Получение и стандартизация синтетических пептидов для подавления респираторно-синцитиального вируса человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Шатилов Артём Андреевич

• Шатилов Артём Андреевич
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Шатилов Артём Андреевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Респираторно-синцитиальный вирус - эпидемиология и вирусология

1.2 Существующие средства против инфекций респираторно-синцитиального вируса

1.3 Пептиды с противовирусной активностью как потенциальные

терапевтические агенты

1.3.1 Проектирование пептидов и прогнозирование их биологической активности

1.4 Методы получения пептидов

1.4.1 Химический синтез пептидов

1.5 Стандартизация субстанций и препаратов пептидов

1.5.1 Анализ подлинности

1.5.1.1 Масс-спектрометрия с аппаратной схемой «матрично-активационная лазерная десорбция/ионизация - времяпролётный анализатор»

1.5.1.2 Масс-спектрометрия с аппаратной схемой «электрораспылительная ионизация - квадрупольный масс-фильтр»

1.5.1.3 Хроматография и электрофорез

1.5.1.4 Иммунохимические методы

1.5.1.5 Определение противоиона

1.5.2 Анализ чистоты

1.5.2.1 Родственные - со-элюирующиеся - примеси

1.5.2.2 Иные примеси

1.5.3 Количественный анализ

1.5.3.1 Методы количественного анализа, не требующие использования стандартных образцов пептидов

1.5.3.2 Методы относительного количественного анализа

1.5.3.3 Прочие методы количественного анализа

1.5.4 Оценка биологической активности

1.5.4.1 Цитотоксичность

1.5.4.2 Противовирусная активность

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Приготовление растворов

2.2 Проектирование пептидов

2.3 Получение пептидов

2.3.1 Синтез пептидов

2.3.2 Первичная изоляция

2.3.3 Очистка пептидов

2.4 Физико-химический анализ пептидов

2.4.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография

2.4.2 Масс-спектрометрия с матрично-активационной лазерной десорбцией/ионизацией и время-пролётным анализатором

2.4.3 Газо-жидкостная хроматография

2.4.4 Автоматический элементный анализ

2.4.5 Капиллярный электрофорез

2.4.6 Ионная хроматография

2.4.7 Дифференциальный термический анализ

2.4.8 Валидация аналитических методик

2.5 Иммунохимический анализ пептидов

2.5.1 Получение антигенов

2.5.2 Получение антител

2.5.3 Иммуноферментный анализ

2.6 Цитологические исследования пептидов

2.6.1 Цитотоксичность

2.6.2 Противовирусная активность

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Получение пептидов

3.1.1 БА-32

3.1.2 БА-35

3.1.3 БЛ-37

3.1.4 БЛ-38

3.2 Физико-химический анализ пептидов

3.2.1 БЛ-32

3.2.2 БЛ-35

3.2.2.1 Подлинность и чистота

3.2.2.2 Количественное определение

3.2.3 БЛ-37

3.2.4 БЛ-38

3.3 Иммуноферментный анализ пептидов

3.3.1 БЛ-32

3.3.2 БЛ-35

3.3.3 БЛ-37 и БЛ-38

3.4 Биологическая активность пептидов

3.4.1 ЬЬ-37

3.4.2 БЛ-32

3.4.3 БЛ-35

3.4.4 БЛ-37

3.4.5 БЛ-38

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение А

Приложение Б

Приложение В

Приложение Г

Приложение Д

Приложение Е

Приложение Ж

Приложение И

Приложение К

Приложение Л

Приложение М

Приложение Н

Приложение П

Приложение Р

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и стандартизация синтетических пептидов для подавления респираторно-синцитиального вируса человека»

Актуальность темы исследования

Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) - один из наиболее значимых патогенов, вызывающих тяжелые заболевания верхних и нижних дыхательных путей, особенно среди детей и пациентов с хроническими заболеваниями. Ежегодно в мире в результате осложнения заболеваний нижних дыхательных путей, связанных с РСВ, умирает несколько миллионов детей младше 5 лет [103]. Эффективной вакцины против РСВ в настоящее время не существует, а попытки создать её оказались неудачными [25]. Для использования в фармакотерапии РСВ-инфекций в России рекомендованы препараты рибавирина и интерферона-a, при этом первые обладают значительным побочным действием, а последние - спорной эффективностью. В последнее время был разработан ряд низкомолекулярных органических соединений, которые были способны ингибировать проникновение РСВ в клетки за счёт связывания с его F-белком, однако в результате мутаций РСВ приобретал устойчивость к этим веществам уже на этапе разработки [75]. Таким образом, актуальность проблемы эффективности препаратов против РСВ заключается в необходимости формирования принципиально новых подходов к их разработке. Одним из актуальных направлений в разработке новых противовирусных препаратов является использование катионных пептидов, например, природных, таких как дефензины и кателицидины. Главное преимущество данных пептидов заключается в их широком спектре противовирусной активности, что объясняется разнообразием механизмов их действия. На сегодняшний день в экспериментах in vitro и in vivo продемонстрирована противовирусная активность дефензинов и кателицинов в отношении многих вирусов, включая вирус иммунодефицита человека 1 типа, вирус герпеса, папилломы, гепатита В и С [48, 49, 96]. Появляется все больше свидетельств о способности природных пептидов ингибировать респираторные вирусы [14, 22, 104]. К немаловажным преимуществам природных пептидов,

помимо широкого спектра действия, можно отнести их биосовместимость и высокую эффективность, однако, сложность их структур делает их достаточно дорогостоящими. В рамках данной работы были спроектированы и получены путём химического синтеза относительно короткие линейные пептиды с длиной пептидной цепи до 25 аминокислот включительно - аналоги фрагментов природных лигандов клеточной мишени РСВ - нуклеолина. Природные пептиды и их аналоги зачастую нестабильны, особенно в сывороточных условиях, например, в кровеносном русле, в связи с чем особую перспективность приобретают не распространённые в природе и мало исследованные в качестве противовирусных средств дендримерные пептиды; в рамках данной работы был получен и охарактеризован 1 пептидный дендример. Благодаря содержанию е-амидных связей они менее подвержены гидролизу сывороточными протеазами, что увеличивает их стабильность и открывает потенциальные возможности для системного применения.

Степень её разработанности

Несмотря на большую распространенность заболеваний, вызванных РСВ, эффективной и безопасной вакцины получено не было. Существующая терапия заболеваний, вызванных РСВ, описывается и регламентируется стандартами оказания медицинской помощи при гриппе и ОРВИ, при этом имеет ряд недостатков в вопросах эффективности и безопасности. Одними из основных преимуществ пептидных лекарственных средств являются их широкий спектр противовирусного действия, биодеградация, и низкая вероятность развития резистентности у возбудителей.

В настоящее время в Российской Федерации не зарегистрированы пептидные препараты против РСВ. В научной литературе представлены примеры использования противовирусных пептидов, но не примеры успешной стандартизации синтетических противовирусных пептидов.

Цель и задачи исследования

Целью работы было получение синтетических пептидов с активностью в отношении РСВ человека и их стандартизация.

Для достижения данной цели были поставлены задачи:

1. Оценить литературные данные о разработке противовирусных пептидов и их стандартизации.

2. Спроектировать новые пептиды с предполагаемой активностью в отношении РСВ, разработать методики их синтеза и очистки.

3. Разработать и валидировать методики качественного и количественного определения полученных пептидов и определения их чистоты.

4. Изучить цитотоксичность полученных пептидов и их ингибирующую активность против РСВ.

5. Выбрать пептид, наиболее перспективный в качестве потенциальной фармацевтической субстанции, и разработать проект его спецификации.

Научная новизна

Впервые получены синтетические пептиды в форме С-амидов: (((Лrg)2Lys)2LysTyr)2LysProTrpCys, MetИeThrHisGlyCysTyrThrЛrgThrЛrgHisLys HisLysLeuLysLysThrLeu, SerSerЛrgLeuGlnЛspLeuTyrSerИeValЛrgЛrgЛlaAspЛrg AlaAlaCys, ThrGluLeuGlnLeuLeuMetGlnЛsnThrProЛlaAlaAsnЛsnЛrgЛlaArgЛrgGlu AlaPшGlnTyrCys. Для трёх последних впервые составлены проекции Шиффера-Эдмундсона.

Полученные пептиды охарактеризованы методами масс-спектрометрии с матрично-активационной лазерной десорбцией/ионизацией и время-пролётным анализатором, зонным капиллярным электрофорезом, высокоэффективной хроматографией, проведён их элементный анализ.

