Получение и характеристика штаммов Listeria monocytogenes, аттенуированных в результате сайт-специфического мутагенеза гена, кодирующего L,D-карбоксипептидазу тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат медицинских наук Юров, Дмитрий Сергеевич

• Юров, Дмитрий Сергеевич
• кандидат медицинских наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Юров, Дмитрий Сергеевич

Оглавление.

Список сокращений

I. Введение.

II. Обзор литературы.

2.1. Listeria monocytogenes: место в инфекционной патологии.

2.2. Листерии как возбудители сапрозоонозной инфекции.

2.2.1. Листерии как возбудители пищевой инфекции.

2.2.2. Листериоз у животных.

2.3. Внутриклеточный паразитизм листерий.

2.4. Факторы, необходимые L. monocytogenes при переходе во внутриклеточное пространство.

2.4.1. Белки, необходимые в процессе инвазии.

2.4.2. Белки, необходимые для выхода из фагосомы.

2.4.3. Белки, необходимые в процессе внутриклеточного размножения и межклеточного распространения.

2.4.4. Координация экспрессии факторов патогенности.

2.5. Метаболические аспекты адаптации бактерий к внутриклеточному паразитизму.

2.5.1. Ионы металлов, влияющие на рост бактерий в организме хозяина.

2.5.2. Углеводы, доступные во внутриклеточном пространстве.

2.5.3. Шапероны.

2.5.4. Значение липоевой кислоты в росте и вирулентности.

2.5.5. Другие механизмы адаптации, активирующиеся в процессе инфекции.

2.6. Разработка вакцинных штаммов патогенных бактерий на основе мутаций в генах общего метаболизма.

2.6.1. Мутации в системе метилирования ДНК (Уши-мутации).

2.6.2. Мутации в генах метаболизма ароматических аминокислот (алу-мутации).

2.6.3. Мутации, связанные с антибиотикоустойчивостью.

III. Материалы и методы.

3.1. Биоинформационный анализ.

3.2. Использованные штаммы и плазмиды.

3.3. Микробиологические методы.

3.3.1. Бактериальные штаммы и условия выращивания.

3.3.2. Приготовление и трансформация компетентных клеток Е. coli.

3.3.3. Приготовление и трансформация компетентных клеток L. monocytogenes.

3.4. Молекулярно - генетические методы.

3.4.1. Выделение хромосомной ДНК L. monocytogenes.

3.4.2. Приготовление лизатов Listeria spp. из колоний.

3.4.3. Выделение плазмидной ДНК E.coli.

3.4.4. Выделение плазмидной ДНК L. monocytogenes.

3.4.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

3.4.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени.

3.4.7. Праймеры, использованные в работе.

3.4.8. Рестрикционный анализ, дефософолирирование, лигирование ДНК.

3.4.9. Электрофорез в агарозном геле.

3.4.10. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

3.4.11. Получение инсерционных мутантов L. monocytogenes.

3.4.12. Получение делеционного штамма L. monocytogenes GIMd0028.

3.4.13. Комплементирование делеции гена 1то0028 в штамме GIMd0028.

3.5. Биохимические методы.

3.5.1. Разделение освобождённых белков и белков клеточной стенки L. monocytogenes методом электрофореза в системе Лэммли (SDS-PAGE).

3.5.2. Определение биохимических свойств листерий.

3.6. Иммунологические методы.

Определение белков L. monocytogenes с помощью иммуноблоттинга (Western-blot).

3.7. Биологические методы.

3.7.1. Измерение скорости роста бактерий.

3.7.2. Изучение морфологии клеток.

3.7.3. Определение эффективности инвазии штаммов L. monocytogenes в эпителиальные клетки.

3.7.4. Определение эффективности внутриклеточного размножения штаммов L. monocytogenes.

3.7.5. Определение вирулентности и LD50 штаммов L. monocytogenes.

3.7.6. Определение цитотоксичности L. monocytogenes.

IV. Результаты.

4.1. Биоинформационный анализ.

4.2. Скриниговый анализ вовлеченности кандидатных белков в вирулентность L. monocytogenes.

4.3. Влияние инсерции в гене 1шо2077 на биохимические, морфологические и культуральные свойства и вирулентность L. monocytogenes.

4.4. Получение и характеристика мутантного штамма L. monocytogenes с делецией гена lmo0028 (GIMd0028).

4.4.1. Получение мутантного штамма с делецией гена 1то0028.

4.4.2. Влияние делеции гена 1то0028 на свойства бактерии при выращивании L. monocytogenes in vitro.

4.4.3. Влияние делеции гена 1то0028 на вирулентность L. monocytogenes.

V. Обсуждение.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и характеристика штаммов Listeria monocytogenes, аттенуированных в результате сайт-специфического мутагенеза гена, кодирующего L,D-карбоксипептидазу»

В 1934 г. академик Е.Н.Павловский писал «.на земле существуют три великие среды обитания: вода, суша и воздух, и организм» (Павловский, 1934). Внимание исследователей, работающих в области медицинской микробиологии, в течение многих лет было приковано к изучению продуцируемых бактериями факторов патогенности, влияющих на структуры и функции макроорганизма, исследованию молекулярных механизмов их активности и роли в развитии инфекционного процесса. Существуют, однако, многочисленные экспериментальные доказательства того, что, помимо продукции специфических факторов патогенности, существование внутри организма требует от бактерий существенных перестроек общего метаболизма. Размножение патогенных бактерий внутри макроорганизма требует от них способности адаптироваться к условиям существования, кардинально отличающимся от внешней среды. Далеко не все эти факторы благоприятны для существования микроорганизма, и даже в целом к благоприятным факторам требуются эффективная адаптация. Так, более высокая, чем во внешней среде, температура не только ускоряет химические реакции и, как следствие обменные процессы, но и увеличивает количество неправильно структурированных белков и является фактором стресса для бактерии; питательные вещества, хотя и присутствующие в избытке, находятся в составе нехарактерных для внешней среды соединений; отсутствие атмосферного кислорода требует от бактерии эффективного переключения метаболизма с аэробного на анаэробный и т.д.

