Получение и характеристика линий мягкой пшеницы с единичными транслокациями от Triticum timopheevii Zhuk. с использованием молекулярно-генетических методов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Тимонова, Екатерина Михайловна

• Тимонова, Екатерина Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Тимонова, Екатерина Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Использование в селекции диких и культурных сородичей пшеницы в качестве доноров генов устойчивости к патогенам злаков.

1.1.1. Особенности вовлечения родственных видов пшеницы в селекционный процесс.

1.1.2. Примеры использования межвидовой гибридизации в селекции на устойчивость к болезням.

1.2. Краткое описание Т. Нторкееуи, ее сородичей и примеры использования пшениц группы Т1торЬееу1 в селекционных работах.

1.3. Коллекция гибридных линий, созданная в ИЦиГ СО РАН.

1.4. Генетические основы устойчивости к фитопатогенам.

1.4.1. Расоспецифическая, вертикальная устойчивость.

1.4.2. Расонеспецифическая, горизонтальная устойчивость.

1.4.3. Влияние генетического окружения на эффективность генов устойчивости.

1.4.4. Супрессия генов устойчивости.

1.5. Характеристика /?-генов устойчивости.

1.5.1. Классификация 7?-генов устойчивости и типы их взаимодействий с патогенами.

1.5.2. Геномная архитектура Я-генов устойчивости.

1.5.3 Полиморфизм Я-генов устойчивости.

1.6. Маркер-ориентированный отбор/селекция (отбор/селекция с помощью молекулярных маркеров).

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Растительный материал.

2.2. Выделение ДНК из растительного материала.

2.3. Микросателлитный анализ.

2.4. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH).

2.5. С-окрашивание хромосом злаков.

2.6. Оценка устойчивости к бурой ржавчине.

2.6.1. Оценка устойчивости к бурой ржавчине на стадии проростков.

2.6.2. Оценка устойчивости к бурой ржавчине на стадии взрослых растений

2.7. Анализ количественных признаков.

2.8. Статистический анализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1.1. Создание интрогрессивных линий с помощью SSR-маркеров.

3.1.2. Оценка протяженности интрогрессивных фрагментов Т. timopheevii у полученных линий мягкой пшеницы.

3.2. Цитологический анализ интрогрессивных линий.

3.2.1. Использование метода FISH для анализа интрогрессивных линий.

3.2.2. Использование метода С-окрашивания для анализа интрогрессивных линий.

3.3. Оценка выбранных линий BC3F3 популяции на устойчивость к бурой ржавчине.

3.3.1. Тест на проростках.

3.3.2. Оценка устойчивости к бурой ржавчине на стадии взрослых растений в полевых условиях.

3.4. Характеристика интрогрессивных линий по количественным признакам

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Использование MAS при создании интрогрессивных линий пшеницы.

4.2. Определение хромосомной локализации и размера интрогрессивных фрагментов в созданных линиях.

4.3. Линии пшеницы, содержащие единичные интрогрессивные фрагменты или их комбинации от Т. іїторкееуіі, как источник новых генов, контролирующих хозяйственно-ценные признаки.

4.4. Влияние транслокаций от Т. timopheevii на количественные признаки интрогрессивных линий мягкой пшеницы.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и характеристика линий мягкой пшеницы с единичными транслокациями от Triticum timopheevii Zhuk. с использованием молекулярно-генетических методов»