Для полученных пептидов установлена противовирусная активность в отношении респираторно-синцитиального вируса человека in vitro в сравнении с кателицидином LL-37 и моноклональными антителами.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость работы заключается в том, что доказана значительная противовирусная активность in vitro в отношении РСВ для впервые синтезированных пептидов. Применительно к методам контроля качества и изучения цитотоксичности и противовирусной активности пептидов в отношении РСВ предложен комплекс базовых методов исследования, который является универсальным и может быть применен для скрининга других противовирусных пептидов. Изложены доказательства, которые подтверждают возможность получения перспективных противовирусных пептидных препаратов методами твердофазного пептидного синтеза с выделением готового продукта методом ион -парной ВЭЖХ. Полученные в ходе выполнения настоящей работы пептиды были охарактеризованы как высоко активные потенциальные средства противовирусной терапии. Результаты работы доказывают возможность получения на основе полученных пептидов препаратов, отвечающих требованиям стандартизации, безопасности и эффективности. Раскрыто превосходство методов физико-химического анализа над методом иммуноферментного анализа применительно к стандартизации пептидных препаратов в простоте выполнения и воспроизводимости, а также в области материальных требований. Изучены причинно-следственные связи между физико-химическими свойствами пептидов и их биологической активностью.

Практическое значение полученных результатов заключается в том, что разработаны и внедрены методики твердофазного пептидного синтеза, ион-парной ВЭЖХ и сублимационной сушки. Кроме этого, разработаны и валидированы методики анализа, позволяющие охарактеризовать полученные пептиды по показателям подлинности, количественного содержания и содержания

родственных примесей, как приемлемые для испытаний in vitro. Предложенные методы не требуют применения стандартных образцов пептидов и могут быть экстраполированы на иные катионные пептиды, что обладает высокой значимостью на этапе разработки пептидных активных фармацевтических субстанций. В то же время разработанные методы могут быть адаптированы к использованию стандартных образцов.

Методология и методы исследования

В ходе выполнения работы были использованы методы химической технологии: твердофазный синтез пептидов, конъюгация пептидов с протеинами, хроматографическая очистка, - инструментальные методы физико-химического анализа: масс-спектрометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография, газо-жидкостная хроматография, зонный капиллярный электрофорез, автоматический элементный анализ, инфракрасная спектроскопия, дифференциальный термический анализ, - биологические методы: иммунизация лабораторных животных, иммуноферментный анализ, - а также цитологические методы: анализ цитотоксичности и ингибирования образования синцитиев. Пептиды были охарактеризованы математически с использованием проекций Шиффера-Эдмундсона при помощи программного обеспечения HeliQuest. Результаты экспериментов статистически обрабатывались с использованием программного обеспечения Microsoft Excel.

Положения, выносимые на защиту

1. Методики получения новых синтетических пептидов с потенциальной активностью против респираторно-синцитиального вируса человека.

2. Разработанные методики контроля качества полученных пептидов.

3. Валидация разработанных методик контроля качества пептида SA-35.

4. Результаты оценки противовирусной активности полученных пептидов.

5. Проект спецификации на пептид SA-35.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют паспорту научной специальности 3.4.2. Фармацевтическая химия, фармакогнозия, конкретно пунктам 1 и 3.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов определяется валидацией разработанных методик качественного и количественного анализа по специфичности с использованием масс-спектрометрии, использованием для получения пептидов ортогонального метода синтеза, исключающего образование пептидов с неверной аминокислотной последовательностью с молекулярной массой целевого пептида, применением фармакопейных методов физико-химического анализа, поверенных средств измерения и сертифицированных химических реактивов. Теоретическая база работы основывается на признанных общеизвестных научных гипотезах и теориях. Результаты исследований докладывались и обсуждались на научных конференциях: «European Academy of Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Congress 2019» (Лиссабон, 1-5 июня 2019 г.), «EAACI Congress 2020» (Лондон, 6-8 июня 2020 г.) «Second Moscow Molecular Allergology Meeting» (Москва, 19 ноября 2019 г.), «Актуальные вопросы органической химии и биотехнологии» (Екатеринбург, 18-21 ноября 2020).

Апробация диссертации проведена на заседании кафедры фармацевтической и токсикологической химии имени А.П. Арзамасцева Института Фармации имени А.П. Нелюбина ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), протокол № 2 от «20» сентября 2023 г.

Внедрение результатов в практику

Результаты работы были внедрены в учебный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии имени А.П. Арзамасцева Института фармации имени А.П. Нелюбина ФГАОУ ВО Первого МГМУ имени И.М. Сеченова МЗ РФ (Сеченовского Университета). - Акт внедрения № 261 от 15.05.2023 г (Приложение А), а также в работу лаборатории пептидных иммуногенов № 52 ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России - Акт внедрения от 29.06.2023 (Приложение Б).

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в построении и проведении экспериментальных исследований, анализе и обобщении полученных результатов. Вклад автора является определяющим на каждом из этапов исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах. Лично автором проводились: анализ структур нуклеолина и его лигандов, проектирование пептидов посредством построения проекций Шиффера-Эдмундосна и их анализа, твердофазный пептидный синтез, хроматографическая очистка, анализ пептидов SA-32, SA-35, SA-37, SA-38 и стандартизация SA-35 методами масс-спектрометрии, инфракрасной спектроскопии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, зонного капиллярного электрофореза, ионной хроматографии, элементного анализа, газожидкостной хроматографии. Все методики инструментального анализа разработаны автором, валидированы в соавторстве с научным руководителем Смирновым В.В. Изучение цитотоксичности и противовирусных свойств полученных пептидов проводилось в соавторстве с заведующим лабораторией противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России Шиловским И.П.

Публикации по теме диссертации

По результатам исследования автором опубликованы 8 работ, в том числе: 3 - статьи в международной базе Scopus, 4 - иные публикации; 1 - патент РФ на изобретение «Пептиды для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот» № 277605, дата регистрации: 06.05.2022 (Приложение В).

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа содержит: введение, главу «Обзор литературы», главу «Материалы и методы», главу «Результаты и обсуждение», выводы, список сокращений и условных обозначений, список литературных источников, приложения; выполнена на 147 страницах, содержит 17 таблиц и 64 рисунка (16 таблиц и 51 рисунок в основной части, 1 таблицу и 13 рисунков в приложениях) 115 источников литературы, из них 10 на русском языке и 105 (№№ 11-115) зарубежных, и 14 приложений.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Респираторно-синцитиальный вирус - эпидемиология и вирусология

Респираторные вирусы являются наиболее часто встречающимися в клинике вирусными патогенами. На респираторно-вирусные инфекции может приходиться до 90% всех летальных исходов вирусных инфекций [43]. РСВ является одним из самых распространённых возбудителей инфекций, его превалентность среди возбудителей РВИ, в зависимости от времени года и региона, колеблется от 12 до 63%; он поражает нижние дыхательные пути и, как минимум, в 19% случаев у детей приводит к тяжёлых бронхиолитам и пневмонии, требующих госпитализации [32]. Особенную угрозу представляет собой РСВ для новорождённых и детей младшего возраста: в 0,5% случаев госпитализированные умирают [76]. Внимания заслуживает также резко негативное влияние РСВ на течение бронхиальной астмы у соответствующих больных и тяжёлое течение инфекции у пациентов с иммунодефицитами [106].

Геном РСВ представляет собой одноцепочечную антисмысловую РНК с отрицательной полярностью и кодирует 10 генов: №1, №2, N P, M, SH, G, F, M2 и L. РНК заключена в нуклеокапсид, составленный белком N РНК-полимеразой (белок L) и её кофактором (белок P), а также белком M2-1. Матричный белок M окружает нуклеокапсид, выполняя функцию моста между нуклеокапсидом и оболочкой, липидной бислой которой содержит гликозилированные формы белков F (протеин слияния), G и SH.

Попадание в клетку РСВ происходит за счёт слияния вириона с её мембраной, что опосредуется протеинами G и F. После слияния вирусный геном попадает в циоплазму, где он реплицируется после транскрипции и трансляции. Синтезированная в клетке вирусная РНК взаимодействует с белком N и заключается в нуклеокапсид белками L и P. Этот нуклеопротеиновый комплекс транспортируется к плазматической мембране клетки, где взаимодействует с

вирусными гликопротеинами и формирует новые вирионы, готовые к заражению других клеток [23].

