Получение модифицированных олигонуклеотидов для молекулярной диагностики наследственных и инфекционных заболеваний тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Лукьянова, Татьяна Александровна

• Лукьянова, Татьяна Александровна
• кандидат химических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат химических наук Лукьянова, Татьяна Александровна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

3. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

3.1. Флуоресцентные маркеры.

3.2. Цианиновые красители.

3.2.1. Строение.

3.2.2. Физико-химические свойства.

3.2.3 Спектральные свойства.

3.2.3.1. Флуоресценция.

3.2.3.2. Электронные спектры и спектры испускания.

3.2.4. Влияние строения цианиновых красителей на их спектральные свойства

3.2.5. Общие методы получения цианиновых красителей.

3.3. Индоцианиновые красители.

3.4. Маркирование олигонуклеотидов.

3.4. 1. Метод активированных эфиров.

3.4. 2. Метод смешанных ангидридов.

4.1. Синтез и масс-спектрометрия олигонуклеотидов, несущих тиофосфорильные модификации заданной локализации.

4.2. Синтез модифицированных индодикарбоцианиновых красителей для маркирования олигонуклеотидов.

4.2.1. Синтез индодикарбоцианинового красителя - аналога Су5, содержащего этильную группу в полиметиновой цепи (Йодид [5-(1-этил-3,3-диметилиндолин-2-илиден)-3-этил-1,3-пентадиен-1 -ил]-1 -этил-3,3-диметилиндолениния).

4.2.2 Синтез индодикарбоцианинового красителя, содержащего этильную группу в полиметиновой цепи и функциональную (карбоксильную) группу в положение при атоме азота (2-[5-(1-этил-3,3-диметилиндолин-2-илиден)-3-этил-1,3-пентадиен-1 -ил]- 1-карбоксипентил-3,3-диметилиндолениний).

4.2.3. Синтез индодикарбоцианинового красителя, содержащего метальную группу в бензольном кольце (йодид 2-[5-(1-этил-3,3,5-триметилиндолин-2-илиден)-1,3-пентадиен-1 -ил]-1 -этил-3,3,5-триметилиндолениния).

4.2.4. Синтез индодикарбоцианинового красителя, содержащего метальную группу в бензольном кольце и функциональную (карбоксильную) группу в положении при атоме азота (2-[5-(1-этил-3,3,5-триметилиндолин-2-илиден)-1,3-пентадиен-1-ил]-1-карбоксипентил-3,3,5-триметилиндолениний.).

4.2.5. Синтез индодикарбоцианинового красителя, содержащего метальную группу в бензольном кольце,активную (карбоксильную) группу и сульфогруппу в положениях при атомах азота (2-[5-(1-карбоксипентил-3,3,5триметилиндолин-2-илиден)-1,3-пентадиен-1 -ил]-1 -сульфобутил-3,3,5триметилиндолениний).

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Материалы и методы.

2. Описание методик.

2.1. Вспомогательные реагенты.

2.2. Синтез индодикарбоцианиновых красителей.

2.2.1. Йодид 2-[5-(1-этил-3,3-диметилиндолин-2-илиден)-3-этил-1,3-пентадиен- 1 -ил]-1 -этил-3,3-диметилиндолениния.

2.2.2. 2-[5-(1-этил-3,3-диметилиндолин-2-илиден)-3-этил-1,3-пентадиен-1-ил]-1-карбоксипентил-3,3-диметилиндолениний.

2.2.3. Йодид 2-[5-(1-этил-3,3,5-триметилиндолин-2-илиден)-1,3-пентадиен-1 -ил]-1-этил-3,3,5-триметилиндолениния.

2.2.4. 2-[5-(1-этил-3,3?5-триметилиндолин-2-илиден)-1,3-пентадиен-1-ил]

1 -карбоксипентил-3,3,5-триметилиндолениний.

2.2.5. 2-[5-( 1 -карбоксипентил-3,3,5-триметилиндолин-2-илиден)-1,3-пентадиен-1 -ил]-1 -сульфобутил-3,3,5-триметилиндолениний.

2.3. Синтез олигонуклеотидов.

