Получение рекомбинантных белков-киллеров патологических В-клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Степанов, Алексей Вячеславович

• Степанов, Алексей Вячеславович
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Степанов, Алексей Вячеславович

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Рассеянный склероз

основный белок миелина

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит

Роль T-клеток в развитии и патологии рассеянного склероза и экспериментального аутоиммунного

энцефаломиелита

Роль В-клеток в развитии и патологии рассеянного склероза и экспериментального аутоиммунного

энцефаломиелита

Современные подходы к терапии рассеянного склероза

Иммуномодулирующие препараты для терапии РС

Моноклональные антитела в терапии РС

Иммунотоксины в терапии рассеянного склероза и аутоиммунных заболеваний

Антиген-специфическая терапия рассеянного склероза

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические реактивы и сопутствующие материалы

Работа с нуклеиновыми кислотами

Работа с эукариотическими клетками

Методы работы с бактериями E.coli

Хроматографические процедуры

Работа с белками

Работа с животными

Пациенты с рассеянным склерозом

Приготовление липосом

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ иммунодоминантных фрагментов ОБМ при рассеянном склерозе и

экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите

Терапия экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита фрагментами ОБМ,

инкапсулированными в липосомы

Создание липосом, содержащих инкапсулированные фрагменты ОБМ

Антиген-специфичная иммуномодулирующая терапия ЕАЕу крыс линии DA пептидами ОБМ,

инкапсулированными в липосомы

Направленная элиминация В-клеток белками-киллерами

Создание генетических конструкций рекомбинантных белков-киллеров

Экспрессия и очистка рекомбинантных белков-киллеров

Анализ функциональной активности полученных белков-киллеров

Исследование цитотоксических свойств белков-киллеров ex vivo

Селективная элиминация целевых В-клеток в культуре спленоцитов

Элиминация аутореактивных В-клеток in vivo

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Л

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

At - антитело

АПК - антигенпредставляющая клетка

ГКГС (МНС) - главный комплекс гистосовместимости

ДМСО - диметилсульфоксид

ДСН - додецилсульфат натрия

ЕАЕ - экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит

ЕТА - псевдомонадный токсин

ИЛ - интерлейкин

ИФНб - интерферон-бета

ИПЛ - измененные пептидные лиганды

ИТ - иммунотоксин

кДа - килодальтон

МОГ - миелин-олигодендроцитарный гликопротеин

монАт - моноклональное антитело

НФГМ - нейротрофический фактор головного мозга

ОБМ (МВР) - основный белок миелина

ПААГ - полиакриламидный гель

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

НАФ - неполный адъювант Фрейнда

ПЦР - полимеразная цепная реакция

PC - рассеянный склероз

РИБ - рибосом-инактивирующие белки

СКВ - системная красная волчанка

ФЭ-2 - фактор элонгации

ФИТЦ - флуоресцеин-5-изотиоцианат

ШПТ - шига-подобный токсин E.coli

IgG - иммуноглобулины класса G

PLP - протеолипидный белок

SUV - однослойные липосомы

TGF - трансформирующий фактор роста

Тх - Т-хелперы

Tr, Treg - Т-регуляторные клетки

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение рекомбинантных белков-киллеров патологических В-клеток»

ВВЕДЕНИЕ.

Рассеянный склероз (РС) - это хроническое воспалительное нейродегенеративное заболевание аутоиммунной природы с неизвестной этиологией. Патогенез данного заболевания включает в себя повреждение миелиновой оболочки нервных волокон, что приводит к постепенной утрате различных функций центральной нервной системы, связанных с физическим и психоэмоциональным состоянием больного. Более миллиона человек болеет рассеянным склерозом во всем мире. Основную роль в патологическом процессе демиелинизации аксонов отводят Т- и В-клеткам, специфичным к компонентам миелиновой мембраны. Список потенциальных аутоантигенов постоянно расширяется и включает в себя различные белки ассоциированные с мембраной олигодендроцитов. Среди них особо выделяют основный белок миелина (ОБМ) и миелин олигодендрацитарный гликопротеин (МОГ). Аутореактивные лимфоциты, специфичные к данным белкам, совместно с макрофагами проникают через гематоэнцефалический барьер и индуцируют процессы воспалительной демиелинизации в ЦНС. Известно, что Т-клетки ответственны за острый иммунный ответ по отношению к олигодендроцитам, в то время как В-клетки продуцируют патогенные аутоантитела и являются активными антигенпредставляющими (АПК) и цитокинпродуцирующими клетками. Ещё одним подтверждением важности В-клеток при патологии РС является наличие каталитических антител к ОБМ в сыворотке больных, которые могут не только связывать ОБМ, но и гидролизовать его.

Современное понимание особенностей механизмов индукции и патогенеза заболевания значительно изменили взгляды на терапию РС. На сегодняшний день существует несколько подходов к лечению данного заболевания: А) Введение так называемых "измененных пептидных лигандов" (ИПЛ), взаимодействующих с Т-клеточными рецепторами (ТкР). ИПЛ являются модифицированными, мутированными или укороченными участками последовательностей, связывающихся с ТкР. ИПЛ могут частично активировать Т-клетки, переключая их

с фенотипа Тх-1 на Тх-2, а также в некоторых случаях индуцировать обращение Т-клетки в анергию.

В настоящее время среди препаратов патогенетического лечения PC (препаратов, изменяющих течение PC или ПИТРС) активно используется Copaxone Б) - синтетический сополимер L-аминокислот Glu, Lys, Ala и Туг. Copaxone стимулирует образование популяции регуляторных Тх-2 клеток, способных проникать через ГЭБ и продуцировать противовоспалительные цитокины. В) Введение ИФНр. Г) Применение моноклональных антител, специфичных к поверхностным клеточным рецепторам: Rituximab (антитело к CD20, содержится на мембране зрелых В-клеток), Daclizumab (антитело к CD25, альфа-субъединица рецептора ИЛ-2, презентирован на активированных Т-клетках), Alemtuzumab (антитело к CD52, гликопротеин с неизвестной функцией, представленный на поверхности всех зрелых лимфоцитов и моноциов). Д) Терапия per os препаратом FTY720 (в фосфорилированной форме - ингибитор SP1-ассоциированных G-опосредованных рецепторов); Teriflunomide - ингибитор пролиферации Т клеток; BG-12, индуцирует продукцию цитокинов Тх-2 типа; Laquinimod, блокирует способность Т-клеток и макрофагов перемещаться через ГЭБ, а также переключает фенотип Тх-2 на Тх-3; Cladribine, ингибитор для дезоксицитидин киназы, влияющий на ДНК репарацию и опосредованно индуцирующий смерть лимфоцитов. (6) Введение инактивированных Т-клеток или вакцинация гипервариабельными регионами ТкР для стимуляции ТкР-специфичных CD8+-клеток. (7) Индукция "назальной" или "оральной толерантности" аутоантигеном.

Тем не менее, стоит отметить, что вопреки впечатляющему массиву клинических, иммунологических и биохимических данных, а также частично изученным молекулярным механизмам, лежащих в основе возникновения и развития заболевания, на сегодняшний день не существует препарата, способного полностью остановить патологические процессы при PC. Таким образом, дальнейшее совершенствование существующих подходов или же разработка новых перспективных методов терапии PC является задачей первостепенной важности.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Рассеянный склероз.

Рассеянный склероз - это хроническое нейродегенеративное заболевание аутоиммунной природы, при котором повреждается миелиновая оболочка нервных волокон, что приводит к постепенной утрате различных функций нервной системы, связанных с физическим и психоэмоциональным состоянием больного [1-6]. Впервые морфологическую картину рассеянного склероза описали французские ученые Крювелье и Красвелл в 1835 году. Ими были обнаружены "островки серой дегенерации, разбросанные по спинному мозгу, стволу мозга, мозжечку и иногда по большим полушариям". Первое подробное описание рассеянного склероза принадлежит известному французскому невропатологу Жану Мартену Шарко (1856 г.), который считал наиболее характерными следующие симптомы заболевания: нистагм (подергивание глазных яблок), интенционное дрожание рук (усиливающееся при приближении к цели) и прерывистую речь (т.н. "триада Шарко"). Детальное микроскопическое описание поражений мозга при рассеянном склерозе принадлежит Джемсу Даусону (1916 г.). Томас Риверс в 1935 году впервые экспериментально воспроизвел демиелинизирующее заболевание на животных и высказал предположение об аутоиммунном характере патогенеза рассеянного склероза. Известный американский невропатолог Джон Куртцке в 1955 году, используя вычислительную технику, установил, что при рассеянном склерозе встречаются 685 симптомов, однако он не выявил ни одного симптома специфического именно для этого заболевания [7].

Распространенность рассеянного склероза неодинакова в различных регионах. До недавнего времени было принято выделять три зоны, различающиеся по степени заболеваемости рассеянным склерозом [6, 8, 9]. Зона высокого риска возникновения заболевания: более 30 случаев рассеянного склероза на 100 тыс. населения. К этой зоне относятся регионы, расположенные выше 30-й параллели на всех континентах. Зона среднего риска — от 5 до 29 случаев на 100 тыс. населения; и зона низкого риска — менее 5 случаев на 100 тыс. населения. Исходя из этого распределения, в ряде регионов России заболеваемость рассеянным склерозом

довольно высокая и находится в пределах 20 — 40 случаев на 100 тыс. населения, также она выше в крупных промышленных районах и городах. По результатам изучения эпидемиологии рассеянного склероза в последние годы получены новые интересные факты. Например, ежегодно наблюдается увеличение числа больных рассеянным склерозом за счет истинного роста заболеваемости, а также за счет повышения качества диагностики и расширения возможностей терапии. Улучшение качества жизни и медико-социальной адаптации привело к увеличению продолжительности жизни больных, что также обусловливает рост показателей распространенности рассеянного склероза. Известно, что риск развития рассеянного склероза связан с местом проживания, принадлежностью к определенной расе и этнической группе [10]. В большей степени болезнь распространена среди лиц белого населения Земли. Рассеянный склероз редко встречается в Японии, Корее, Китае: от 2 до 6 случаев на 100 тыс. населения [5, 11]. Применение новых подходов при изучении эпидемиологии рассеянного склероза привело к изменению привычных классических понятий о распространенности заболевания. Значительно возросли показатели в зонах высокого, среднего и низкого риска, сглаживаются границы этих зон, появились данные о существенных различиях эпидемиологических показателей в близко расположенных регионах или в пределах одного региона. Хотя остается тенденция, выражающаяся понятием «градиент широты»: распространение заболевания увеличивается с юга на север. Статистический анализ показал, что чаще рассеянным склерозом болеют женщины, также у женщин заболевание начинается в среднем на 1 — 2 года раньше, однако у мужчин преобладает прогрессирующая форма течения заболевания.

Различают две формы рассеянного склероза: RR-MS (relapsing-remitting multiple sclerosis) - наиболее распространенная форма заболевания (85-90%), характеризующаяся чередованием процессов де- и ремиелинизации с полным восстановлением пациента при ремиссии. RR-MS в большинстве случаев через некоторое время переходит в SP-MS (secondary progressive multiple sclerosis). Подобное течение болезни приводит к необратимому повреждению миелинового покрова, которое усиливается с течением времени. В 10-15% случаев после первого клинического проявления заболевание сразу переходит в прогрессирующее

течение, так называемое PP-MS (primary progressive multiple sclerosis) [12, 13]. При развитии рассеянного склероза в разных отделах белого вещества центральной нервной системы формируются очаги демиелинизации ("бляшки"), которые имеют характерную форму и локализацию. Размеры очагов, как правило, составляют 1-5 мм, но иногда за счет слияния и отека они достигают 10 мм. Наиболее типичные места локализации очагов - вдоль боковых желудочков и в мозолистом теле. Очаги могут также быть выявлены в стволе мозга, мозжечке или в спинном мозге.