Актуальность проблемы. Генетическая эрозия, вызванная современными методами культивирования растений, привела к сужению разнообразия мягкой пшеницы Triticum aestivum L. по генам, контролирующим хозяйственно-ценные признаки, в том числе по генам устойчивости к болезням (Fiebe et al. 1996). Для увеличения генетического разнообразия и в качестве источников эффективных генов устойчивости используются сородичи пшеницы — дикие и культурные виды злаков (Friebe et al. 1996, Гончаров 2002). Одним из таких видов является Т. timopheevii Zhuk. (2п=28, геномная формула GGAlAl), обладающий комплексным иммунитетом к желтой, бурой и стеблевой ржавчинам, мучнистой росе, пыльной и твердой головне, фузариозу, гессенской и шведской мухам, клопу-черепашке, зеленоглазке и пьявице (Дорофееев и др. 1979). Вид Т. timopheevii недостаточно использовался в селекционных работах и потенциал этого вида как источника эффективных генов устойчивости еще далеко не исчерпан к настоящему моменту (Broun-Guedira et al. 1996, Будашкина и др. 1988). Однако Т. timopheevii имеет ряд отрицательных качеств, делающих его неудобным для непосредственного использования в селекции. Такими признаками являются пленчатость зерна, ломкость колоса, позднеспелость и полная или реже частичная стерильность F] гибридов от скрещивания с мягкой пшеницей (Дорофеев и др. 1979, Жуковский 1964). Поэтому одной из возможностей использования ценных свойств и генов этого вида является вовлечение в селекционный процесс интрогрессивных линий мягкой пшеницы, полученных путем беккроссирования на второго (рекуррентного) родителя (Friebe at al. 1996, Liu et al. 2006, Qi et al. 2007, Pestsova et al. 2001). Поиск новых и эффективных генов, контролирующих устойчивость к заболеваниям, подбор доноров для селекционных программ и создание новых улучшенных генотипов пшеницы являются неизменно актуальными задачами, направленными на расширение генетического разнообразия сельскохозяйственных культур.

Одним из наиболее распространенных и вредоносных заболеваний пшеницы является бурая ржавчина, вызываемая базидиальным грибом Puccinia triticina Eriks. При развитии сильной эпифитотии потери урожая зерна в результате поражения растений могут достигать 40-50% (Маркелова 2011, Roelfs et al. 1992). Наиболее эффективным способом борьбы является создание и культивирование сортов и линий пшеницы, обладающих устойчивостью к бурой ржавчине. Однако появляющиеся в результате эволюционных процессов новые расы ржавчинных грибов способны быстро преодолевать устойчивость возделываемых сортов, а также приобретать невосприимчивость к применяемым пестицидам. Помимо этого, часто новые сорта, созданные на основе одинаковых генов устойчивости, рекомендуют для выращивания во многих регионах, что может приводить к быстрому накоплению вирулентных рас патогенов и последующему их массовому распространению. Лишь немногие из интенсивно используемых генов устойчивости к бурой ржавчине (Zr-генов) способны на сегодняшний день обеспечить длительную устойчивость (durable resistance) (Kou, Wang 2010, Qi et al. 1999, Singh et al. 2005).

Ранее в ИЦиГ СО РАН была создана коллекция гибридных линий мягкой пшеницы устойчивых к бурой ржавчине, полученная на основе скрещивания T. aestivum с T. timopheevii (Будашкина и др. 1988). И.Н. Леоновой с соавторами (2008) было показано на двух сестринских линиях, что устойчивость к бурой ржавчине детерминируется тремя локусами QLr.icg-lA, QLr.icg-2A и QLr.icg-5B, картированных на хромосомах 1А, 2А и 5В, соответственно. Созданные гибридные линии содержали множественные участки интрогрессии от Т. timopheevii, что негативно влияло на формирование количественных признаков и не позволяло оценить вклад отдельных локусов в формирование признака устойчивости. Тогда как, линии, которые содержали бы только «целевые» локусы в составе единичных участков интрогрессии, могут непосредственно использоваться в селекционном процессе в качестве доноров признаков.

Создание и изучение линий мягкой пшеницы несущих в составе генома только «целевой» ген (почти изогенные линии), или фрагмент хромосомы дикого или культурного родственного вида преследует несколько целей. В первую очередь это оценка вклада гена (или интрогрессивного фрагмента) в формирование признаков (Салина и др. 2008, Uhrin et al. 2010). Помимо этого, линии, содержащие только «целевой» ген (или чужеродныйфрагмент хромосомы) от генотипа-донора, могут использоваться в качестве моделей для картирования генов, изучения их структуры и экспрессии, а также в качестве источника новых генов в селекционном процессе.