2.4. MALDI-TOF масс-спектрометрия олигонуклеотидов.

6. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение модифицированных олигонуклеотидов для молекулярной диагностики наследственных и инфекционных заболеваний»

Трудно представить современную молекулярную биологию, генетику, генетическую инженерию и медицинскую диагностику без использования синтетических олигодезоксирибонуклеотидов. Их применение в этих отраслях знания стало необходимым и даже рутинным приемом. Особую роль в развитии диагностических и генотерапевтических подходов имеют фрагменты ДНК, несущие межнуклеотидные модификации и олигонуклеотиды, снабженные концевыми флуоресцентными метками.

Совершенствование методов биоорганического синтеза олигонуклеотидов позволяет получать для решения конкретных задач олигонуклеотиды с соответствующими разнообразными модификациями. Так, например, реализовать терапевтический потенциал фрагментов ДНК для медицинских и фармацевтических целей удается только благодаря использованию устойчивых к биодеградации аналогов олигонуклеотидов: Р-алкилфосфонатных [1,2], тиофосфорильных [3,4], тиоамидофосфитных [5], пептидно-нуклеиновых кислот [6] и др. Среди них наиболее изученными и часто используемыми являются тиофосфорильные олигонуклеотиды. Показано, что по гибридизационным свойствам такие аналоги близки природным фосфодиэфирам. Однако, в тоже время они достаточно стабильны в биологических жидкостях, мембранотропны и, вследствие этого, эффективны как антисмысловые олигонуклеотиды. Также применение тиофосфорильных олигонуклеотидов дает ряд преимуществ в генодиагностике и методе быстрой амплификации плазмидной ДНК [7,8]. С другой стороны, тиофосфорильные олигонуклеотиды и их метаболиты обладают высокой системной токсичностью. В связи с этим ведется поиск лишь частично модифицированных эффективных и менее токсичных последовательностей. Тиофосфорильная модификация сахаро-фосфатного остова может приводить к функционально значимым изменениям третичной структуры олигомеров.

Особенно важно изучение влияния тиофосфорильных замен на конформацию олигонуклеотидов-аптамеров [9], биологическая активность которых непосредственно обусловлена их пространственной организацией [10]. Проведение таких скрининговых и структурно-функциональных исследований требует, широкого набора частично модифицированных олигонуклеотидов.

Наиболее экономичным в настоящее время является автоматический параллельный синтез олигонуклеотидов на многоканальных синтезаторах, но для получения локально тиофосфорилированных олигонуклеотидов методы не созданы. В этой связи; особенно; актуальны как разработка стратегии и способов синтеза таких производных; так и оптимизация достоверных способов подтверждения их состава.

Интенсивное развитие методов автоматического секвенирования ДНК, НЦР-генодиагностики в режиме реального времени (Real-Time PGR), в особенности, создание комплексных диагностических наборов, позволяющих одновременно анализировать содержание в. пробе нескольких ДНК-мишеней [11,12], а также технологии микрочипов требует постоянного поиска; новых флуорохромов, позволяющих расширить используемую область спектра [13]. На сегодняшний? день- существуют несколько классов флуоресцентных красителей; активно применяющихся в биологии и медицине. Требования, предъявляемые к этим красителям; довольно жесткие, они должны обладать: спектральными свойствами в нужном диапазоне (определяются свойствами источников света регистрирующих приборов); —химической стабильностью при твердофазном автоматическом синтезе олигонуклеотидов (например; в автоматическом ДНК-синтезаторе); —биохимической инертностью'' (отсутствием неспецифических взаимодействий в ходе биохимических и; молекулярно-биологических процессов) [14].

Одними из наиболее используемых (в технологиях анализа ДНК) являются цианиновые красители. Они имеют высокий квантовый выход флуоресценции (от 0,02 до 0,5) и высокие коэффициенты поглощения, что позволяет измерять флуоресценцию при низких концентрациях метки в системе [15].

Оптимальными среди красителей этого класса для маркирования биополимеров являются индодикарбоцианиновые производные благодаря спектральным характеристикам в ближнем ИК-диапазоне, т.к. биоматериал (ДНК) обладает незначительной собственной флуоресценцией в диапазоне 700-1200 нм [16]. Спектральные свойства цианиновых красителей напрямую зависят от наличия и природы заместителей в полиметиновой цепи и гетероциклических остатках. Применение новых красителей позволит расширить возможности диагностических и аналитических методов.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Лукьянова, Татьяна Александровна

6. ВЫВОДЫ.

