Получение и иммунохимический анализ рекомбинантного глиофибриллярного кислого протеина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Павлов, Константин Александрович

• Павлов, Константин Александрович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Павлов, Константин Александрович

Оглавление.

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. ОБ АР - глиофибриллярный кислый протеин.

1.2 Иммуноферментые системы для количественного определения антигена в биологических жидкостях.

1.3 Диагнстическая ценность количественного определения ОБ АР в биологических жидкостях.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и иммунохимический анализ рекомбинантного глиофибриллярного кислого протеина»

Актуальность исследования. Возрастающий интерес к проблеме получения рекомбинантных нейроспецифических белков обусловливается, прежде всего, их высокой диагностической значимостью как критериев оценки проницаемости гематоэнцефалического барьера при заболеваниях ЦНС [Aurell А. 1991; Blennow М. 1995,1996; Dotevall L. 1996; Hermann М. 2000; Чехонин В.П. 2001; Van Geel W. J. 2002, Herrmann 2003; Jauch E. 2000; Kristjansdottir R. 2001; Sporer B. 2004; Vissers J.L. 2006, Wunderlich M.T. 2006, Foerch C. 2006, Roseng-ren L. 2007, Heckl S. 2007, Notturno F.2008, Mullett S.J. 2008]. Практически любой патологический процесс в ЦНС приводит к реактивному астроглиозу - выраженной активации астроглиального компонента нервной ткани [Fitch M.T. 2008]. Наиболее ярким проявлением реактивного астроглиоза на молекулярно-биологическом уровне является резкое увеличение экспрессии GFAP в активированных астроцитах [Blomstrand С. 1995, Hill М. 2000, Brahmachari S. 2006]. Дальнейшее развитие патологического процесса приводит к гибели реактивных астроцитов, вследствие чего нарушается резистентность клеточной мембраны и GFAP (белок промежуточных филаментов астроцитов) оказывается в межклеточной жидкости, откуда элиминируется в кровоток и ликвор пациента, несмотря на его внутриклеточную локализацию. Подобный «прорыв» GFAP в биологические жидкости организма возможен лишь при заболеваниях, сопровождающихся нарушением резистентности гемато-энцефалического барьера [Blennow М. 1995,1996, Чехонин В.П. 2001, Chekhonin V. 2002, Rosengren L. 2007, Rosenfeld R. G. 1987]. Таким образом, количество GFAP в биологических жидкостях может напрямую зависеть от количества погибших или поврежденных астроцитов, что, в свою очередь, отражает степень выраженности нейроде-генераторного процесса [Lamers К. J. 2003; Petzold А. 2004, Notturno F.2008, Mullett S.J. 2008]. Используя метод количественного иммуноферментного анализа для определения GFAP в крови и ликворе, в динамике развития патологического процесса, представляется возможным создать систему получения достоверной объективной информации не только о наличии процесса как такового, но и о динамических особенностях течения заболевания и что особенно важно и перспективно оценить эффективность применяемой терапии. В связи с этим, биотехнологические аспекты получения необходимых количеств высоко-очищенного и абсолютно идентичного препарата белка, несомненно, являются определяющими при разработке способов количественного скриннингового определения его диагностически значимых количеств в биологических жидкостях пациентов (Чехонин В.П. 2001,2007, Jung CS 2007., Sarthy V.2007, Foerch C.2006). Всем этим требованиям полностью удовлетворяет рекомбинантный препарат GFAP, позволяющий разработать высокоточную, воспроизводимую и, что особенно важно, биотехнологически стандартизованную систему его имму-ноферментного определения для практического здравоохранения.

Цель исследования: Получить и охарактеризовать рекомбинантный GFAP человека, иммунохимически идентичный нативному антигену и разработать иммуноферментный анализ для количественного определения GFAP в биологических жидкостях человека на основе рекомбинантного GFAP и антител полученных при иммунизации данным белком.

Задачи исследования:

1. Клонировать кДНК hGFAP в вектор рЕТ28-а, и получить штамм-продуцент, обладающий способностью к биосинтезу рекомбинантного белка с высоким уровнем эффективности.

2. Разработать метод очистки рекомбинантного белка из первичного биоматериала с высоким уровнем гомогенности и максимальным выходом. \

3. Провести сравнительный иммунохимический анализ нативного и рекомбинантного препарата GFAP с использованием коммерческих препаратов антисывороток.