Изучение механизмов адаптации к условиям размножения в ходе процесса инфекции, связанных с изменениями общего метаболизма бактерий, имеет существенный фундаментальный интерес как само по себе, так и для понимания механизмов становления патогенности как явления. Вместе с тем, изучение перестроек метаболизма, необходимых для эффективного размножения внутри организма, имеет и большое практическое значение как подход к созданию аттенуированных штаммов, обладающих высокой иммуногенностью благодаря сохранению антигенных детерминант, в том числе являющихся факторами патогенности, но не способных индуцировать инфекционный процесс. Несмотря на активные разработки субъединичных и генно-инженерных вакцин, живые вакцины до настоящего времени не потеряли своего значения, что хорошо видно на примере вакцины БЦЖ, которая продолжает надежно защищать население, по крайней мере, до 15-летнего возраста. Более того, в настоящее время проводятся значительные исследования возможности использования аттенуированных штаммов бактерий, способных размножаться внутри эукариотической клетки, для разработки векторных систем для доставки в антигенпрезентирующие клетки рекомбинантных антигенов, в том числе опухолевых (бактериофекция). Основной моделью для разработки систем бактериофекции является грам-положительная бактерия Listeria monocytogenes (Goossens et al., 1995; Paterson and Masiag, 2005).

L. monocytogenes вызывает листериоз, тяжелое заболевание людей и животных, связанное с поражением центральной нервной системы и/или плода у беременных (Шлыгина, 1970, Vazquez-Boland et al., 2001; Тартаковский и др., 2002). В связи с высокой летальностью (до 30% от числа госпитализированных больных с диагнозом листериоз) листериоз является серьезной проблемой для медицины (Тартаковский и др., 2002; Зайцева и др., 2007). Кроме того, листериоз является важной проблемой для ветеринарии, что связано с убикитарностью листерий, активно размножающихся во внешней среде, характерной для агропромышленного комплекса, например, в силосе, и приводящих к развитию эпидемий среди мелкого и крупного рогатого скота (Бакулов и др., 1994; Czuprynski, 2005).

L. monocytogenes относится к числу факультативных внутриклеточных паразитов. В процессе инфекции L. monocytogenes проникает в эукариотические клетки путем естественного или индуцированного (в случае непрофессиональных фагоцитов) фагоцитоза. Попавшая в фагосому бактерия разрушает фагосомальную мембрану и выходит в цитоплазму, где размножается с высокой эффективностью (Portnoy et al., 1992; Vazquez-Boland et al., 2001; Тартаковский и др. 2002).

Гены факторов патогенности, необходимые для процесса внутриклеточного размножения, координировано регулируются фактором транскрипции PrfA (Ермолаева, 2001; Vazquez-Boland and Kreft, 2001). Транскриптомный анализ экспрессии генов L. monocytogenes в присутствии активного и неактивного PrfA показал, что активность более 150 генов увеличивается и около 100 генов уменьшается в зависимости от активности PrfA (Milohanic et al., 2003). Помимо генов уже изученных факторов патогенности, таких как листериолизин О, фосфолипазы, фактор полимеризации актина ActA и т.д., гены, положительно регулируемые PrfA, кодируют белки с неизвестными функциями и белки общего метаболизма. Для некоторых из последних, например, для участвующего в импорте глюкозо-1-фосфата белка Hpt, продукта гена hpt, доказана роль в адаптации к размножению внутри цитоплазмы и в вирулентности (Chico-Calero et al., 2002). Однако, в большинстве своем, роль в инфекционном процессе кодируемых этими генами белков общего метаболизма не изучалась. В целом, адаптационные механизмы, позволяющие бактериям колонизировать макроорганизм, эффективно используя его ресурсы и приспосабливаясь к встречающемуся в процессе инфекции микроокружению, во многом остаются неизученными.

Целью данной работы явилась выявление и идентификация белков, обеспечивающих адаптацию L. monocytogenes к размножению в макроорганизме, и оценка возможности аттенуации L. monocytogenes путем делеции кодирующих их генов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• разработать критерии для проведения биоинформационного анализа и провести анализ базы данных, содержащей последовательность генома L. monocytogenes, с целью идентификации открытых рамок считывания (ОРС), продукты которых могут быть вовлечены в процесс адаптации к размножению в макроорганизме;

• провести инсерционный мутагенез кандидатных ОРС для выявления мутаций, приводящих к уменьшению вирулентности L. monocytogenes на модели экспериментального листериоза у лабораторных мышей;

• получить и охарактеризовать мутантные штаммы L. monocytogenes с делецией генов, инсерции в которых приводят к уменьшению вирулентности;

• оценить вирулентность и способность к внутриклеточному размножению штаммов L. monocytogenes, с делециями генов, идентифицированных в ходе данной работы.

Научная новизна.

Разработаны критерии биоинформационного поиска, позволившие выявить ОРС, нарушение целостности которых в результате инсерции приводит к изменениям вирулентности L. monocytogenes. Впервые на модели экспериментального листериоза у лабораторных мышей показано, что инсерции в генах 1то0028 и 1то1493 приводят к уменьшению степени поражения внутренних органов при экспериментальном листериозе лабораторных мышей линии BALB/c, а инсерции в генах 1то0961 и 1то2077 увеличивают степень поражения.

Установлено, что инсерция в опероне 1то2075 - 1то2078 приводит к увеличению вирулентности мутантных бактерий in vivo, но снижает способность L. monocytogenes расти in vitro в аэробных условиях, которая восстанавливается при культивировании бактерий в анаэробных условиях.

Показано, что мутации в гене 1то0028, кодирующем L,D-карбоксипептидазу, приводят к появлению удлиненных (до 10 раз по сравнению с бактериями дикого типа) бактериальных клеток при выращивании листерий in vitro на твердых питательных средах, но не в бульоне.