1. Разработаны приемы автоматического параллельного синтеза олигонуклеотидов, несущих различные локальные тиофосфорильные межнуклеотидные связи, с использованием сборки олигонуклеотидов в «ждущем режиме» и с созданием специальных программных блоков. Найденные схемы организации реакционных циклов могут быть успешно применены в работе современных синтезаторов.

2. Продемонстрирована эффективность предложенных методов сборки олигомеров на примере параллельного синтеза и получения высокоочищенных (по данным ВЭЖХ-анализа и электрофореза в ПААГ), несущих заданное количество модификаций тиоаналогов биологически значимых олигонуклеотидов, что позволит широко применять частично модифицированные олигонуклеотиды как молекулярно-биологические исследовательские инструменты и диагностикумы, а также для поиска новых олигонуклеотидных лекарственных средств.

3. Оптимизированы условия анализа олигонуклеотидов с помощью MALDI TOF масс-спектрометрии, позволившие повысить чувствительность метода и получать достоверные характеристики тиофосфорильных аналогов олигонуклеотидов, надежно подтверждающие наличие заданного числа тиофосфорильных связей в составе целевых синтетических последовательностей.

4. Синтезированы, выделены и охарактеризованы 5 аналогов коммерческого индодикарбоцианинового красителя Су5, содержащих различные заместители: а) в полиметиновой цепи б) в бензольном кольце в) при атоме азота. Строение промежуточных соединений подтверждено с помощью MALDI-масс спектрометрии, 'Н-ЯМР-спектроскопии, а также с помощью электронной спектроскопии поглощения. Строение цианиновых красителей подтверждено с помощью MALDI-масс спектрометрии и электронной спектроскопией поглощения.

5. Синтезированы активированные (N-гидроксисукцинимидные) производные полученных индодикарбоцианиновых красителей.

6. Конденсацией аминоалкилолигодезоксирибонуклеотидо.в с активированными производными модифицированных индодикарбоцианиновых красителей получены меченые олигнуклеотидные зонды и праймеры.

7. Показана перспективность использования новых флуоресцентномеченных олигонуклеотидов в системах ПЦР ДНК-диагностики и технологии биологических микрочипов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Лукьянова, Татьяна Александровна, 2008 год

1. Richardson P.D., Kren B.T., Steer С J. Gene repair in the new age of gene therapy. Hepatology. 2002. V. 35. №3. P. 512-518.

2. Heggestad A.D., Notterpek L., Fletcher B.S. Transposon-based RNAi delivery system for generating knockdown cell lines. Biochem Biophys Res Commun. 2004. V. 316. №3. P. 643-650.

3. Han S., Mahato R.I., Sung Y.K., Kim S.W. Development of biomaterials for gene therapy. Mol Ther. 2000. V. 2. №4. P.302-317.

4. Nielsen P.E., Egholm M., Berg R.H., Buchardt O. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science. 1991. V. 254. №5037. P. 1497-1500.

5. Dean F.B., Nelson J.R., Giesler T.L., Lasken R.S. Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification. Genome Res. 2001. V. 11. №6. P. 1095-1099.

6. Di Giusto D., King G.C. Single base extension (SBE) with proofreading polymerases and phosphorothioate primers: improved fidelity in single-substrate assays. Nucleic Acids Res. 2003. V.31. №3. P. 7.

7. Probert W.S., Schrader K.N., Khuong N.Y., Bystrom S.L., Graves M.H. Real-time multiplex PCR assay for detection of Brucella spp., B. abortus, and B. melitensis. J Clin Microbiol. 2004. V. 42. №3. P. 1290-1293.

8. Ram S., Shanker R. Computing TaqMan probes for multiplex PCR detection of E. coli 0157 serotypes in water. In Silico Biol. 2005. V. 5. №5-6. PP. 499-504.

9. Fernandes P.B. Technological advances in high-throughput screening. Curr.Opin. Chem. Biol. 1998. №2. P.597 603.

10. Kawamura A. Fluorescent antibody techniques and their applications. University Pare Press, Baltimore. 1969.

11. Tetin S.Y., Swift K.M., and Matayoshi E.D. Measuring antibody affinity and performing immunoassay at the single molecule level. 2002. Anal. Biochem. V.307. P.84-91.