4. Получить поликлональные и моноклональные анти-GFAP антитела и иммунохимически охарактеризовать их.

5. Разработать метод количественного иммуноферментного анализа ОБ АР на основе рекомбинантного препарата и соответствующих поли- и мо-ноклональных антител в биологических жидкостях и протоколы для иммуноги-стохимического анализа ОБ АР на гистологических срезах и в культуре клеток.

Научная новизна.

1. Впервые показано, что рекомбинантный ОБ АР обладает идентичными нативному белку иммунохимическими и иммуногенными свойствами, а препараты моноклональных и поликлональных антител полученных в результате иммунизации рекомбинантным ОБ АР идентичны антителам, традиционно получаемым иммунизацией нативным белком.

2. Впервые создан и стандартизован сэндвич вариант твердофазного ИФА для определения концентрации ОБ АР в биологических жидкостях человека на основе рекомбинантного препарата ОБ АР и полученных к нему антител.

Практическая значимость: Разработанная иммуноферментная тест-система анализа ОБ АР характеризуется высоким уровнем технологичности. Все антительные компоненты системы получены при иммунизации животных рекомбинантным ОБ АР, что позволяет их стандартизовать и накапливать в необходимых количествах. Данная тест-система позволяет воспроизводимо, специфично и надежно осуществлять количественный мониторинг функциональной и структурной целостности ГЭБ при нервных и психических заболеваниях, а также других поражениях ЦНС (болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, различные формы менингитов и энцефалитов), опухолях и травмах головного мозга. Анализ результатов количественного скрининга и мониторинга ОБ АР в сыворотке крови больных дает возможность рекомендовать его для дополнительной диагностики, прогноза течения заболевания и оценки эффективности проводимой терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клонирование кДНК hGFAP в вектор рЕТ28а и последующая экспрессия в штамме Е. coli (DE3 BL21) позволяет выделять рекомбинантный GFAP иммунохимически идентичный нативному антигену.

2. Поликлональные и моноклональные антитела, полученные к реком-бинантному GFAP идентичны антителам, получаемым к нативному антигену.

3. На основе рекомбинантного GFAP и антител полученных к нему может быть разработан твердофазный сэндвич вариант ИФА для количественного определения концентрации GFAP в биологических жидкостях человека.

Внедрение результатов исследования: Разработанный иммунофермент-ный анализ активно применяется в лаборатории иммунохимии отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ «ГНЦССП Росздрава» для изучения иммунохимических аспектов патогенеза нервных и психических заболеваний.

Полученные антитела активно применяются для иммуногистохимических исследований мозга экспериментальных животных с целью оценки степени выраженности нейродегенеративных процессов при моделировании различных патологических состояний, а также для разработки липосомальных контейнеров векторного типа, способных транспортировать диагностические и терапевтические препараты в заинтересованную область ЦНС.

Апробация материалов диссертационного исследования. Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на заседании проблемного совета по фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ «ГНЦССП Росздрава».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ: 4 - в журналах рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, 1 - глава в монографии .

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2 схемами, 21 рисунком, 1 таблицей. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы отражающей результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (160 источников из них 4 отечественных и 156 зарубежных авторов). Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован автором лично.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Павлов, Константин Александрович, 2009 год

1. Bignami A., Eng L. F., Dahl D., Uyeda С. T. Localization of the glial fibrillary acidic protein in astrocytes by iMMunofluorescence // Brain Res. — 1972. — Vol. 43.—P. 429-435.

2. Eng L. F., Ghirnikar R. S., Lee Y.L. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). // Neurochem. Res. — 2000. — Vol. 25. — P. 14391451.

3. Bignami A., Dalil D. Isolation of GFA protein from normal brain — a coMMent // J. Histochem. Cytochem. — 1979. — Vol. 27. — P. 693.

4. Dahl D., Bignami A. iMMunogenic properties of the glial fibrillary acidic protein. // Brain Res. — 1976. — Vol. 116. — P. 150.

5. Lewis SA, Balcarek JM, Krek V, Shelanski M, Cowan NJ, Sequence of a cDNA clone encoding mouse glial fibrillary acidic protein: structural conservation of intermediate filaments. ProcNatl Acad Sci USA. 1984 May;81(9):2743-6.

6. Miura M, Tamura T, Mikoshiba K., Cell-specific expression of the mouse glial fibrillary acidic protein gene: identification of the cis- and trans-acting promoter elements for astrocyte-specific expression. J Neurochem. 1990 Oct; 55(4):11808.