1.2 Существующие средства против инфекций респираторно-синцитиального

вируса

В Российской Федерации терапия инфекций РСВ описывается и регламентируется стандартами оказания медицинской помощи при гриппе и ОРВИ, различающимися для амбулатории и стационаров, для детей и взрослых, а также зависимо от тяжести протекания; МКБ определяет инфекции, вызванные РСВ, как Л2.1 (пневмония), 120.5 (бронхит), 121.0 (бронхиолит), а также В97.4 (общий код для инфекции РСВ) [5]. Среди включённых в упомянутые стандарты препаратов к противовирусным относятся лишь препараты антител, а также обладающий спорной эффективностью в отношении РСВ интерферон-а [4, 9, 94].

Несмотря на десятилетия исследования биологии РСВ, эффективной и безопасной вакцины получено не было [47]. На данный момент доступным средством против РСВ являются препараты рибавирина, имеющие, однако, ряд побочных действий [93]. Высокую эффективность в клинических исследованиях показали средства на основе моноклональных антител, как Паливизумаб (Синагис™), однако, их стоимость значительно снижает их доступность для больных, в связи с чем в настоящее время продолжается поиск новых противовирусных агентов [86, 93], в том числе растительного происхождения [7].

1.3 Пептиды с противовирусной активностью как потенциальные

терапевтические агенты

Одним из перспективных подходов к разработке средств терапии РСВ является использование пептидов, в том числе природных. Млекопитающие имеют

два основных семейства защитных пептидов: дефензины и кателицидины. Эти пептиды обычно выделяются клетками эпителия и нейтрофилами в поражённых инфекцией органах и обладают иммунорегуляторными и противомикробными свойствами. В последнее время было выявлено, что ряд природных пептидов обладают активностью в отношении вирионов РСВ. Одними из основных преимуществ таких пептидов являются их широкий спектр противовирусного действия, биодеградация, и низкая вероятность развития резистентности у возбудителей [26, 31, 59, 84, 95].

Тем не менее, использование природных пептидов в терапии затрудняется двумя основными проблемами: природные пептиды легко разрушаются ферментами, а их выделение из природных источников сопряжено со значительными затратами, как и их химический синтез, что связано со значительной длиной их аминокислотных последовательностей. Решением этим проблем является получение синтетических пептидов, являющихся короткими фрагментами природных пептидов и белков, а также получение неестественных для природы пептидов разнообразными модификациями боковых цепей аминокислот [13].

В настоящее время известно, что клеточной мишенью РСВ является мембранный протеин нуклеолин. Анализ его первичной структуры показывает наличие на его ^концевом участке кислотного кластера (Приложение Г); нормальная функциональность данного домена связана со взаимодействием с нуклеиновыми кислотами, однако, установлено, что именно этот участок нуклеолина РСВ использует для атаки клетки-жертвы с применением протеина слияния [53, 54, 102].

В настоящее время известны пептиды, способные препятствовать развитию вирусной инфекции на разных этапах жизни вируса [19]:

1) Прямо действующие на вирион, опсонизируя или повреждая капсид;

2) Связывающие клеточный рецептор, делая его недоступным для вириона;

3) Действующие на невирионные стадии жизненного цикла вируса.

1.3.1 Проектирование пептидов и прогнозирование их биологической

активности

Прогностический аппарат биохимии пептидов использует математические методы предсказания склонности определённых аминокислотных последовательностей к образованию известных супрамолекулярных структур -спиралей и складок - именно с ними связывается множество видов биологической активности пептидов, так как данные структуры встречаются в протеинах, и предполагается, что они определяют способность пептидов к проявлению активности во взаимодействиях с протеинами, из чего, в конечном счёте, следует их биологическая активность. Такие взаимодействия называются пептидо-протеиновыми, аналогично протеино-протеиновым [1, 20, 56].

Чаще при проектировании пептидов целевой является их склонность к спирализации, нежели к образованию складок, - с целью определения потенциальных а-спиралей используются проекции Шиффера-Эдмундсона и диаграммы Рамачандрана. Первые отличаются простотой получения - для а-спиралей известны благоприятные факторы, как чередование гидрофобных и гидрофильных аминокислот по две через каждый полный оборот спирали (около четырёх аминокислотных остатков). Аминокислоты проектируемого пептида располагаются в круг согласно оборотам спирали, и по получившейся проекции оценивается гипотетическая склонность пептида к образованию а-спирали. Проекции Шиффера-Эдмундсона не предполагают получения однозначных количественных характеристик пептидов, однако, в настоящее время возможно получения для них т яШев величин номинальной гидрофобности и гидрофобного момента. Данный прогностический метод является широкодоступным, и в сети Интернет представлены его бесплатные реализации с базовым или расширенным функционалом [61, 62, 108].

Построение диаграмм Рамачандрана предполагает использование продвинутого математического аппарата и является более сложным процессом,

чем построение проекций Шиффера-Эдмундсона, однако, результатом является числовая вероятность образования пептидом а-спирали. Бесплатные инструменты для построения диаграмм Рамачандрана т 8Шсв с адекватным порогом вхождения обнаружены не были [18, 79].

Следует упомянуть, что оба методы оперируют идеализированными представлениями о супрамолекулярной химии пептидов, и игнорируют способность пептидов существовать в растворах в неструктурированном виде. Возможно также использование более продвинутых предикативных моделей, в частности, методов молекулярной динамики и «обучаемых» баз данных (т.н. искусственного интеллекта) [1].

Как было упомянуто ранее, пептиды способны вступать с протеинами во взаимодействия, аналогичные протеино-протеиновым; в связи с этим рационально предположение о потенциальной способности у фрагментов природных лигандов нуклеолина связывать его на клеточной мембране, блокируя атаку РСВ на клетку. Замена отдельного протеина на его фрагмент в моделированном протеино-протеиновом взаимодействии также является распространённым подходом в биохимии. В прогностических целях при определении потенциально активного фрагмента используются первичные последовательности рецепторов и лигандов. Нуклеолин имеет достаточно большое число лигандов, в частности: эндостатин, протеин слияния РСВ, протеины интиминовой группы [80, 100, 105].

Эндостатин человека является протеолитическим фрагментом коллагена 1 8-ого типа; он является нативным онколитиком организма человека. Анализ его структуры показывает потенциальный а-спиральный кластер на участке 1622-1639 (Приложение Д).

Протеин слияния РСВ имеет несколько форм существования, из них с нуклеолином связывается первичная - F0. В своём составе F0 имеет суперспираль на участке 91-114, которая, как установлено, используется для связи с нуклеолином (Приложение Е).

Интимины - протеины патологических микроорганизмов, в частности, геморрагической кишечной палочки; среди них наибольшей установленной

аффинностью к нуклеолину обладает интимин-у. Из анализа его структуры можно сделать вывод о его общей гидрофобности, что в целом характерно для прокариотических протеинов. Единственным полярным кластером значимого размера в данном протеине является К-конец, аминокислоты 1-20 (Приложение Ж).

1.4 Методы получения пептидов

Среди актуальных на данный момент методов получения пептидов можно выделить четыре:

1. Экстракция из природного сырья - отличается низкой стоимостью; находит широкое применение в косметологии. Обычно пептиды экстрагируются водно-солевыми растворами и используются в качестве смесей вместе с протеинами, однако, такие протеиновые вытяжки могут также быть подвергнуты гидролизу для получения преимущественно смесей пептидов [41].

2. Биотехнологический - такой способ получения целесообразен для пептидов со значительной молекулярной массой. Наиболее известным примером является рекомбинантный инсулин. Отличием от классической биотехнологии протеинов является встраивание в геном супермутанта дополнительного балластного протеина (т.н. «поплавка»), нивелирующего трудности выделения пептида. Поплавок удаляется ферментативным гидролизом на отдельной стадии биотехнологического процесса [30].

3. Химический синтез в растворе - широко используемый способ получения отдельных коротких пептидов и так называемых «строительных блоков» - коротких пептидов, впоследствии соединяемых в более длинные. Данный метод в настоящее время используется, например, в получении октреотида. На продление стерически незатруднённой (простой) пептидной цепи на один аминокислотный остаток уходит около трёх часов [82, 83].

4. Химический синтез на смоле - наиболее широко применяемый метод получения пептидов с длиной цепи, избыточной для синтеза в растворе и

недостаточной для биотехнологии; также предпочтительный способ получения пептидов в аналитических количествах ввиду возможности автоматизации процесса синтеза. Простая пептидная цепь продлевается на один остаток приблизительно за два часа [24].

5. Ферментативные методы - помимо возможности получения пептидов посредством гидролиза протеинов, в том числе ферментативного, возможно получение пептидов из отдельных аминокислот с использованием изолированных протеаз и синтаз. Данный метод распространён меньше прочих перечисленных

[114].

Следует отметить, что возможно использование комбинации приведённых методов [88].

В целях получения пептидов для скрининга противовирусной активности наиболее целесообразно применение химического синтеза ввиду возможности быстрого получения пептидов с необходимыми структурами.