12. Bushmann V., Weston K.D., and Sauer M. Spectroscopic study and evaluation of red-adsorbing fluorescent dyes. 2002. Bioconjugate Chem. №14. P. 195 204.

13. Егоров A. M., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Е. М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа. 1991.

14. Популярная медицинская энциклопедия. Гл. редактор Петровский Б. В. М.: Советская энциклопедия. Т. 1. 1987.

15. Пащенко В. 3. Новые физические методы в биологических исследованиях. М.: Наука. 1987. С. 45^6

16. Handbook of Biological Confocal Microscopy / Ed. J. B. Pawley. N. Y.: Plenum Press. 1990.

17. Молотковский Ю. Г. Флуоресцентные липидные зонды: свойства и применение. Биоорганическая химия. 1999. Т. 25. №11. С.855-867.

18. Савицкий А. П. Флуоресцентный анализ: иммуноанализ, гибридные ДНК, биосенсоры. Успехи биологической химии. 1990. Т. 31. С. 209-238.

19. Chibisov А.К., and Gorner. Н. Singlet versus triplet photoprosses in indodicarbocyanine dyes and spiripyran-derived merocyanines. 1997. J. Photochem. Photobiol. V.105. P.261 267.

20. Artanari H., Basu S., Kawano T. L., Bolton P. H. Fluorescent dyes specific for quadruplex DNA. Nucleic Acids Research. 1998. V. 26. №16. P. 3724-3728.

21. Кольман Я., Рём К. -Г. Наглядная биохимия. М.: Мир. 2000.

22. Кнорре Д. Г. Биологическая химия. М.: Высшая школа. 2000.

23. Корнберг А. Синтез ДНК. М.: Мир. 1977.

24. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. T.l. М.: Мир. 1998.

25. Кнорре Д. Г. ДНК- и РНК-зонды как альтернатива и дополнение иммунохимического анализа. Журнал Всесоюзного Химического Общества им. Д. И. Менделеева. 1989. Выпуск 1. Т.34.

26. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. М.: Мир, 1980. 582 с.

27. Добрецов Г. Е. Флуоресцентные-зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М.:Наука, 1989.

28. Weber P. J. A., Bader J. Е., Folkers G., Beck-Sickinger A. G. A fast and inexpensive method for N-terminal fluorescein-labeling of peptides. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998. №8. P.597 600.

29. Владимиров Ю. А., Добрецов Г. Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука. 1980.

30. Qun Li, Ji Tan, Bi-Xian Peng. Synthesis and characterization pf heptamethine cyanine dyes. Molecules. 1997. №2. P.91 98.

31. Shealy D.B., Lipowska M., Lipowski J. et.al. Synthesis, chromatographic separation, and characterization of near-infrared-labeled DNA oligomers for use in DNA sequencing. Anal. Chem. 1995. V.67. P.247-251.

32. Дьяконов A.H. Химия фотографических материалов. M.: Искусство. 1989.

33. Степанов Б.И. Введение в химию и технологию органических красителей. М.: Химия. 1977.

34. Венкатараман К. Химия синтетических красителей, Ленинград: Государственное научно-техническое издательство химической литературы. 1957.

35. Chibisov А.К. Triplet states of cyanine dyes and reactions of electron transfer with their participation. J. Photochem. 1976. №6. P. 199 214.

36. Киприанов А.И. Цвет и строение цианиновых красителей. Киев. Наукова Думка. 1979.

37. Коган И.М. Химия красителей. М.: Госхимиздат. 1956.

38. Лёвшин Л.В., Салецкий A.M. Оптические методы исследования молекулярных систем. Ч. 1. Молекулярная спектроскопия. М. Изд-во МГУ. 1994.

39. Устинов Д.А. Свет молекул. М.: Колос. 1966.

40. Медицинская биофизика./ под ред. В.О. Самойлова. Ленинград: Издательство ВМА им. Кирова. 1990.

41. Гуринович Г. П., Севченко А. Р., Соловьёв К. Н. Спектроскопия хлорофилла и родственных соединений. Минск. "Наука и техника". 1968.