Показано, что удлинение бактериальных клеток, мутантных по гену 1то0028, коррелирует с увеличением количества генетического материала, содержащегося в одной колониеобразующей единице, что свидетельствует о присутствии нескольких копий генома в одной бактериальной клетке. Таким образом, впервые для грам-положительных бактерий доказано участие L,D-карбоксипептидазы в процессе расхождения бактериальных клеток после деления.

Показано, что мутация в гене 1то0028, кодирующем L,D-карбоксипептидазу, нарушает процесс бактериального деления при размножении листерий внутри цитоплазмы эпителиальных клеток.

Показано, что инактивация гена 1то0028 приводит к снижению вирулентности L. monocytogenes на модели экспериментального листериоза мышей линии BALB/c. При этом аттенуация не связана с изменением уровня продукции основных факторов патогенности (LLO и PlcA) и/или цитотоксичности, и, по-видимому, связана с ролью кодируемой геном 1то0028 ЬД>карбоксипептидазы в бактериальном делении в процессе внутриклеточного размножения.

Практическая значимость.

Полученные результаты могут быть использованы для получения аттенуированных штаммов других видов бактерий путем введения сайт-специфических мутаций в гены, кодирующие Ь,Б-карбоксипептидазы, как предложено нами в методических рекомендациях «».

И. Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Юров, Дмитрий Сергеевич

VII. Выводы

1. Показано, что инсерционные мутации в генах 1то0028 и 1то1493 приводят к уменьшению степени поражения внутренних органов при экспериментальном листериозе у мышей линии BALB/c, а инсерции в генах 1то0961 и 1то2077 увеличивают степень поражения.

2. Установлено, что инсерционная мутация в опероне 1то2075 - 1то2077, увеличивает вирулентность L. monocytogenes, но ухудшает эффективность роста на искусственных питательных средах. Эффективность роста in vitro восстанавливается при культивировании бактерий в анаэробных условиях.

3. Показано, что нарушение функции гена 1то0028, кодирующего L,D-карбоксипептидазу, приводит к нарушению процесса расхождения бактериальных клеток после деления при культивировании на агаризованных питательных средах.

4. Показано, что делеция гена 1то0028 снижает эффективность инвазии в эпителиальные клетки линии НТ29 в 2 раза и нарушает формирование дочерних бактериальных клеток при размножении листерий в цитоплазме.

5. Показано, что мутации в гене 1то0028 приводят к снижению вирулентности L. monocytogenes на модели экспериментального листериоза у лабораторных мышей.

VI. Заключение

В работе, на основании разработанных критериев биоинформационного анализа, были выбраны четыре гена-мишени, продукты которых потенциально могут быть вовлечены в обеспечение вирулентности L. monocytogenes. Сделанное предположение было подтверждено экспериментально, в результате сайт-специфического мутагенеза генов-мишеней вирулентность L. monocytogenes в отношении чувствительных мышей линии BALB/c изменилась. Было показано, что инсерция в опероне 1то2075-2077, включающем ОРС, имеющие гомологию с N-аланин-ацетилтрансферазой, модифицирующей рибосомальный белок S18, и гомологичными пептидазами, активными в отношении О-сиалогликозилированных белков, ухудшает способность листерий расти в аэробных условиях in vitro, но увеличивает вирулентность. Было показано, что нарушение функции гена 1то0028, кодирующего Ь,В-карбоксипептидазу, напротив, не влияет на эффективность роста в питательном бульоне, но снижает эффективность инвазии и внутриклеточного размножения в эпителиальных клетках, что, по-видимому, является причиной сниженной вирулентности.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Юров, Дмитрий Сергеевич, 2008 год

1. Бакулов И.А. Листериоз сельскохозяйственных животных. Москва. «Колос», 1967.

2. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Листериоз как пищевая инфекция. Вопросы диагностики и профилактики. Учебное пособие. Ульяновск, 1991.

3. Бакулов И. А., Котляров В.М., Шестиперова Т.И. Эпидемиологические и эпизоотологические аспекты листериоза. Журн микробиол. 1994. 5: 100-105.

4. Гершун В.И. Листериоз сельскохозяйственных животных. Алма-Ата, 1981.

5. Езепчук Ю.В., Патогенность как функция биомолекул. Москва.1985.

6. Ермолаева С.А. Генетические механизмы вирулентности Listeria monocytogenes. Генетика. 2001. 37: 286-293.

7. Ермолаева С.А. Тартаковский И.С. Регуляция экспрессии факторов вирулентности у Listeria monocytogenes. Журн. микробиол. 2001. 3: 106-110.

8. Ермолаева С.А., Белый Ю., Тартаковский И.С. ЖМЭИ. 2000. 5: 3-6.

9. Ермолаева С.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С., Гинцбург А.Л., Прозоровский С.В. Клонирование и экспрессия фосфатидилинозитол-специфичной фосфолипазы С L. monocytogenes. Мол. Ген. Микробиол. Вирусол. 1995. 1: 3-10.

10. Ермолаева С.А. Роль системной регуляции экспрессии генов патогенности в вирулентности Listeria monocytogenes. Дисс. докт. биол. наук. Москва. 2004. 189.

11. Карпова JI.A., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С., Прозоровский С.В. Очистка и характеристика листериолизина О Listeria monocytogenes. Журн. микробиол. 1994. 4:3-7.

12. Книзе А.В., Бузун А.И. Эпизоотическая ситуация по листериозу в странах мира и России. В сб. Листериоз на рубеже тысячелетий. Покров. 1999. 118-122.

13. Котляров В.М. Проблема листериоза на рубеже тысячелетий. В сб. Листериоз на рубеже тысячелетий. Покров. 1999. 48-52.