Симптомы рассеянного склероза различны и зависят от того, какой именно участок ЦНС подвергся поражению, большинство больных имеют сразу несколько признаков болезни, но, в свою очередь, не было обнаружено ни одного пациента имеющего все симптомы одновременно. Из наиболее часто встречающихся симптоматических проявлений PC следует отметить следующие: нарушения зрения - нечеткость зрения, диплопия, снижение остроты зрения, нистагм, временная полная потеря зрения; нарушение координации - нарушение равновесия, тремор, атаксия, головокружение, нарушение координации движения; спастичность -спастика и спазмы; нарушение речи - скандированная речь, замедленная речь, смазанность речи, дисфагия; а также различные типы боли, хроническая усталость, учащенное мочеиспускание, недержание мочи, импотенция, фригидность, ухудшение кратковременной памяти, характеризуемое снижением способности к концентрации внимания, логическому мышлению.

Основный белок миелина.

При развитии патологии PC одним из превалирующих иммуногенных компонентов миелина для B-клеток человека является основный белок миелина (ОБМ), он же является наиболее сильным индуктором экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у животных. Основная информация о структуре миелина получена с помощью электронной микроскопии. Уникальной морфологической особенностью миелина является то, что он формируется в результате спирального обвитая отростков олигодендроглиоцитов (в центральной нервной системе) и шванновских клеток (на периферии, вокруг аксонов нейронов). Таким образом, миелин представляет собой своеобразную мембрану, состоящую из

липидного бислоя и белков, связанных с ним. Среди белков миелина выделяют так называемые внутренние и внешние белки. Первые прочно связаны с мембраной, проходя сквозь нее, в то время как другие, расположенные поверхностно, связаны слабее. Подобная мембрана является асимметричной по химическому составу и электрическому заряду. Процесс формирования миелина отростками глиальных клеток сопровождается вытеснением цитоплазмы из этих клеток таким образом, что цитоплазматические поверхности мембраны плотно соприкасаются друг с другом, образуя так называемую главную плотную линию. Плотный контакт наружных поверхностей мембран, образующихся при спиралевидном обвитии отростков миелинообразующих клеток вокруг аксонов нейронов, способствует формированию так называемой межпромежуточной линии. Одной из биохимических характеристик, которая отличает миелин от других биологических мембран, является высокое соотношение липид/белок. Белки составляют от 25 до 30% массы сухого вещества миелиновой оболочки. На долю липидов приходится приблизительно 70-75% от сухой массы белого вещества центральной нервной системы млекопитающих. Основный белок миелина содержит необычайно высокий процент (приблизительно 25%) основных аминокислот, равномерно распределенных по всей полипептидной цепи, что и обусловливает очень высокую изоэлектрическую точку ОБМ (р1 более 12). Основная изоформа ОБМ имеет молекулярную массу 18,5 кДа [14]. Основной функцией миелина является быстрое проведение нервного импульса по аксонам, которые он окружает. Мембраны клеток, формирующих миелин, плотно соприкасаются, что обусловливает высокое сопротивление и малую емкость, обеспечивая, таким образом, аксону эффективную изоляцию и предотвращает продольное распространение импульса. Миелин прерывается только в области перехватов Ранвье, которые встречаются через одинаковые промежутки длинной примерно 1 мм. В связи с тем, что ионные токи не могут проходить сквозь миелин, вход и выход ионов осуществляется лишь в области перехватов. Это приводит к существенному увеличению скорости проведения нервного импульса - по миелинизированным волокнам импульс проводится приблизительно в 5-10 раз быстрее, чем по не миелинизированным. Помимо передачи нервного импульса, миелин участвует в питании нервного волокна, а также выполняет структурную и защитную функции [15].

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит.

Для проведения исследований на сегодняшний день существует хорошо изученная общепринятая животная модель рассеянного склероза -экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ). В большинстве исследований ЕАЕ применяется для детального изучения иммунологических и нейробиологических аспектов нейродегенеративных заболеваний, а так же для определения терапевтического потенциала создаваемых лекарственных препаратов. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит можно развить у различных видов животных, но наиболее часто в исследованиях используют ЕАЕ индуцированный у мышей или крыс [16]. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит впервые был описан более 50 лет назад в работе Olitsky и Yager, как модель аутоиммунного воспаления ЦНС [17]. Не смотря на то что на сегодняшний день не существует природной модели PC, развивающей спонтанный ЕАЕ, в арсенале ученых имеются мышиные и крысиные модели ЕАЕ, имитирующие различные типы и стадии течения PC (Табл. 1). Наиболее популярной методикой индукции ЕАЕ является иммунизация нейроантигеном в эмульсии адъюванта Фрейнда. Например, мыши линии C57BL/6 при подкожном введении внеклеточного домена МОГ или пептида МОГ35.55 в эмульсии полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) развивают ЕАЕ, в целом схожий с хроническим прогрессирующим течением PC [18-20]. При индукции ЕАЕ у мышей SJL с помощью ОБМ или пептида ОБМ84.104 в ПАФ развивается релапсирующая форма аутоиммунного заболевания [21], а крысы DA способны развивать релапсирующую-ремиттирующую форму ЕАЕ при индукции пептидом ОБМ63_81 в ПАФ [22]. Для нарушения проницаемости гематоэнцефалического барьера, животным дополнительно внутривенно вводят Pertussis toxin (РТ). Существует альтернативный метод индукции ЕАЕ методом адаптивного переноса активированных лимфоцитов от животного с развившимся заболеванием. Данная методика позволяет достичь более сильного развития ЕАЕ, с наибольшим процентом заболевших животных [20].

Табл. 1. Существующие животные модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, представляющие различные типы течения рассеянного склероза.

Вид Линия Индукция Тип заболевания Литературный

источник

Крыса LEW ОБМ или ОБМб8-88 пептид в ПАФ Единичное обострение [23,24]

Крыса DA ГСММ в НАФ или МОГ 1.125 в ПАФ или НАФ Ремиттирующая/ прогрессирующая форма [25, 26]

Крыса DA ОБМбз-81 пептид в ПАФ Релапсирующая- ремиттирующая форма [22]

Мышь PL/J ОБМ в ПАФ + РТ Единичное обострение [27]

Мышь SJL ПЛП или ПЛП139.151 пептид в ПАФ + РТ Хроническое обострение [28]

Мышь C57BL/6 МОГ или МОГ35.55 пептид в ПАФ + РТ Прогрессирующая или острая форма [18, 19]

Мышь Biozzi МОГ или МОГ92-Ю6 пептид в ПАФ + РТ Хроническое обострение [29]

Мышь NOD МОГ35.55 пептид в ПАФ + РТ Хроническая прогрессирующая форма [30]

Мышь SJL Вирус мышиного энцефаломиелита Тейлера Ремиттирующая прогрессирующая [31]

Мышь SJL ОБМ или ОБМ84-104 пептид в ПАФ +РТ Релапсирующая форма [21]

Мышь SJL ГСММ в ПАФ +РТ Релапсирующая форма [32]

Мышь B10.PL-H2u Трансгенные животные по ТкР к ОБМ Спонтанная острая форма [33]

Мышь C57BL/6 Трансгенные животные Оптический [34]

по ТкР к МОГ неврит

Таким образом, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит является эффективным инструментом изучения молекулярных основ рассеянного склероза, а также отправной точкой в разработке терапевтических препаратов РС.

Роль Т-клеток в развитии и патологии рассеянного склероза и экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.

Не смотря на то что этиология рассеянного склероза до конца не известна, большинство исследователей ведущую роль в развитии этого аутоиммунного заболевания отводят аутореактивным СБ4 Тх1 клеткам [35-37] (Рис. 1).

I Регуляция аутоиммунного ответа

И-4

МНС II

III Инициация заболевания

Отрицательная регуляция Ц Положительная регуляция

II Иммунносупрессия

Рис. 1. Предположительная роль Т-клеточной системы в патогенезе рассеянного

склероза.

Данное предположение подтверждается исследованиями клеточного состава спинномозговой жидкости больных, которая содержит СБ4+ и СБ8+ Т-клетки вместе с остальными мононуклеарными лимфоцитами [38, 39], а также исследованиями ЕАЕ развиваемого у мышей и крыс [40, 41]. Одно из самых веских доказательств роли Т-клеток в развитии РС состоит в индукции ЕАЕ у животных после введения миелина или его компонентов с адъювантом или же при пересадке сенсибилизированных СЭ4+ Т-клеток от другой особи, уже имеющей ЕАЕ [12]. Более того, терапия, направленная на СБ4+ Т-клетки, положительно сказывается на течении ЕАЕ [42]. Еще одно косвенное подтверждение состоит в генетической предрасположенности больных к рассеянному склерозу, реализующееся через локусы ГКГС класса II - комплекса, способного представлять антиген патогенным

11

CD4+ Т-клеткам [43]. Опытные мыши, экспрессирующие оба типа МНС - DR-DQ, а также изолированный из больного ОБМ-специфичный Т-клеточный рецептор, проявляют как спонтанный, так и индуцированный ЕАЕ [12].

Основной вклад в развитие ЕАЕ и PC CD4+ клетки (Тх-1) вносят путем продукции ИЛ-2, ИФНу и ФНО. Роль CD8+ Т-клеток в развитии ЕАЕ и PC заключается в цитолитической [44] и регуляторной активностях, а также в привлечении в очаг воспаления CD4+ Т-клеток [45].

Однако, наличия лишь аутореактивных Т-клеток недостаточно для развития заболевания. Подобные ОБМ-специфичные клоны были обнаружены и у абсолютно здоровых доноров, что свидетельствует о гораздо более тонком механизме возникновения рассеянного склероза. Совсем недавно появились сведения о значительной роли регуляторных Т-клеток (CD25+, Тг или Treg) в патогенезе данного заболевания [46]. У трансгенных мышей, экспрессирующих исключительно ОБМ-специфичный Т-клеточный рецептор и проявляющих вследствие этого спонтанный ЕАЕ (линия T/R-), возможно полностью предотвратить развитие аутоиммунного заболевания пересадкой CD4+ CD25+ регуляторных Т-клеток от нормальных мышей или мышей линии T/R+, в которых лишь часть Т-клеток аутореактивна по отношению к ОБМ [47].

Роль B-клеток в развитии и патологии рассеянного склероза и экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.

На ряду с Т-клетками, B-клетки также вносят существенный вклад в развитие и патогенез PC и ЕАЕ. В 1981 году группа исследователей изолировала популяцию анти-ОБМ Т-клеток крысы, внутривенное введение которых здоровым животным вызывало развитие ЕАЕ [48], с тех пор продолжительное время было принято считать ЕАЕ и PC заболеванием, опосредованным аутореактивными CD4+ Т-клетками. Однако, в последнее время появляется все больше данных, демонстрирующих существенный вклад B-клеток в патологические процессы при PC и ЕАЕ. Несмотря на то что первые попытки индуцировать ЕАЕ изолированными аутоантителами оказались неудачными, более поздние работы по совместному введению анти-МОГ моноклональных антител (монАТ) вместе с

миелин-специфичными Т-клетками показали высокий уровень развития демиелинизации и церебрального воспаления [49-51].