1.4.1 Химический синтез пептидов

Исторически первым методом химического синтеза пептидов был изобретённый в начале XX века Нобелевским лауреатом Эмилем Фишером синтез в растворе. В настоящее время, модернизированный за счёт использования карбодиимидных индукторов и карбаматных защитных групп, он используется для пептидов длинной в среднем не более 3 аминокислотных остатков. Для получения больших по молекулярной массе пептидов используется преимущественно метод твердофазного синтеза, изобретённый и автоматизированный в 1960-ых годах Нобелевским лауреатом Робертом Брюсом Меррифилдом. К настоящему моменту метод был модернизирован, главным образом, Луисом Карпино за счёт введения в практику 9-флуоренилметоксикарбонильной защитной группы и комбинированных индукторов. Получение пептидов данным способом обычно включает три стадии: синтез на нерастворимом полимере - смоле, - отщепление от

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шатилов Артём Андреевич, 2024 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ГОСТ Р 52841-2007. Продукция винодельческая. Определение органических кислот методом капиллярного электрофореза : национальный стандарт Российской Федерации : издание официальное : утверждён и введён в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 декабря 2007 г. № 470-ст : введён впервые : дата введения 200901-01. - Москва: Стандартинформ, 2008. - Текст: электронный.

- URL: https://docs.cntd.ru/document/1200061311 (дата обращения: 16.07.2021)

2. ГОСТ Р 56373-2015. Корма и кормовые добавки. Определение массовой доли органических кислот методом капиллярного электрофореза : национальный стандарт Российской Федерации : издание официальное : утверждён и введён в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 марта 2015 г. №189-ст : введён впервые : дата введения 2016-07-01. - Москва: Стандартинформ, 2015. - Текст: электронный.

- URL: https://docs.cntd.ru/document/1200119489 (дата обращения: 16.07.2021)

3. Государственная фармакопея Российской Федерации. - XV изд.: утверждена приказом Министерства здравоохранения 20 июля 2023 г. No 377.

- Москва, 2023. - Текст : непосредственный.

4. Клинические рекомендации «Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) у взрослых» 2021 г. - Текст : электронный. - URL: Режим доступа: https://cr.minzdrav.gov.ru/recomend/724_1 (дата обращения: 17.02.2022)

5. Международная классификация болезней 10 пересмотра (МКБ-10)

- Текст : электронный. - URL: Режим доступа: https://icd.who.int/browse10/2016/en (дата обращения: 14.01.2020)

6. Патент № 277605 Российская Федерация, МПК: C07K7/08, A61K48/00, A61K47/42, A61K38/10. Пептиды для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот: N 2020134974 : заявл. 26.10.2020 : опубл. 06.05.2022 / Хаитов М.Р.,

Кожихова К.В., Колоскова О. О., Андреев С. М., Тимофеева А. В., Шатилов А. А., Шиловский И. П., Кофиади И. А., Смирнов В. В., Никонова А. А.

7. Перспективные соединения из природных источников для терапии Covid-19 / Андреев С.М., Шершакова Н.Н., Кожихова К.В., Шатилов А.А., Тимофеева А.В., Турецкий Е.А., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. // Russian Journal of Mlergy. - 2020. - Т. 17. - № 2. - C. 18-25.

8. Постникова, А.Д. Биохимические методы стандартизации контроля качества лекарств / А.Д. Постникова, Я.С. Ножкалюк // E-Scio. - 2020. - № 6 (45).

- С. 526-530.

9. Российская Федерация. Министерство здравоохранения. Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при острых респираторных заболеваниях тяжелой степени тяжести : приказ Минздрава Российской Федерации от 24.12.2012 № 1450н (ред. от 14.06.2022) // Министерство здравоохранения : офиц. сайт. URL:https://mmzdrav.gov.ru/documents/8986-prikaz-ministerstva-zdravoohraneniya-rossiyskoy-federatsii-ot-24-dekabrya-2012-g-1450n-ob-utverzhdenii-standarta-spetsializirovannoy-meditsinskoy-pomoschi-detyam-pri-ostryh-respiratornyh-zabolevaniyah-tyazheloy-stepeni-tyazhesti (дата обращения: 18.10.2022)

10. Суперкатионные пептидные дендримеры как векторы для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих / К.В. Кожихова, С.М Андреев., Д.В. Успенская, А.В. Шатилова, Е.А Турецкий., А.А. Шатилов, А.А. Лушникова, Л.И. Вишнякова, И.П. Шиловский, В.В. Смирнов, Д.А. Кудлай, М.Р. Хаитов // Иммунология. - 2022. - Т. 43. - №. 3.

- С. 320-332.

11. A comprehensive review on current advances in peptide drug development and design / A.C.L. Lee, J.L. Harris, K.K. Khanna, [et al.] // International journal of molecular sciences. - 2019. - Vol. 20. - № 10. - P. 2383.

12. A new approach for fluorine determination by solid sampling graphite furnace molecular absorption spectrometry / E.L. de Moraes Flores, J.S. Barin, E.M. de Moraes Flores, [et al.] // Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy. - 2007.

- Vol. 62. - № 9. - P. 918-923.

13. A novel peptide dendrimer LTP efficiently facilitates transfection of mammalian cells / K.V. Kozhikhova, S.M. Andreev, I.P. Shilovskiy, [et al.] // Organic & biomolecular chemistry. - 2018. - Vol. 16. - № 43. - P. 8181-8190.

14. A novel peptide with potent and broad-spectrum antiviral activities against multiple respiratory viruses / H. Zhao, J. Zhou, K. Zhang, [et al.] // Scientific reports.

- 2016. - Vol. 6. - № 1. P. 22008.

15. A novel strategy for MALDI-TOF MS analysis of small molecules / S. Zhang, Y. Chen, S. Xiong, [et al.] // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. - 2010. - Vol. 21. - №. 1. - P. 154-160.

16. Aguilar, M.I. HPLC of peptides and proteins: basic theory and methodology. / M.I. Aguilar // HPLC of Peptides and proteins. Methods in Molecular Biology. - 2004.

- Vol. 251. - P. 3-8

17. Amino acid analysis of peptides using HPLC with evaporative light scattering detection / J.A. Peterson, L.J. Lorenz, D.S. Risley, [et al.] // Journal of liquid chromatography & related technologies. - 1999. - Vol. 22. - № 7. - P. 1009-1025.

18. Antimicrobial peptide designing and optimization employing large-scale flexibility analysis of protein-peptide fragments / N. Kumar, D. Sood, R. Tomar, [et al.] // ACS omega. - 2019. - Vol. 4. - № 25. - P. 21370-21380.

19. Antiviral peptides as promising therapeutic drugs / L.C.P. Vilas Boas, M.L. Campos, R.L.A. Berlanda, [et al.] // Cellular and Molecular Life Sciences. - 2019.

- Vol. 76. - P. 3525-3542.

20. Approaching infinite affinity through engineering of peptide-protein interaction / A.H. Keeble, P. Turkki, S. Stokes, [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2019. - Vol. 116. - № 52. - P. 26523-26533.

21. Balcerzak, M. Fast ion chromatographic method for the determination of formates in alcoholic drinks / M. Balcerzak, D. Kapica // Food Analytical Methods.

- 2017. - Vol. 10. - P. 2358-2364.

22. Basic chemokine-derived glycosaminoglycan binding peptides exert antiviral properties against denguevirus serotype 2, herpes simplex virus-1 and

respiratory syncytial virus / V. Vanheule, P. Vervaeke, A. Mortier, [et al.] // Biochemical pharmacology. - 2016. - Vol. 100. - P. 73-85.

23. Battles, M.B. Respiratory syncytial virus entry and how to block it / M.B. Battles, J.S. McLellan // Nature Reviews Microbiology. - 2019. - Vol. 17. - №. 4.

- P. 233-245.

24. Behrendt, R. Advances in Fmoc solid-phase peptide synthesis / R. Behrendt, P. White, J. Offer // Journal of Peptide Science. - 2016. - Vol. 22. - № 1. - P. 4-27.

25. Castilow, E.M. Understanding respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease / E.M. Castilow, M.R. Olson, S.M. Varga // Immunologic research.

- 2007. - Vol. 39. - № 1-3. - P. 225-239.

26. Cathelicidins have direct antiviral activity against respiratory syncytial virus in vitro and protective function in vivo in mice and humans / S.M. Currie, E. Gwyer Findlay, A.J. McFarlane, [et al.] // The Journal of Immunology. - 2016. - Vol. 196.

- № 6. - P. 2699-2710.