14. Маракуша Б.И., Принципы аттенуации патогенных бактерий на модели сальмонелл. Дис. Докт. мед. наук. Москва. 1996. 302.

15. Мешкова Р.Я. Иммунопрофилактика. Руководство для врачей. Смоленск. Русич, 1999.

16. Павловский Е.Н. Курс паразитологии человека (с учением о переносчиках инфекций и инвазий). Изд. 2. Гос. изд. биол. и мед. лит. 1934. 592.

17. Пушкарева В.И. Патогенные бактерии в почвенных и водных сообществах. Дис. докт. биол. наук. Москва. 1994. 210.

18. Пушкарева В.И., Емельяненко Е.Н., Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Кулеш Е.В., Белякова Г.А., Дьяков Ю.Т. Патогенные листерии в почве и в ассоциации с водорослями: обратимый переход в некультивируемое состояние. Журн. микробиол. 1997. 3: 3-10.

19. Родина Л.В. МаненковаГ.М. Степанова Н.В. Тимошков В.В. Салова Н.Я. ШестепероваТ.И. Состояние эпиднадзора за листериозом в г. Москве. В сб. Листериоз на рубеже тысячелетий. Покров. 1999. 129-131.

20. Салова Н.Я., Голованова В.П., Шестеперова Т.И., Маненкова Г.М., Степанова Н.В. Современное состояние лабораторной диагностики листериозав санэпидслужбе г. Москвы. В.сб. Листериоз на рубеже тысячелетий. Покров. 1999. 68-71.

21. Сапенко Т.П. Механизмы и роль освобождения поверхностного белка ActA во взаимодействии Listeria monocytogenes с эпителиальными клетками. Дис. канд. мед. наук. Москва. 2006. 102.

22. Сахаров П.П., Гудкова Е.И. Листереллезная инфекция. Медгиз.1959.

23. Супотницкий М.В. Микроорганизмы, токсины и эпидемии. Москва. Вузовская книга, 2000.

24. Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. Медицина для всех, 2002.

25. Тартаковский И.С., Палей О.С., Опочинский Э.Ф., Лукина З.А., Прозоровский С.В. «Листерии в инфекционной патологии человека -современная концепция». ЗниСО, 1994. 1-4.

26. Шлыгина К.Н. Сравнительное изучение лабораторных методов диагностики листериоза. Дис. канд. биол. наук. Москва. 1970. 345.

27. Beck B.D., Park J.T. Activity of three murein hydrolases during the cell division cycle of Escherichia coli K-12 as measured in toluene-treated cells. J Bacteriol. 1976. 126: 1250-1260.

28. Beck B.D., Park J.T. Basis for the observed fluctuation of carboxypeptidase II activity during the cell cycle in BUG 6, a temperature-sensitive division mutant of Escherichia coli. J Bacteriol. 1977. 130: 1292-1302.

29. Belyi Y.F. Intracellular parasitism of microorganisms. Springer-Verlag GmbH&Co.KG. 1996.

30. Bi E., Zigmond S.H. Actin polymerization: Where the WASP stings. Curr. Biol. 1999. 9: R160-R163.

31. Bjorn M. J., Iglewski В. H., Ives S. K., Sadoff J. C., Vasil M. L. Effect of iron on yields of exotoxin A in cultures of Pseudomonas aeruginosa PA-103. Infect. Immun. 1978. 19: 785-791.

32. Bonnemain C., Raynaud C., Reglier-Poupet H., Dubail I., Frehel C., Lety M.A., Berche P., Charbit A. Differential roles of multiple signal peptidases in the virulence of Listeria monocytogenes. Mol Microbiol. 2004. 51: 1251-1266.

33. Brookfield D.E., Green J., Ali S.T., Machado R.S., Guest J.R. Evidence for two protein-lipoylation activities in Escherichia coli. FEBS Lett. 1991. 295: 1316.

34. Burnette WN."Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 1981. 112: 195-203.

35. Buzzola F.R., Barbagelata M.Sol, Caccuri R.L., Sordelli D.O. Attenuation and Persistence of and Ability to Induce Protective Immunity to a Staphylococcus aureus aroA Mutant in Mice Infect Immun. 2006. 74: 3498-3506.

36. Cabanes D., Dussurget O., Dehoux P., Cossart P. Auto, a surface associated autolysin of Listeria monocytogenes required for entry into eukaryotic cells and virulence. Mol Microbiol. 2004. 51: 1601-14.

37. Chamberlain L.M., Strugnell R., Dougan G., Hormaeche С. E., Demarco de Hormaeche R. Neisseria gonorrhoeae strain MS 11 harbouring a mutation in gene aroA is attenuated and immunogenic. Microb. Pathog. 1993. 15: 51-63.

38. Conte M.P., Longhi C., Polidoro M., Petrone G., Buonfiglio V., Santo S.D., Papi E., Seganti L., Visca P., Valenti P. Iron Availability Affects Entry of Listeria monocytogenes into the Enterocytelike Cell Line Caco-2, Inf. Imm. 1996. 64: 3925-3929.

39. Cossart P., Kocks C. The actin-based motility of the facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes. Molecular Microbiol. 1994. 13: 395402.

40. Cossart P., Sansonetti P.J. Bacterial invasion: the paradigms of enteroinvasive pathogens. Science. 2004. 5668: 242-248.

41. Cowart R. E., Foster B. G. Differential effects of iron on the growth of L. monocytogenes: minimum requirements and mechanism of acquisition. J. Infect. Dis. 1985. 151:721-730.

42. Cowart R. E., Foster B. G. The role of iron in the production of haemolysin by L. monocytogenes. Curr. Microbiol. 1981. 6: 287-290.

43. Crosa J. H. A plasmid associated with virulence in the marine fish pathogen Vibrio anguillarum specifies an ironsequestering system. Nature. 1980. 284: 566-568.