В норме В-клетки не способны преодолевать ГЭБ, однако при развивающемся воспалении его проницаемость может нарушаться, открывая доступ в центральную нервную систему лимфоцитам, иммуноглобулинам и системе комплемента. В-клетки могут служить антиген-представляющими для аутореактивных Т-клеток, привлекать их в центральную нервную систему и производить костимуляцию (Рис. 2) [12]. Так, у больных детектируется аккумуляция в ЦНС клонально родственных В-клеток [52] и повышенный синтез в ткани мозга и спинномозговой жидкости антител, специфичных к основному белку миелина, протеолипидному белку, миелин-олигодендроцитарному гликопротеину [53], а также к ДНК и другим компонентам нервных тканей. Было показано, что уровень аутоантител к ОБМ коррелирует с воспалительным процессом в ЦНС [54]. Индукция ЕАЕ полноразмерным МОГ невозможна у мышей линии C57BL/6, дефицитных по В-клеткам [55, 56]. Дополнительно, группой исследователей была обнаружена прямая зависимость между тяжестью течения PC и наличием в сыворотке больных конформационных антител, специфичных к МОГ [57].

На сегодняшний день наиболее веским доказательством важности В-клеток в патогенезе ЕАЕ является создание трансгенной мыши, имеющей МОГ-специфичные В-клетки [58]. В-клетки данных мышей экспрессировали тяжелую цепь антитела, полученную из МОГ-специфичной гибридомы 8.18С5 [59], в паре с эндогенной легкой цепью иммуноглобулина. В результате комбинаторных процессов у мышей происходило формирование большой популяции МОГ специфичных В-клеток и, как следствие, высокого титра сывороточных анти-МОГ антител, что приводило к развитию спонтанного ЕАЕ с высокой частотой [58].

Помимо воспалительных процессов, В-клетки также играют двоякую роль в аутоиммунных процессах, проявляя и особую защитную функцию. Группой исследователей под руководством Mitsushita Т. было показано, что элиминация популяции В-клеток до индукции ЕАЕ анти-СБ20 антителами приводит к развитию более агрессивного течения заболевания, в то время как терапия антителами после развития ЕАЕ практически полностью купирует заболевание. В аналогичном опыте мыши, дефицитные по CD 19, развивали ЕАЕ вне зависимости

от терапии анти-С020 антителами. Данные эксперименты позволили обнаружить, что при предварительной терапии монАт элиминируется небольшая популяция регуляторных В-клеток, продуцирующих противовоспалительный цитокин ИЛ-10. В то время как терапевтическая эффективность анти-СЭ20 антител после индукции ЕАЕ вызвана элиминацией В-клеток, необходимых для активации СБ4+ Т-клеток [60, 61]. Данное наблюдение в очередной раз подчеркивает необходимость В-клеточной системы для корректного презентирования антигена и инициации аутоиммунного заболевания. Аналогично в работе РШа1теаи была показана необходимость В-клеток, продуцирующих ИЛ-10, для восстановления животных после пика обострения ЕАЕ [62].

Антиген

■а

<5

Ф

* \ J

В-клеточный N. рецептор

Активация '

Презентация Антигена

Т-клетка

В-клетка|

' Провосполительные .* <, цитокины

"■* .Регуляторные у .цитокины

Рис. 2. Роль В-клеток в патогенезе рассеянного склероза (адаптировано из [25]).

Как уже упоминалось ранее, превалирующим иммуногенным компонентом миелина для В-клеток человека является основный белок миелина, он же является одним из наиболее сильных индукторов ЕАЕ у животных. При исследовании роли В-клеточного звена в патогенезе рассеянного склероза было показано, что у

некоторых больных количество антител-продуцирующих В-лимфоцитов, специфичных к ОБМ, составляло в тканях мозга более 50% в общем пуле В-клеток [63]. С другой стороны, IgG-опосредованный фагоцитоз миелинового дебриса макрофагами и активация комплемента внутри центральной нервной системы являются косвенными доказательствами участия антител в патогенезе рассеянного склероза (Рис. 3). Группой исследователей было показано, что у 72% больных рассеянным склерозом в сыворотке детектируются анти-МОГ антитела и в 59% случаев обнаруживаются аутоантитела к ОБМ [64]. При этом, среди иммуноглобулинов, специфичных к названным антигенам, доминировали изотипы IgM, а также IgGi и IgG3. При скрининге пациентов с риском заболевания PC на присутствие аутоантител к МОГ и ОБМ было установлено, что 83% больных с положительным ответом на анти-МОГ и 95% на оба антитела имели первое обострение в течение 52 месяцев, в то время как 77% испытуемых, сыворотка крови которых не содержала ни одно из этих антител, не были затронуты болезнью. Данное наблюдение возможно позволит диагностировать рассеянный склероз в его предклинической форме [65].

Линии В-клеток узнают различные эпитопы ОБМ, в первую очередь область от 84-го до 102-го аминокислотного остатка. Warren и Catz в своих работах неоднократно демонстрировали, что внутривенное введение больным рассеянным склерозом синтетических пептидов, идентичных иммунодоминантному эпитопу ОБМ75.95, приводит к значительному снижению титра анти-ОБМ антител как в сыворотке, так и в спинномозговой жидкости [66]. Эти же исследователи в своих дальнейших публикациях показали, что наиболее иммунодоминантным эпитопом ОБМ, с наибольшей эффективностью блокирующим аутоантитела к ОБМ, является последовательность аминокислот, расположенная между 85-м и 96-м пролинами, а именно 85PVVHFFKNIVTP96 [67].

Олигодендроцит \

Миелиновая оболочка

МВР

*

,—> а

Т-клетка

I

Цитоплазма ]

П,

% -

lf< Ответ на

/

' \

_ Система 1 О- комплемента Т-клетка

О

к/

& Г*

' -V . 't о О

^ о^, Оо

'-О V- О .^Антитела

о^ ^

1С/Г

повреждение^ ^ - ■

Инициация демиелинюации

-f

МВР

О !

t<

MOG -V

- Макрофаг

\

В-клетка

Fc-рецептор

Рис. 3. Роль аутоантител к основному белку миелина и миелин-олигодендроцитарному гликопротеину при развитии рассеянного склероза

(адаптировано из [30]).

Интересно, что, как уже упоминалось, подобный пептид возможно использовать в качестве эффективного индуктора экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у модельных животных. Однако, использование полноразмерной молекулы ОБМ и пептида МОГ9|.юб приводит к возникновению так называемого «epitope spreading», т.е. переключению иммунной системы на другие эпитопы и молекулы нейроантигенов [68]. В ранних работах лаборатории биокатализа ИБХ РАН было показано, что протеолиз этого белка может осуществляться аутоантителами [69], что нашло подтверждение в работах других авторов [70]. Продолжение данного исследования получило развитие в создании рекомбинантной библиотеки эпитопов ОБМ, с помощью которой были проанализированы сайты связывания и гидролиза ОБМ аутоантителами, полученными из 26 пациентов с PC, 22 больных другими нейродегенаритвными

16

заболеваниями и 11 здоровых доноров [71]. В результате проведенного исследования был показан высокий титр аутоантител больных РС как к полноразмерному ОБМ, так и к его фрагментам ОБМ48.7о и ОБМ85.170, в сравнении со здоровыми донорами. Также у 77% пациентов РС с прогрессирующей и 85% с релапсирующей формой течения заболевания были обнаружены каталитические антитела к ОБМ с превалирующим сайтом гидролиза, расположенным между 81 и 103 остатками ОБМ. Интересно, что данная последовательность ОБМ явлеятся не только иммунодоминантной, но и способна выпетливаться из клеточной мембраны при определнных условиях (ССЫ). Данные наблюдения в очередной раз подчеркивают важную роль аутоантител на воспалительные процессы, возникающие при развитии рассеянного склероза.

Современные подходы к терапии рассеянного склероза.

Лечение РС остается одной из наиболее серьезных проблем современной медицины, хотя достигнутый в последние годы существенный прогресс в понимании механизмов развития заболевания и его патогенеза позволил создать ряд эффективных подходов в терапии данного аутоиммунного заболевания. Если ранее терапевтическая помощь пациентам с РС сводилась лишь к попыткам купирования обострений заболевания и проведению симптоматического лечения, то к настоящему времени появились пути воздействия на течение болезни.

Иммуномодулирующие препараты для терапии РС.

Современное лечение РС включает в себя применение препаратов "изменяющих течение РС" (ПИТРС). Данное направление активно внедряется в практическую неврологию только последнее десятилетие и позволяет существенно снизить активность патологического процесса, в первую очередь воспаления и демиелинизации. К сожалению, на сегодняшний день не разработан препарат, который способен полностью остановить развитие заболевания. Имеющиеся в распоряжении врачей препараты могут лишь снизить частоту и тяжесть обострений, а также замедлить темпы накопления неврологического дефицита, что подтверждается данными магнитно-резонансной томографии головного и спинного

мозга [72-74]. К ПИТРС, разрешенным к применению, относят иммуномодулирующие препараты интерферон-бета (ИНФб) и глатирамера ацетат (Copaxone), а также иммуносупрессор митоксонтрон [75]. Первые два препарата являются наиболее активно используемыми при ремитирующем течении PC.

Препараты ИФНб представляют собой рекомбинантные бета-интерфероны человека, продуцируемые в прокариотической (ИФНб-lb) или эукариотической системах экспрессии (ИФНб-1а). ИНФб-lb (Бетаферон) стал первым препаратом ИФНб, одобренным для лечения PC в 1993 г. Изучение механизма действия ИФНб на животных с ЕАЕ и при лечении PC показало, что его связывание со специфическим рецептором инициирует ряд антипролиферативных и иммуномодулирующих реакций, которые вызывают изменение экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) и костимулирующих молекул на поверхности клеток. Это, в свою очередь, может приводить к ингибированию активации CD4+ Т-лимфоцитов, а также к изменению в балансе цитокинов в сторону уменьшения продукции противовоспалительных (Тх-1) и увеличения продукции антивоспалительных (Тх-2) цитокинов [76]. Показано также, что ИНФб блокирует резистентность Т-лимфоцитов к апоптотическим сигналам [77]. В исследованиях in vitro установлено, что ИНФб ингибирует экспрессию молекул адгезии [78] и матриксных металлопротеаз [79], а также увеличивает уровень ингибитора ММП - TIMP-1 [80] и, как следствие, клеточную миграцию.

Группой Kaveri были получены обнадеживающие данные в области применения внутривенных иммуноглобулинов (ВВГ) для терапии PC. Данные препараты представляют очищенную фракцию иммуноглобулинов класса IgG плазмы крови человека. Изначально разработанные для лечения иммунодефицитов, ВВГ продемонстрировали свою эффективность при терапии тромбоцитопении, синдрома Гийена-Барре, хронической воспалительной демиелинизирующей полинейропатии, тяжелой псевдопаралитической миастении, болезни Вагнера и синдрома Кавасаки. Введение ВВГ индуцирует увеличение экспрессии рецептора супрессии лимфоцитов Fcyllb на их поверхности, и, как следствие, снижает степень развития воспаления. Исследования Kaveri на мышах линии C57BL/6 с индуцированным ЕАЕ, которым вводили ВВГ, показали высокий терапевтический

потенциал данных препаратов [81]. Однако терапия ВВГ в некоторых случаях может привести к асептическому менингиту, тромбоцитозу и отказу почек.