Процесс создания интрогрессивных линий с небольшим количеством чужеродного материала в геноме традиционными методами очень трудоемок и может занять продолжительное время. Применение молекулярных маркеров в селекционном процессе снижает временные затраты на 50-70% (Kuchel et al. 2005, Kolmer et al. 2007, Collard, Mackill 2008). Разработка методических подходов и оптимальных схем создания новых генотипов пшеницы, которые могут служить исходным материалом для создания сортов, с использованием молекулярных маркеров, является актуальной проблемой, над которой работают во всем мире (Frish et al. 1999а, 1999b, Randhawa et al. 2009).

Отбор нужных генотипов растений в беккроссных поколениях с помощью молекулярных маркеров (marker assisted backcrossing, МАВ) является одним из новых подходов, который в настоящее время используется для ускорения процессов интрогрессии «целевых» генов и создания почти изогенных линий (Collard, Mackill 2008). Использование молекулярных маркеров позволяет также контролировать элиминацию генетического материала донора и отбирать генотипы с минимальным возможным размером интрогрессивного фрагмента, снижая тем самым вероятность сцепления «целевых» локусов с чужеродными генами, негативно влияющими на формирования хозяйственно-ценных признаков. Кроме того, использование молекулярных маркеров позволяет успешно проводить отбор по генам, фенотипическое проявление которых зависит от условий внешней среды или трудно различимо.

Основная цель нашей работы - это создание интрогрессивных линий мягкой пшеницы с использованием молекулярно-генетических методов и изучение влияния отдельных участков хромосом ТгШсит Иторкевуп ЪЪик. на формирование устойчивости к бурой ржавчине и количественные признаки мягкой пшеницы.

Задачи данного исследования:

1) Создание линий мягкой пшеницы с единичными интрогрессивными фрагментами от Т. иторкееуп или их комбинациями путем контролирования процессов беккроссирования микросателлитными (88Я) маркерами.

2) Молекулярно-цитологический анализ интрогрессивных линий мягкой пшеницы. Определение хромосомной локализации и размера интрогрессированных фрагментов в созданных линиях.

3) Оценка интрогрессивных линий мягкой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине.

4) Оценка влияния различных фрагментов интрогрессии Т. {¿торкееуН и их комбинаций на хозяйственно-ценные признаки мягкой пшеницы.

Научная новизна работы. В результате проведенной работы нами впервые с применением отбора с помощью молекулярных маркеров были получены линии мягкой пшеницы, несущие единичные транслокации от Т. 1шорНееуИ. Впервые показано, что локус 0Ьглс£-5В, перенесенный в геном мягкой пшеницы от Т. (¿торИевуЦ, обеспечивает устойчивость линий мягкой пшеницы к бурой ржавчине на всех стадиях развития растения. Продемонстрирована эффективность комплексного подхода при использовании молекулярных 88Я-маркеров и цитологических методов для анализа форм мягкой пшеницы, полученных с участием материала Т. ИторкееуП.

Практическая ценность работы. В результате данного исследования получено 5 цитологически стабильных линий мягкой пшеницы с единичными транслокациями от Т. Нторкееуп, обладающих устойчивостью к бурой ржавчине, которые могут быть использованы в селекции в качестве доноров устойчивости. В ходе данной работы был отработан метод маркер-вспомогательного отбора, использование которого позволяет значительно сокращать время получения новых улучшенных генотипов пшеницы. Были отобраны молекулярные маркеры, позволяющие эффективно маркировать локусы, контролирующие признак устойчивости к бурой ржавчине QLrлcg-1А, QLr.icg-2A и

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1) Локус QLr.icg-5B, перенесенный в геном мягкой пшеницы от Т. ИторкееуЦ, обеспечивает устойчивость линий мягкой пшеницы к бурой ржавчине, характерной для Западной Сибири, на всех стадиях развития растения.

2) Комбинация минорных локусов устойчивости к бурой ржавчине ()Ьг. А и QLr.icg-lA у интрогрессивных линий мягкой пшеницы сдерживает развитие болезни на стадии взрослых растений и не приводит к развитию гиперчувствительного ответа.