7. Sarkar S, Cowan NJ. Intragenic sequences affect the expression of the gene encoding glial fibrillary acidic protein.J Neurochem. 1991 Aug;57(2):675-84.РМШ: 2072110

8. Sarkar S, Cowan NJ. Regulation of expression of glial filament acidic protein.J Cell Sci Suppl. 1991;15:97-102.PMTO: 1824112

9. Kaneko R, Sueoka N. Tissue-specific versus cell type-specific expression of the glial fibrillary acidic protein.Proc Natl Acad Sei USA. 1993 May 15;90(10):4698-702.PMLD: 8506321

10. Brenner M, Lampel K, Nakatani Y, Mill J, Banner C, Mearow K, Dohadwa-la M, Lipsky R, Freese E.Characterization of human cDNA and genomic clones for glial fibrillary acidic protein.Brain Res Mol Brain Res. 1990 May;7(4):277-86.РМЮ: 2163003

11. Reeves SA, Helman LJ, Allison A, Israel MA.Molecular cloning and primary structure of human glial fibrillary acidic protein.Proc Natl Acad Sei USA. 1989 Jul;86(13):5178-82.PMID: 2740350 PubMed indexed for MEDLINE.

12. Sarthy PV, Fu M, Huang J.Subcellular localization of an intermediate filament protein and its mRNA in glial cells.Mol Cell Biol. 1989 0ct;9(10):4556-9.РМГО: 2586519 PubMed indexed for MEDLINE.

13. Quinlan RA, Brenner M, Goldman JE, Messing A.GFAP and its role in Alexander disease .Exp Cell Res. 2007 Jun 10;313(10):2077-87. Epub 2007 Apr 6. Review.PMID: 17498694 PubMed indexed for MEDLINE.

14. Laping NJ, Teter B, Nichols NR, Rozovsky I, Finch CE.Glial fibrillary acidic protein: regulation by hormones, cytokines, and growth factors.Brain Pathol. 1994 Jul;4(3):259-75. Review.PMID: 7952267

15. Калашников В.В. Раково-эмбриональные белки человека: Дис. . д-ра. мед. наук. —М., 1986.

16. Köhler G., Milstein С. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. // Nature -1975 V. 256 - P. 495-497.

17. Чехонин В.П., Гурина О.И., Дмитриева Т.Е. и др. Моноклональные ан-ти-GFAP антитела: получение характеристика и иммуноферментный анализ.БЭБМ 2001- № 8 - с.188-191

18. Weir D. Handbook of experimental iMMunology. — Oxford, 1978

19. Чехонин В. П., Дмитриева Т. Б., Жирков Ю. А. Иммунохимический анализ нейроспецифических антигенов. -М. Медицина, 1999

20. Albrechtsen М., Massaro A., Bock Е. Enzyme-linked iMMunosorbent assay for human glial fibrillary acidic protein using a mouse monoclonal antibody. // J. Neurochem. — 1985. — Vol. 44. — P. 560-565.

21. Albrechtsen M., Sorensen P. S., Gjerris F., Bock E. High cerebrospinal fluid concentration of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in patients with normal pressure hydrocephalus. // J. Neurol. Sci. — 1985. — Vol. 70. — P. 269-274.

22. Arochena M., Anadón R., Diaz-Regueira S. M. Development of vimentin and glial fibrillary acidic protein iMMunoreactivities in the brain of gray mullet (Chelon labrosus), an advanced teleost. // .J Сотр. Neurol. — 2004. — Vol. 469. — P. 413-436.

23. Aurell A., Rosengren L. E., Karlsson B. et al. Determination of S100 and glial fibrillary acidic protein concentrations in cerebrospinal fluid after brain infarction. // Stroke. — 1991. — Vol. 22. — P. 1254-1258.

24. Beach T. G., Walker R., McGeer E. G. Patterns of gliosis in Alzheimer's disease and aging cerebrum. // Glia. — 1989. — Vol. 2. — P. 420-436.

25. Berry M. Regeneration in the central nervous system. — In: Smith W. Т., Canavagh J. B. (Eds.). Recent advances in neuropathology. — Edinburgh: Churchill Livingstone, 1979. — Vol. 1. — P. 67-111.

26. Bertelli E., Regoli M., Gambelli F. et al. GFAP is expressed as a major soluble pool associated with glucagon secretory granules in A-cells of mouse pancreas. // J. Histochem. Cytochem. — 2000. — Vol. 48. — P. 1233-1242.