Многообещающие результаты были получены во время второй стадии клинических испытаний препарата FTY720. После 12 месяцев per os терапии у 80% пациентов отсутствовали области воспаления в головном мозгу при МРТ сканировании. Терапевтический эффект FTY720 основан на схожести в химической структуре молекул препарата и сфинголипида сфингозина. Как и сфингозин, FTY720 фосфорилируется сфингозин-киназой и его фосфорилированная форма является ингибитором SIP-ассоциированных G-опосредованных рецепторов [82]. Функционально S1P играет ключевую роль в процессах клеточного морфогенеза, пролиферации и перестройке цитоскелета [83]. В случае терапии PC FTY720 останавливает выход Т- и В-клеток из вторичных лимфойдных органов, предотвращая миграцию лимфоцитов в ЦНС [82]. Однако у перспективы массового применения препарата, в силу его комплексного влияния на иммунную систему, есть серьезные ограничения. На третей стадии клинических испытаний препарата, в которой участвовали 1292 пациента, у больных с тяжелым типом течения PC не наблюдалось улучшения состояния. У больных наблюдались такие побочные эффекты как замедление сердечного ритма, повышенное кровяное давление, повышенный уровень ферментов печени и проявление инфекции вируса герпеса. Более того, во время проведения испытаний было 4 случая летального исхода, 10 случаев рака кожи и 4 случая рака легких [82].

Аналогично действию FTY720, препарат Teriflunomide ингибирует пролиферацию Т-клеток. Teriflunomide является блокатором синтеза пиримидинов в активно профилирующих клетках [82]. В испытаниях на животных было показано, что Teriflunomide супрессирует тирозинкиназы, участвующие в передаче сигналов и влияет на кальциевую мобилизацию и активацию Т-клеток [84]. Не смотря на то что в данный момент Teriflunomide проходит третью фазу клинических испытаний, препарат имеет обширный список побочных эффектов [82]. Экспериментальные исследования на животных, которым вводили лефлуномид (метаболический предшественник Teriflunomide), показали сердечную деформацию и серьезные нарушения в формировании скелета у плода [85].

Препарат BG-12 (улучшенный Fumaderm) показал терапевтическую эффективность для пациентов с PC. BG-12 индуцирует продукцию цитокинов Тх-2 типа, которые имеют противовоспалительное действие и индуцируют апоптоз у активированных Т-клеток, а также снижают экспрессию молекул адгезии у лимфоцитов [86-88]. Наиболее часто встречаемыми побочными эффектами во время второй стадии клинических испытаний при терапии BG-12 были нарушения работы ЖКТ и рвота, а также двукратное увеличение количества ферментов печени, наблюдавшееся у нескольких пациентов [82].

Применение иммуномодулятора Roquinimex препятствует формированию новых очагов воспаления в головном мозге, что было подтверждено во время второй и третьей стадии клинических испытаний [89]. Однако его способность вызывать серозит и инфаркт миокарда остановила дальнейшее применение препарата [90, 91]. Его структурно близкий аналог Laquinimod, лишенный побочных эффектов, блокирует способность Т-клеток и макрофагов перемещаться через ГЭБ, а также переключает фенотип с Тх-2 на Тх-3 [92]. Стоит отметить, что данный препарат редко применяется в практике терапии PC в силу его невысокой эффективности, отсутствия эффекта при терапии обострений и недееспособности пациентов, а также из-за риска развития сердечных осложнений.

Изначально разработанный для терапии волосато-клеточной лейкемии, препарат Cladribine завершил третью стадию клинических испытаний для терапии PC, после проведения которых внедрение Cladribine было остановлено [93]. Cladribine это ингибитор дезоксицитидин киназы, влияющий на ДНК репарацию и опосредованно индуцирующий гибель лимфоцитов.

Моноклональные антитела в терапии PC.

Альтернативным подходом в терапии PC является применение препаратов моноклональных антител. Эта группа высокоспецифичных иммуномодуляторов состоит из химерных или гуманизированных антител, направленных против определенных молекул, участвующих в патогенезе заболевания [94]. Данный подход реализован в препарате - Natalizumab™, представляющий собой моноклональное антитело к интегринам a4ßl. Связываясь с интегринами, данное монАт блокирует адгезию мононуклеарных клеток с неохарактеризованными

рецепторами на поверхности стромальных эндотелиальных клеток (Рис. 4) [13]. Это приводит к предотвращению миграции аутореактивных лимфоцитов через ГЭБ и в воспаленные ткани. Эффективность этого препарата при лечении РС оказалась выше, чем эффективность ИНФб [95], однако, в 2005 г. его внедрение было остановлено после сообщения о трех случаях тяжелого заболевания у больных, два из которых имели летальный исход [96].

В настоящее время существуют данные, описывающие эффективную терапию лимфомы [97], рассеянного склероза [13, 98], гемолитической анемии [99], ревматойдного артрита [100], васкулита [101], диабета первого типа [102] и системной красной волчанки [103], препаратом ИлйштаЬ™ (антитело класса 1§С, специфичное к СБ20).

Э™™™ клеточные

Артерия

тето'»

ТЫ!

Венула

Селил! тстогу Т

Рис. 4. Эффект моноклональных антител Ыа1аНгитаЬ™ на проникновение мононуклеарных клеток в ЦНС (адаптировано из [13]).

Антиген CD20 - это негликозилированный фосфопротеин, экспонированный на поверхности всех зрелых В-клеток, молекулярная масса которого составляет 33-37 кДа. Рецептор не имеет известного природного лиганда, однако считается, что он участвует в транспорте ионов кальция через клеточную мембрану, после связывания антигена с БкР [104]. При связывании Rituximab с В-клеткой происходит активация механизмов антител-зависимого фагоцитоза, клеточной цитотоксичности и активации комплемента. Rituximab влияет на клеточный цикл, снижает количество CD23 антигена, повышает количество молекул класса ГКГС II и провоцирует привлечение LFA-1 с LFA-3 (lymphocyte function-associated antigen), а также индуцирует апоптоз клеток, несущих CD20. Терапия препаратом Rituximab приводит к системному влиянию на продукцию антител, цитокиновую сеть, презентацию антигена В-клетками, активацию Т-клеток и макрофагов [105-109]. Данные полученные во время второй фазы клинических испытаний показали, что введение 2000 мг препарата Rituximab значительно снижает количество очагов демиелинизации в течение 48 недель в сравнении с контрольной группой [106]. Тем не менее, у терапии антителом анти-СЮ20 имеется ряд значительных недостатков, связанных с неспецифическим удалением подавляющей популяции циркулирующих В-клеток. Более того, использование данного препарата в терапии PC остановлено, в связи с двумя летальными исходами при терапии ревматойдного артрита с помощью Rituximab [110].

Иммунотоксины в терапии рассеянного склероза и аутоиммунных

заболеваний.

Несмотря на большое количество существующих подходов к терапии PC, идея направленного подавления популяции аутореактивных лимфоцитов остается до сих пор актуальной и востребованной. Применяя подход селективной элиминации аутореактивных В-клеток, можно избежать большинства описанных ранее проблем [111], характерных для неспецифической терапии аутоиммунных заболеваний. Идеальными кандидатами на роль молекул адресного воздействия являются иммунотоксины (ИТ), большой опыт применения которых в раковой терапии создает существенную базу для создания терапевтических препаратов аутоиммунных заболеваний [112].

Молекулы иммунотоксинов состоят из двух ключевых фрагментов: сигнальной последовательности адресной доставки к клетке-мишени и действующей части, приводящей к убйству клетки [112]. В качестве сигнальной последовательности могут выступать любые молекулы имеющие аффинность к белкам, экспонированным на поверхности клетки: антитела, Fab фрагменты антител, гормоны, цитокины, клеточные факторы, в случае терапии аутоиммунных заболеваний, последовательности, специфичные для поверхностных Т- или В-клеточных рецепторов [112, 113]. Адресная доставка терапевтических агентов имеет два основных преимущества по сравнению с неспецифической терапией: направленная терапия позволяет применять лекарства в меньших концентрациях, что уменьшает общее неспецифическое цитотоксическое воздействие препарата на организм; цитотоксическое воздействие препарата сказывается в основном на клетках-мишенях.

При создании иммунотоксинов наиболее часто в качестве цитотоксического домена применяют каталитический домен растительных или бактериальных токсинов. Также в последнее время появляется все больше сообщений о создании иммунотоксинов на основе РНКаз в силу их более низкой неспецифической цитотоксичности. Большинство токсинов растительной и бактериальной природы, которые используют для конъюгирования с антителами, содержат одну или несколько связывающих субъединиц, отвечающих за взаимодействие токсина с клеткой и одну ферментативно активную субъединицу, проникающую внутрь клетки и приводящую к её гибели. Благодаря научному прогрессу в области генной инженерии белков в последнее время преобладает тенденция создания рекомбинантных ИТ из-за возможности получать более гомогенные препараты высокой степени чистоты.

Растительные или бактериальные токсины, применяемые для создания ИТ, относятся к классу рибосом инактивирующих белков (РИБ), которые модифицируют компоненты системы трансляции и ингибируют синтез белков. Наиболее часто при создании ИТ используют РИБ, которые АДФ-рибозилируют фактор элонгации-2 (ФЭ-2) или токсины, обладающие N-гликозидазной активностью по отношению к 28S рРНК (блокируется ассоциация ФЭ-2 с 60S субъединицей рибосомы) [112]. Псевдомонадный токсин, используемый в

аминокислотной последовательности REDL, связывается с сортирующим рецептором, который транспортирует оставшуюся часть токсина (37 кДа) из трансретикулума в ЭПР [125, 126]. Фрагмент 280-313 АК обеспечивает проникновение токсина в цитозоль, где АДФ-рибозилирующий фермент инактивирует ФЭ-2, после чего в клетке останавливается белковый синтез и запускаются механизмы апоптоза [127, 128]. В каталитическом процессе АДФ-рибозилирования ключевую роль играют His 440 и Glu553, His 440 связывает НАД через АМФ рибозу, а карбоксильная группа Glu553 образует с Туг481 и Glu546 водородные связи, что позволяет Туг481 связывать НАД в процессе гидрофобных взаимодействий ароматических колец. Группа авторов продемонстрировала принципиальную возможность направленного удаления патогенных В-лимфоцитов из общего пула клеток in vitro и ex vivo путем их инкубации с иммунотоксином, основанном на каталитическом домене псевдомонадного токсина и пептида МОГ [119]. В ходе работы удалось подобрать оптимальную концентрацию токсичного агента, при которой процент аутореактивных B-клеток уменьшался до 30% без вреда для остальной популяции.

К классу токсинов, обладающих N-гликозидазной активностью, относится шига-подобный токсин (ШПТ), который продуцирует штамм E.coli серотипа 0157:Н7 [129]. ШПТ удаляет первый аденин в последовательности GAGA, которая находится в петле 28S рРНК 60S субъединицы рибосомы, что приводит к потере способности рибосомы связывать ФЭ-2, что, в свою очередь, ингибирует трансляцию и приводит к гибели клетки [130]. ШПТ (68 кДа) состоит из одного каталитического А-домена (32 кДа) и пяти одинаковых связывающих В-доменов (7,7 кДа каждый), связанных с каталитическим доменом нековалентно. Каталитический домен можно разделить на две функциональные части - Al домен обладает ферментативной активностью, а А2 образует нековалентные взаимодействия с пятью связывающими доменами [131] (Рис. 6). Связывающие В-домены специфичны к поверхностному гликолипиду Gb3 (глоботриазил церамид) клеток. Цитотоксическое действие ШПТ также можно разделить на несколько стадий. С помощью В-домена ШПТ связывается с Gb3 и инициирует эндоцитоз по клатриновому пути. Попав из эндосомы в аппарат Гольджи, токсин транспортируется в эндоплазматический ретикулум с помощью сигнальной

комплекс с БкР (Рис. 8), и в клетку одновременно поступает два конфликтующих сигнала [136].