44. Czuprynski С.J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 2005. 6: 211-7.

45. Dubos R. J., Geiger J. W. Preparation and properties of shiga toxin and toxoid. J. Exp. Med. 1946. 84: 143-156.

46. Engel J.N., Pollack J., Perara E., Ganem D. Heat shock response of murine Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 1990. 172: 6959-6972.

47. Ermolaeva S., Novella S., Vega Y., Ripio M.T., Scortti M., Vazquez-Boland J.A. Negative control of Listeria monocytogenes virulence genes by a diffusible autorepressor. Mol Microbiol. 2004. 52: 601-611.

48. Ermolaeva S., Varfolomeeva N., Belyi Y., Tartakovskii I. Isolation and characterization of a Listeria monocytogenes mutant strain hyperproducing virulence factors. FEMS Microbiol Lett. 1997. 150: 189-195.

49. Farber J.M., Peterkin P.I. Listeria monocytogenes, a food-borne patyhogen. Microbiol. Rev 2005. 55: 476-511.

50. Fisher S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la difference! Mol. Microbiol. 1999. 32: 223-232.

51. Gaillot O., Pellegrini E., Bregenholt S., Nair S., Berche P. The ClpP serine protease is essential for the intracellular parasitism and virulence of Listeria monocytogenes. Mol Microbiol. 2000. 35: 1286-1294.

52. Gao H., Jiang X., Pogliano K., Aronson A.I. The El beta and E2 subunits of the Bacillus subtilis pyruvate dehydrogenase complex are involved in regulation of sporulation. J Bacteriol. 2002. 184: 2780-2788.

53. Garcia-del-Portillo F., Pucciarelli M. G., Casadesus J. DNA adenine methylase mutants of Salmonella typhimurium are deficient in protein secretion, cellinvasion and M cell cytotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. 96: 1158411588.

54. Gellin B.G., Broome C.V. Listeriosis. JAMA. 1989. 261: 1313-1320.

55. Gilbreth S.E., Benson A.K., Hutkins R.W. Catabolite repression and virulence gene expression in Listeria monocytogenes. Curr Microbiol. 2004. 49: 9598.

56. Glickman В., van den Elsen P. Radman M. Induced mutagenesis in dam2 mutants of Escherichia coli: a role for 6-methyladenine residues in mutation avoidance. Mol Gen Genet. 1978. 163: 307-312.

57. Goebel W., Krefit J. Cytolysins and the intracellular life of bacteria. Trends Microbiol. 1997. 5: 86-88.

58. Goossens P.L., Milon G., Cossart P., Saron M.F. Attenuated Listeria monocytogenes as a live vector for induction of CD8+ T cells in vivo: a study with the nucleoprotein of the lymphocytic choriomeningitis virus. Int Immunol. 1995. 7: 797-805.

59. Gottesman S., Maurizi M.R. Regulation by proteolysis: energy-dependent proteases and their targets. Microbiol Rev. 1992. 56: 592-621.

60. Gouin E., Mengaud J., Cossart P. The virulence gene cluster of Listeria monocytogenes is also present in Listeria ivanovii, an animal pathogen, and in Listeria seeligeri, a nonpathogenic species. Infect. Immun. 1994. 62: 3550-3553.

61. Guinand M., Vacheron M.J., Michel G., Tipper D.J. Location of peptidoglycan lytic enzymes in Bacillus sphaericus. J Bacteriol. 1979. 138: 126-132.

62. Guinn K.M., Hickey M.J., Mathur S.K., Zakel K.L., Grotzke J.E., Lewinsohn D.M., Smith S., Sherman D.R. Individual RD1-region genes are requiredfor export of ESAT-6/CFP-10 and for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Microb. 2004. 51: 359-370.

63. Hanawa Т., Yamamoto Т., Kamiya S. Listeria monocytogenes can grow in macrophages without the aid of proteins induced by environmental stresses. Infect Immun. 1995. 63: 4595-4599.

64. Heithoff D.M., Enioutina E.I., Daynes R.A., Sinsheimer R.L., Low D.A., Mahan M. J. Salmonella DNA adenine methylase mutants confer cross-protective immunity. Infect. Immun. 2001. 69: 6725-6730.

65. Heithoff, D., Sinsheimer R. L., Low D. A., Mahan M. J. An essential role for DNA adenine methylation in bacterial virulence. Science. 1999. 284: 967970.

66. Helms S. D., Oliver J. D., Travis J. C. Role of heme compounds and haptoglobin in Vibrio vulnificus pathogenicity. Infect. Immun. 1984. 45: 345-349.

67. Isono K., Isono S. Ribosomal protein modification in Escherichia coli. II. Studies of a mutant lacking the N-terminal acetylation of protein SI8. Mol Gen Genet. 1980. 177: 645-651.

68. Kazmierczak M.J., Mithoe S.C., Boor K.J., Wiedmann M. Listeria monocytogenes sigma В regulates stress response and virulence functions. J Bacteriol. 2003. 185: 5722-5734.

69. Kazmierczak M.J., Wiedmann M., Boor K.J. Contributions of Listeria monocytogenes sigmaB and PrfA to expression of virulence and stress response genes during extra- and intracellular growth. Microbiology. 2006. 152: 1827-1838.

70. Kim H., Boor K.J., Marquis H. Listeria monocytogenes sigmaB contributes to invasion of human intestinal epithelial cells. Infect Immun. 2004. 72: 7374-7378.

71. Kim H., Marquis H., Boor K.J. SigmaB contributes to Listeria monocytogenes invasion by controlling expression of inlA and inlB. Microbiology. 2005. 151: 3215-3222.

72. Kim J., Adhya S., Garges S. Allosteric changes in the camp receptor protein of Escherichia coli; hinge reorientation. Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 1992. 89: 9700-9704.

73. Klose K.E., Mekalanos J. J. Simultaneous prevention of glutamine synthesis and high-affinity transport attenuates Salmonella typhimurium virulence. Infect. Immun. 1997. 65: 587-596.