27. Chan, W. Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach / W. Chan, P. White. - OUP Oxford, 1999. - 370 с. - ISBN: 9780199637249. - Текст: непосредственный.

28. Characterization of synthetic peptide therapeutics using liquid chromatography-mass spectrometry: Challenges, solutions, pitfalls, and future perspectives / Z. Lian, N. Wang, Y. Tian, [et al.] // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. - 2021. - Vol. 32. - № 8. - P. 1852-1860.

29. Cohen, S.A. PITC derivatives in amino acid analysis / S.A. Cohen, B.A. Bidlingmeyer, T.L. Tarvin // Nature. - 1986. - Vol. 320. - № 6064. - P. 769-770.

30. Cost-effective production of recombinant peptides in Escherichia coli / R. Gaglione, K. Pane, E. Dell'Olmo, [et al.] // New biotechnology. - 2019. - Vol. 51.

- P. 39-48.

31. Current scenario of peptide-based drugs: the key roles of cationic antitumor and antiviral peptides / K.C. Mulder, L.A. Lima, V.J. Miranda, [et al.] // Frontiers in microbiology. - 2013. - Vol. 4. - P. 321.

32. Defining the Epidemiology and Burden of Severe Respiratory Syncytial Virus Infection Among Infants and Children in Western Countries. Infectious diseases and therapy / L. Bont, P.A. B. Checchia, Fauroux, [et al.] // /Infectious diseases and therapy. - 2016. - Vol. 5. - P. 271-298.

33. Demeure, K. New advances in the understanding of the in-source decay fragmentation of peptides in MALDI-TOF-MS / K. Demeure, V. Gabelica, E.A. De Pauw // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. - 2010.

- Vol. 21. - № 11. - P. 1906-1917.

34. Determination of fluorine in organic compounds by potentiometric titration with aluminum chloride solution combined with oxygen flask combustion / T. Miyahara, F. Ogai, H. Kitamura, [et al.] // Analytical sciences. - 1998. - Vol. 14.

- № 6. - P. 1145-1147.

35. Determination of organic acids by ion chromatography in rain water in the State of Zulia, Venezuela / J.A. Morales, H.L. de Medina, M.G. de Nava, [et al.] // Journal of Chromatography A. - 1994. - Vol. 671. - № 1-2. - P. 193-196.

36. Determination of water content by capillary gas chromatography coupled with thermal conductivity detection / A. Lodi, M.S. Bellini, A. Clavel, [et al.] // Pharmeuropa bio & Scientific Notes. - 2011. - Vol. 2011. - № 2. - P. 40-44.

37. Dhillon, M.K. A common HPLC-PDA method for amino acid analysis in insects and plants / M.K. Dhillon, S. Kumar, G.T. Gujar- 2014. - Vol. 52. - № 1.

- P. 73-79.

38. Diodiu, R. Development and validation of an analytical method for quantitative determination of carboxylic acids in air samplers / R. Diodiu, A. Dogeanu // Energy Procedia. - 2016. - Vol. 85. - P. 201-205.

39. Direct analysis of amino acids by HILIC-eSI-MS / A. Schriewer, K.J. Heilen, H. Hayen, [et al.] // The Application Notebook. - 2017. - Vol. 30. - № 2.

- P. 386-387.

40. Duncan, M.W. Amino acid analysis of peptides and proteins on the femtomole scale by gas chromatography/mass spectrometry / M.W. Duncan, A. Poljak // Analytical Chemistry. - 1998. - Vol. 70. - № 5. - P. 890-896.

41. Erdem Buyukkiraz, M. Antimicrobial peptides (AMPs): A promising class of antimicrobial compounds / M. Erdem Buyukkiraz, Z. Kesmen // Journal of applied microbiology. - 2022. - Vol. 132. - № 3. - P. 1573-1596.

42. Establishment and validation of an ELISA for the quantitation of HBsAg in recombinant hepatitis B vaccines / C.I. Costa, I.F. Delgado, J.A.C. da Costa, [et al.] // Journal of virological methods. - 2011. - Vol. 172. - № 1-2. - P. 32-37.

43. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory tract infections in 195 countries: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015 / C. Troeger, M. Forouzanfar, P.C. Rao, [et al.] // The Lancet Infectious Diseases. - 2017. - Vol. 17. - № 11. - P. 1133-1161

44. Estimation of peptide concentration by a modified bicinchoninic acid assay / K.N. Kapoor, D.T. Barry, R.C. Rees, [et al.] // Analytical Biochemistry. - 2009.

- Vol. 393. - № 1. - P. 138-140.

45. Fields, R. The measurement of amino groups in proteins and peptides / R. Fields // Biochemical Journal. - 1971. - Vol. 124. - № 3. - P. 581-590.

46. Gauthier, T. Peptide Synthesis: Methods and Protocols. Peptide Therapeutics: Fundamentals of Design, Development, and Delivery / T. Gauthier, D. Liu

- Cham : Springer International Publishing, 2022. - P. 51-77.

47. Griffiths, C. Respiratory syncytial virus: infection, detection, and new options for prevention and treatment / C. Griffiths, S.J. Drews, D.J. Marchant // Clinical microbiology reviews. - 2017. - Vol. 30. - № 1. - P. 277-319.

48. Gwyer Findlay, E. Cationic host defence peptides: potential as antiviral therapeutics / E. Gwyer Findlay, S.M. Currie, D.J. Davidson // BioDrugs. - 2013.

- Vol. 27. - № 5. - P. 479-93.

49. Henrich, T.J. HIV-1 entry inhibitors: Recent development and clinical use / T.J. Henrich, D.R. Kuritzkes // Current opinion in virology. - 2013. - Vol. 3.

- № 1. - P. 51-57.

50. Hettiarachchi, K. Capillary electrophoretic determination of acetic acid and trifluoroacetic acid in synthetic peptide samples / K. Hettiarachchi, S. Ridge // Journal of Chromatography A. - 1998. - Vol. 817. - № 1-2. - P. 153-161.

51. High-throughput LC-MS/MS method for chiral amino acid analysis without derivatization / Y. Nakano, M. Taniguchi, Y. Umakoshi, [et al.] // Amino Acid Analysis: Methods and Protocols. - 2019. - P. 253-261.

52. H0jrup, P. Analysis of peptides and conjugates by amino acid analysis / P. H0jrup // Peptide Antibodies: Methods and Protocols. - 2015. - P. 65-76.

53. Identification of nucleolin as a cellular receptor for human respiratory syncytial virus / F. Tayyari, D. Marchant, T.J Moraes, [et al.] // Nature medicine. - 2011.

- Vol. 17. - № 9. - P. 1132-1135

54. Identification of RSV fusion protein interaction domains on the virus receptor, nucleolin / P. Mastrangelo, A.A. Chin, S. Tan, [et al.] // Viruses. - 2021.

- Vol. 13. - № 2. - P. 261.

55. Impurity profiling quality control testing of synthetic peptides using liquid chromatography-photodiode array-fluorescence and liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the obestatin case / B. De Spiegeleer, V. Vergote, A. Pezeshki, [et al.] // Analytical biochemistry. - 2008. - Vol. 376. - №. 2. - P. 229-234.

56. In silico approaches for the design and optimization of interfering peptides against protein-protein interactions / Z.S. Hashemi, M. Zarei, M.K. Fath, [et al.] // Frontiers in Molecular Biosciences. - 2021. - Vol. 8. - P. 669431.

57. Inagaki, S. Development of a reliable method to determine water content by headspace gas chromatography/mass spectrometry with the standard addition technique / S. Inagaki, N. Morii, M. Numata // Analytical Methods. - 2015.

- Vol. 7. - № 11. - P. 4816-4820.

58. Infrared study of trifluoroacetic acid unpurified synthetic peptides in aqueous solution: Trifluoroacetic acid removal and band assignment / L.E. Valenti, M.B. Paci, C.P. De Pauli, [et al.] // Analytical biochemistry. - 2011. - Vol. 410. - № 1.

- P. 118-123.

59. Inhibitory effects of bee venom and its components against viruses in vitro and in vivo / M.B. Uddin, B.H. Lee, C. Nikapitiya, [et al.] // Journal of microbiology. -2016. - Vol. 54. - № 12. - P. 853-866.

60. Jaradat, D.M.M. Thirteen decades of peptide synthesis: key developments in solid phase peptide synthesis and amide bond formation utilized in peptide ligation / D.M.M. Jaradat // Amino acids. - 2018. - Vol. 50. - № 1. - P. 39-68.

61. Juretic, D. Design of a-helical antimicrobial peptides with a high selectivity index / D. Juretic, J. Simunic // Expert Opinion on Drug Discovery. - 2019. - Vol. 14.