Рис. 8. Механизм действия гибридной молекулы ДНК-пептид-анти-С032 антитело

Альтернативно супрессирующему действию описанной гибридной молекулы, Zocher реализовал идею селективной элиминации МОГ-реактивных В-клеток in vitro и in vivo слитным белком МОГ-константный домен иммуноглобулина мыши (MOG-Fc). МОГ пептид в составе химерного белка связывается с анти-МОГ БкР, а константный домен иммуноглобулина мыши индуцирует иммунные механизмы элиминации клетки-мишени [111].

Эксперименты, проведенные на животной модели аутоиммунного диабета, индуцированного у мышей линии NOD, показали возможность элиминации Т-клеток рекомбинантной молекулой, содержащей ИЛ-2 и константный домен иммуноглобулина мыши (IL2-Fc) [137]. При введении животным цитолитическое действие созданной молекулы было направленно в большей степени на потенциально патогенные Т-клетки, так как на их поверхности расположен рецептор ИЛ-2, который в большом количестве представлен на поверхности активированных Т-клеток и мало представлен у неактивированных клеток, а также Т-клеток памяти [138]. Следует отметить, что молекулы, созданные на основе константных доменов иммуноглобулинов, имеют низкую иммуногенность, а также более высокую стабильность в кровотоке по сравнению с иммунотоксинами.

Безусловно необходимо упомянуть о других цитотоксических агентах, применяемых при создании терапевтических конъюгатов антител. Как было

анти-С032 антитело

Супрессия

на анти-ДНК В-клетку.

J

указано ранее, попытки направленного подавления опухолевых клеток изначально производили антителами, специфичными к поверхностным антигенам клеток-мишеней [139]. Стоит отметить, что, не смотря на высокую эффективность монАт, у некоторых онкобольных раковые клетки обладают устойчивостью к индукции апоптоза, более того пациенты с ослабленным иммунитетом не могут в полной мере реализовать терапевтический потенциал вводимых антител. В таких случаях возможно применение антител, меченных радионуклидами, однако, радиоиммунотерапия имеет ограничение в применении изотопов с высокой удельной радиоактивностью [139]. Альтернативным подходом направленной элиминации патологических клеток является применение химиопрепарата, конъюгированного с антителом. В качестве примера можно привести препарат "gemtuzumab ozogamicin" - коньюгат анти-СБЗЗ монАт и калихеамицина, применяемого при миелолейкозе, либо коньюгат анти-СОЗО антитела и ауристатина Е для терапии лимфогранулематоза и неходжкинкой лимфомы. Химиотерапия является более предпочтительной по сравнению с радиоиммунотерапией, но к сожалению, в некоторых случаях клетки, обладающие мультилекарственной устойчивостью, оказываются невосприимчивыми и к химиотерапии [139].

Создание ИТ на базе растительных и бактериальных токсинов позволило решить большинство проблем, описанных ранее. Более того, для гибели клетки достаточно всего одной молекулы иммунотоксина в случае применения таких сильнодействующих токсинов как рицин, дифтерийный токсин, ШИТ или псевдомонадный токсин [112]. Именно поэтому концепция направленной доставки токсических агентов на основе ИТ к опухолевым и аутореактиным клеткам стала предметом интенсивного изучения в последнее время. За прошедшее время были достигнуты значительные успехи в создании и применении иммунотоксинов как in vitro так и in vivo (Табл. 2).

Табл. 2. Иммунотоксины созданные для терапии аутоиммунных заболеваний и

стадия их испытаний (адаптировано из [139]).

Мишень Адресная Токсин Заболевание Стадия

молекула испытаний

ИЛ-2 рецептор ИЛ-2 ДТ РТПХ, псориаз, РА I/II

CD25 монАт Рицин РТПХ I/II

CD7 монАт Рицин РТПХ I/II

CD5 Рицин РА, СКВ, РТПХ I/II

CD3 Рицин РТПХ I/II

CD64 Рицин РА in vivo

Аутореактивные ОБМ пт ЕАЕ in vivo

Т-клетки

Рецептор монАт Гелонин ЭАМГ in vitro

ацетилхолина

Dsg3 монАт ПТ ПО in vitro

Аутореактивные МОГ Fcyl АД in vivo

В-клетки

Аутореактивные ГКГС I класса Сапорин АД in vivo

Т-клетки

РТПХ - реакция иммунокомпетентных клеток трансплантата на антигены хозяина; РА - ревматойдный артрит; СКВ - системная красная волчанка; АХ - ацетилхолин; ЭАМГ - экспериментальная аутоиммунная миастения гравис; ПО - пузырчатка обыкновенная; АД - аутоиммунный диабет I типа.

Антиген-специфическая терапия рассеянного склероза.

Антиген-специфическая терапия, в отличие от большинства подходов лечения аутоиммунных заболеваний, направлена на аутоиммунные Т- и В-клетки, специфичные к определенной антигенной детерминанте. Данный подход уже более 10 лет применяется при терапии PC и заключается в подкожном введении препарата Copaxone. Copaxone это полипептид длиной 40-100 аминокислот, включающий в себя случайную комбинацию аланина, лизина, глутамата и тирозина в соотношении 4.5:3.6:1.5:1 соответственно. Структурно Copaxone имитирует положительно заряженный иммунодоминантный фрагмент ОБМ. Действие Copaxone предположительно состоит в конкуренции с фрагментами основного белка миелина за связывание с молекулами ГКГС класса II DR, а также в индукции регуляторных Т-клеток (тип Тх2/3), секретирующих противовоспалительные цитокины ИЛ-4, ИЛ-10 и нейротрофический фактор головного мозга (Рис. 9).

Периферия

Терапия Copaxone

Copaxone специфичная Т-клетка

макрофаг

Q.

Ol

п

О. ,

га

Ю

>s

- S

1 *

] *->

/ <и

т

s

с;

то

-е-

V

-з

I

m

О

га

2

Ф

1_

к

Г

цнс

микроглия

(иммуносупресси!Г)

противовоспалительные

Тх-2

ИЛ-10 г цитокины

► нейротрофины

(нейропротекция)

Рис. 9. Предположительный механизм терапевтического действия Copaxone.

Недавно группа исследователей показала, что модифицированные варианты Сорахоп - сополимеры FYAK и VWAK еще более эффективно супрессируют ЕАЕ на модельных животных [140]. Авторы объясняют это лучшим связыванием данных полимеров с сайтами Р1 и Р4 молекул ГКГС II DRB1*1501. Следует отметить, что степень влияния ИФНб и Copaxone на течение PC может варьировать у разных больных, вплоть до устойчивой резистентности к используемому препарату [141].

Перспективным направлением в разработке ПИТРС является введение так называемых "измененных пептидных лигандов" (ИПЛ), взаимодействующих с Т-клеточными рецепторами (ТкР). Принцип работы данного метода, основанного на иммунодоминантных пептидах, заключается индукции иммунотолерантности при введении большой дозы антигена. ИПЛ являются модифицированными [142], мутированными [143] или укороченными [144] участками последовательностей, связывающихся с ТкР. ИПЛ могут частично активировать Т-клетки, переключая их с фенотипа Тх-1 на Тх-2, а также, в некоторых случаях, индуцировать переход Т-клетки в анергию. Ранее были проведены клинические испытания ИПЛ, содержащего аминокислотную последовательность энцефалитогенного фрагмента ОБМ89.98, на пациентах с PC, имеющих гаплотип rKrC-DR2-DR4. Однако, несмотря на то, что препарат в некоторых случаях ингибировал развитие

заболевания, 3-я стадия клинических испытаний была признана неуспешной [82]. Есть экспериментальные свидетельства, что двойная замена аминокислот в пептиде ОБМ83.99 вызывает выработку ИЛ-4 и ингибирование продукции ИФНу [145]. Возможность проведения терапии ЕАЕ введением инкапсулированных миелиновых аутоантигенов была описана ранее в экспериментах проведенных на крысах линии Lewis [146, 147], с другой стороны группа Nagelkerken [142] показала индукцию толерантности при ЕАЕ у мышей линии SJL/J после введения маннозилированного ИПЛ Mann-PLPi39.i5i.

В заключение стоит отметить, что вопреки впечатляющему массиву клинических, иммунологических и биохимических данных, а также частично изученным молекулярным механизмам, лежащих в основе возникновения и развития заболевания, на сегодняшний день не существует препарата, способного полностью остановить патологические процессы при PC. Таким образом, дальнейшее совершенствование существующих подходов или же разработка новых перспективных методов терапии PC является задачей первостепенной важности.

В результате анализа имеющегося опыта в создании препаратов для терапии PC в данной работе на животной модели рассеянного склероза ЕАЕ нами были протестированы два подхода антиген-специфичной терапии (Рис. 10).

иммунотолерантность селективная элиминация

с?

?

Рис. 10. Терапевтические подходы к терапии рассеянного склероза, изученные в

настоящей работе

Первый из реализованных подходов - это индукция иммунотолерантности по

отношению к основному белку миелина. В данной работе было осуществлено

успешное лечение крыс линии ЭА, развивающих ЕАЕ, путем введения

маннозилированных липосом, содержащих иммунодоминантные пептиды ОБМ.

Вторая часть работы была посвящена созданию панели рекомбинантных

иммунотоксинов на основе барназы, псевдомонадного и шига-подобного токсинов,

32

а также константного домена иммуноглобулина. В работе был произведен анализ функциональной активности созданных белков-киллеров на модельной линии клеток и изучен их терапевтический потенциал. Наиболее перспективная молекула на основе константного домена иммуноглобулина мыши специфически элиминировала популяцию аутореактивных клеток in vivo у мышей линии SJL/J с индуцированным ЕАЕ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Химические реактивы и сопутствующие материалы.

В работе использовали следующие реактивы и материалы;

Реактивы: трис-гидроксиметиламинометан (трис), персульфат аммония, тетраборат натрия, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), одно- и двузамещенный фосфат натрия, хлорид натрия, ацетат натрия, хлорид магния, 4-хлоро-1-нафтол, бромистый этидий, (3-меркаптоэтанол, бычий сывороточный альбумин фракция V (БСА), глицин (Sigma, США); акриламид, N\N"-метиленбисакриламид, додецилсульфат натрия (ДСН), мочевину sequence grade, нитроцеллюлозную мембрану Hybond С extra (Amersham, США); nonidet Р-40 (NP40); агар, триптон, дрожжевой экстракт (Difco, Великобритания); металлохелатный сорбент Talon (BD, США); глицин, изопропил-P-D-тиогалактопиранозид (IPTG) (Fermentas, Литва); раствор ТМВ (тетраметилбензидина) (США), остальные реактивы отечественного производства марки "осч" (особо чистые); полный адъювант Фрейнда (Sigma, США). Pertussis toxin (Calbiochem, США); Культуральные среды и их компоненты (Gibco, США); 3-Maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester (MBS, Sigma, США); ФИТЦ (Sigma, США); Панкреатический ингибитор РНКазы A (Fermentas, Литва); Туберкулин (BD Difco, США);

Ферменты: термостабильную ДНК-зависимую ДНК-полимеразу, щелочную фосфатазу, Rapid DNA Ligation kit (Fermentas, Литва), эндонуклеазы рестрикции и соответствующие стандартные буферные растворы (Fermentas, Литва); дезоксирибонуклеазу I (Biozyme Laboratories ltd, США); трипсин, лизоцим (Merck, Германия); маркеры размера фрагментов ДНК и молекулярной массы: GeneRuler™ 50 bp DNA Ladder; GeneRuler™ 1 k DNA Ladder, Protein Molecular Weight Marker 14.4-116.0 кДа, Prestained Protein Molecular Weight Marker 19.0-118.0 кДа (Fermentas, Литва); низкомолекулярный маркер 2.5-16.9 кДа (Amresham, США); коньюгат Streptavidin-Pacific Blue™ (BD, США);

Антитела: антитела к с-тус эпитопу, продуцируемые гибридомой C-MYC; антитела козы к Fc-фрагменту IgG мыши и человека, антитела козы к Fc-фрагменту

IgG мыши и человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США); анти-В220-АРС антитела (eBioscience, США); анти-ИЛ-2 (sc-7896, Santa Cruz Biotechnology, США); анти-ИФНу (ab-9657, AbCam, Великобритания); анти-НФГМ (ab-72439, AbCam, Великобритания).