74. Kocks C., Gouin E., Tabouret M., Berche P., Ohayon H., Cossart P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 1992. 68: 521-531.

75. Korza H.J., Bochtler M. Pseudomonas aeruginosa LD-carboxypeptidase, a serine peptidase with a Ser-His-Glu triad and a nucleophilic elbow. J Biol Chem. 2005.280: 40802-40812.

76. Kreft J., Vazquez-Boland J.A. Regulation of virulence genes in Listeria. Int J Med Microbiol. 2001.291: 145-157.

77. Lasa I., David V., Gouin E., Marchand J.B., Cossart P. The amino-terminal part of ActA is critical for the actin-based motility of Listeria monocytogenes; the central proline-rich region acts as a stimulator. Mol. Microbiol. 1995. 18:425-436.

78. Laurent V., Loisel T.P., Harbeck В., Wehman A., Grobe L., Jockusch B.M., Wehland J., Gertler F.B., Carlier M.F. Role of proteins of the Ena/VASP family in actin-based motility of Listeria monocytogenes. J. Cell Biol. 1999. 144: 1245-1258.

79. Leimeister-Wachter M., Domann E., Chakraborty T. The expression of virulence genes in Listeria monocytogenes is thermoregulated. J Bacteriol. 1992. 174: 947-52.

80. Lenz L.L., Mohammadi S., Geissler A., Portnoy D.A. SecA2-dependent secretion of autolytic enzymes promotes Listeria monocytogenes pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 2003. 100: 12432-12437.

81. Lewis K.N., Liao R., Guinn K.M., Hickey M.J., Smith S., Behr M.A., Sherman D.R. Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis Mimics Bacille Calmette-Guerin Attenuation. JID. 2003. 187: 117-123.

82. Litwin C.M., Calderwood S.B. Role of Iron in Regulation of Virulence Genes. Clinical Microbiology Reviews. 1993. 6: 137-149.

83. Lodish H., Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudira P., Darnell J. Transport across cell membranes. In Molecular cell biology. Scientific American Books, New York, N.Y. 1995. 633-668.

84. Lucht J. M., Bremer E. Adaptation of Escherichia coli to high osmolarity environments: osmoregulation of the high-affinity glycine betaine transport system proU. FEMS Microbiol. Rev. 1994. 14: 3-20.

85. Machesky L.M., Atkinson S.J., Ampe C., Vandekerckhove J., Pollard T.D. Purification of a cortical complex containing two unconventional actins from Acanthamoeba by affinity chromatography on profilin-agarose. J Cell Biol. 1994. 127: 107-115.

86. Machesky L.M., Insall R.H. Scarl and the related Wiskott-Aldrich syndrome protein, WASP, regulate the actin cytoskeleton through the Arp2/3 complex. Cuit. Biol. 1998. 8: 1347-1356.

87. Magnusson I., Rothman D. L., Jucker В., Cline G. W., Shulman R. G., Shulman G. I. Liver glycogen turnover in fed and fasted humans. Am. J. Physiol. 1994. 266: E796-E803.

88. Mahairas G.G., Sabo P.J., Hickey M.J., Singh D.C., Stover C.K. Molecular Analysis of Genetic Differences between Mycobacterium bovis BCG and Virulent M. bovis. J.Bact. 1996. 178: 1274-1282.

89. Marquis H., Hager E. J. pH-regulated activation and release of a bacteria-associated phospholipase С during intracellular infection by Listeria monocytogenes. Mol Microbiol. 2000. 35: 289-98.

90. Massillon D., Bollen M., Wulf H. De, Overloop K., Vanstapel F., Van Hecke P., Stalmans W. Demonstration of a glycogen/glucose-1-phosphate cycle in hepatocytes from fasted rats. J. Biol. Chem. 1995. 270: 19351-19356.

91. Masuda N., Church G. M. Escherichia coli gene expression responsive to levels of the response regulator EvgA. J. Bacteriol. 2002. 184: 6225-6234.

92. May R.C., Caron E., Hall A., Machesky L.M. Involvement of the Arp2/3 complex in phagocytosis mediated by FcgammaR or CR3. Nat. Cell Biol. 2000. 2: 246-248.

93. Mead P.S., Slutsker L., Dietz V., McCaig L.F., Bresee J.S., Shapiro C., Griffin P.M., Tauxe R.V. Food-related illness and death in the Unites States. Emerg. Infect. Dis. 1999. 5: 607-625.

94. Mellors A., Sutherland D.R. Tools to cleave glycoproteins. Trends Biotechnol. 1994. 12: 15-8.

95. Mengaud J., Dramsi S., Gouin E., Vazquez-Bo land J.A., Milon G., Cossart P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Mol Microbiol. 1991. 9: 2273-2283.

96. Mickelsen P. A., Sparling P. F. Ability of Neisseria gonorrhoeae, Neissena meningitidis, and commensal Neissena species to obtain iron from transferrin and iron compounds. Infect. Immun. 1981. 33: 555-564.

97. Milenbachs A., Brown D. P., Moors M., Youngman P. Carbon-source regulation of virulence gene expression in Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol. 1997. 23: 1075-1085.

98. Milohanic E., Jonquieres R., Cossart P., Berche P., Gaillard J.L. The autolysin Ami contributes to the adhesion of Listeria monocytogenes to eukaryotic cells via its cell wall anchor. Mol Microbiol. 2001. 39: 1212-1224.

99. Morris T.W., Reed K.E., Cronan J.E. Jr. Lipoic acid metabolism in Escherichia coli: the IplA and lipB genes define redundant pathways for ligation of lipoyl groups to apoprotein. JBacteriol. 1995. 177: 1-10.

100. Neilands, J. B. Evolution of biological iron binding centers. Struct. Bond. 1972. 11: 145-170.

101. Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annu. Rev. Microbiol. 1982. 36: 285-309.