27. Bigner D. D., Bigner S. H., Ponten J., et al. Heterogeneity of genotypic and phenotypic characteristics of fifteen permanent cell lines derived from human gliomas // J. Neuropathol. Exp. Neurol. — 1981. — Vol. 40. — P. 201-229.

28. Bjorklund H., Dahl D., Seiger A. Neurofilament and glial fibrillary acid protein-related iMMunoreactivity in rodent enteric nervous system // Neuroscience. — 1984. — Vol. 12. — P. 277-287.

29. Blennow M., Hagberg H., Rosengren L. Glial fibrillary acidic protein in the cerebrospinal fluid: a possible indicator of prognosis in full-term asphyxiated newborn infants? // Pediatr. Res. — 1995. — Vol. 37. — P. 260-264.

30. Blennow M., Rosengren L., Jonsson S., Forssberg H., et al. Glial fibrillary acidic protein is increased in the cerebrospinal fluid of preterm infants with abnormal neurological findings // Acta Paediatr. — 1996 — Vol. 85. — P. 485-489.

31. Blennow M., Savman K., lives P. et al. Brain-specific proteins in the cerebrospinal fluid of severely asphyxiated newborn infants. // Acta Paediatr. — 2001Vol. 90 —P. 1171-1175.

32. Blomstrand C., Johansson B., Rosengren B. Blood-brain barrier lesions in acute hypertension in rabbits after unilateral X-ray exposure of the brain // Acta Neurol. Scand. — 1995. — Vol. 31. — P. 97-102.

33. Bush T .G., Puvanachandra N., Horner C. H. et al. Leukocyte infiltration, neuronal degeneration, and neurite outgrowth after ablation of scar-forming, reactive astrocytes in adult transgenic mice. // Neuron. — 1996. — Vol. 23. — P. 297308.

34. Calne D. B. — In: W. B. Saunders (Ed.) Neurodegenerative Diseases — Philadelphia, 1994.

35. Campbell I. L. Transgenic mice and cytokine actions in the brain: bridging the gap between structural and functional neuropathology. // Brain Res. Brain Res. Rev. — 1998. — Vol. 26. — P. 327-336.

36. Carrasco J., Hernandez J., Gonzalez B. et al. Localization of metallothione-in-I and -III expression in the CNS of transgenic mice with astrocyte-targeted expression of interleukin 6. // Exp. Neurol. — 1998. — Vol. 153. — P. 184 -194.

37. Carpenter M. K., Winkler C., Fricker R. et al. Generation and transplantation of EGF responsive neural stem cells. // Exp. Neurol. — 1997. — Vol. 148. — P. 187-204.

38. Chen W. J., Liem R. K. Reexpression of glial fibrillary acidic protein rescues the ability of astrocytoma cells to form processes in response to neurons. // J. Cell Biol. — 1994. — Vol. 127. — P. 813-823.

39. Choi B. H., Kim R. C. Expression of glial fibrillary acidic protein by iMMature oligodendroglia and its implications. // J. NeuroiMMunol. — 1985. — Vol. 8,—P. 215-235.

40. Dadi H. K. et al. — In: Reid E., Cook G. M. W., Moore D. J. (Eds.) Investigation of membrane located receptors. — Plenum, 1984. — 548 p.

41. Dahl D., Rueger D. C., Bignami A., et al. Vimentin, the 57,000 molecular weight protein of fibroblast filaments, is the major cytoskeletal component of iMMature glia. // Eur. J. Cell Biol. — 1981. — Vol. 24. — P. 191-196.

42. Dahl D., Chi N. H., Miles L. E., et al. Glial fibrillary acidic (GFA) protein in Schwann cells // J. Histochem. Cytochem. — 1982. — Vol. 30. — P. 912-918.

43. Delaney C. L., Brenner M., Messing A. Conditional ablation of cerebellar astrocytes in postnatal transgenic mice. //J. Neurosci. — 1996. — Vol. 16. — P. 6908-6918.

44. Dotevall L., Rosengren L. E., Hagberg L. Increased cerebrospinal fluid levels of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in Lyme neuroborreliosis. // Infection. — 1996. — Vol. 24. — P. 125-129.

45. Duffy P. E., Rapoport M., Graf L. Glial fibrillary acidic protein and Alzheimer-type senile dementia. //Neurol. — 1980. — Vol. 30. — P. 778-782.

46. Eddleston M., Mucke L. Molecular profile of reactive astrocytes; implications for their role in neurologic diseases. // Neurosci. — 1993. — Vol. 54. — P. 15-36.

47. Ehlers S., Kyllerman M., Rosengren L. Analysis of glial fibrillary acidic protein in the cerebrospinal fluid of children investigated for encephalopathy. // Neuropediatrics. — 1994. — Vol. 25. — P. 129 133.

48. Eng L. F., Ghirnikar R. S., Lee Y.L. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). //Neurochem. Res. — 2000. — Vol. 25. — P. 14391451.

49. Galbreath E., Kim S. J., Park K., Brenner M. et al. Overexpression of TGF-beta 1 in the central nervous system of transgenic mice results in hydrocephalus. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. — 1995. — Vol. 54. — P. 339-349.

50. Gard A. L., White F. P., Dutton G. R. Extra-neural glial fibrillary acidic protein (GFAP) iMMunoreactivity in perisinusoidal stellate cells of rat liver. // J. NeuroiiviMunol. — 1985. — Vol. 8. — P. 359-375.

51. Ghirnikar R .S., Yu A. C., Eng L. F. Astrogliosis in culture: III. Effect of recombinant retrovirus expressing antisense glial fibrillary acidic protein RNA. // J. Neurosci. Res. — 1994. — Vol. 38. — P. 376-385.

52. Goldman R. D., Zackroff R. V., Steinert P. M. Intermediate filaments: overview. — In: Goldman R. D., Steinert P. M. (Eds.) Cellular and molecular biology of intermediate filaments. — N. Y.: Plenum, 1990. — P. 3-20.

53. Gomes F. C., Garcia-Abreu J., Galou M. et al. Neurons induce GFAP gene promoter of cultured astrocytes from transgenic mice. // Glia. — 1999. — Vol. 26. — P. 97-108.

54. Gomi H., Yokoyama T., Fujimoto K., et al. Mice devoid of the glial fibrillary acidic protein develop normally and are susceptible to scrapie prions. //Neuron. — 1995. —Vol. 14.—P. 29-41.

55. Goodison K. L., Parhad I. M., White C. L. et al. Neuronal and glial gene expression in neocortex of Down's syndrome and Alzheimer's disease. // J. Neuropa-thol. Exp. Neurol. — 1993, — Vol. 52.—P. 192-198.

56. Hatfield J. S., Skoff R .P., et al. The lens epithelium contains glial fibrillary acidic protein. // J. NeuroiMMunol. — 1985. — Vol. 8. — P. 347 — 357.

57. Herrmann M., Ehrenreich H. Brain derived proteins as markers of acute stroke: their relation to pathophysiology, outcome prediction and neuroprotective drug monitoring. //Restor. Neurol. Neurosci. — 2003. — Vol. 21. — P. 177-190.

58. Herrmann M., Vos P., Wunderlich M. T. et al. Release of glial tissue-specific proteins after acute stroke: A comparative analysis of serum concentrations of protein S100B and glial fibrillary acidic protein. // Stroke. — 2000 — Vol. 31—P. 2670-2677.

59. Higley H. R., McNulty J. A., Rowden G. Glial fibrillary acidic protein and SI00 protein in pineal supportive cells: an electron microscopic study. //Brain Res. — 1984, —Vol. 304 —P. 117-120.

60. Hill M. D., Jackowski G., Bayer N. et al. Biochemical markers in acute ischemic stroke // CMAJ. — 2000. — V. 18. — P. 162-168.

61. Hofler H., Walter G. F., Denk H. iMMunohistochemistry of folliculo-stellate cells in normal human adenoliypophyses and in pituitary adenomas. // Acta Neuro-pathol. — 1984. — Vol. 65. — P. 35-40.

62. Holland E. C., Varmus H. E. Basic fibroblast growth factor induces cell migration. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. — 1998. — Vol. 95. — P. 1218-1223.

63. Iida K., Takashima S. et al. iMMunohistochemical study of myelination and oligodendrocytes in infants with periventricular leukomalacia. // Pediatr. Neurol. Nov. — 1995. — Vol. 13. — P. 296-304.

64. Jauch E. C. Diagnosis of stroke: the use of serum markers. // Stroke. — 2000. —Vol. 31,—P. 39-45.

65. Kalman M., Pritz M. B. Glial fibrillary acidic protein-iMMunopositive structures in the brain of a Crocodilian, Caiman crocodilus, and its bearing on the evolution of astroglia. // J. Comp. Neurol. — 2001. — Vol. 431. — P. 460-480.