Плазмидные вектора: pGEM5Z; pET22N; рЕТ28а+; модифицированный вектор pBud.CE4 (Promega) содержащий CMV промотор; pFUSE (Invivogen, США);

Бактериальные штаммы Е. coli: DH5a - supE44, delta lacU169 (phi 80 lacZ delta M15), hsdR17, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, relAl (Gibco, Велкобритания); BL21 (DE3) - F- ompT hsdSB (r-m-) gal dem (DE3) (Novagen, США).

Животные: мыши линии Balb/c (Питомник ФИБХ г.Пущино, Россия); мыши линии SJL (Janvier, Франция); мыши линии C57BL/6 (Harlan, Израиль); Крысы линии DA (Harlan, Израиль).

Растворы.

Все растворы готовились на дистиллированной воде или на воде особой чистоты из установки "Milli-Q" (Millipore).

PBS: 8.0 г/л NaCl, 0.2 г/л KCl, 1.15 г/л Na2HP04, 0.2 г/л КН2Р04, pH 7.2. Карбонатный буфер: 1,5 г/л Na2C03, 29.3 г/л NaHC03, pH 9,6. TBS: 20 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, pH 7.5 Глицин-HCl: 0.1 M глицина, pH 2.5.

TBE десятикратный: 0.89 M трис-основание, 0.89 M борная кислота, 20 мМ ЭДТА, pH 8.0.

ТЕ: 10 мМ Трис-HCl, 1мМ ЭДТА, pH 8.0. Соленый спирт: 70% ЕЮН, 30% 0.14М NaCl.

Бактериальные среды.

LB: 10 г/л бактотриптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl. LB-агар: LB, 18 г/л агара.

2xYT: 16 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl.

SOB: 20 г/л бактотриптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 0.5 г/л NaCl, 250 мМ KCl,

10 мМ MgCl2.

SOC: SOB, 50 мМ глюкоза.

Антибиотики.

Раствор натриевой соли ампициллина в воде с концентрацией 25 мг/мл. Водный раствор зеоцина с концентрацией 50 мг/мл.

Работа с нуклеиновыми кислотами.

Амплификация фрагментов ДНК методом полимеразной цепной

реакции.

Полимеразную цепную реакцию проводили на приборе РТС-200 (M&J Research, США).

Готовили инкубационную смесь следующего состава:

• однократный буфер для Taq-полимеразы

• по 10 рМ каждого праймера

• по 2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата

• 1-2 ед. Taq-полимеразы

• 0.1-0.2 мкг ДНК

Амплификацию проводили по следующей схеме: А

предварительная денатурация

1цикл.

Б

денатурация отжиг праймеров элонгация 25 циклов. В

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Степанов, Алексей Вячеславович, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Hafler, D.A., Multiple sclerosis. J Clin Invest, 2004. 113(6): p. 788-94.

2. Hafler, D.A., et al., Multiple sclerosis. Immunol Rev, 2005. 204: p. 208-31.

3. Kurtzke, J.F. and H. Bui Quoc, Multiple sclerosis in a migrant population: 2. Half-orientals immigrating in childhood. Ann Neurol, 1980. 8(3): p. 256-60.

4. Frohman, E.M., M.K. Racke, and C.S. Raine, Multiple sclerosis—the plaque and its pathogenesis. N Engl J Med, 2006. 354(9): p. 942-55.

5. Noseworthy, J.H., et al., Multiple sclerosis. N Engl J Med, 2000. 343(13): p. 938-52.

6. Kurtzke, J.F., Epidemiologic evidence for multiple sclerosis as an infection. Clin Microbiol Rev, 1993. 6(4): p. 382-427.

7. Kurtzke, J.F., A new scale for evaluating disability in multiple sclerosis. Neurology, 1955. 5(8): p. 580-3.

8. Kurtzke, J.F., A Note on Skin Reactions and Autoimmunization in Multiple Sclerosis. Neurology, 1964.14: p. 361.

9. Kurtzke, J.F., Epidemiologic contributions to multiple sclerosis: an overview. Neurology, 1980. 30(7 Pt 2): p. 61-79.

10. Paul, W.E., Fundamental immunology. 5th ed. 2003, Philadelphia, Penn. ; London: Lippincott Williams & Wilkins. xxi, 1701.

11. Ebers, G.C. and A.D. Sadovnick, The geographic distribution of multiple sclerosis: a review. Neuroepidemiology, 1993. 12(1): p. 1-5.

12. Sospedra, M. and R. Martin, Immunology of multiple sclerosis. Annu Rev Immunol, 2005. 23: p.683-747.

13. Ransohoff, R.M., Natalizumab for multiple sclerosis. N Engl J Med, 2007. 356(25): p. 2622-9.

14. Amur, S.G., G. Shanker, and R.A. Pieringer, Regulation of myelin basic protein (arginine) methyltransferase by thyroid hormone in myelinogenic cultures of cells dissociated from embryonic mouse brain. J Neurochem, 1984. 43(2): p. 494-8.

15. Чехонин, В.П., et al., Основной белок миелина. Строение, свойства, функции, роль в диагностике димиелинизирующих заболеваний. Вопросы медецинской химии, 2000. 6: р. 10-27.

16. t Hart, В.А., В. Gran, and R. Weissert, EAE: imperfect but useful models of multiple sclerosis. Trends Mol Med, 2011. 17(3): p. 119-25.

17. Olitsky, P.K. and R.H. Yager, Experimental disseminated encephalomyelitis in white mice. J Exp Med, 1949. 90(3): p. 213-24.

18. Mendel, I., N. Kerlero de Rosbo, and A. Ben-Nun, A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur J Immunol, 1995. 25(7): p. 1951-9.

19. Oliver, A.R., G.M. Lyon, and N.H. Ruddle, Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol, 2003. 171(1): p. 462-8.

20. Rao, P. and B.M. Segal, Experimental autoimmune encephalomyelitis. Methods Mol Biol, 2012. 900: p. 363-80.

21. Fritz, R.B., C.H. Chou, and D.E. McFarlin, Relapsing murine experimental allergic encephalomyelitis induced by myelin basic protein. J Immunol, 1983. 130(3): p. 1024-6.

22. Miyakoshi, A., et al., Characterization of the antigen specificity and TCR repertoire, and TCR-based DNA vaccine therapy in myelin basic protein-induced autoimmune encephalomyelitis in DA rats. J Immunol, 2003. 170(12): p. 6371-8.

23.

24.

25.

26.

27,

28,

29,

30,

31,

32,

33,

34,

35,

36,

37,

38

39

40

41

42

Mannie, M.D., et al., Induction of experimental allergic encephalomyelitis in Lewis rats with purified synthetic peptides: delineation of antigenic determinants for encephalitogenicity, in vitro activation of cellular transfer, and proliferation of lymphocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 1985. 82(16): p. 5515-9.

McFarlin, D.E., et al., The immune response against myelin basic protein in two strains of rat with different genetic capacity to develop experimental allergic encephalomyelitis. J Exp Med, 1975.141(1): p. 72-81.

Lorentzen, J.C., et al., Protracted, relapsing and demyelinating experimental autoimmune encephalomyelitis in DA rats immunized with syngeneic spinal cord and incomplete Freund's adjuvant. J Neuroimmunol, 1995. 63(2): p. 193-205. Weissert, R., et al., MHC haplotype-dependent regulation of MOG-induced EAE in rats. J Clin Invest, 1998. 102(6): p. 1265-73.

Zamvil, S.S., et al., T-cell epitope of the autoantigen myelin basic protein that induces encephalomyelitis. Nature, 1986. 324(6094): p. 258-60.

Kuchroo, V.K., et al., Induction of experimental allergic encephalomyelitis by myelin proteolipid-protein-specific T cell clones and synthetic peptides. Pathobiology, 1991. 59(5): p. 305-12.

Baker, D., et al., Induction of chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis in Biozzi mice. J Neuroimmunol, 1990. 28(3): p. 261-70.

Maron, R., et al., Genetic susceptibility or resistance to autoimmune encephalomyelitis in MHC congenic mice is associated with differential production of pro- and antiinflammatory cytokines. Int Immunol, 1999. 11(9): p. 1573-80.

Olson, J.K., et al., A virus-induced molecular mimicry model of multiple sclerosis. J Clin Invest, 2001. 108(2): p. 311-8.

Brown, A.M. and D.E. McFarlin, Relapsing experimental allergic encephalomyelitis in the SJL/J mouse. Lab Invest, 1981. 45(3): p. 278-84.

Goverman, J., et al., Transgenic mice that express a myelin basic protein-specific T cell receptor develop spontaneous autoimmunity. Cell, 1993. 72(4): p. 551-60. Bettelli, E., et al., Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific T cell receptor transgenic mice develop spontaneous autoimmune optic neuritis. J Exp Med, 2003. 197(9): p. 1073-81.

Ota, K., et al., T-cel'l recognition of an immunodominant myelin basic protein epitope in multiple sclerosis. Nature, 1990. 346(6280): p. 183-7.

Katz-Levy, Y., et al., Endogenous presentation of self myelin epitopes by CNS-resident APCs in Theiler's virus-infected mice. J Clin Invest, 1999. 104(5): p. 599-610. Astier, A.L., et al., Alterations in CD46-mediated Trl regulatory T cells in patients with multiple sclerosis. J Clin Invest, 2006. 116(12): p. 3252-7.

Martin, R. and H.F. McFarland, Immunological aspects of experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. Crit Rev Clin Lab Sci, 1995. 32(2): p. 121-82. Babbe, H., et al., Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infdtrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med, 2000. 192(3): p. 393-404.

Pettinelli, C.B. and D.E. McFarlin, Adoptive transfer of experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice after in vitro activation of lymph node cells by myelin basic protein: requirement for Lyt 1+ 2- T lymphocytes. J Immunol, 1981. 127(4): p. 1420-3.

Aktas, O., S. Waiczies, and F. Zipp, Neurodegeneration in autoimmune demyelination: recent mechanistic insights reveal novel therapeutic targets. J Neuroimmunol, 2007. 184(1-2): p. 17-26.

Hu, H., et al., Depletion of T lymphocytes with immunotoxin retards the progress of experimental allergic encephalomyelitis in rhesus monkeys. Cell Immunol, 1997. 177(1): p. 26-34.

43.

44.

45.

46.

47.

48.

49.

50.

51.

52,

53,

54,

55,

56,

57,

58

59

60

61

62

Wekerle, H. and R. Hohlfeld, Molecular mimicry in multiple sclerosis. N Engl J Med, 2003.349(2): p. 185-6.

Jurewicz, A., W.E. Biddison, and J.P. Antel, MHC class I-restricted lysis of human oligodendrocytes by myelin basic protein peptide-specific CD8 T lymphocytes. J Immunol, 1998. 160(6): p. 3056-9.