- № 10. - P. 1053-1063.

62. Juretic, D. Tools for designing amphipathic helical antimicrobial peptides / D. Juretic, D. Vukicevic, A. Tossi // Antimicrobial Peptides: Methods and Protocols.

- 2017. - P. 23-34.

63. Kasicka, V. Recent developments in capillary electrophoresis and capillary electrochromatography of peptides / V. Kasicka // Electrophoresis. - 2006. - Vol. 27.

- № 1. - P. 142-175.

64. Kielkopf, C.L. Bradford assay for determining protein concentration / C.L. Kielkopf, W. Bauer, I.L. Urbatsch // Cold Spring Harbor Protocols. - 2020.

- Vol. 2020. - №. 4. - P. pdb. prot102269.

65. Kumar, P. Analysis of cell viability by the MTT assay / P. Kumar, A. Nagarajan, P.D. Uchil / /Cold spring harbor protocols. - 2018. - Vol. 2018. - № 6.

- P. pdb. prot095505.

66. Kumar, R. Applications of capillary electrophoresis for biopharmaceutical product characterization / R. Kumar, A. Guttman, A.S. Rathore // Electrophoresis. - 2022.

- Vol. 43. - № 1-2. - P. 143-166.

67. Linear and dendrimeric antiviral peptides: Design, chemical synthesis and activity against human respiratory syncytial virus / K.V. Kozhikhova, I.P. Shilovskiy, A.A. Shatilov [et al.] // Journal of Materials Chemistry B. - 2020. - Vol. 8.

- № 13. - P. 2607-2617.

68. Liquid chromatography-high resolution mass spectrometry for peptide drug quality control / K. Zeng, I. Geerlof-Vidavisky, A. Gucinski, [et al.] // The AAPS Journal.

- 2015. - Vol. 17. - P. 643-651.

69. Low-temperature mineralization of perfluorocarboxylic acids / B. Trang, Y. Li, X.S. Xue, [et al.] // Science. - 2022. - Vol. 377. - № 6608. - P. 839-845.

70. Mahoney, W.C. Separation of large denatured peptides by reverse phase high performance liquid chromatography. Trifluoroacetic acid as a peptide solvent / W.C. Mahoney, M.A. Hermodson // Journal of Biological Chemistry. - 1980. - Vol. 255.

- № 23. - P. 11199-11203.

71. Matsushita, S. Colorimetric estimation of amino acids and peptides with the Folin phenol reagent / S. Matsushita, N. Iwami, Y. Nitta // Analytical Biochemistry.

- 1966. - Vol. 16. - № 2. - P. 365-371.

72. Method development and validation for trifluoroacetic acid determination by capillary electrophoresis in combination with capacitively coupled contactless conductivity detection (CE-C4D) / M.N. El-Attug, B. Lutumba, J. Hoogmartens, [et al.] // Talanta. - 2010. - Vol. 83. - № 2. - P. 400-403.

73. Minic, R. Optimization, validation and standardization of ELISA / R. Minic, I. Zivkovic // Norovirus. - 2020. - P. 9-28.

74. Mitchell, A.R. Bruce Merrifield and solid-phase peptide synthesis: A historical assessment / A.R. Mitchell // Peptide Science. - 2008. - Vol. 90. - № 3.

- P. 175-184.

75. Molecular mechanism of respiratory syncytial virus fusion inhibitors / M.B. Battles, J.P. Langedijk, P. Furmanova-Hollenstein, [et al.] // Nature chemical biology. - 2016. - Vol. 12. № 2. - P. 87-93.

76. Mortality due to respiratory syncytial virus. Burden and risk factors / S. Geoghegan, A. Erviti, M.T. Caballero, [at al.] // American journal of respiratory and critical care medicine. - 2017. - Vol. 195. - № 1. - P. 96-103.

77. Morvan, M. Recent advances in chiral analysis of proteins and peptides / M. Morvan, I. Miksik // Separations. - 2021. - Vol. 8. - № 8. - P. 112.

78. New and evolving techniques for the characterization of peptide therapeutics / S.M. D'Addio, J.R. Bothe, C. Neri, [et al.] // Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2016.

- Vol. 105. - № 10. - P. 2989-3006.

79. Non-protein amino acids in peptide design / S. Aravinda, N. Shamala, R. S. Roy, [et al.] // Journal of Chemical Sciences. - 2003. - Vol. 115. - P. 373-400.

80. Nucleolin on the cell surface as a new molecular target for gastric cancer treatment / T. Watanabe, K. Hirano, A. Takahashi, [et al.] //Biological and Pharmaceutical Bulletin. - 2010. - Vol. 33. - № 5. - P. 796-803.

81. Ozbek, N. Method development for the determination of fluorine in water samples via the molecular absorption of strontium monofluoride formed in an electrothermal atomizer / N. Ozbek, S. Akman //Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy. - 2012. - Vol. 69. - P. 32-37.

82. Patent № W02013132505A1 International, IPC: C07K14/6555. Improved process for preparation of octreotide by solution phase peptide synthesis : N PCT/IN2012/000164 : priority date 09.03.2012 : publication date 12.09.2013 / Kota S., Tallapaneni V., Adibhatla R. K. S. B., Nannapaneni V. C.

83. Patent № W02017112809A1 International, IPC C07K1/061. System and method for solution phase gap peptide synthesis : N PCT/US2016/068112 : priority date 21.12.2016 : publication date 29.06.2017 / Guigen L., SEIFERT C.

84. Perspective of use of antiviral peptides against influenza virus / S. Skalickova, Z. Heger, L. Krejcova, [et al.] // Viruses. - 2015. - Vol. 7. - № 10.

- P. 5428-5442.

85. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of recombinant human angiotensin-converting enzyme 2 in healthy human subjects / M. Haschke, M. Schuster, M. Poglitsch, [et al.] //Clinical pharmacokinetics. - 2013. - Vol. 52. - P. 783-792.

86. Porous silicon nanoparticles as scavengers of hazardous viruses / L.A. Osminkina, V.Y. Timoshenko, I.P. Shilovsky, [et al.] //Journal of nanoparticle research. - 2014. - Vol. 16. - № 6. - P. 2430.

87. Potentiometric titration of peptides, the starting materials for their synthesis, and intermediates. II. Acidimetric microdetermination of peptides / A.Y. Veveris, B.A. Spintse, U.O. Kaleis, [et al.] // Chemistry of Natural Compounds. - 1990. - Vol. 26.

- P. 67-69.

88. Production of peptides as generic drugs: a patent landscape of octreotide / G. Sabatino, I. Guryanov, A. Rombecchi, [et al.] // Expert Opinion on Therapeutic Patents. - 2016. - Vol. 26. - № 4. - P. 485-495.

89. Quality specifications for peptide drugs: a regulatory-pharmaceutical approach / V. Vergote, C. Burvenich, C. Van de Wiele, [et al.] // Journal of peptide science: an official publication of the European Peptide Society. - 2009. - Vol. 15.

- № 11. - P. 697-710.

90. Quantifying trifluoroacetic acid as a counterion in drug discovery by 19F NMR and capillary electrophoresis / M.J. Little, N. Aubry M.E. Beaudoin, [et al.] // Journal of pharmaceutical and biomedical analysis. - 2007. - Vol. 43. - № 4.

- P. 1324-1330.

91. Quantitative GC determination of water in small samples / R. Nussbaum, D. Lischke, H. Paxmann, [et al.] // Chromatographic - 2000. - Vol. 51. - P. 119-121.

92. Related impurities in peptide medicines / M. D'Hondt, N. Bracke, L. Taevernier, [et al.] // Journal of pharmaceutical and biomedical analysis. - 2014.

- Vol. 101. - P. 2-30.

93. Ribavirin: adverse drug reactions, 1986 to 1988 / H.K. Janai, M.I. Marks, M. Zaleska, [et al.] // The Pediatric infectious disease journal. - 1990.

- Vol. 9. - №. 3 - P. 209-211.

94. RSV replication is attenuated by counteracting expression of the suppressor of cytokine signaling (SOCS) molecules / K. Hashimoto, K. Ishibashi, K. Ishioka, [et al.] // Virology. - 2009. - Vol. 391. - № 2. - P. 162-170.

95. Safety and effectiveness of palivizumab in children at high risk of serious disease due to respiratory syncytial virus infection: a systematic review / C. Wegzyn, L.K. Toh, G. Notario, [et al.] // Infectious diseases and therapy. - 2014. - Vol. 3. - № 2.

- P. 133-158.

96. Sarrazin, C. The importance of resistance to direct antiviral drugs in HCV infection in clinical practice / C. Sarrazin // Journal of hepatology. - 2016. - Vol. 64.

