, из одного кишлака в ноябре 1998 года поступил 71 больной с диагнозом «ОВГ», у 28 (39,4%) из которых выявлены антитела к ВГЕ. Полученные данные свидетельствуют не только о наличии очаговых случаев заболевания гепатитом Е, но и о значительном удельном весе этой инфекции в структуре ОВГ.

Антитела к ВГЕ были обнаружены в 37 (9,4%) из 392 сывороток здоровых доноров, собранных в том же районе в мае-июне 1999 года. Этот показатель согласуется с данными ВОЗ о величине иммунной прослойки населения в эндемичных районах, которая может достигать 10-15%, а иногда 25%. (Балаян М.С. 1995). Такая частота обнаружения антител к вирусу - невысокая по сравнению с этой величиной для гепатита А (100%) - также является характерной для инфекции, вызываемой ВГЕ.

4.6.3. Тестирование сывороток пациентов из Москвы без клинических проявлений гепатита Е

При исследовании с помощью тест-системы «ВГЕ-скрин» 407 сывороток пациентов с неустановленным диагнозом, проходящих плановое обследование в НИИ Вирусных препаратов РАМН антитела к ВГЕ обнаружены в 10 (2,45%) случаях. Ни в одном из случаев выявления антител к ВГЕ не было клинических проявлений гепатита в момент обследования. Этот факт обнаружения антител к вирусу у населения неэндемичного района не является неожиданным, так как по данным других исследователей число серопозитивных в отношении ВГЕ лиц может достигать 1-3% среди здорового населения неэндемичных районов (Федорова O.E. 1999).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в ходе проведенных исследований клонированы фрагменты второй и третьей открытых рамок считывания генома вируса гепатита Е, отобранные по результатам изучения > антигенной структуры белков вируса. В результате экспрессии в бактериальной клеточной системе клонированных фрагментов генов ВГЕ были получены рекомбинантные полипептиды, содержащие вирусспецифические эпитопы. Для синтеза и выделения рекомбинантных полипептидов создана новая патентно чистая векторная система. Доказана антигенная специфичность полученных рекомбинантных полипептидов и отобраны наиболее диагностически значимые из них. На основе этих полипептидов созданы иммуноферментные тест-системы "ВГЕ-скрин" и "ВГЕ-скан" для выявления антител к вирусу гепатита Е в сыворотках крови. Проведенные испытания показали возможность использования данных тест-систем для проведения сероэпидемиологических исследований как в эндемичных районах, так и на территориях с отсутствием эпидемической заболеваемости.

выводы

1. Сконструирована и запатентована новая векторная система экспрессии рекомбинантных генов в клетках Escherichia coli, предназначенная для синтеза и выделения рекомбинантных белков.

2. Синтезированы и клонированы фрагменты ДНК, кодирующие иммунодоминантные эпитопы белков - продуктов ORF2 и ORF3 вируса гепатита Е штамма Бирма.

3. Получены бактериальные штаммы - продуценты рекомбинантных полипептидов, содержащих антигенные детерминанты белков pORF2 и pORF3 вируса гепатита Е штамма Бирма.

4. Исследована диагностическая значимость полученных рекомбинантных полипептидов. Из них отобраны полипептиды с наиболее выраженной антигенной активностью. На их основе созданы иммуноферментные тест-системы «ВГЕ-скрин» и «ВГЕ-скан» для определения антител к вирусу гепатита Е в сыворотках крови. Разработанные диагностические препараты обладают высокой чувствительностью и специфичностью.

5. При помощи тест-системы «ВГЕ-скрин» проведены серо-эпидемиологические исследования острого вирусного гепатита на территории Дехканабадского района Кашкадарьинской области Узбекистана. Определена доля гепатита Е в этиологической структуре острых вирусных гепатитов и рассчитан показатель заболеваемости, который составил 51,7 на 100 тыс. населения.