Biddison, W.E., et al., CD8+ myelin peptide-specific T cells can chemoattract CD4+ myelin peptide-specific T cells: importance of IFN-inducible protein 10. J Immunol,

1998. 160(1): p. 444-8.

Zozulya, A.L. and H. Wiendl, The role of regulatory T cells in multiple sclerosis. Nat Clin Pract Neurol, 2008. 4(7): p. 384-98.

Hori, S., et al., Specificity requirements for selection and effector functions of CD25+4+ regulatory T cells in anti-myelin basic protein T cell receptor transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(12): p. 8213-8.

Ben-Nun, A. and I.R. Cohen, Vaccination against autoimmune encephalomyelitis (EAE): attenuated autoimmune T lymphocytes confer resistance to induction of active EAE but not to EAE mediated by the intact T lymphocyte line. Eur J Immunol, 1981. 11(11): p. 949-52.

Schluesener, H.J., et al., A monoclonal antibody against a myelin oligodendrocyte glycoprotein induces relapses and demyelination in central nervous system autoimmune disease. J Immunol, 1987.139(12): p. 4016-21.

Linington, C., et al., Augmentation of demyelination in rat acute allergic encephalomyelitis by circulating mouse monoclonal antibodies directed against a myelin/oligodendrocyte glycoprotein. Am J Pathol, 1988. 130(3): p. 443-54. Genain, C.P., et al., Antibody facilitation of multiple sclerosis-like lesions in a nonhuman primate. J Clin Invest, 1995. 96(6): p. 2966-74.

Colombo, M., et al., Accumulation of clonally related B lymphocytes in the cerebrospinal fluid of multiple sclerosis patients. J Immunol, 2000. 164(5): p. 2782-9. Reindl, M., et al., Antibodies against the myelin oligodendrocyte glycoprotein and the myelin basic protein in multiple sclerosis and other neurological diseases: a comparative study. Brain, 1999. 122 ( Pt 11): p. 2047-56.

Kuhle, J., et al., Antimyelin antibodies in clinically isolated syndromes correlate with inflammation in ivIRI and CSF. J Neurol, 2007. 254(2); p. 160-8.

Lyons, J.A., et al., B cells are critical to induction of experimental allergic encephalomyelitis by protein but not by a short encephalitogenic peptide. Eur J Immunol,

1999. 29(11): p. 3432-9.

Lyons, J.A., M.J. Ramsbottom, and A.H. Cross, Critical role of antigen-specific antibody in experimental autoimmune encephalomyelitis induced by recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein. Eur J Immunol, 2002. 32(7): p. 1905-13. Menge, T., et al., Conformational epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein are targets of potentially pathogenic antibody responses in multiple sclerosis. J Neuroinflammation, 2011. 8: p. 161.

Litzenburger, T., et al., B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med, 1998. 188(1): p. 169-80.

Linnington, C., M. Webb, and P.L. Woodhams, A novel myelin-associated glycoprotein defined by a mouse monoclonal antibody. J Neuroimmunol, 1984. 6(6): p. 387-96. Matsushita, T., et al., Regulatory B cells inhibit EAE initiation in mice while other B cells promote disease progression. J Clin Invest, 2008. 118(10): p. 3420-30. Kurosaki, T., Paradox ofB cell-targeted therapies. J Clin Invest, 2008. 118(10): p. 32603.

Fillatreau, S., et al., B cells regulate autoimmunity by provision of IL-10. Nat Immunol, 2002. 3(10): p. 944-50.

63. Gerritse, K., et al., The involvement of specific anti myelin basic protein antibody-forming cells in multiple sclerosis immunopathology. J Neuroimmunol, 1994. 49(1-2): p. 153-9.

64. Egg, R., et al., Anti-MOG and anti-MBP antibody subclasses in multiple sclerosis. Mult Scler, 2001. 7(5): p. 285-9.

65. Berger, T., et al., Antimyelin antibodies as a predictor of clinically definite multiple sclerosis after a first demyelinating event. N Engl J Med, 2003. 349(2): p. 139-45.

66. Warren, K.G. and I. Catz, Administration of myelin basic protein synthetic peptides to multiple sclerosis patients. J Neurol Sci, 1995. 133(1-2): p. 85-94.

67. Warren, K.G. and I. Catz, The effect of intrathecal MBP synthetic peptides containing epitope P85 VVHFFKNIVTP96 on free anti-MBP levels in acute relapsing multiple sclerosis. J Neurol Sci, 1997. 148(1): p. 67-78.

68. Bischof, F., et al., A structurally available encephalitogenic epitope of myelin oligodendrocyte glycoprotein specifically induces a diversified pathogenic autoimmune response. J Immunol, 2004. 173(1): p. 600-6.

69. Ponomarenko, N.A., et al., Catalytic antibodies in clinical and experimental pathology: human and mouse models. J Immunol Methods, 2002. 269(1-2): p. 197-211.

70. Polosukhina, D.I., et al., Hydrolysis of myelin basic protein by polyclonal catalytic IgGs from the sera of patients with multiple sclerosis. J Cell Mol Med, 2004. 8(3): p. 359-68.

71. Belogurov, A. A., Jr., et al., Recognition and degradation of myelin basic protein peptides by serum autoantibodies: novel biomarker for multiple sclerosis. J Immunol, 2008. 180(2): p. 1258-67.

72. Jacobs, L.D., et al., Intramuscular interferon beta-la for disease progression in relapsing multiple sclerosis. The Multiple Sclerosis Collaborative Research Group (MSCRG). Ann Neurol, 1996. 39(3): p. 285-94.

73. Johnson, K.P., et al., Extended use of glatiramer acetate (Copaxone) is well tolerated and maintains its clinical effect on multiple sclerosis relapse rate and degree of disability. Copolymer 1 Multiple Sclerosis Study Group. Neurology, 1998. 50(3): p. 701-8.

74. Randomised double-blind placebo-controlled study of interferon beta-la in relapsing/remitting multiple sclerosis. PRISMS (Prevention of Relapses and Disability by Interferon beta-la Subcutaneously in Multiple Sclerosis) Study Group. Lancet, 1998. 352(9139): p. 1498-504.

75. Freedman, M.S., et al., Efficacy of disease-modifying therapies in relapsing remitting multiple sclerosis: a systematic comparison. Eur Neurol, 2008. 60(1): p. 1-11.

76. Kovarik, P., I. Sauer, and B. Schaljo, Molecular mechanisms of the anti-inflammatory functions of interferons. Immunobiology, 2007. 212(9-10): p. 895-901.

77. Billiau, A., B.C. Kieseier, and H.P. Hartung, Biologic role of interferon beta in multiple sclerosis. J Neurol, 2004. 251 Suppl 2: p. II10-4.

78. Jensen, J., M. Krakauer, and F. Sellebjerg, Cytokines and adhesion molecules in multiple sclerosis patients treated with interferon-betalb. Cytokine, 2005. 29(1): p. 24-30.

79. Stuve, O., et al., Chemokine-enhanced migration of human peripheral blood mononuclear cells is antagonized by interferon beta-lb through an effect on matrix metalloproteinase-9. J Neuroimmunol, 1997. 80(1-2): p. 38-46.

80. Waubant, E., et al., IFN-betala may increase serum levels of TIMP-1 in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis. J Interferon Cytokine Res, 2001. 21(3): p. 181-5.

81. Bayry, J., S. Lacroix-Desmazes, and S.V. Kaveri, Novel therapeutic strategies for multiple sclerosis: potential of intravenous immunoglobulin. Nat Rev Drug Discov, 2009. 8(7): p. 594.

82. Fontoura, P. and H. Garren, Multiple sclerosis therapies: molecular mechanisms and future. Results Probl Cell Differ, 2010. 51: p. 259-85.

83. Brinkmann, V., Sphingosine 1-phosphate receptors in health and disease: mechanistic insights from gene deletion studies and reverse pharmacology. Pharmacol Ther, 2007. 115(1): p. 84-105.

84. Korn, T., et al., Suppression of experimental autoimmune neuritis by leflunomide. Brain, 2001. 124(Pt 9): p. 1791-802.

85. Fukushima, R., et al., Teratogenicity study of the dihydroorotate-dehydrogenase inhibitor and protein tyrosine kinase inhibitor Leflunomide in mice. Reprod Toxicol, 2007. 24(3-4): p. 310-6.

86. de Jong, R., et al., Selective stimulation of T helper 2 cytokine responses by the antipsoriasis agent monomethylfumarate. Eur J Immunol, 1996. 26(9): p. 2067-74.

87. Ockenfels, H.M., et al., The antipsoriatic agent dimethylfumarate immunomodulates T-cell cytokine secretion and inhibits cytokines of the psoriatic cytokine network. Br J Dermatol, 1998.139(3): p. 390-5.

88. Vandermeeren, M., et al., Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 1997. 234(1): p. 19-23.

89. Wolinsky, J.S., et al., Linomide in relapsing and secondary progressive MS: part II: MRI results. MRI Analysis Center of the University of Texas-Houston, Health Science Center, and the North American Linomide Investigators. Neurology, 2000. 54(9): p. 1734-41.

90. Andersen, O., et al., Linomide reduces the rate of active lesions in relapsing-remitting multiple sclerosis. Neurology, 1996. 47(4): p. 895-900.

91. Karussis, D.M., et al., Treatment of secondary progressive multiple sclerosis with the immunomodulator linomide: a double-blind, placebo-controlled pilot study with monthly magnetic resonance imaging evaluation. Neurology, 1996. 47(2): p. 341-6.

92. Yang, J.S., et al., Laquinimod (ABR-215062) suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis, modulates the Thl/Th2 balance and induces the Th3 cytokine TGF-beta in Lewis rats. J Neuroimmunol, 2004. 156(1-2): p. 3-9.

93. Thone, J. and G. Ellrichmann, Oral available agents in the treatment of relapsing remitting multiple sclerosis: an overview of merits and culprits. Drug Healthc Patient Saf, 2013. 5: p. 37-47.

94. Arkfeld, D.G., The potential utility of B cell-directed biologic therapy in autoimmune diseases. Rheumatol Int, 2008. 28(3): p. 205-15.

95. Buttmann, M. and P. Rieckmann, Treating multiple sclerosis with monoclonal antibodies. Expert Rev Neurother, 2008. 8(3): p. 433-55.

96. Kleinschmidt-DeMasters, B.K. and K.L. Tyler, Progressive multifocal leukoencephalopathy complicating treatment with natalizumab and interferon beta-la for multiple sclerosis. N Engl J Med, 2005. 353(4): p. 369-74.

97. Wang, M., et al., Oral Lenalidomide with rituximab in relapsed or refractory diffuse large cell, follicular, and transformed lymphoma: a phase II clinical trial. Leukemia, 2013.

98. Cross, A.H., et al., Rituximab reduces B cells and T cells in cerebrospinal fluid of multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol, 2006. 180(1-2): p. 63-70.

99. Tanaka, Y., et al., Successful treatment with rituximab for autoimmune hemolytic anemia associated with chronic lymphocytic leukemia. Rinsho Ketsueki, 2013. 54(2): p. 229-31.

100. Bryant, A. and J. Moore, Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag, 2006. 2(2): p. 207-12.

101. Korkosz, M., et al., Successful treatment of digital tip necrosis in rheumatoid vasculitis with anti-CD20 antibody rituximab. J Clin Rheumatol, 2013. 19(1): p. 43-5.

102. Kroll, J.L., et al., Reactivation of latent viruses in individuals receiving rituximab for new onset type 1 diabetes. J Clin Virol, 2013.