Личный вклад автора. Основная часть экспериментальной работы и анализ полученных результатов выполнена автором самостоятельно. Данные по устойчивости на стадии проростков предоставлены сотрудниками ГНУ СибНИИРС Россельхозакадемии Сочаловой Л.А. и Христовым Ю.А. Данные по количественным признакам у интрогрессивных линий в Омской области 2009-2010 гг. (поле 1) предоставлены сотрудниками ГНУ СибНИИСХ Россельхозакадемии Беланом И.А. и Россеевой Л.П. Данные по микросателлитным маркерам, уточняющие границы интрогрессивных фрагментов, предоставлены Леоновой И.Н.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 12 международных и российских конференциях, среди которых 1-ая международная школа-конференция молодых учёных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (2008, Москва-Звенигород), 5-ый съезд ВОГиС (2009, Москва), международная конференция «Генетика, геномика и биотехнология растений» (2010, Новосибирск), международная конференция «Green plant breeding technologies» (2010, Vienna, Austria), международная конференция «Генетические ресурсы и геномика пшеницы» (2011, Новосибирск), 20th ITMI/2ndWGC Joint Workshop (2011, Beijing, China) и другие, а также обсуждались на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН (2008, 2011).

Публикации. По результатам исследования опубликовано 17 работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных изданиях, получен патент «Способ создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой листовой ржавчине», номер 2407283 RU, от 27 июля 2010.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 15 рисунков. Библиографический указатель содержит 282 источника.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Тимонова, Екатерина Михайловна

выводы

1) Получено 38 линий мягкой пшеницы с единичными транслокациями хромосом 2G, 5G, 6G от Т. timopheevii и 72 линии, содержащие комбинации двух интрогрессивных фрагментов хромосом 1А1, 2A1, 3G, 2G, 5G, 6G в различных сочетаниях.

2) Выявлено, что в процессе беккроссирования происходит значительное уменьшение длины интрогрессивных фрагментов 1А1, 2А1, 2GS, 6G (30% и более), тогда как размер фрагментов 2GL и 5GL остается практически неизменным (сокращение длины на 5% и менее).

3) Установлено, что цитологические методы (С-окрашивание, in situ гибридизация) позволяют более эффективно выявлять терминальные транслокации, делеции и транслокации, затрагивающие хромосомы D генома по сравнению с SSR-анализом у интрогрессивных линий Т. aestivum-T. timopheevii

4) Впервые показано, что интрогрессивные линии мягкой пшеницы, несущие только главный локус QLr.icg-5B, являются устойчивыми к бурой ржавчине на стадии проростков и взрослых растений. Линии, в геноме которых присутствует комбинация из минорных локусов QLr. icg-2A и QLr.icg-lA, являются среднечувствительными. Показано, что присутствие в геноме только минорных локусов QLr.icg-2A и QLr.icg-lA оказывает сдерживающий эффект на развитие болезни и не приводит к развитию гиперчувствительного ответа.

5) Не выявлено негативного влияния интрогрессивных фрагментов 1А1, 2AlL, 2GS, 2GL, 5GL, 6G от Т. timopheevii на количественные признаки линий мягкой пшеницы. Показан положительный эффект для транслокации 2DS.2GL на снижение высоты у растений и на признаки, определяющие озерненность колоса.

Список публикаций по теме работы Статьи;

1) Тимонова Е.М., Леонова И.Н., Белан И.А., Россеева Л.П., Салина Е.А. Влияние отдельных участков хромосом Т. timopheevii на формирование устойчивости к болезням и количественные признаки мягкой пшеницы // Вестник ВОГиС. 2012. Т.16 (1), С.142-159

2) Timonova Е.М., Leonova I.N., Röder M.S., Salina Е.А. Marker-assisted development and characterization of a set of Triticum aestivum lines carrying different introgressions from T. timopheevii genome // Molecular breeding. 2012. DOI: 10.1007/sl 1032-012-9776-x, published online 5 September

3) Адонина И.Г., Петраш H.B., Тимонова E.M., Христов Ю.А., Салина Е.А. Создание и изучение устойчивых к листовой ржавчине линий мягкой пшеницы с транслокациями от Aegilops speltoides Tausch // Генетика. 2012. Т. 48(4), С. 488-494

4) Салина Е.А., Егорова Е.М., Адонина И.Г., Добровольская О.Б., Будашкина Е.Б., Леонова И.Н. ДНК-маркеры для генотипирования линий мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) с генетическим материалом Aegilops speltoides Tausch и Triticum timopheevii Zhuk. // Вестник ВОГиС. (2008), Т. 12 (4), С.620-628