1. Alexandra S., Babes Y.T. The hepatitis E virus. Rev. Roum. Virol.,1993, 44,v.l-2, p.127-136.

2. Arankalle V.A., Favorov M.O., Chadha M.S., Phule D.M., Banerjee K. Rhesus monkeys infected with hepatitis E virus (HEV) from the former USSR are immune to subsequent challenge with an Indian strain of HEV. Acta Virol. ,1993, 37, p.515-518.

3. Arankalle V.A., Goverdhan M.K., Banerjee K. Antibodies against hepatitis E virus in Old World monkeys. J. Viral hepatol., 1994, 1, p.125-129.

4. Arankalle V.A., Ticehurst J., Sreenivasan M.A., Kapikian A.Z., Popper H., Pavri K.M., Purcell R.M. Association of a virus like particle with enterically transmitted non-A, non-B hepatitis. Lancet, 1988,1, p.550-554.

5. Aye T.T., Uchida T., Ma X.Z., Iida F„ Shikata T., Ichikawa M., Rikihisa T., Win K.M. Sequence and genome structure of hepatitis E virus isolated from Myanma. Virus Genes, 1993, 7, p.95-100.

6. Aye T.T., Uchida T., Ma X.Z., Iida F„ Shikata T., Zhuang H„ Win K.M. Sequence comparison of the capsid region of hepatitis E virus isolated from Myanma and China. Microbiology and Immunology, 1992, 36, p.615-621.

7. Aye T.T., Uchida T., Ma x-Z, Iida F., Shikata T., Zhuang H., Win K.M. Complete nucleotide sequence of a hepatitis E virus isolated from the Xinjiang epidemic (19861988) of China. Nucleic Acids Research, 1992, 20, p.3512.

8. Balayan M.S. Type E hepatitis :state of art. Intern. J. Infect. Dis. 1997, 2, p.l 13-120.

9. Balayan M.S., Andjaparidze A.G., Savinskaya S.S. et al.. Evidence for a virus in non-A, non-B hepatitis transmitted via fecal-oral route. Intervirol., 1983, 20, p.23-31.

10. Balayan M.S., Usmanov R.K., Zamyatina N.A. et al.. Experimental hepatitis E infection in domestic pigs. J. Med Virol., 1990, 32, p.58-59.

11. Balayan M.S., Zamyatina N.A., Mikhailov M.I. et al. Serological survey on hepatitis E virus infection in an endemic area: diagnostic potential of enzyme immunoassay for detection of IgG antibody. Clin. Diagn. Virol., 1994, 2, p.297-304.

12. Bauvet J.P., Pires R., Quan C., Iscaki S., Pillot J. Non-immune Vh- binding cpecifity of human protein Fv. Scand. J. Immunol., 1991, 33, p.381-386.

13. Bradley D.W. Hepatitis E: Epidemiology, aetiology and molecular biology. Review of Med. Virol. 1992, 2, p. 19-28.

14. Bradley D.W. Hepatitis non-A, non-B viruses become identified as hepatitis C and E viruses.- .Prog. Med. Virol., 1990, 37, p.101-135.

15. Bradley D.W., Andjaparidze A.G., Cook E.H., et al.. Ethiologic agent of enterically transmitted non-A, non-B hepatitis. J. Gen. Virol., 1988, 69, p.731.

16. Bradley D.W., Krawcczynski K., Cook E.H.Jr, Huphrey C.D., Spelbring J.E., Myint H., Maynard J.E., McCaustland K.A. Enterically transmitted non-A,non-B hepatitis: Serial passage of disease assciated 27 kD 31 nm virus like particles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, p.6247-6281.

17. Bradly D.W. Enterically transmitted non-A,non-B hepatitis. Br. Med. Bull., 1990, 46, p.442-461.

18. Chanhan A., Jameel S., Dilawari J.B., Chawla Y.K., Kaur U., Gunguly N.K. Hepatitis E virus transmission to a volunteer. Lancet, 1993, 431, p. 149-150.

19. Chattarjee R., Tsarev S., Pillot J., Coursagent P., Emerson S., Purcell R.H. African Strains of Hepatitis E Virus That Are Distinct From Asian Strains. J. Med. Virol., 1997, 53, p.139-144.