- № 2. - P. 486-504.

97. Schaiberger, A.M. Optimized sample preparation for MALDI mass spectrometry analysis of protected synthetic peptides / A.M. Schaiberger, J.A. Moss // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. - 2011. - Vol. 19. - № 4.

- P. 614-619.

98. Simonzadeh, N. Ion chromatographic method for the simultaneous determination of trifluoromethanesulfonic acid and trifluoroacetic acid / N. Simonzadeh // Journal of Chromatography A. - 1993. - Vol. 634. - № 1. - P. 125-128.

99. Simultaneous quantitation of water and residual solvents in pharmaceuticals by rapid headspace gas chromatography with thermal conductivity detection (GC-TCD) / J. Kay, R. Thomas, J. Gruenhagen, [et al.] // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2021. - Vol. 194. - P. 113796.

100. Sinclair, J.F. Intimin types a, p, and y bind to nucleolin with equivalent affinity but lower avidity than to the translocated intimin receptor / J.F. Sinclair, A.D. O'Brien // Journal of Biological Chemistry. - 2004. - Vol. 279. - № 32.

- P. 33751-33758.

101. Sustainability challenges in peptide synthesis and purification: from R&D to production / A. Isidro-Llobet, M.N. Kenworthy, S. Mukherjee, [et al.] // The Journal of Organic Chemistry. - 2019. - Vol. 84. - № 8. - P. 4615-4628.

102. Targeting host cell surface nucleolin for RSV therapy: challenges and opportunities / P. Mastrangelo, M.J. Norris, W. Duan, [et al.] // Vaccines. - 2017.

- Vol. 5. - № 3. - P. 27.

103. The burden of respiratory syncytial virus infection in young children / C.B. Hall, G.A. Weinberg, M.K. Iwane, [et al.] // New England Journal of Medicine. -2009. - Vol. 360. - № 6. - P. 588-598.

104. The human cathelicidin LL-37 has antiviral activity against respiratory syncytial virus / S.M. Currie, E.G. Findlay, B.J. McHugh, [et al.] // PloS one. - 2013.

- Vol. 8. - № 8. - P. e73659.

105. The nuclear translocation of endostatin is mediated by its receptor nucleolin in endothelial cells / N. Song, Y. Ding, W. Zhuo, [et al.] // Angiogenesis. - 2012.

- Vol. 15. - P. 697-711.

106. The role of influenza, RSV and other common respiratory viruses in severe acute respiratory infections and influenza-like illness in a population with a high HIV sero-prevalence, South Africa 2012-2015 / M.A. Pretorius, S. Tempia, S. Walaza, [et al.] // Journal of Clinical Virology. - 2016. - Vol. 75. - P. 21-26.

107. The United States Pharmacopeia. The National Formulary. Rockville, Md. : United States Pharmacopeial Convention, Inc. - 2007. - Текст : электронный

108. Tossi, A. Amphipathic, a-helical antimicrobial peptides / A. Tossi, L. Sandri, A. Giangaspero // Peptide Science. - 2000. - Vol. 55. - № 1. - P. 4-30.

109. Tsochatzis, E. Validation of a HILIC UHPLC-MS/MS method for amino acid profiling in triticum species wheat flours / E. Tsochatzis, M. Papageorgiou, S. Kalogiannis // Foods. - 2019. - Vol. 8. - № 10. - P. 514.

110. Vemuri, S. Comparison of assays for determination of peptide content for lyophilized thymalfasin / S. Vemuri // The Journal of peptide research. - 2005. - Vol. 65.

- № 4. - P. 433-439.

111. Wieland, T. The history of peptide chemistry / T. Wieland // Peptides: Synthesis, Structures and Applications. - Academic Press, 1995. - 511 с.

- ISBN 0123109205. - Текст : электронный.

112. Wujcik, C.E. Extraction and analysis of trifluoroacetic acid in environmental waters / C.E. Wujcik, T.M. Cahill, J.N. Seiber / /Analytical chemistry. - 1998. - Vol. 70.

- № 19. - P. 4074-4080.

113. Xiao, Conductance titration of single-peptide molecules / Xiao, B. Xu, Tao. // Journal of the American Chemical Society. - 2004. - Vol. 126. - № 17. - P. 5370-5371.

114. Yagasaki, M. Synthesis and application of dipeptides; current status and perspectives / M. Yagasaki, S. Hashimoto // Applied microbiology and biotechnology.

- 2008. - Vol. 81. - № 1. - P. 13-22.

115. Zhu, D.Z.Y. Respiratory Syncytial Virus Fusion Protein Interaction with its Cellular Receptor, Nucleolin : дис. / Daniel Zheng Yuan; University of Toronto.

- Canada, 2018. - 98 с.

УТВЕРЖДАЮ шю учебно-воспитательной работе ВО'Шриый МГМУ им. И.М. Сеченова вМ^зрЫй (Сеченовский Университет)

Литвинова Т.М.

2023 г.

о внедрении результатов диссертации Шатилова Артёма Андреевича в учебный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева Института Фармации им. А.П. Нелюбина

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет) Мы, нижеподписавшиеся, подтверждаем, что основные научные положения, выводы и рекомендации кандидатской диссертации

на тему «Получение и стандартизация синтетических пептидов для подавления респираторно-синцитиального вируса человека»

внедрены в учебный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева Института Фармации им. А.П. Нелюбина

при изучении дисциплины «специальная фармацевтическая химия»,

читаемая студентам по направлениям подготовок (специальностей) 33.05.01 Фармация.

Директор Института Фармации им. А.П. Нелюбина

Шатилова Артёма Андреевича

д.ф.н., профессор

Раменская Г.В.

(подпись)

Заведующий кафедрой фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева д.ф.н., профессор

Раменская Г.В.

Начальник Учебного управления к.м.н.

Юдина Л.Ю.

(подпись)

Б И ол,

УТВЕРЖДАЮ

,..7:гор ФГЦУ «ПНЙ^ Институт ¡кдррЛРАН,

БА России, , профессор

Хаитов

20-2 5г.

АКТ

о внедрении методики стандартизации по показателям подлинности, чистоты и количественного содержания синтетических противовирусных пептидов

Настоящим актом подтверждаем, что методика стандартизации по показателям подлинности, чистоты и количественного содержания синтетических противовирусных пептидов, разработанная в рамках научно-исследовательской работы «Получение и стандартизация синтетических пептидов для подавления респираторно-синцитиального вируса человека» Шатилова Артёма Андреевича на кафедре фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева Института Фармации им. А.П. Нелюбина ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) используется (внедрена) в работе лаборатории пептидных иммуногенов № 52 ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Заведующий лабораторией пептидных иммуногенов № 52

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии»

ФМБА России,

кандидат химических наук

Андреев С.М.