42. Современные методы биофизических исследований. Практикум по биофизике./ под ред. А.Б.Рубина. М.: Высшая школа. 1988.

43. Красовицкий Б.М., Болотин Б.М. Органические люминофоры. М.: Химия, 1984.

44. Southwick P. L., Ernst L. A., Tauriello Е. W. Cyanine dye labeling reagents -carboxymethylindocyanine succinimidyl esters. Cytometry. 1990. V. 11. P. 418430.

45. Шапиро Б. И. Теоретические начала фотографического процесса. М.: Эдиториал УРСС. 2000.

46. Ищенко А. А. Строение и спектрально-люминесцентные свойства полиметиновых красителей. Киев.: Наукова Думка. 1994.

47. Михайленко Ф. А., Дядюша Г. Г., Богуславская А. Н. Полиметиновые красители с несколькими сопряжёнными хромафорами. Химия Гетероциклических Соединений. 1975. Выпуск 3.

48. Mushkalo I. L., Dyadyusha G. G., Turova L. S., Kornilov M. Yu. A macrocyclic bis-cyanine dye. Tetrahedron Letters. 1980. V. 21. №30. P. 2977-2980.

49. Tolmachev A. I., Ishchenko A. A., Slominsky Yu. L. Directed synthesis of functional polymethine dyes. Chemistry of functional dyes. Ed. by Z. Yoshida. T. Kitao.-Tokio: Mita Press. 1989. P. 108-111.

50. Madge D., Rojas G.E., and Seybold P.G. Solvent dependence of the fluorescence lifetimes of xanthene dyes. Photochem. Photobiol. 1999. V.70. P.737 744.

51. Киприанов А. И. Введение в электронную теорию органических соединений. Киев.: Наукова Думка. 1975.

52. Khimenko V., Chibisov А.К., and Gorner H. Effects of alkyl substituents in the polymethine chain on the photoprocesses in thiacarbocyanine dyes. J. Phys. Chem. 1997. V.101. P.7304 7310.

53. Ficken G. E., Kendall J. D. Chimia. 1961. V. 15. P. 114.

54. Mujumbar R. В., Ernst L. A., Mujumbar S. R. Cyanine dye labeling reagents: sulfoindocyanine succinimidil esters. Bioconjugat chemistry. 1993. V. 4. №2.

55. Джеймс T.-X. Теория фотографического процесса. JT.: Химия. 1982.

56. Левкоев И. И. Органические вещества в фотографических процессах. М.: Наука. 1982.

57. Яновская Л. А., Юфит С. С., Кучеров В. Ф. Химия ацеталей. Сообщение 1: Общий метод синтеза тетраэтилацеталей /3-дикарбонильных соединений. Известия АНСССР ОХН. 1960. № 7. С. 1246 1253.

58. Zhifei Dai, Bixiar Peng. Synthesis and characterization of indodicarbocyanines. Dyes and Pigments. 1998. V.36. №2. P. 169 175.

59. Gromov S. P. Ring transformation of pyridines and benzo derivatives under the action of c-nucleophiles. Heterocycles. 2000. V.53. №7. P. 1607 1630.

60. Грандберг И. И., Сорокин В. И. Направление циклизации арилгидразонов и о-фениловых эфиров оксимов несимметричных кетонов в условиях реакции Фишера. Успехи Химии. 1974. T.XLI1I. В.2. 266 293.

61. Illy Н., Funderburk L. Fischer indole synthesis. Direction of Cyclization of isopropylmethyl ketone phenylhydrazone. J. Org. Chem. 1968. V.33. № 11. P.4283 -4285.

62. Jackson A.H., Smith P. Electrophilic substitution in indoles-III. Rearrangement of 3,3-dialkyl indolenines. Tetrahedron. 1968. V.24. P. 2227-2239.

63. Агрономов A.E., Шабаров Ю.С. Лабораторные работы в органическом практикуме. Издание 2Lc. М.: Химия. 1974.

64. Hunsberger М., Shaw Е. R., Fugger J., Ketcham R., Lednicer D. The preparation of substituted hydrazines. IV. Arylhydrazines via conventional methods. J. Org. Chem. 1956. V.21. № 4. P.394 399.