20. Clayson E.T., Chau K.H., Cabal C.M., Yarbough P.O., Reyes G.R., Mushahwar I.K. Evidence that the hepatitis E virus (HEV) is a zoonotic virus: detection of natural infections among swine, rats, and chickens in area endemic for human disease. In

Enterically-transmitted hepatitis viruses. Edit. Buisson Y., Coursaget P., Kane M. J. Tours, France, La Simmarre, 1996, p.329-335.

21. Cousaget P., Y. Buisson , N.Depril, P. le Cann , M.Chabaud, C.Molinie, R.Roul . Mapping of linear B cell epitopes in open reading frames 2- and 3'-encoded proteins of hepatitis E virus using synthetic peptides. FEMS Microbiol. Lett. 1993. 109:251-255.

22. Dawson G.J., Chau K.H., Cabal C.M., Yarbough P.O., Reyes G.R., Mushahwar I.K Solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay for hepatitis E virus IgG and IgM antibodies utilising recombinant antigens and synthetic peptides. J. Med Virol., 1992, 38, p. 175-186.

23. Dawson G.L., Mushahwar I.K., Chau K.H., Gitnik G.L. Detection of long - lasting

antibody to hepatitis E virus in US traveller to Pakistan. Lancet, 1992, 340, p.426.

24. De Cock K.M., Bradly D.W, Sandford N.L.,Gondarajan S., Maynard J.E., Redeker A.G. Epidemic non-A,non-B hepatits inpatients from Pakistan. Ann. Intern. Med., 1987, 106, p.227-230.

25. Diallo A., Lazizi Y., Guenno B.Le., Pillot J. Hepatitis-E-virus-associated antigen: improved detection in stools by protein by Fv removal. Res. Virol., 1991, 142, p.449-459.

26. Erker J.C., Deai S.M., Schlauder G.G., Dawson G.J., Mushahwar I.K. A hepatitis E variant from the United States: Molecular characterization and transmission in cynomolgus macaques. J. Gen Virol., 1999, 80, v.3, p.681-690.

27. Favorov M.O., Fields H.A., Purdy M.A., Yashina T.L., Aleksandrov A.G., Alter M.J., Yarasheva D.M., Bradley D.W., Margolis H.S. Serologic identification of hepatitis E virus infection in epidemic and endemic settings. J. Med Virol., 1992, 36, p.246-250.

28. Favorov M.O., Khudyakov Y.E., Fields H.A. et al.. Enzyme immunoassay for detection of antibody to hepatitis E virus based on synthetic peptides. J. Med Virol., 1994, 46, p.237-250.

29. Favorov M.O., Khudyakov Y.E., Mast E.E., Yashina T.L., Shapiro C.N., Khudyakova N.S., Jue D.L., Onischenco G.G., Margolis H.S., Fields H.A. IgM and IgG antibodies to hepatitis E virus (HEV) detected by an enzyme immunoassay based on an HEV-specific artificial recombinant mosaic protein. J. Med Virol., 1996, 50, p.50-58.

30. Fortier D., TreadwellT.L., Koff R.S., Enterically transmitted non-A,non-B hepatitis: Importation from Mexico to Massachucetts. New England Journal of Medicine. 1989, 320, p.1281-1282.

31. Fry K.E., TamA.W, Smith M.M., Kim J.P., Luk K.C., Young L.M., Piatack M„ Feldman R.A., Yun K.Y., Purdy M.A., McCaustland K.A., Bradley D.W., Reyes G.R. Hepatitis E virus (HEV): strain variation in the nonstructural gene region encoding consensus motifs for an RNA-dependent RNA polymerase and an ATP/GTP binding site. Virus Genes, 1992, 6, p.173-185.

32. Goldsmith R., Yarbough P.O., Reyes G.R., Fry K.E., Gabar K.A., Kamel M., Zakaria S., Amer S., Gaffar Y. Enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of acute sporadic hepatitis E in Egyptian children. Lancet, 1992, 339, p.328-331.