10 20 30

MVKLAKAGKN QGDPKKMAPP PKEVEEDSED 60 70 80

KKGKKAAATS AKKVWSPTK KVAVATPAKK 110 120 130

AKAVTTPGKK GATPGKALVA TPGKKGAAIP 160 170 180

DDSEEDEEDD EDEDEDEDEI EFAAMKAAAA 210 220 230

DEEDDSEEEA METTPAKGKK AñKWFVKAK 260 270 280

EDDEDDDDED DEEEEEEEEE EPVKEAPGKR 310 320 330

TEPTTAFNLF VGNLNFNKSA PELKTGISDV 360 370 380

YVDFESAEDL EKALELTGLK VFGNEIKLEK 410 420 430

PYKVTQDELK EVFEDAAEIR LVSKDGKSKG 460 470 480

GTEIDGRSIS LYYTGEKGQN QDYRGGKNST 510 520 530

TLQEVFEKAT FIPÍVPQMQNG KS KGYAFIEF 560 570 580

RAIRLELQGP RGSPNARSQP SKTLFVKGLS 610 620 630

VTDRETGSSK GFGFVDFNSE EDAKAAKEAM 660 670 680

GGFGGRGGGR GGFGGRGGGR GGRGGFGGRG 710

KPQGKKTKFE

Рисунок Г.1 - Первичная структура

40

EEMSEDEEDD

90

AAVTPGKKAA 140

AKGAKNGKNA 190

APñ¡SEDEDDE

240

NVAEDEDEEE

290

KKEMAKQKAA

340

FAKNDLAWD

390

PKGKDSKKER 440

IAYIEFKTEA 490

WSGESKTLVL 540

ASFEDAKEAL 590

EDTTEETLKE 640

EDGEIDGNKV 690

RGGFGGRGGF

50

SSGEEWIPQ 100

ATPAKKTVTP 150

KKEDSDEEED

200

DDEDDEDDDD

250

DDEDEDDDDD

300

PEAKKQKVEG

350

VRIGMTRKFG 400

DARTLLAKNL 450

DAEKTFEEKQ

500

SNLSYSATEE 550

NSCNKREIEG

600

SFDGSVFARI 650

TLDWAKPKGE 700

RGGRGGGGDH

w о

Й ni

tr

зЯ 3 =1 и

о

в

я

человеческого нуклеолина

960 970

LPGPPGPPGR EGPPGRTGQK 1010 1020 GAPGPAGPPG PPGPPGPPGP 1060 1070

GLPGLKGDPG VPGLPGAKGE 1110 1120 RGEKGDPGKD GVGQPGLPGP 1160 1170

GFPGPAGPKG NLGSKGERGS 1210 1220 EPGFRGPPGP YGRPGYKGEI

1260 RGMPGPPGPP 1310

1270 GPPGPPGTPV 1320

GEVGPPGPPG QFPFDFLQLE 1360 1370

SLPGPPGPPG PPGPRGYPGI

1410 PPGPPGPPGP 1460 RQAMLGQVHE 1510

1420 PSFPGPHRQT 1470 VPEGWLIFVA 1520

EVAALQPPW QLHDSNPYPR 1560 1570

980

GSLGEAGAPG 1030 GLPAGFDDME 1080 VGADGVPGFP 1130 PGPPG PWYV 1180 PGPKGEKGEP 1230 GFPGRPGRPG 1280 YDSNVFAESS 1330 AEMKGEKGDR 1380 PGPKGESIRG 1430 ISVPGPPGPP 1480 EQEELYVRVQ 1530 REHPHPTARP 1580

990

HKGSKGAPGP 1040 GSGGPFWSTA 1090 GLPGREGIAG 1140 SEQDGSVLSV 1190 GSIFSPDGGA 1240 MNGLKGEKGE 1290 RPGPPGLPGN 1340 GDAGQKGERG 1390 QPGPPGPQGP 1440 GPPGPPGTMG 1490 NGFRKVQLEA 1540 WRABDILASP 1590

1000 AGARGESGLA 1050 RSADGPQGPP 1100 PQGPKGDRGS 1150 PGPEGRPGFA 1200 LGPAQKGAKG 1250 PGDASLGFGM 1300 QGPPGPKGAK 1350 EPGGGGFFGS 1400 PGIGYEGRQG 1450 ASSGVRLWAT 1500 RTPLPRGTDN 1550 PRLPEPQPYP 1600

GAPHHSSYVH LRPARPTSPP AHSHRDFQPV LHLVALNSPL SGGMRGIRGA

1610 1620 1630 1640 1650

DFQCFQQARA VGLAGTFRAF LSSRLQDLYS rVRRADRAAV PIVNLKDELL

1660 1670 1680 1690 1700

FPSWEALFSG SEGPLKPGAR IFSFDGKDVL RHPTWPQKSV WHG S D PNGRR

1710 1720 1730 1740 1750

LTESYCETWR ТЕАРSATGQA SSLLGGRLLG QSAASCHHAY IVLCIENSFM

Я

5

6

<T5 &

U О

и

X

О)

TASK

Рисунок Д.1 - Первичная структура эндостатина в составе человеческого

коллагена а-1 (XVIII), 951-1754

10

MELLIHRLSA 60

GWYTSVITIE 110

PAANNRARRE

160

GIAVSKVbHL 210

NQLLPIVNQQ 260

MLTNSELLSL 310

VQLPIYGVID 360

FFPQADTCKV 410

DISSSVITSL 460

SVGNTLYYVN 510

QSLÄFIRRSD 560

KAKNTPVTLS Рисунок Е.1 -

20 30 40

IFLTLAINAL YLTSSQNITE EFYQSTCSAV 70 80 90

LSNIKETKCN GTDTKVKLIK QELDKYKNAV 120 130 140

AFQYMNYTIN TTKNLNVSIS KKRKRUFLGF 170 180 190

EGEVNKIKNA LLSTNKÄWS LSNGVSVLTS 220 230 240

SCRISNIETV IEFQQKNSRL LEINREFSVN 270 280 290

INDMPITNDQ KKLMSSNVQI VRQQSYSIMS 320 330 340

TPCWKLHTSP LCTTNIKEGS NICLTRTDRG 370 380 390

QSNRVFCDTM NSLTLPSEVS LCNTDIFNSK 420 430 440

GAIVSCYGKT KCTASNKHRG IIKTFSNGCD

480 490

470

KLEGKNLYVK GEPIINYYDP LVFPSDEFDA 520

ELLHNVNTGK 570

KDQLSGINNI AFSK

Первичная структура протеина слияния РСВ F0 штамма B1

530

STTNIMITTI

540

IIVIIWLLS

50

SRGYFSALRT 100

TELQÜiLMQpiT

150

LLGVGSAIAS

200

KVLDLKNYIN 250

AGVTTPLSTY

300

IIKEEVLAYV 350

WYCDNAGSVS 400

YDCKIMTSKT 450

YVSNKGVDTV

500

SISQVWEKIN 550

LIAIGLLLYC

10 20 30 40 50

М1ТНвСУТКТ ЕШКНКЪККТЬ ШЬЗАСЬСЬЕ ЕУУМдКБЕАИ СЕЫУЕКЪОБО

60 70 80 90 100

ЗКЪЬТНБЗУд ЫВ.ЬЕУТЬКТС ЕТУАБЬЗКЭд БгаЪБТШБЬ ЫЕНЬУББЕБЕ

110 120 130 140 150

ММКААРСдд1 1ЬРЬККЪРЕЕ УЙАЬРЬЬСБА РЬУААССУАС НТ ЫКЬ Т ЕМБ Р

160 170 180 190 200

ВУТКБЫМТБО КАЬЫУААддА АяьоБдьдзк БЬКОБУАКБТ АЬС1АСКдАБ

210 220 230 240 250

здъдйиъдну ОТАЕУИЪдБС ШЕБОЗЙЬБЕ ЬЬРЕУББЕКМ ЬАЕСдУСАКУ

260 2 70 280 290 300

1Б£КЕТАЖ,С АСдИЕЕЬРАН мьсуыупвд БЕЗОБИТЕЪС ЮСЕ УШИБУ Г

310 320 330 340 350

КЕЗУШУЕТО* БСШЕ БУЙКЕ БУБЕВ-РАЖ^Е Б^ЕШУЪРБ УРАЬОАКЫУ

360 3 70 380 390 400

ЕдУУСБЫУАЬ ЕТТБОкъдзыр (ЗААТУСУНУТ Р1РЪУТМС1Б УЕШСТСЫЕШ

410 420 430 440 450

ььУймдЕВУд ЕБК5ШЗдд1Е РдУУМЕБИТЬ БОБКУБЬУдИ НЖГПЬЕУКК

460 470 480 490 500

QDH.SI.NIPH В1ШТЕНБТд к1дыук5ку СЬБВ.1УТСБББ Аъв.Бдссд1д

510 520 530 540 550

нзсйдзАдБУ дА1ЬРАУУдс СБЫIУ КУТ АЕ. АУБШФОЫББН ыудьт1ТУББ

560 5 70 580 590 600

ысдутодусу ТБЕТАБКТ5А КАОЫАБТ1ТУ ТАТУККНСУА 2АНУРУБЕИ1

610 620 630 640 650

УЗСТАТБСАМ БАКТБАЫбКА ТУТЬКБЙТРО дУУУБАКТАЕ МТБАЬЫАБАУ

660 670 680 690 700

1ЕЕБдТКАЙ1 ТЕ1КАБКТТА УАЖЖБА1КУ тукумкнсдр УШдБУТЕБТ

710 720 730 740 750

ЫЕСмкмекБд ТдАТТСГОСЕ АТ1ТЪТ£ББА СКАТУБАТУБ ООАЕУКАТЕУ

760 770 780 790 800

ТЕЕБЕЬК1БЫ ктоисшта СЕЬРЫШЬдУ ОСТУБЩУБЕК

810 820 830 840 850

Т31АТУБАЙ6 КУТБЫОКбБУ У1КАТэеокд ТУБУТ1КАРБ Ш1КУБКдАУ

360 3 70 880 890 900

УАБАМ БIСКМ ЬЬРБТдТУЬЗ Б1УБЗШААМ КУБНУББМЫБ 1ТАШКдТББ

910 920 930

ЕдИЗСУББТУ rn.iTQNPi.PG УЪГУИТ РЫУУА УСУЕ

Основание 8А-38

Брутто-формула: Состав: