Получение и исследование генно-инженерного нейротоксина II и его мутантных форм тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Люкманова, Екатерина Назымовна

• Люкманова, Екатерина Назымовна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Люкманова, Екатерина Назымовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ТОКСИНОВ - ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНЫХ ИНГИБИТОРОВ НИКОТИНОВОГО АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА.

1.1. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор.

1.2. Механизм активации канала.

1.3. Структура никотинового ацетилхолинового рецептора.

1.4. Конотоксины.

1.5. Нейротоксины из яда змей.

1.6. Взаимодействие нейротоксинов с никотиновым ацетилхолиновым рецептором.

Глава 2. ПОЛУЧЕНИЕ а-НЕЙРОТОКСИНОВ IN VITRO.

2.1. Введение.

2.2. Экспрессия эукариотических полипептидов в Е. coli.

2.3. Прямая экспрессия генов нейротоксинов в E.coli.

2.4. Продукция нейротоксинов в виде гибридов с другими белками в E.coli.

2.5. Секреция нейротоксинов в E.coli.

2.6. Твердофазный химический синтез.

ЧАСТЬ И. ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Материалы.

3.1.1. Реактивы и ферментные препараты.

3.1.2. Штаммы.

3.1.3. Плазмидные вектора.

3.1.4. Питательные среды для роста бактериальных культур.

3.1.5. Синтетические олигонуклеотиды.

3.2. Методы.

3.2.1. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

3.2.1.1. Приготовление компетентных клеток.

3.2.1.2. Трансформация плазмидной ДНК.

3.2.2. Выделение плазмидной ДНК.

3.2.3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле.

3.2.4. Количественные определения препаратов ДНК и примесей РНК.

3.2.5. Выделение ДНК из агарозного геля.

3.2.6. Олигонуклеотид-направленный мутагенез.

3.2.7. Полимеразная цепная реакция.

3.2.8. Экспрессия гена нейротоксина II в виде слитной полипептидной цепи с геном тиоредоксина.

3.2.9. Анализ локализации гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин И в клетках

Е. coli.

3.2.10. Выделение и очистка гибридного белка.

3.2.11. Выделение и очистка рекомбинантного нейротоксина II.

3.2.12. Экспрессия гена нейротоксина II в секретирующей конструкции.

3.2.13. Анализ локализации секретируемых нейротоксинов в клетках Е. coli.

3.2.14. Выделение и очистка секретируемых нейротоксинов.

3.2.15. Аналитические методы.

3.2.15.1. Электрофоретический анализ белков в SDS-ПААГ.

3.2.15.2. Количественный анализ белковых препаратов.

3.2.15.3. Определение //-концевой последовательности полипептидов.

3.2.15.4. Масс-спектрометрический анализ белковых препаратов.

3.2.16. Методы структурных исследований.

3.2.16.1. Спектры 'Н-ЯМР.

3.2.16.2. Получение двумерных и трехмерных гетроядерных ЯМР-спектров.

3.2.17. Методы биологических исследований.

3.2.17.1. Анализ взаимодействия гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II с никотиновым ацетилхолиновым рецептором из Torpedo californica.

3.2.17.2. Определение токсичности рекомбинантных токсинов.

3.2.17.3. Определение константы ингибирования нейрональных нАХР рекомбинантным нейротоксином II и мутантными нейротоксинами.

3.2.18. Построение молекулярных моделей.

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

4.1. Конструирование гена нейротоксина II.

4.2. Конструирование гена тиоредоксина.

4.3. Экспрессирующие вектора и биосинтез рекомбинантных токсинов в прокариотической системе (Е. colí).

4.3.1.1. Сборка экспрессирующей конструкции для наработки слитного белка тиоредоксин-нейротоксин II.

4.3.1.2. Биосинтез нейротоксина II в составе слитного белка с тиоредоксином.

4.3.1.3. Выделение и очистка гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II.

4.3.1.4. ЯМР-спектроскопия гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II.

4.3.1.5. Биологические свойства гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II.

4.3.1.6. Выделение и очистка рекомбинантного нейротоксина II.

4.3.1.7. Анализ рекомбинантного нейротоксина II.

4.3.2.1. Экспрессирующая конструкция для секреции рекомбинантного нейротоксина II.

4.3.2.2. Секреция рекомбинантного нейротоксина II.

4.3.2.3. Выделение и очистка рекомбинантного нейротоксина II.

4.3.2.4. Анализ рекомбинантного нейротоксина II.

4.3.2.5. ЯМР-анализ рекомбинантного нейротоксина II.

4.3.2.6. Анализ токсичности рекомбинантного нейротоксина II.

4.3.3.1. Биосинтез изотопно-меченых вариантов нейротоксина II.

4.3.3.2. Выделение и очистка изотопно-меченых вариантов нейротоксина II.

4.3.3.3. ЯМР-анализ чистоты и степени мечения препаратов изотопно-меченых вариантов нейротоксина II.

4.3.3.4. Отнесение ЯМР спектров.

4.3.3.5. Исследование взаимодействия нейротоксина II с липидными бицеллами (анизотропной средой, моделирующей биологическую мембрану).

4.3.4.1. Конструирование мутантных вариантов нейротоксина II.

4.3.4.2. Получение генов мутантных вариантов нейротоксина II mutl и mutll.

4.3.4.3. Биосинтез мутантных вариантов нейротоксина II Mutl и Mutll.

4.3.4.4. Выделение и очистка мутантных вариантов нейротоксина II Mutl и Mutll.

4.3.4.5. Анализ рекомбинантных белков Mutl и Mutll.

4.3.4.6. ЯМР-анализ рекомбинантных белков Mutl и Mutll.

4.3.4.7. Анализ биологической активности рекомбинантных белков Mutl и Mutll.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и исследование генно-инженерного нейротоксина II и его мутантных форм»

Актуальность темы. а-Нейротоксины - наиболее сильнодействующие компоненты яда змей семейства Elapidae, к которому относятся и кобры /1 / . Эти токсины являются высокоспецифичными конкурентными ингибиторами никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР), который представляет собой лиганд-зависимый ионный канал, встроенный в постсинаптическую мембрану нейронов /2/. Высокая специфичность связывания, небольшие размеры и жесткая структура нейротоксинов делают их удобным инструментом для изучения свойств нАХР. Кроме того, наличие большого числа гомологичных аминокислотных последовательностей а-нейротоксинов делает возможным анализ структурно-функциональных взаимосвязей в их молекулах.

Существует два типа а-нейротоксинов: короткие (4 дисульфидных связи, 60-62 а.о.) и длинные (5 дисульфидных связей, 66-75 а.о.). Причем, только длинные а-нейротоксины эффективно связываются с нАХР нейронального типа, которые расположены в нейронах нервной системы, в то время как с нАХР мускульного типа, локализованными в нервно-мышечных соединениях, эффективно взаимодействуют а-нейротоксины обоих типов. Это различие объясняется разным строением центральной петли коротких и длинных а-нейротоксинов /3/. Нейротоксин II из яда кобры Naja oxiana принадлежит семейству коротких а-нейротоксинов /4/ и является высокоспецифичным конкурентным ингибитором мускульного нАХР. Получение и исследование различных мутантных вариантов нейротоксина II позволит не только понять принципиальные различия между короткими и длинными нейротоксинами, но и выявить механизмы, лежащие в основе взаимодействия молекул нейротоксинов с нАХР.

Данные о структуре и свойствах а-нейротоксинов, понимание механизмов их действия на молекулярном уровне важны не только с точки 5 i 1

• зрения фундаментальной науки, но и для разработки новых биомедицинских препаратов для лечения ряда заболеваний нервной системы, обусловленных дисфункцией тех или иных нАХР, таких как, аутизм /5/, эпилепсия /6/, депрессия, никотиновая /7/ и алкогольная зависимости /8,9/, болезнь Альцгеймера /10/, паркинсонизм /11,12/, мышечная дистрофия /13/.

Цель исследования. Целью настоящей диссертационной работы являлось конструирование, получение и исследование физико-химических и биологических свойств генно-инженерного нейротоксина II и его мутантных вариантов.

Основные задачи исследования.

1. Получить ген нейротоксина II, а также вектора для экспрессии в прокариотической системе (Escherichia coli), и разработать эффективную схему биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантного нейротоксина. Наработать генно-инженерный нейротоксин II в необходимых для исследований количествах.

2. Изучить физико-химические и биологические свойства нейротоксина II.

3. Осуществить теоретический дизайн мутантных вариантов нейротоксина II из яда кобры Naja oxiana.

4. Получить гены мутантных вариантов нейротоксина II. Наработать мутантные варианты нейротоксина II в необходимых для исследований количествах.

5. Исследовать физико-химические и биологические свойства полученных рекомбинантных нейротоксинов и выявить роли конкретных аминокислотных остатков в распознавании мускульного и нейрональных нАХР различных подтипов (а7, a3ß2).

Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.

1. Разработаны высокопродуктивные экспрессионные системы, позволяющие получать нейротоксины, белки со значительным содержанием дисульфидных связей, в препаративных количествах.

2. Впервые проведено генно-инженерное конструирование химерного нейротоксина с заданной специфичностью.

3. Впервые получен ,3С-15М-меченый нейротоксин, и проведено полное отнесение его ЯМР сигналов.

4. Впервые изучено взаимодействие коротких а-нейротоксинов с окружением, моделирующим липидный бислой.

5. Исследованы биологические свойства рекомбинантных белков. Показано, что гибридный белок тиоредоксин-нейротоксин II обладает активностью по отношению к нАХР мускульного типа, сопоставимой с активностью природного нейротоксина II. Рекомбинантный нейротоксин II практически полностью воспроизводит активность природного токсина. Полученные генно-инженерным путем мутантные варианты нейротоксина II с модифицированной центральной петлей, соответствующей петле нейротоксина I с некоторыми заменами, обладают способностью взаимодействовать с нейрональными нАХР. Причем, активность одного из мутантных вариантов по отношению к нейрональному нАХР а7 типа близка к активности нейротоксина I. Наличие биологической активности полученных рекомбинантных нейротоксинов позволяет использовать эти белки как инструменты в дальнейших детальных исследованиях механизмов взаимодействия различных типов нАХР со своими лигандами, что, несомненно, представляет большой интерес с точки зрения создания эффективных терапевтических средств для лечения заболеваний нервной системы, обусловленных дисфункцией нАХР.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Люкманова, Екатерина Назымовна

выводы

1. Впервые получен синтетический ген нейротоксина II и разработаны высокопродуктивные экспрессионные системы, позволяющие получать нейротоксины, белки со значительным содержанием дисульфидных связей, в препаративных количествах.

2. Впервые сконструированы два новых нейротоксина путем пересадки в молекулу нейротоксина II фрагмента центральной петли нейротоксина I.

3. Разработаны эффективные схемы биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантных белков.

4. Нейротоксин II, его мутантные варианты и 15Ы-меченый нейротоксин II получены в препаративных количествах, достаточных для проведения исследований физико-химических и биологических свойств.

5. Впервые получен 13С-15Ы-меченый а-нейротоксин и сделано отнесение химических сдвигов ]Н, 13С и 15Ы ядер белка нейротоксин II.

6. Структурные свойства рекомбинантных белков исследованы методами ядерного магнитного резонанса. Показано, что а) все полученные в работе белки обладают жесткой пространственной структурой, б) пространственная структура рекомбинантного нейротоксина II идентична структуре природного токсина, в) нейротоксин II способен взаимодействовать с бицеллами, моделирующими липидный бислой.

7. В ходе исследования биологических свойств полученных белков было показано, что: а) гибридный белок тиоредоксин-нейротоксин II обладает активностью по отношению к нАХР мускульного типа, сопоставимой с активностью природного нейротоксина II, б) рекомбинантный нейротоксин II практически воспроизводит активность природного токсина, в) полученные мутантные варианты нейротоксина II приобрели способность взаимодействовать с нейрональными нАХР, причем, мутантный вариант нейротоксина II с модифицированной центральной петлей, соответствующей петле нейротоксина I, обладает селективной активностью по отношению к нейрональному нАХР а7 типа, близкой к активности нейротоксина I.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мне хотелось бы выразить глубокую благодарность и искреннюю признательность своим научным руководителям академику РАН, д.б.н. Михаилу Петровичу Кирпичникову и профессору д.б.н. Дмитрию Александровичу Долгих, которые обеспечили возможность выполнения настоящей диссертационной работы, оказывали своевременную помощь и поддержку и проявляли неустанное благожелательное внимание на протяжении всего времени моей работы в лаборатории.

Приношу свою глубокую благодарность руководителю лаборатории структурной биологии ИБХ РАН проф. A.C. Арсеньеву и сотрудникам этой лаборатории И.В. Масленникову и 3.0. Шенкареву, чьи идеи легли в основу создания мутантных вариантов нейротоксина П. Также хочу поблагодарить сотрудников этой лаборатории Э.В. Бочарова за неоценимую помощь в исследовании полученных пептидов методами ЯМР-спектроскопии и П.Е. Волынского за помощь в построении молекулярных моделей пространственных структур нейротоксинов.

Выражаю свою искреннюю признательность сотруднику лаборатории инженерии белка ИБХ РАН А. А. Шульге, чьи разработки в области высокоэффективных систем для экспрессии рекомбинантных белков в Е. coli позволили выполнить основную часть представленной работы. Также хочу поблагодарить Д.А. Арсеньеву (University of Chicago, Illinois, США) за совместную работу по созданию экспрессирующих систем для нейротоксина П.

Особую благодарность выражаю сотрудникам лаборатории рецепции нейропептидов ИБХ РАН Ю.Н. Уткину и И.Е. Кашеверову, сотруднику лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН К.А. Плужникову и A.C. Курятову (Department of Neuroscience, University of Pennsylvania, Medical School, Philadelphia, Pennsylvania, США) за огромную помощь в исследовании биологических свойств и тестировании активностей полученных пептидов.

Отдельную благодарность хочу выразить всем сотрудникам лабораторий инженерии белка и структурной биологии ИБХ РАН за высокий профессионализм и дружелюбие, неизменно помогавшее мне на всем пути выполнения диссертационной работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в диссертационной работе результаты выявляют основные принципы, использованные природой при конструировании высокоселективных лигандов, действующих на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы. В рамках работы, на примере созданного рекомбинантного токсина (МиЙ), селективно действующего на нейрональный нАХР а7 типа, показано, что различие в специфичности действия "трехпальцевых" нейротоксинов из ядов змей на различные нАХР в основном обусловлено строением кончика центральной пептли токсинов. В то же время, как показывают данные по другому нейротоксину (МиШ), действующему на нейрональный нАХР а3|32 типа, строение центральной петли - не единственная структурная детерминанта, ответственная за взаимодействие а-нейротоксинов с нАХР. Одной из возможных дополнительных детерминант может служить участок молекулы нейротоксина, взаимодействующий с мембраной клетки, окружающей нАХР.

Результаты диссертационной работы указывают на возможность создания новых пептидных молекул, селективно действующих на отдельные подтипы мембранных рецепторов, что имеет фундаментальное и практическое значение для современной медицины и фармакологии. Вероятно, в будущем, конструирование методами белковой инженерии белков, пептидов и пептидомиметиков позволит создавать новые поколения высокоселективных лекарственных препаратов и откроет путь для излечения многих болезней центральной нервной системы, связанных с дисфункцией нАХР.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Люкманова, Екатерина Назымовна, 2005 год

1. Tsetlin VI, Hucho F. Snake and snail toxins acting on nicotinic acetylcholine receptors: fundamental aspects and medical applications.// FEBS Lett (2004); 557(l-3):9-13.

2. Hucho F., Weise C. Ligand-Gated Ion Chanells.// Angew Chem (2001); 40:3100-3116.

3. Tsetlin V. Snake venom alpha-neurotoxins and other 'three-finger' proteins.// Eur J Biochem (1999); 264(2):281-286.

4. Tsetlin VI, Karlsson E, Utkin Y, Pluzhnikov KA, Arseniev AS, Surin AM, Kondakov VV, Bystrov VF, Ivanov VT, Ovchinnikov Y. Interaction surfaces of neurotoxins and acetylcholine receptor.// Toxicon (1982); 20(l):83-93.

5. Martin-Ruiz CM, Lee M, Perry RH, Baumann M, Court J A, Perry EK. Molecular analysis of nicotinic receptor expression in autism.// Brain Res Mol Brain Res (2004); 123(1-2):81-90.

6. Bertrand D. Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptors and Epilepsy.// Epilepsy Curr (2002); 2(6): 191-193.

7. Hogg RC, Bertrand D. Neuroscience. What genes tell us about nicotine addiction.// Science (2004); 306(5698):983-985.

8. Cardoso RA, Brozowski SJ, Chavez-Noriega LE, Harpold M, Valenzuela CF, Harris RA. Effects of ethanol on recombinant human neuronal nicotinic acetylcholine receptors expressed in Xenopus oocytes.// J Pharmacol Exp Ther (1999); 289(2):774-780.

9. Dohrman DP, Reiter CK. Ethanol modulates nicotine-induced upregulation of nAChRs.// Brain Res (2003); 975(l-2):90-98.

10. Shen XM, Ohno K, Tsujino A, Brengman JM, Gingold M, Sine SM, Engel AG. Mutation causing severe myasthenia reveals functional asymmetry of AChR signature cystine loops in agonist binding and gating.// J Clin Invest (2003); 111(4):497-505.

11. Martin-Ruiz CM, Haroutunian VH, Long P, Young AH, Davis KL, Perry EK, Court JA. Dementia rating and nicotinic receptor expression in the prefrontal cortex in schizophrenia.// Biol Psychiatry (2003); 54(11):1222-1233.

12. Bertrand D, Picard F, Le Hellard S, Weiland S, Favre I, Phillips H, Bertrand S, Berkovic SF, Malafosse A, Mulley J. How mutations in the nAChRs can cause ADNFLE epilepsy.// Epilepsia (2002); 43 Suppl 5:112-122.

13. Hogg RC, Bertrand D. Regulating the regulators: the role of nicotinic acetylcholine receptors in human epilepsy.// Drug News Perspect (2003); 16(5):261-266.

14. Moulard B, Picard F, Le Hellard S, Agulhon C, Weiland S, Favre I, Bertrand S, Malafosse A, Bertrand D. Ion channel variation causes epilepsies.// Brain Res Brain Res Rev (2001); 36(2-3):275-284.

15. Hogg RC, Bertrand D. Neuronal nicotinic receptors and epilepsy, from genes to possible therapeutic compounds.// Bioorg Med Chem Lett (2004); 14(8):1859-1861.

16. Sine SM, Ohno K, Bouzat C, Auerbach A, Milone M, Pruitt JN, Engel AG. Mutation of the acetylcholine receptor alpha subunit causes a slow-channel myasthenic syndrome by enhancing agonist binding affinity.// Neuron (1995); 15(l):229-239.

17. Hogg RC, Raggenbass M, Bertrand D. Nicotinic acetylcholine receptors: from structure to brain function.// Rev Physiol Biochem Pharmacol (2003); 147:1-46.

18. Weiland S, Bertrand D, Leonard S. Neuronal nicotinic acetylcholine receptors: from the gene to the disease.// Behav Brain Res (2000); 113(l-2):43-56.

19. Wang H, Yu M, Ochani M, Amelia CA, Tanovic M, Susarla S, Li JH, Wang H, Yang H, Ulloa L, A1 Abed Y, Czura CJ, Tracey KJ. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation.// Nature (2003); 421(6921):384-388.

20. Рубин А.Б. Биофизика клеточных процессов. Том 2. (2004).

21. Wilson G, Karlin A. Acetylcholine receptor channel structure in the resting, open, and desensitized states probed with the substituted-cysteine-accessibility method.// Proc Natl Acad Sci U S A (2001); 98(3):1241-1248.

22. Eisenman G., Dani JA. An introduction to molecular architecture and permeability of ion channels. (1987).

23. Б.Альбертс, Д.Брей, Дж.Льюис, М.Рефф, К.Робертс, Дж.Уотсон. Молекулярная биология клетки. ТЗ, п. 19. (2004).

24. Unwin N. The nicotinic acetylcholine receptor of the Torpedo electric ray.// J Struct Biol (1998); 121(2):181-190.

25. Unwin N. Structure of the acetylcholine-gated channel.// Novartis Found Symp (2002); 245; discussion 15-21,165-8.:5-15.

26. Unwin N. Structure and action of the nicotinic acetylcholine receptor explored by electron microscopy.// FEBS Lett (2003); 555(l):91-95.

27. Wise DS, Schoenborn BP, Karlin A. Structure of acetylcholine receptor dimer determined by neutron scattering and electron microscopy.// J Biol Chem (1981); 256(8):4124-4126.

28. Schapira M, Abagyan R, Totrov M. Structural model of nicotinic acetylcholine receptor isotypes bound to acetylcholine and nicotine.// BMC Struct Biol (2002); 2(1): 1.

29. Grant MA, Gentile LN, Shi QL, Pellegrini M, Hawrot E. Expression and spectroscopic analysis of soluble nicotinic acetylcholine receptor fragments derived from the extracellular domain of the alpha-subunit.// Biochemistry (1999); 38(33):10730-10742.

30. Lai R, Yu L. Atomic force microscopy of cloned nicotinic acetylcholine receptor expressed in Xenopus oocytes.// Proc Natl Acad Sci U S A (1993); 90(15):7280-7284.

31. Yao Y, Wang J, Viroonchatapan N, Samson A, Chill J, Rothe E, Anglister J, Wang ZZ. Yeast expression and NMR analysis of the extracellular domain of muscle nicotinic acetylcholine receptor alpha subunit.// J Biol Chem (2002); 277(15):12613-12621.

32. Fischer M, Corringer PJ, Schott K, Bacher A, Changeux JP. A method for soluble overexpression of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor extracellular domain.// Proc Natl Acad Sci U S A (2001); 98(6):3567-3570.

33. Court JA, Martin-Ruiz C, Graham A, Perry E. Nicotinic receptors in human brain: topography and pathology.// J Chem Neuroanat (2000); 20(3-4):281-298.

34. Le NN, Corringer PJ, Changeux JP. The diversity of subunit composition in nAChRs: evolutionary origins, physiologic and pharmacologic consequences.// J Neurobiol (2002); 53(4):447-456.

35. Lindstrom JM. Nicotinic acetylcholine receptors of muscles and nerves: comparison of their structures, functional roles, and vulnerability to pathology.// Ann N Y Acad Sci (2003); 998:41-52.:41-52.

36. Цетлин В.И., Плужников К.А., Карелин А.А., Карлссон E., Иванов B.T. Взаимное расположение субъединиц ацетилхолинового рецептора и связанного с ним нейротоксина.// Биоорг.Химия (1984); 10(2): 176-187.

37. Unwin N, Toyoshima С, Kubalek Е. Arrangement of the acetylcholine receptor subunits in the resting and desensitized states, determined by cryoelectron microscopy of crystallized Torpedo postsynaptic membranes.// J Cell Biol (1988); 107(3):1123-1138.

38. Unwin N. Nicotinic acetylcholine receptor at 9 A resolution.// J Mol Biol (1993); %20;229(4):1101-1124.

39. Unwin N. Acetylcholine receptor channel imaged in the open state.// Nature (1995); 373(6509):37-43.

40. Akabas MH, Kaufmann C, Archdeacon P, Karlin A. Identification of acetylcholine receptor channel-lining residues in the entire M2 segment of the alpha subunit.// Neuron (1994); 13(4):919-927.

41. Anand R, Nelson ME, Gerzanich V, Wells GB, Lindstrom J. Determinants of channel gating located in the N-terminal extracellular domain of nicotinic alpha7 receptor.// J Pharmacol Exp Ther (1998); 287(2):469-479.

42. Sine SM. The nicotinic receptor ligand binding domain.// J Neurobiol (2002); 53(4):431-446.

43. Brejc K, van Dijk WJ, Klaassen RV, Schuurmans M, van Der О J, Smit AB, Sixma TK. Crystal structure of an ACh-binding protein reveals the ligand-binding domain of nicotinic receptors.// Nature (2001); 411(6835) :269-276.

44. Sixma TK, Smit AB. Acetylcholine binding protein (AChBP): a secreted glial protein that provides a high-resolution model for the extracellular domain of pentameric ligand-gated ion channels.// Annu Rev Biophys Biomol Struct (2003); 32:311-334.

45. Smit AB, Brejc K, Syed N, Sixma TK. Structure and function of AChBP, homologue of the ligand-binding domain of the nicotinic acetylcholine receptor.// Ann N Y Acad Sci (2003); 998:81-92.:81-92.

46. Tierney ML, Unwin N. Electron microscopic evidence for the assembly of soluble pentameric extracellular domains of the nicotinic acetylcholine receptor.// J Mol Biol (2000); 303(2): 185-196.

47. Wells GB, Anand R, Wang F, Lindstrom J. Water-soluble nicotinic acetylcholine receptor formed by alpha7 subunit extracellular domains.// J Biol Chem (1998); 273(2):964-973.

48. Craik D.J. Applications of NMR in drug design: structure-activity relationships in disulfide-rich peptides.// Protein and Peptide Letters (1999); 6(5):341-350.

49. Basus VJ, Nadasdi L, Ramachandran J, Miljanich GP. Solution structure of omega-Conotoxin MVIIA using 2D NMR spectroscopy.// FEBS Lett (1995); 370(3): 163-169.

50. Gehrmann J, Daly NL, Alewood PF, Craik DJ. Solution structure of alpha-conotoxin Iml by 1H nuclear magnetic resonance.// J Med Chem (1999); 42(13):2364-2372.

51. Hill JM, Alewood PF, Craik DJ. Three-dimensional solution structure of mu-conotoxin GIIIB, a specific blocker of skeletal muscle sodium channels.// Biochemistry (1996); 35(27):8824-8835.

52. Hill JM, Alewood PF, Craik DJ. Solution structure of the sodium channel antagonist conotoxin GS: a new molecular caliper for probing sodium channel geometry.// Structure (1997); 5(4):571-583.

53. Hill JM, Oomen CJ, Miranda LP, Bingham JP, Alewood PF, Craik DJ. Three-dimensional solution structure of alpha-conotoxin Mil by NMR spectroscopy: effects of solution environment on helicity.// Biochemistry (1998); 37(45):15621-15630.

54. Hill JM, Alewood PF, Craik DJ. Conotoxin TVIIA, a novel peptide from the venom of Conus tulipa 2. Three-dimensional solution structure.// Eur J Biochem (2000); 267(15):4649-4657.

55. Hu SH, Gehrmann J, Alewood PF, Craik DJ, Martin JL. Crystal structure at 1.1 A resolution of alpha-conotoxin PnIB: comparison with alpha-conotoxins PnIA and GUI Biochemistry (1997); 36(38):11323-11330.

56. Kobayashi Y, Ohkubo T, Kyogoku Y, Nishiuchi Y, Sakakibara S, Braun W, Go N. Solution conformation of conotoxin GI determined by 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy and distance geometry calculations.// Biochemistry (1989); 28(11):4853-4860.

57. Maslennikov IV, Sobol AG, Gladky KV, Lugovskoy AA, Ostrovsky AG, Tsetlin VI, Ivanov VT, Arseniev AS. Two distinct structures of alpha-conotoxin GI in aqueous solution.// Eur J Biochem (1998); 254(2):238-247.

58. Shon KJ, Koerber SC, Rivier JE, Olivera BM, Mcintosh JM. Three-dimensional solution structure of alpha-conotoxin Mil, an alpha3beta2 neuronal nicotinic acetylcholine receptor-targeted ligand.// Biochemistry (1997); 36(50):15693-15700.

59. Millard EL, Daly NL, Craik DJ. Structure-activity relationships of alpha-conotoxins targeting neuronal nicotinic acetylcholine receptors.// Eur J Biochem (2004); 271(12):2320-2326.

60. Mcintosh JM, Yoshikami D, Mahe E, Nielsen DB, Rivier JE, Gray WR, Olivera BM. A nicotinic acetylcholine receptor ligand of unique specificity, alpha-conotoxin Iml.// J Biol Chem (1994); 269(24): 16733-16739.

61. Quiram PA, Sine SM. Identification of residues in the neuronal alpha7 acetylcholine receptor that confer selectivity for conotoxin Iml.// J Biol Chem (1998); 273(18):11001-11006.

62. Cartier GE, Yoshikami D, Gray WR, Luo S, Olivera BM, Mcintosh JM. A new alpha-conotoxin which targets alpha3beta2 nicotinic acetylcholine receptors.// J Biol Chem (1996); 271(13):7522-7528.

63. Harvey SC, Mcintosh JM, Cartier GE, Maddox FN, Luetje CW. Determinants of specificity for alpha-conotoxin Mil on alpha3beta2 neuronal nicotinic receptors.// Mol Pharmacol (1997); 51(2):336-342.

64. Hider RC. A proposal for the structure of conotoxin~a potent antagonist of the nicotinic acetylcholine receptor.// FEBS Lett (1985); 184(2):181-184.

65. Hodgson WC, Wickramaratna JC. In vitro neuromuscular activity of snake venoms.// Clin Exp Pharmacol Physiol (2002); 29(9):807-814.

66. Tsernoglou D, Petsko GA. The crystal structure of a post-synaptic neurotoxin from sea snake at A resolution.// FEBS Lett (1976); 68(1): 1-4.

67. Михайлов A.M., Никитенко A.B., Четверина E.B., Траханов С.Д., Вайнштейн Б.К. Пространственное строение основной цепи молекулы нейротоксина I из яда кобры Naja naja oxiana и ее укладка в кристаллической ячейке. // Биоорг.Химия (1991); 17(3):372-378.

68. Inagaki F, Tamiya N, Miyazawa T, Williams RJ. Structural differences between erabutoxins in aqueous solution and in crystalline states.// Eur J Biochem (1981); 118(3):621-625.

69. Golovanov AP, Lomize AL, Arseniev AS, Utkin YN, Tsetlin VI. Two-dimensional 1H-NMR study of the spatial structure of neurotoxin II from Naja naja oxiana.// Eur J Biochem (1993); 213(3):1213-1223.

70. Tsernoglou D, Petsko GA. Three-dimensional structure of neurotoxin a from venom of the Philippines sea snake.// Proc Natl Acad Sci U S A (1977); 74(3):971-974.

71. Lauterwein J, Wuthrich K, Schweitz H, Vincent JP, Lazdunski M. 1H n.m.r. studies of a neurotoxin and a cardiotoxin from Naja mossambica mossambica: amide proton resonances.// Biochem Biophys Res Commun (1977); 76(4):1071-1078.

72. Lauterwein J, Lazdunski M, Wuthrich K. The 1H nuclear-magnetic-resonance spectra of Neurotoxin I and cardiotoxin Vii4 from Naja mossambica mossambica.// Eur J Biochem (1978); 92(2):361-371.

73. Low BW. Three-dimensional structure of erabutoxin b, prototype structure of the snake venom postsynaptic neurotoxins: consideration of structure and function; description of the reactive site.// Adv Cytopharmacol (1979); 3:141-147.

74. Arseniev AS, Pashkov VS, Pluzhnikov KA, Rochat H, Bystrov VF. The 1H nuclear-magnetic-resonance spectra and spatial structure of the Naja mossambica mossambica neurotoxin III.// Eur J Biochem (1981); 118(3):453-462.

75. Corfield PW, Lee TJ, Low BW. The crystal structure of erabutoxin a at 2.0-A resolution.// J Biol Chem (1989); 264(16):9239-9242.

76. Le Goas R, LaPlante SR, Mikou A, Delsuc MA, Guittet E, Robin M, Charpentier I, Lallemand JY. Alpha-cobratoxin: proton NMR assignments and solution structure.// Biochemistry (1992); 31(20):4867-4875.

77. Brown LR, Wuthrich K. Nuclear magnetic resonance solution structure of the alpha-neurotoxin from the black mamba (Dendroaspis polylepis polylepis).// J Mol Biol (1992); 227(4):1118-1135.

78. Zinn-Justin S, Roumestand C, Gilquin B, Bontems F, Menez A, Toma F. Three-dimensional solution structure of a curaremimetic toxin from Naja nigricollis venom: a proton NMR and molecular modeling study.//Biochemistry (1992); 31(46):11335-11347.

79. Juan HF, Hung CC, Wang KT, Chiou SH. Comparison of three classes of snake neurotoxins by homology modeling and computer simulation graphics.// Biochem Biophys Res Commun (1999); 257(2):500-510.

80. Уткин Ю.Н., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. а-Нейротоксины и а-конотоксины -блокаторы никотиновых холинорецепторов.// Биоорг.Химия (1999); 25(11):805-810.

81. Servent D, Winckler-Dietrich V, Hu HY, Kessler P, Drevet P, Bertrand D, Menez A. Only snake curaremimetic toxins with a fifth disulfide bond have high affinity for the neuronal alpha7 nicotinic receptor.// J Biol Chem (1997); 272(39):24279-24286.

82. Antil S, Servent D, Menez A. Variability among the sites by which curaremimetic toxins bind to torpedo acetylcholine receptor, as revealed by identification of the functional residues of alpha-cobratoxin.//J Biol Chem (1999); 274(49):34851-34858.

83. Teixeira-Clerc F, Menez A, Kessler P. How do short neurotoxins bind to a muscular-type nicotinic acetylcholine receptor?// J Biol Chem (2002); 277(28):25741-25747.

84. Kreienkamp HJ, Utkin YN, Weise C, Machold J, Tsetlin VI, Hucho F. Investigation of ligand-binding sites of the acetylcholine receptor using photoactivatable derivatives of neurotoxin II from Naja naja oxiana.// Biochemistry (1992); 31(35):8239-8244.

85. Hucho F, Tsetlin VI, Machold J. The emerging three-dimensional structure of a receptor. The nicotinic acetylcholine receptor.// Eur J Biochem (1996); 239(3):539-557.

86. Уткин Ю.Н., Мунд М., Хухо Ф., Цетлин В.И. Эффективное связывание а-бунгаротоксина солюбилированной а-субъединицей ацетилхолинового рецептора.// Биоорг.Химия (1996); 22(5):387-389.

87. Mulac-Jericevic В, Atassi MZ. Profile of the alpha-bungarotoxin-binding regions on the extracellular part of the alpha-chain of Torpedo californica acetylcholine receptor.// Biochem J (1987); 248(3):847-852.

88. Ruan KH, Stiles BG, Atassi MZ. The short-neurotoxin-binding regions on the alpha-chain of human and Torpedo californica acetylcholine receptors.// Biochem J (1991); 274(Pt 3):849-854.

89. Conti-Tronconi BM, Tang F, Diethelm BM, Spencer SR, Reinhardt-Maelicke S, Maelicke A. Mapping of a cholinergic binding site by means of synthetic peptides, monoclonal antibodies, and alpha-bungarotoxin.// Biochemistry (1990); 29(26):6221-6230.

90. Takamori M, Okumura S, Nagata M, Yoshikawa H. Myasthenogenic significance of synthetic alpha-subunit peptide 183-200 of Torpedo californica and human acetylcholine receptor.// J Neurol Sci (1988); 85(2): 121-129.

91. Griesmann GE, McCormick DJ, De Aizpurua HJ, Lennon VA. Alpha-bungarotoxin binds to human acetylcholine receptor alpha-subunit peptide 185-199 in solution and solid phase but not to peptides 125-147 and 389-409.// J Neurochem (1990); 54(5):1541-1547.

92. Wilson PT, Hawrot E, Lentz TL. Distribution of alpha-bungarotoxin binding sites over residues 173-204 of the alpha subunit of the acetylcholine receptor.// Mol Pharmacol (1988); 34(5):643-650.

93. Samson A, Scherf T, Eisenstein M, Chill J, Anglister J. The mechanism for acetylcholine receptor inhibition by alpha-neurotoxins and species-specific resistance to alpha-bungarotoxin revealed by NMR.// Neuron (2002); 35(2):319-332.

94. Samson AO, Chill JH, Rodriguez E, Scherf T, Anglister J. NMR mapping and secondary structure determination of the major acetylcholine receptor alpha-subunit determinant interacting with alpha-bungarotoxin.// Biochemistry (2001); 40(18):5464-5473.

95. Bouzat C, Gumilar F, Spitzmaul G, Wang HL, Rayes D, Hansen SB, Taylor P, Sine SM. Coupling of agonist binding to channel gating in an ACh-binding protein linked to an ion channel.//Nature (2004); 430(7002):896-900.

96. Henchman RH, Wang HL, Sine SM, Taylor P, McCammon JA. Asymmetric structural motions of the homomeric alpha7 nicotinic receptor ligand binding domain revealed by molecular dynamics simulation.// Biophys J (2003); 85(5):3007-3018.

97. Chakrapani S, Bailey TD, Auerbach A. Gating dynamics of the acetylcholine receptor extracellular domain.// J Gen Physiol (2004); 123(4):341-356.

98. Young HS, Herbette LG, Skita V. Alpha-bungarotoxin binding to acetylcholine receptor membranes studied by low angle X-ray diffraction.// Biophys J (2003); 85(2):943-953.

99. Хечинашвили H.H., Цетлин В.И. Калориметрическое исследование тепловой денатурации токсинов.// Мол. Биол (Москва) (1984); 18(3):786-791.

100. Marston FA. The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli.// Biochem J (1986); 240(1):1-12.

101. LaVallie ER, DiBlasio EA, Kovacic S, Grant KL, Schendel PF, McCoy JM. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.// Biotechnology (N Y) (1993); 11(2):187-193.

102. LaVallie ER, Lu Z, Blasio-Smith EA, Collins-Racie LA, McCoy JM. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.// Methods Enzymol (2000); 326:322-40.:322-340.

103. LaVallie ER, Blasio-Smith EA, Collins-Racie LA, Lu Z, McCoy JM. Thioredoxin and related proteins as multifunctional fusion tags for soluble expression in E. coli.// Methods Mol Biol (2003); 205:119-40.: 119-140.

104. Takahashi N, Creighton TE. On the reactivity and ionization of the active site cysteine residues of Escherichia coli thioredoxin.// Biochemistry (1996); 35(25):8342-8353.

105. Wang Y, Jing L, Xu K. A unique approach for high level expression and production of a recombinant cobra neurotoxin in Escherichia coli.// J Biotechnol (2002); 94(3):235-244.

106. Economou A. Following the leader: bacterial protein export through the Sec pathway.// Trends Microbiol (1999); 7(8):315-320.

107. Ghrayeb J, Kimura H, Takahara M, Hsiung H, Masui Y, Inouye M. Secretion cloning vectors in Escherichia coli.// EMBO J (1984); 3(10):2437-2442.

108. Tan S, Wu W, Liu J, Kong Y, Pu Y, Yuan R. Efficient expression and secretion of recombinant hirudin III in E. coli using the L-asparaginase II signal sequence.// Protein Expr Purif (2002); 25(3):430-436.

109. Kebir MO, Kendall DA. SecA specificity for different signal peptides.// Biochemistry2002); 41(17):5573-5580.

110. Bardwell JC, McGovern K, Beckwith J. Identification of a protein required for disulfide bond formation in vivo.// Cell (1991); 67(3):581-589.

111. Maskos K, Huber-Wunderlich M, Glockshuber R. DsbA and DsbC-catalyzed oxidative folding of proteins with complex disulfide bridge patterns in vitro and in vivo.// J Mol Biol2003); 325(3):495-513.

112. Bowden GA, Georgiou G. Folding and aggregation of beta-lactamase in the periplasmic space of Escherichia coli.// J Biol Chem (1990); 265(28): 16760-16766.

113. Mourier G, Servent D, Zinn-Justin S, Menez A. Chemical engineering of a three-fingered toxin with anti-alpha7 neuronal acetylcholine receptor activity.// Protein Eng (2000); 13(3):217-225.

114. Studier FW, Moffatt BA. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.// J Mol Biol (1986); 189(1):113-130.

115. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Д. Молекулярное клонирование. (1984).

116. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.// J Mol Biol (1983); 166(4):557-580.

117. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.//Nature (1970); 227(5259):680-685.

118. Schagger H, von JG. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.// Anal Biochem (1987); 166(2):368-379.

119. Cavanagh J., Fairbrother W.J., Palmer A.G., Skelton N.J. Protein NMR spectroscopy: principles and practice. (1996).

120. Shaka A.J., Keeler J., Frenkiel Т., Freeman R. Computer optimized decoupling scheme for wideband application and low-level operation.// J Magn Reson (1985); 64:547-552.

121. Shaka A.J., Keeler J., Frenkiel Т., Freeman R. An improved sequence for broadband decoupling: WALTZ-16.// J Magn Reson (1983); 52:335-338.

122. States D.J., Habercorn R.A., Ruben DJ. 2D NOE with pure absorption phase in four quadrants.// J Magn Reson (1982); 48:286-292.

123. Bartels С., Xia T.-H., Billeter M„ Guntert P., Wuthrich K. The program XEASY for computer-supported NMR spectral analysis of biological macromolecules. // J Biomol NMR (1995); 6:1-10.

124. Koradi R, Billeter M, Wuthrich K. MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures.// J Mol Graph (1996); 14(l):51-55.

125. Hoog JO, von Bahr-Lindstrom H, Josephson S, Wallace BJ, Kushner SR, Jornvall H, Holmgren A. Nucleotide sequence of the thioredoxin gene from Escherichia coli.// Biosci Rep (1984); 4(ll):917-923.

126. Schein C.H., Noteborn M.H.M. formation of soluble recombinant proteins in Escherichia coli is favored by lower growth temperature.// Biotechnology (1988); 6:291-295.

127. Wishart D.S., Sykes B.D. Chemical shifts as a tool for structure determination.// Methods Enzymol (1994); 239:363-392.

128. Schwyzer R. 100 years lock-and-key concept: are peptide keys shaped and guided to their receptors by the target cell membrane?// Biopolymers (1995); 37(1):5-16.

129. Schiebler W., Lauffer L., Hucho F. Acetylcholine receptor enriched membranes: acetylcholine binding and excitability after reduction in vitro. // FEBS Lett. (1977); 81:39-42.

130. Carrier G.E., Yoshikami D., Gray W.R., Luo S., Olivera B.M., Mcintosh J.M. A new a-conotoxin which targets a3p2 nicotinic acetylcholine receptors. // J.Biol.Chem. (1996); 271:7522-7528.

131. Mcintosh J.M., Azam L., Staheli S., Dowell C., Lindstrom J.M., Kuryatov A., Garret J.E., Maries M.J., Whiteaker P. Analogs of a-conotoxin Mil are selective for a6-containing nicotinic acetylcholine receptors. // Mol. Pharmacol (2004); 65(4):944-952.