102. Neilands, J. B. Microbial iron compounds. Annu. Rev.Biochem. 1981. 50: 715-731.

103. Nyfelt A. Etiologie de la mononucleose infectieuse. C. R. Soc. Biol. 1929. 101: 590-591.

104. Offner F. F. Ion flow through membranes and the resting potential of cells. J. Membr. Biol. 1991. 123: 171-182.

105. Packer L., Witt E.H., Tritschler H.J. alpha-Lipoic acid as a biological antioxidant. Free Radic Biol Med. 1995. 19: 227-250.

106. Pappenheimer A. M., Jr., Johnson S. J. Studies in diphtheria toxin production. I. The effect of iron and copper. Br. J. Exp. Pathol. 1936. 17: 335-341.

107. Parish Т., Stoker N. G. The common aromatic amino acid biosynthesis pathway is essential in Mycobacterium tuberculosis. Microbiology. 2002. 148: 30693077.

108. Paterson Y., Maciag P.C. Listeria-based vaccines for cancer treatment. Curr Opin Mol Ther. 2005. 7: 454-460.

109. Perham R.N. Swinging arms and swinging domains in multifunctional enzymes: catalytic machines for multistep reactions. Annu Rev Biochem. 2000. 69: 961-1004.

110. Perry R. D., Brubaker R. R. Accumulation of iron by Yersiniae. J. Bacteriol. 1979. 137: 1290-1298.

111. Peters C., Domann E., Darbouche A., Chakraborty Т., Mielke M.E. Tailoring host immune responses to Listeria by manipulation of virulence genes the interface between innate and acquired immunity. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003.35:243-253.

112. Pilgrim S., Kolb-Maurer A., Gentschev I., Goebel W., Kuhn M. Deletion of the gene encoding p60 in Listeria monocytogenes leads to abnormal cell division and loss of actin-based motility. Infect Immun. 2003. 71: 3473-3484.

113. Pistor S., Chakraborty Т., Walter U., Wehland J. The bacterial actin nucleator protein ActA of Listeria monocytogenes contains multiple binding sites for host microfilament proteins. Curr. Biol. 1995. 5: 517-525.

114. Porankiewicz J., Wang J., Clarke A.K. New insights into the ATP-dependent Clp protease: Escherichia coli and beyond. Mol Microbiol. 1999. 32: 44958.

115. Portnoy D.A., Chakraborty Т., Goebel W., Cossart P. Molecular determinants of Listeria monocytogenes pathogenesis. Infect Immun. 1992. 60: 12637.

116. Premaratne R.J., Lin W.J., Johnson E.A. Development of an improved chemically defined minimal medium for Listeria monocytogenes. Appl Environ Microbiol. 1991. 57:3046-8.

117. Prieto A.I., Ramos-Morales F., Casadesus J. Bile-induced DNA damage in Salmonella enterica. Genetics. 2004. 168: 1787-1794.

118. Pucciarelli M.G., Prieto A.I., Casadesus J., Garcia-del-Portillo F. Envelope instability in DNA adenine methylase mutants of Salmonella enterica. Microb. 2002. 148: 1171-1182.

119. Pym A.S., Brodin P., Brosch R., Huerre M., Cole S.T. Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccines Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium microti. Mol. Microb. 2002. 46: 709-717.

120. Reed K.E, Cronan J.E. Jr. Lipoic acid metabolism in Escherichia coli: sequencing and functional characterization of the lipA and lipB genes. J Bacteriol. 1993. 175: 1325-1336.

121. Reglier-Poupet H., Frehel C., Dubail I., Beretti J.L., Berche P., Charbit A., Raynaud C. Maturation of lipoproteins by type II signal peptidase is required for phagosomal escape of Listeria monocytogenes. J Biol Chem. 2003. 278: 4946949477.

122. Reinhard M., Giehl K., Abel K., Haffner C., Jarchau Т., Hoppe V., Jockusch В. M., Walter and U. The proline-rich focal adhesion and microfilament protein VASP is a ligand for profilins. Embo J. 1995. 14: 1583-1589.

123. Renzoni A., Klarsfeld A., Dramsi S., Cossart P. Evidence that PrfA, the pleiotropic activator of virulence genes in Listeria monocytogenes, can be present but inactive. Infect Immun. 1997. 65: 1515-1518.

124. Ripio M.T., Brehm K., Lara M., Sua'rez M., Va'zquez-Boland J.A. Glucose-1-Phosphate Utilization by Listeria monocytogenes Is PrfA Dependent and Coordinately Expressed with Virulence Factors. Journal of Bacteriology. 1997. 179: 7174-7180.

125. Ritchie L.J., Hall R.M., Podger D.M. Mutant of Salmonella typhimurium LT2 deficient in DNA adenine methylation. J Bacteriol. 1986. 167: 420^122.

126. Romick T.L., Fleming H.P., McFeeters R.F. Aerobic and anaerobic metabolism of Listeria monocytogenes in defined glucose medium. Appl. Environ. Microbiol. 1996. 62: 304-307.

127. Rouquette C., Ripio M.T., Pellegrini E., Bolla J.M., Tascon R.I., Vazquez-Boland J.A., Berche P. Identification of a ClpC ATPase required for stress tolerance and in vivo survival of Listeria monocytogenes. Mol Microbiol. 1996. 21: 977-987.

128. Rozelle A.L., Machesky L.M., Yamamoto M., Driessens M.H., Insall R.H., Roth M.G., Luby-Phelps K., Marriott G., Hall A., Yin H.L.

129. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate induces actin-based movement of raft-enriched vesicles through WASP-Arp2/3. Curr. Biol. 2000., 10: 311-320.

130. Runyen-Janecky L. J., Reeves S.A., Gonzales E.G., Payne S.M. Contribution of the Shigella flexneri Sit, Iuc, and Feo iron acquisition systems to iron acquisition in vitro and in cultured cells. Infect. Immun. 2003. 71: 1919-1928.