33. Gouvea V., Cohen S.J., Santos N., Myint K.S., Hoke C.Jr., Innis B.L. Identification of hepatitis E virus in clinical specimens: Amplification of hydroxyapatite-purified virus RNA and restriction RNA analysis. J. Virol. Meth., 1997, 69, p.53-61.

34. Grabrah T.M., Tsarev S.A., Yarbough P.O., Emerson S.U., Stickland G.T., Purcell R.H. Comparison of tests for antibody to hepatitis E virus. J. Med. Virol., 1998, 55, p. 134-

35. Grunstain M., Hogness D.S. Colony hybridization: a method for the isolation of clones DNAs that contain a specific gene. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1975, 72, v.10, p.3961-3965.

36. He J., Ching W-M, Yarbough P.O.,Wang H., Carl M. Purification of a baculovirus-expressed hepatitis E virus structural protein and utility in an enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin Microbil., 1995, 33, p.3308-3311.

37. He J., Tam A.W., Yarbough P.O., Reyes G.R., Carl M. Expression and diagnostic utility of hepatitis E virus putative structural proteins expressed in insect cells. J.Clin. Microbiol., 1993, 31:2167-2173.

38. Hsieh S.Y., Yang P.Y., Ho Y.P., Chu C.M., Liaw Y.F. Identification of a Novel Strain of Hepatitis E Virus Responsible for Sporadic Acute Hepatitis in Taiwan. J. Med. Virol., 1998, 55, p.300-304.

39. Huang C-C., Nguyen D., Fernandez J., Yun K.Y., Fry K.E., Bradley D.W., Tam A. W., Reyes G.R. Molecular cloning of the Mexico isolate of hepatitis E virus (HEV). Virol., 1992, 191, p.550-558.

40. Humphrey C.D., Cook E.H.Jr, Bradley D.W. Identification of enterically transmitted hepatitis virus particles by solid -phase immune electron microscopy. J. Virol. Meth., 1990, 29, p.177-188.

41. Ichikawa M., Araki M., Rikihisa T. Cloning and expression of cDNAs from entericalli-transmitted non-A, non-B hepatitis virus. Microbiol. Immunol., 1991, 35, p.535-543.

42. Jameel S., Durgapal H., Habibullah C.M., Khuroo M.S., Panda S.K. Enteric non-A, non-B Hepatitis: Epidemics, Animal transmission, and hepatitis E virus detection by polymerase chain reaction. J. Med. Virol., 1992, 37, p.263-270.

43. Jameel S., Zafrullah M., Ozdener M. H., Panda S.K. Expression in animal cells and characterization of the hepatitis E virus structural proteins. J. Virol., 1996, 70, p.207-216.

44. Kabrane-Lazizi Y., Fine J.B., Glass G.E., Higa H., Diwan A., Gibbs C.J., Meng X.J., Emerson S.U., Purcell R.H. Evidence for widespread infection of rats with hepatitis E virus in the United States. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1999, 61, v.2, p.331-335.

45. Kaur M., Hyams K.C., Purdy M.A., Krawczynski K., Ching W.M., Fry K.E., Reyes G.R., Bradley D.W., Carl M. Human linear B-cell epitopes encoded by the hepatitis E virus include determinants in the RNA-dependent RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, p.3855-3858.

46. Khudyakov Y.E., Favorov M.O., Jue D., Hine T.K., Fields H.A. Immunodominant antigenic regions in a structural protein of the hepatitis E virus. Virol., 1994, 198, p.390-393.

47. Khudyakov Y.E., Favorov M.O., KhudyakovaN.S., Cong M-E., Holloway B.P., Padhye N., Lambert S.B., Jue D.L., Fields H.A. Artificial mosaic protein containing antigenic epitopes of hepatitis E virus. J. Virol., 1994, 68, v.l 1, p.7067-7074.

48. Khudyakov Y.E., Khudyakova N.S., Fields H.A., Jue D., Starling C., Favorov M.O., Krawczynski K., Polish L., Mast E., Margolis H. Epitope mapping in proteins of hepatitis E virus. Virol., 1993, 194, p.89-96.