66. Kordower J. H., Chen E. Y., Winkler C. et al. Grafts of EGF-responsive neural stem cells derived from GFAP-hNGF. // J. Comp. Neurol. — 1997. — Vol. 387,—P. 96-113.

67. Kragh J., Bolwig T. G., Woldbye D. P. et al. Electroconvulsive shock and li-docaine-induced seizures in the rat activate astrocytes as measured by glial fibrillary acidic protein. //Biol. Psychiatry. — 1993. — Vol. 33. — P. 794-800.

68. Kristjansdottir R., Uvebrant P., Rosengren L. Glial fibrillary acidic protein and neurofilament in children with cerebral white matter abnormalities. // Neuro-pediatrics. — 2001. — Vol. 32. —P. 307-312.

69. Landry C. F., Ivy G. O., Brown I. R. Developmental expression of glial fibrillary acidic protein mRNA in the rat brain analyzed by in situ hybridization // J. Neurosci. — 1990. — Vol. 25. — P. 194-203.

70. Liedtke W., Edelmann W., Biery P. L., et al. GFAP is necessary for the integrity of CNS white matter architecture and long-term maintenance of myelination. //Neuron. — 1996. — Vol. 17. — P. 607-615.

71. Lundkvist J., Sundgren-Andersson A. K., Tingsborg S. et al. Acute-phase responses in transgenic mice with CNS overexpression of IL-1 receptor antagonist. // Am. J. Physiol. — 1999. — Vol. 276. — P. R644-651

72. Magerkurth O. Nachweis von saurem glialen Faserprotein (GFAP) in humanem Serum und erste klinische Ergebnisse. // Dissertation zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin. —München, 2003.

73. Mann D. M. A. The pathological association between Down's syndrome and Alzheimer's disease. // Mech. Aging Dev. — 1988. — Vol. 43. — P. 99-136.

74. McCall M. A., Gregg R. G., Behringer R. R. et al. Targeted deletion in astrocyte intermediate filament (Gfap) alters neuronal physiology. //Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. — 1996. — Vol. 93. — P. 6361-6366.

75. McKie E. A., Graham D. I., Brown S. M. Selective astrocytic transgene expression in vitro and in vivo. // Gene Therapy. — 1998. — Vol. 5. — P. 440 -450.

76. Michetti F., Larocca L. M., Rinelli A. et al. iMMuriocytochemical distribution of SI00 protein in patients with Down's syndrome. // Acta Neuropathol. — 1990. — Vol. 80. — P. 475-478.

77. Miller D. B., Blackman C. F., O'Callaghan J. P. An increase in glial fibrillary acidic protein follows brain hyperthermia in rats. //Brain Res. — 1987. — Vol. 415,—P. 371-374.

78. Missler U., Wiesmami M., Wittmann G. et al. Measurement of glial fibrillary acidic protein in human blood: Analytical method and preliminary clinical results. // Clin. Chem. — 1999. — Vol. 45. — P. 138-141.

79. Mito T., Becker L. E. Developmental changes of S100 protein and glial fibrillary acidic protein in the brain in Down syndrome. // Exp. Neurol. — 1993. — Vol. 120.—P. 170-176.

80. Mori T., Morimoto K., Hayakawa T., et al. RadioiMMunoassay of astro-protein (an astrocyte specific cerebroprotein) in cerebrospinal fluid and its clinical significance //Neurol. Med.-Chir. — 1978. — Vol. 18. — P. 25-31.

81. Mucke L., Rockenstein E. M. Prolonged delivery of transgene products to specific brain regions by migratory astrocyte grafts. // Transgenics. — 1993. — Vol. 1.—P. 3-9.

82. Murphy G. M., Eng L. F., Ellis W. G. et al. Antigenic profile of plaques and neurofibrillary tangles in the amygdala in Down's syndrome: a comparison with Alzheimer's disease. // Brain Res. — 1990. — Vol. 537. — P. 102-108.

83. Nakazato Y., Ishizeki J., et al. Localization of SI00 and glial fibrillary acidic protein-related antigen in pleomorphic adenoma of salivary glands. // Lab. Invest. — 1982. — Vol. 46. — P. 621-626.