131. Schuchat A., Swaminathan В., Broome C.V. Epidemiology of human listeriosis. Clin. Microbiol. Rev. 1991. 4: 169-183.

132. Seeliger H.P.R. Listeriosen. Springer-Verlag KG, 1958.

133. Sheehan В., Klarsfeld A., Msadek Т., Cossart P. Differential activation of virulence gene expression by PrfA, the Listeria monocytogenes virulence regulator. J Bacteriol. 1995. 177: 6469-76.

134. Sheehan В., Kocks C., Dramsi S., Gouin E., Klarsfeld A.D., Mengaud J., Cossart P. Molecular and Genetic Determinants of the Listeria monocytogenes infectious process. Current Topics in microbiology and immunology. 1994. 192: 187216.

135. Skoble J., Portnoy D.A., Welch M.D. Three regions within ActA promote Arp2/3 complex-mediated actin nucleation and Listeria monocytogenes motility. J. Cell Biol. 2000. 150: 527-538.

136. Smith R.L., Maguire M.E. Microbial magnesium transport: unusual transporters searching for identity. Mol. Microbiol. 1998. 28: 217-226.

137. Stritzker J., Janda J., Schoen C., Taupp M., Pilgrim S., Gentschev I., Schreier P., Geginat G., Goebel W. Growth, virulence, and immunogenicity of Listeria monocytogenes aro mutants. Infect. Immun. 2004. 72: 5622-5629.

138. Stull T. L. Protein sources of heme for Haemophilus influenzae. Infect. Immun. 1987. 55: 148-153.

139. Taylor V.L., Titball R.W., Oyston P.C.F. Oral immunization with a dam mutant of Yersinia pseudotuberculosis protects against plague. Microbiology. 2005. 151: 1919-1926.

140. Templin M.F., Ursinus A., Holtje J.V. A defect in cell wall recycling triggers autolysis during the stationary growth phase of Escherichia coli. EMBO J. 1999. 18:4108-4117.

141. Tullius M.V., Harth G., Horwitz M. A. Glutamine synthetase GlnAl is essential for growth of Mycobacterium tuberculosis in human THP-1 macrophages and guinea pigs. Infect. Immun. 2003. 71: 3927-3936.

142. Ursinus A., Steinhaus H., Holtje J.V. Purification of a nocardicin A-sensitive LD-carboxypeptidase from Escherichia coli by affinity chromatography. J Bacteriol. 1992. 174: 441-446.

143. Van Heyningen W. E., Gladstone G. P. The neurotoxin of Shigella shigae. 3. The effect of iron on production of the toxin. Br. J. Exp. Pathol. 1953. 34: 221-229.

144. Vazquez-Boland J.A, Kocks C., Dramsi S., Ohayon H., Geoffroy C., Mengaud J., Cossart P. Nucleotide sequence of the lecithinase operon of Listeria monocytogenes and possible role of lecithinase in cell-to-cell spread. Infect Immun. 1992. 60:219-230.

145. Vazquez-Boland J.A., Dominguez-Bernal G., Gonzalez-Zorn В., Krefl J., Goebel W. Pathogenicity islands and virulence evolution in Listeria. Microb. Inf. 2001. 3: 571-584.

146. Vazquez-Boland J.A., Kuhn M., Berche P., Chakraborty Т., Dominguez-Bernal G., Goebel W., Gonzalez-Zorn В., Wehland J., Kreft J. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clin. Microbiol. Rev. 2001. 14: 584-640.

147. Vijh S., Pamer E.G. Immunodominant and subdominant CTL responses to Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 1997, 158: 3366-71.

148. Villar-Palasf C., Guinovart J.J. The role of glucose 6-phosphate in the control of glycogen synthase. FASEB J. 1997. 11: 544-58.

149. Walker J.C., Verma N.K. Cloning and characterization of the aroA and aroD genes of Shigella dysenteriae type 1. Microbiol. Immunol. 1997. 41: 809-813.

150. Welch M.D., Iwamatsu A., Mitchison T.J. Actin polymerization is induced by Arp2/3 protein complex at the surface of Listeria monocytogenes. Nature. 1997. 385: 265-269.

151. Welch M.D., Rosenblatt J., Skoble J., Portnoy D.A., Mitchison and T.J. Interaction of human Arp2/3 complex and the Listeria monocytogenes ActA protein in actin filament nucleation. Science. 1998. 281: 105-108.

152. Wesley I.V. Listeriosis in animals, p.39-73. In: E.T.Ryser and E.H. Marth (ed.) Listeria, listeriosis and food safety. 2nd ed. 1999. Marcel Dekker Inc. New York, NY.

153. White-Ziegler C.A., Black A.M., Eliades S.H., Young S., Porter K. The N-acetyltransferase RimJ responds to environmental stimuli to repress pap fimbrial transcription in Escherichia coli. J Bacteriol. 2002. 184: 4334-4342.

154. White-Ziegler C.A., Low D.A. Thermoregulation of the pap operon: evidence for the involvement of RimJ, the N-terminal acetylase of ribosomal protein S5. J Bacteriol. 1992. 174: 7003-7012.

155. Wiedmann M., Bruce J.L., Keating C., Johnson A.E., McDonough P.L., Batt C.A. Ribotypes and virulence gene polymorphisms suggest three distinct Listeriamonocytogenes lineages with differences in pathogenic potential. Infect. Immun. 1997. 65:2707-2716.

156. Yoshikawa A., Isono S., Sheback A., Isono K. Cloning and nucleotide sequencing of the genes riml and rimJ which encode enzymes acetylating ribosomal proteins S18 and S5 of Escherichia coli K12. Mol Gen Genet. 1987. 209: 481-488.

157. Zalevsky J., Grigorova I.I., Mullins R.D. Activation of the Arp2/3 complex by the Listeria ActA protein: ActA binds two actin monomers and three subunits of the Arp2/3 complex. J. Biol. Chem. 2001. 276: 3468-3475.