103. Vallerskog, T., et al., Treatment with rituximab affects both the cellular and the humoral arm of the immune system in patients with SLE. Clin Immunol, 2007. 122(1): p. 62-74.

104.

105.

106.

107.

108.

109.

110.

111.

112.

113.

114.

115.

116.

117,

118,

119,

120

121

122

123

124

125

Cragg, M.S., et al., The biology of CD20 and its potential as a target for mAb therapy. Curr Dir Autoimmun, 2005. 8: p. 140-74.

Duddy, M. and A. Bar-Or, B-cells in multiple sclerosis. Int MS J, 2006.13(3): p. 84-90. Hauser, S.L., et al., B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis. N Engl J Med, 2008. 358(7): p. 676-88.

Uchida, J., et al., The innate mononuclear phagocyte network depletes B lymphocytes through Fc receptor-dependent mechanisms during anti-CD20 antibody immunotherapy. J Exp Med, 2004. 199(12): p. 1659-69.

Bar-Or, A., et al., Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a 72-week, open-label, phase I trial. Ann Neurol, 2008. 63(3): p. 395-400.

Liossis, S.N. and P.P. Sfikakis, Rituximab-induced B cell depletion in autoimmune

diseases: potential effects on T cells. Clin Immunol, 2008.127(3): p. 280-5.

Burton, C., R. Kaczmarski, and R. Jan-Mohamed, Interstitial pneumonitis related to

rituximab therapy. N Engl J Med, 2003. 348(26): p. 2690-1; discussion 2690-1.

Zocher, M., et al., Specific depletion of autoreactive B lymphocytes by a recombinant

fusion protein in vitro and in vivo. Int Immunol, 2003. 15(7): p. 789-96.

Kreitman, R.J., Immunotoxins for targeted cancer therapy. AAPS J, 2006. 8(3): p. E532-

51.

Frankel, A.E., Increased sophistication of immunotoxins. Clin Cancer Res, 2002. 8(4): p. 942-4.

Seetharam, S., et al., Increased cytotoxic activity of Pseudomonas exotoxin and two chimeric toxins ending in KDEL. J Biol Chem, 1991. 266(26): p. 17376-81. Siegall, C.B., D.J. FitzGerald, and I. Pastan, Cytotoxicity of IL6-PE40 and derivatives on tumor cells expressing a range of interleukin 6 receptor levels. J Biol Chem, 1990. 265(27): p. 16318-23.

Batra, J.K., et al., TGF alpha-anti-Tac(Fv)-PE40: a bifunctional toxin cytotoxic for cells with EGF or IL2 receptors. Biochem Biophys Res Commun, 1990. 171(1): p. 1-6. Lorberboum-Galski, H., et al., IL2-PE664Glu, a new chimeric protein cytotoxic to human-activated T lymphocytes. J Biol Chem, 1990. 265(27): p. 16311-7. Brenner, T., et al., A novel antigen-toxin chimeric protein: myelin basic proteinpseudomonas exotoxin (MBP-PE 40) for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Immunol Lett, 1999. 68(2-3): p. 403-10.

Nachreiner, T., et al., Depletion of autoreactive B-lymphocytes by a recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein-based immunotoxin. J Neuroimmunol, 2008. 195(1-2): p. 28-35.

Carroll, S.F. and R.J. Collier, Active site of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Glutamic acid 553 is photolabeled by NAD and shows functional homology with glutamic acid 148 of diphtheria toxin. J Biol Chem, 1987. 262(18): p. 8707-11. Siegall, C.B., et al., Functional analysis of domains II, lb, and III of Pseudomonas exotoxin. J Biol Chem, 1989. 264(24): p. 14256-61.

Hwang, J., et al., Functional domains of Pseudomonas exotoxin identified by deletion analysis of the gene expressed in E. coli. Cell, 1987. 48(1): p. 129-36. Kounnas, M.Z., et al., The alpha 2-macroglobulin receptor/low density lipoprotein receptor-related protein binds and internalizes Pseudomonas exotoxin A. J Biol Chem, 1992. 267(18): p. 12420-3.

Chiron, M.F., C.M. Fryling, and D.J. FitzGerald, Cleavage of Pseudomonas exotoxin and diphtheria toxin by a furin-like enzyme prepared from beef liver. J Biol Chem, 1994. 269(27): p. 18167-76.

Chaudhary, V.K., et al., Pseudomonas exotoxin contains a specific sequence at the carboxyl terminus that is required for cytotoxicity. Proc Natl Acad Sei USA, 1990. 87(1): p. 308-12.

126.

127.

128.

129.

130.

131.

132.

133.

134.

135.

136.

137.

138,

139.

140.

141.

142,

143,

144

Kreitman, R.J. and I. Pastan, Importance of the glutamate residue ofKDEL in increasing the cytotoxicity of Pseudomonas exotoxin derivatives and for increased binding to the KDEL receptor. Biochem J, 1995. 307 ( Pt 1): p. 29-37.

Keppler-Hafkemeyer, A., R.J. Kreitman, and I. Pastan, Apoptosis induced by immunotoxins used in the treatment of hematologic malignancies. Int J Cancer, 2000. 87(1): p. 86-94.

Brinkmann, U., et al., Cloning and characterization of a cellular apoptosis susceptibility gene, the human homologue to the yeast chromosome segregation gene CSE1. Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92(22): p. 10427-31.

Giraldi, R., B.E. Guth, and L.R. Trabulsi, Production of Shiga-like toxin among Escherichia coli strains and other bacteria isolated from diarrhea in Sao Paulo, Brazil. J Clin Microbiol, 1990. 28(6): p. 1460-2.

Gyles, C.L., Shiga toxin-producing Escherichia coli: an overview. J Anim Sci, 2007. 85(13 Suppl): p. E45-62.

Sandvig, K. and B. van Deurs, Entry of ricin and Shiga toxin into cells: molecular mechanisms and medical perspectives. EMBO J, 2000. 19(22): p. 5943-50. Sandvig, K. and B. van Deurs, Endocytosis, intracellular transport, and cytotoxic action of Shiga toxin and ricin. Physiol Rev, 1996. 76(4): p. 949-66.

Rybak, S.M., et al., Ribonucleases and immunoRNases as anticancer drugs. Curr Pharm Des, 2009. 15(23): p. 2665-75.

Edelweiss, E., et al., Barnase as a new therapeutic agent triggering apoptosis in human cancer cells. PLoS One, 2008. 3(6): p. e2434.

Putterman, C. and B. Diamond, Immunization with a peptide surrogate for double-stranded DNA (dsDNA) induces autoantibody production and renal immunoglobulin deposition. J Exp Med, 1998. 188(1): p. 29-38.

Nikolova, K.A., et al., Selective silencing of autoreactive B lymphocytes-Following the Nature's way. Autoimmun Rev, 2010. 9(11): p. 775-9.

Zheng, X.X., et al., IL-2 receptor-targeted cytolytic IL-2/Fc fusion protein treatment blocks diabetogenic autoimmunity in nonobese diabetic mice. J Immunol, 1999. 163(7): p. 4041-8.

Strom, T.B., et al., Interleukin-2 receptor-directed therapies: antibody-or cytokine-based targeting molecules. AnnuRev Med, 1993. 44: p. 343-53.

Madhumathi, J. and R.S. Verma, Therapeutic targets and recent advances in protein immunotoxins. Curr Opin Microbiol, 2012. 15(3): p. 300-9.

Stern, J.N., et al., Amelioration of proteolipidprotein 139-151-induced encephalomyelitis in SJL mice by modified amino acid copolymers and their mechanisms. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(32): p. 11743-8.

Macciardi, F., F. Martinelli Boneschi, and D. Cohen, Pharmacogenetics of autoimmune diseases: research issues in the case of Multiple Sclerosis and the role of IFN-beta. J Autoimmun, 2005. 25 Suppl: p. 1-5.

Luca, M.E., et al., Mannosylated PLP(139-151) induces peptide-specific tolerance to experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol, 2005. 160(1-2): p. 17887.

Katsara, M., et al., Design and synthesis of a cyclic double mutant peptide (cyclo(87-99)[A91,A96]MBP87-99) induces altered responses in mice after conjugation to mannan: implications in the immunotherapy of multiple sclerosis. J Med Chem, 2009. 52(1): p. 214-8.

Warren, K.G., et al., Intravenous synthetic peptide MBP8298 delayed disease progression in an HLA Class II-defined cohort of patients with progressive multiple sclerosis: results of a 24-month double-blind placebo-controlled clinical trial and 5 years of follow-up treatment. Eur J Neurol, 2006. 13(8): p. 887-95.

145. Katsara, M., et al., A double mutation ofMBP(83-99) peptide induces IL-4 responses and antagonizes IFN-gamma responses. J Neuroimmunol, 2008. 200(1-2): p. 77-89.

146. St Louis, J., et al., Suppression of experimental allergic encephalomyelitis in the Lewis rat, by administration of an acylated synthetic peptide of myelin basic protein. J Neuroimmunol, 1997. 73(1-2): p. 90-100.

147. Avrilionis, K. and J.M. Boggs, Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by the encephalitogenic peptide, in solution or bound to liposomes. J Neuroimmunol, 1991. 35(1-3): p. 201-10.

148. Lewis, J.D., et al., Hospitalization and mortality rates from peptic ulcer disease and GI bleeding in the 1990s: relationship to sales of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and acid suppression medications. Am J Gastroenterol, 2002. 97(10): p. 2540-9.

149. Sallusto, F. and A. Lanzavecchia, Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med, 1994. 179(4): p. 1109-18.

150. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(5259): p. 680-5.

151. Ivanov, A.E., et al., Inorganic supports coated with N-substituted polyacrylamides: application to biospecific chromatography of proteins. Biomed Chromatogr, 1991. 5(2): p. 90-3.

152. Yasuda, T., et al., Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Jpn J Exp Med, 1975. 45(5): p. 423-7.

153. Kurtzke, J.F., Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: an expanded disability status scale (EDSS'). Neurology, 1983. 33(11): p. 1444-52.

154. Durova, O.M., et al., Strategies for induction of catalytic antibodies toward HIV-1 glycoprotein gpI20 in autoimmune prone mice. Mol Immunol, 2009. 47(1): p. 87-95.

155. Constantinescu, C.S., et al., Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol, 2011. 164(4): p. 1079-106.

156. Bielekova, B., et al., Expansion and functional relevance of high-avidity myelin-specific CD4+ T cells in multiple sclerosis. J Immunol, 2004.172(6): p. 3893-904.

157. Engering, A.J., et al., The mannose receptor functions as a high capacity and broad specificity antigen receptor in human dendritic cells. Eur J Immunol, 1997. 27(9): p. 2417-25.

158. van Bergen, J., et al., Get into the groove! Targeting antigens to MHC class II. Immunol Rev, 1999.172: p. 87-96.

159. Kawakami, S., et al., Mannose receptor-mediated gene transfer into macrophages using novel mannosylated cationic liposomes. Gene Ther, 2000. 7(4): p. 292-9.

160. Kawakami, S., et al., Glycosylated cationic liposomes for cell-selective gene delivery. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 2002. 19(2): p. 171-90.

161. Aharoni, R., et al., Magnetic resonance imaging characterization of different experimental autoimmune encephalomyelitis models and the therapeutic effect of glatiramer acetate. Exp Neurol, 2013. 240: p. 130-44.

162. Jia, L., et al., An attempt to understand kidney's protein handling function by comparing plasma and urine proteomes. PLoS One, 2009. 4(4): p. e5146.