Патент:

1) Пат. 2407283 RU, МПК А 01 Н 1/104. Способ создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой ржавчине / Салина Е.А., Леонова H.H., Будашкина Е.Б., Егорова Е.М. - Опубл. 27.12.2010. - Бюл. № 36. Тезисы конференций: 1) Егорова Е.М., Леонова И.Н., Салина Е.А., Получение интрогресивных линий мягкой пшеницы, содержащих различные фрагменты А1 и G геномов тетраплоидной пшеницы Т. timopheevii / Материалы всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск (2007), 16-19 сентября, С. 82-84.

2) Леонова И.Н., Егорова Е.М., Будашкина Е.Б., Салина Е.А., Использование методов «молекулярной» селекции для получения устойчивых к листовой ржавчине линий мягкой пшеницы, содержащих интрогрессии от Triticum timopheevii. / Материалы второй всероссийской конференции «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам», Санкт-Петербург

2008), 29 сентября - 2 октября, С. 153-156.

3) Егорова Е.М., Леонова И.Н., Будашкина Е.Б., Салина Е.А., Получение и анализ линий мягкой пшеницы, содержащих единичные интрогрессивные фрагменты от Triticum timopheevii / V Международная научная конференция «Факторы экспериментальной эволюции организмов», г. Алушта, Украина

2009), 21-25 сентября, Т. 6 С. 298-303

4) Егорова Е.М., Леонова И.Н., Салина Е.А., Будашкина Е.Б., Использование молекулярно-генетических подходов для получения и характеристики линий Triticum aestivum содержащих единичные участки интрогресий от Triticum timopheevii / Международная научная школа-конференция "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях", Звенигород (2008), 7-12 декабря, С. 29.

5) Егорова Е.М., Леонова И.Н., Будашкина Е.Б., Салина Е.А., Анализ интрогрессивных линий мягкой пшеницы, содержащих генетический материал Triticum timopheevii, полученных с использованием методов молекулярной селекции / Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, V съезд Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров, Москва (2009), 21-28 июня, Ч. 1, С. 224.

6) Salina Е.А., Leonova I.N., Egorova Е.М., Budashkina E.B., Roder M., Biotechnology for development of resistant wheat genotypes / Proc. of the German-Russian forum Biotechnology GRFB'09, Novosibirsk (2009), 15 - 19 June, P.43.

7) Egorova E.M., Leonova I.N., Budashkina E.B., Salina E.A. Development and characterization of Triticum aestivum x T.timopheevii near-isogenic introgression

8) Egorova E.M., Leonova I.N., Budashkina E.B., Salina E.A. The application of microsatellite markers for development of leaf rust resistant near isogenic lines carriing QLr.icg-5B loci / Proc. of International Conference "Green Plant Breeding Technologies", Vienna, Austria (2010), Feb 2-5, P. 46.

9) Salina E.A., Leonova I.N., Egorova E.M., Budashkina E.B., Roder M.S. Development and application of Triticum timopheevii mapping data in wheat resistance management strategies / Proc. of 8th International Wheat Conference, St.Petersburg (2010), June 1-4, P. 468- 469.

10) Egorova E„ Leonova I., Budashkina E., Salina E. Application of marker assisted selection for transferring resistance genes from Triticum timopheevii to bread wheat / Proc. 20th ITMI/2ndWGC Joint Workshop, Beijing, China (2010), September 1-5, P. 78.

11) Salina E., Dobrovolskaya O., Timonova E„ Silkova O., Leonova I., Sourdille P., Feuillet C., Development of molecular and genetic stocks for a physical map of 5B chromosome of common wheat / Proc. of the international Conference "Wheat genetic resources and genomics", Novosibirsk (2011), August 28-31, p.72

12) Leonova I.N., Timonova E.M., Budashkina E.B., Kalinina N.P., Salina E.A., Development and utilization of leaf rust resistance lines with multiple and single introgressions of the T. timopheevii genome / Proc. of international Conference "Wheat genetic resources and genomics", Novosibirsk (2011), August 28-31, p. 35