49. Khuroo M.S., Kamili S., Dar M.Y., Moecklii R., Jameel S. Hepatits E and long-term antibody status. Lancet, 1993, 341, p.1355.

50. Khuroo M.S., Kamili S., Jameel S. Verical transmission of hepatitis E virus. Lancet, 1995, 345, p.1025-1026.

51. Khuroo M.S., Rustgi Y.K., Dawson G.J. et al. Spectrum of hepatitis E virus infection in India. J. Med. Virol., 1994, 43, p.281-286.

52. Koonin E.V., Gorbalenia A.E., Purdy M.A., Rozanov M.N., Reyes G.R., Bradley D.W. Computer-assisted assignment of functional domains in the nonstructural polyprotein of hepatitis E virus: delineation of an additional group of positive-strand RNA plant and animal viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, p.8259-8263.

53. Krawczynski K., Bradley D.W. Enterically transmitted non-A, non-B Hepatitis: Identification of virus-associated antigen in experimentally infected cynomolgus macaques. J. Infect. Dis., 1989, 159, p.1042-1049.

54. Krawczynski K., Bradley D.W., Ajdukiewicz A., Alter M., Caredda F., Dilawari J., Hlady G., Innis B., Kane M., Nasidi A., Redeker A., Stetler H., Toukan A., Yoffee B. Virus-associated antigen and antibody of epidemic non-A, non-B hepatitis: Serology of outbreaks and sporadik cases. In "Viral hepatitis C,D and E." Eds. Shikata T, Purcell R.H., Uchida T New York, Elsevier Science Publishers, 1991, p.229-236.

55. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, 227, p.680-685.

56. Li F., Torresi J., Locarnini S., Zhuang H., Zhu W., Guo X., Anderson D. Amino-terminal epitopes are exposed when full-length open reading frame 2 of hepatitis E virus is expressed in Escherichia coli, but carboxy-terminal epitopes are masked. J.Med Virol., 1997, 52, p.289-300.

57. Li F., Zhuang H., Kovalis S., Locarnini S., Anderson D. Persistent and transient antibody responses to hepatitis E virus detected by Western immunoblot using open reading frame 2 and 3 and glutation-S-transferase fusion proteins. J. Clin. Microbiol., 1994,32, p.2060-2066.

58. Mannerat Y., Clayson E.T., Myint K.S.A., Young G.D., Innis B.L. Experimental infection of the laboratory rats with the hepatitis virus. J. Med Virol., 1996, 48, p.121-

59. Mast E.E., Alter M.J., Holland P.V., Purcell R.H., Group HEVASPE. Evaluation of assays for antibody to hepatitis E virus by a serum panel. Hepatology, 1998, 27, v.3, p.857-861.

60. Maxam A.M., Gilbert W. A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1977, 74, v.2, p.560-564.

61. McCaustland K.A., Bi S., Purdy M.A., Bradley D.W. Application of two RNA extraction methods prior to amplification of hepatitis E virus nucleic acid by the polymerase chain reaction. J. Virol. Meth., 1991, 35, p.331-342.

62. Meng X.J., Purcell R.H., Halbur P.G., Lehman J.R., Webb D.M., Tsareva T.S., Haynes J.S., Thacher B.J., Emerson S.U. A novel virus in swine is closely related to the human hepatitis E virus. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1997, 94, p.9860-9865.

63. Naik S.R., Aggraval R., Salunke P.N., Mehrofran N.N. Bull. Worth Health Organ., 1992, 70, v.5, p.597-604.

64. Oligonucleotide synthesis : a practical approach. Ed. M.Y. Gait. Oxford, 1984, p.35-81, p.117-132.

65. P.J.Hugo Johansson, Isa K. Mushawar, Gunnar Norkrans, Ola Weiland, Eric Nordenfelt. Hepatitiss E Virus infection in patients with acute hepatitis non-A-D in Sweden. Scand J. Infect. Dis., 1995, 27, p.543-546.