65. Пептиды. Основные методы образования пептидных связей. Ред. Гросс Э., Майенхофер И. М.: Мир. 1983. 424 с.

66. Eigen М., Rigler R. Sorting single molecules: application to diagnostics and evolutionary biotechnology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. V.91. P.5740 -5747.

67. Staros J.V., Wright R.W.," Swingle D.M. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Anal. Biochem. 1986. V.156. P.220 222.

68. Wang Y.-L. Fluorescent analog cytochemistry: trasing functional protein components in living cells. Methods Cell Biol. 1989. V.29. P.l 12.

69. Mader O., Reiner K., Egelhaa H.-J., Fischer R., Brock R. Structure property analysis of pentamethine indocyanine dyes: identification of a new dye for life science applications. Bioconjugate Chem. 2004, V.15. P.70 78.

70. Kuhn H. A quantum-mechanical theory of light absorption of organic dyes and similar compounds. J. Chem. Phys. 1949. V. 17. P.l 198 1212.

71. Gordon P. F., Gregory P. Organic Chemistry in colour. Springer-Verlag, Heidelberg. 1983.

72. Mostovnikov V. A., Rubinov A. N., Al'perovich M. A., Avdeeva V. I., Levkoev I. I., Loiko M. M. Dependence of the luminescence and generation properties of solutions of polymethine dyes on their structure. Zh. Pricl. Spectr. 1974. V.20. P.42 -47.

73. Mujumdar R.B., Ernst L.A., Mujumdar S.R., Lewis C.J., and Waggoner A.S. Cyanine dye labeling reagents: Sulfoindocyanine succinimidyl esters. Bioconjugate Chem. 1993. №4. P. 105- 111.

74. Lansdorp P. M., Smith C., Safford M., Terstappen L. W., Thomas Т. E. Single laser three color immunofluorescence staining procedures based on energy trsnsfer between phycoerythrin and cyanine 5. Cytometry. 1991. V.12. P.723 730.

75. Kodadec T. Development of protein-detecting microarrays and related devices. Trends Biochem. Sci. 2002. V.27. P.295 300.

76. Ernst L. A., Gupta R. K., Mujumdar R. В., Waggoner A. S. Cyanine dye labeling reagents for sulfohydryl groups. Cytometry. 1989. V.10. P.3 10.

77. Mujumdar R. B, Ernst L. A., Mujumdar S. R., Waggoner A. S. Cyanine dye labeling reagents containing isothiocyanate groups. Cytometry. 1989. V.10. P.l 1 -19.

78. Southwick P. L., Ernst L. A., Tauriello E. W., Parcer S. R., Mujumdar R. В., Mujumdar S. R., Clever H. A., Waggoner A. S. Cyanine dye labeling reagents -carboxymethylindocyanine succinimidyl esters. Cytometry. 1990. V.ll. P.418 -430.

79. Mishra A., Behera R. K., Behera P. K., Mishra В. K., Behera G. B. Cyanines during the 1990s: a review. Chem. Rec. 2000. V.100. P. 1973 2011.

80. Murphy S., Schuster G. B. Electron relazation in a series of cyanine dyes: evidence for electronic and steric control of the rotational rate. J. Phys. Chem. 1995. V.99. P.8516 8518.

81. Sun W.-C., Gee K. R., Klaubert D. H., Haugland R. P. Synthesis of fluorinated fluoresceins. J. Org. Chem. 1997. V.62. P.6469 6475.

82. Синтез органических препаратов. Сборник 12. М.: Мир. 1964.

83. Barnes C.S., Pausacker К.Н., Schubert C.I. The Fischer indole synthesis. Part I. J. Chem. Soc. 1949. P. 1381-1384.

84. Pat. Ins. 4981977. USA. Intermediate for and fluorescent cyanine dyes containing carboxylic acid groups / Philip L. Southwick, Alan S. Waggoner (USA). 01.01.91.

85. Ratnakar B. Mujumdar, Lauren A. Waggoner. Cyanine dye labeling reagents containing isothiocyanate groups. Cytometry. 1989. V.10. P. 13.

86. Jonathan S. Lindsey, Philip A. Brown, David A. Siesel. Visible light harvesting in covalently-linked porphyrin-cyanine dyes. Tetrahedron. 1989. V.45. № 15. P. 4845 4866.