66. Paul D.A., Knigge M.F., Ritter A., Gutierres R., Pilot M.T., Chau K.H., Dawson G.J. Determination of hepatitis E virus seroprevalence by using recombinant fusion proteins and synthetic peptides. J. Infect. Dis., 1994,169, p.801-806.

67. Pillot J., Sharma M.D., LaziziY., Budkowska A., Dauguet C., Galimand M., Sarthou J.L. Characterization of a viral agent involved in epidemic and sporadic non-A, non-B hepatitis. Ann. Inst. Pasteur/Virol., 1987,138, p.145-158.

68. Pujol F.H., Favorov M.O., Marcano T., Este J.A., Magris M., Liprandi F., Khudyakov Y.E., Khudyakova N.S., Fields H.A. Prevalence of antibodies against hepatitis E among urban and rural population in Venezuela. J. Med. Virol., 1994, 42, p.234-236.

69. Purcell R.H., Ticehurst J. Enterically transmitted non-A non-B hepatitis: Epidemiology and clinical characteristics. In "Viral hepatitis and liver disease." Ed. Zuckerman A.J. New York, Alan R. Liss, 1988, p. 131-137.

70. Purdy M.A., Carson D., McCaustland K.A., Bradley D.W., Beach M.J., Krawczynski K. Viral Specificity of hepatitis E virus Antigens identified by fluorescent antibody assay using recombinant HEV proteins. J. Med. Virol., 1994, 44, p.212-214.

71. Purdy M.A., McCaustland K.A.,Krawczynsky K., Spelbring J., Reyes G.R., Bradley D.W. Expression hepatitis E virus (HEV)-trpE Fusion protein containing epitopes recognized by antibodies in sera from human cases and experimentally infected primates. Arch. Virol., 1992, 123, p.335-349.

72. Qoirida J.A., Cotonat T., Castillo I., Carreno V. Hepatitis E virus seroprevalence in acute viral hepatitis in a development country confirmed by a supplemental assay. J. Med Virol., 1996, 50,p.l6-19.

73. Rapicetta M., Kondili L.A., Pretolani S., Stroffolini T., et al. Seroprevalence and anti -HEV persistence in the general population of the reppublic of San Marino. J. Med Virol., 1999, 58, p.49-53.

74. Reyes G.R., Purdi M.A., Kim J.P., Luk K.-C., Young L.A., Fry K.E., Bradley D.W. Isolation of cDNA from the virus responsible for enterically transmitted non-A, non-B hepatitis. Science, 1990, 247, p.1335-1339.

75. Rioche M., Himmich H., Chercaoui A., Mourid A., Dubreuil P., Zahraaoui M., Pillot J. Forte incidence des hepatites non-A,non-B sporadiques au Maroc: etude epidemiologique. Bull. Soc. Pathol. Exot. Filiales., 1991, 84., p,117-"127.

76. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. . Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977, 74, v. 12, p.5463-5467.

77. Sarthou J.L., Budkowska A., Sharma M.D., Pillot J. Characterization of an antigen-antibody system associated with epidemic non-A, nonB hepatitis in West Africa and experimental transmission of infectious agent to primates. Ann. Inst. Pasteur/Virol., 1986, 137E, p.225-232.

78. Schlauder G.G., Dawson G.J., Ritter A., Sutherland R., Moaness A., Kamel M.A. Viremia in Egyptian children with hepatitis E virus infection. Lancet, 1992, 341, p.378.

79. Silvan P.E., HellstromU.B., Hampl H. el al. Hepatitis E in patients with chronic autoimmune liver disease. J.A.M.A. 1995,273, p.377-373.

80. Skaug K., Hagen I.J., von der Lippe B. Three cases of acute hepatitis E virus infection imported into Norwey. Scand. J.Infect.Dis., 1994, 26, p. 137-139.

81. Skidmore S.J., Yarbough P.O., Gabor K.A., Tam A.W., Reyes G.R., Flower A.J. Imported hepatitis E in U.K. (letter). Lancet, 1991, 337, p.1541.