84. Niebroj-Dobosz I., Rafalowska J., Lukasiuk M., et al. iMMunochemical analysis of some proteins in cerebrospinal fluid and serum of patients with ischemic strokes // Folia Neuropathol. — 1994. — Vol. 34. — P. 182-186.

85. O'Callaghan J. P., Lavin K. L., Chess G., Clouet D. H. A method for dissection of discrete regions of rat brain following microwave irradiation. // Brain Res. Bull. — 1983. — Vol. 11. — P. 31-42.

86. Onteniente B., Kimura H., Maeda T. Comparative study of the glial fibrillary acidic protein in vertebrates by PAP iMMunohistochemistry // J. Comp. Neurol. — 1983. — Vol. 215 — P. 427-436.

87. Papasozomenos S., Shapiro S. Pineal astrocytoma — report of a case, confined to the epiphysis, with iMMunocytochemical and electron microscopic studies // Cancer. — 1981. — Vol. 47. — P. 99-103.

88. Pekny M., Leveen P., Pekna M. et al. Mice lacking GFAP display astrocytes devoid of intermediate filaments but develop and reproduce normally. // EMBO J. — 1995 — Vol. 14 — P. 1590-1598.

89. Pekny M., Johansson C. B., Eliasson C. et al. Abnormal reaction to central nervous system injury in mice lacking glial fibrillary acidic protein and vimentin. // J. Cell Biol. — 1999. — Vol. 145. — P. 503-514.

90. Petito C. K., Halaby I. A. Relationship between ischemia and ischemic neuronal necrosis to astrocyte expression of glial fibrillary acidic protein // Int. J. Dev. Neurosci. — 1993. — Vol. 11. — P. 239-247.

91. Petzold A., Keir G., Green A. J. et al. An ELISA for glial fibrillary acidic protein. // J. iMMunol. Methods. — 2004. — Vol. 287. — P. 169-177.

92. Quintana J. G., Lopez-Colberg I., Cunningham, L. A. Use of GFAP-lacZ transgenic mice to determine astrocyte fate in grafts of embryonic ventral midbrain. //Brain Res. Dev. Brain Res. — 1998. — Vol. 105. — P. 147-151.

93. Ramer M. S., Kawaja M. D., Henderson J. T. et al. Glial overexpression of NGF enhances neuropathic pain and adrenergic sprouting into DRG followingchronic sciatic constriction in mice. //Neurosci. Lett. — 1998. — Vol. 251. — P. 53-56.

94. Ribotta M. G., Menet V., Privat A. Glial scar and axonal regeneration in the CNS: lessons from GFAP and vimentin transgenic mice. // Acta Neurochir. Suppl. — 2004. — Vol. 89. — P. 87-92.

95. Rosengren L. E., Ahlsen G., Belfrage M. et al. A sensitive ELISA for glial fibrillary acidic protein: application in CSF of children. // J. Neurosci. Methods. — 1992. — Vol. 44. — P. 113-119.

96. Rosengren L. E., Lycke J., Andersen O. Glial fibrillary acidic protein in CSF of multiple sclerosis patients: relation to neurological deficit. // J. Neurol. Sci. — 1995.— Vol. 133, —P. 61-65.

97. Rosengren L. E., Wikkelso C., Hagberg L. A sensitive ELISA for glial fibrillary acidic protein: Application in CSF of adults // J. Neurosci. Methods. — 1994. —Vol. 51.—P. 197-204.

98. Rozemuller J. M., Eikelenboom P., Stam F. C. et al. A4 protein in Alzheimer's disease: Primary and secondary cellular events in extracellular amyloid deposition. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. — 1989. — Vol. 48. — P. 674 -691.

99. Rutka J. T., Murakami M., Dirks P. B., et al. Role of glial filaments in cells and tumors of glial origin: a review // J. Neurosurg. — 1997. — Vol. 87. — P. 420-430.

100. Rutka J. T., Smith S. L. Transfection of human astrocytoma cells with glial fibrillary acidic protein complementary DNA: analysis of expression, proliferation, and tumorigenecity// Cancer Res. — 1993. — Vol. 53. — P. 3624-3641.

101. Ruutiainen J., Newcombe J., Salmi A. et al. Measurement of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and anti-GFAP antibodies by solid-phase radioiMMunoassays. // Acta Neurol. Scand. — 1981. — Vol. 63. — P. 297-305.

102. Salm A. K., Hatton G. I., Nilaver G. iMMunoreactive glial fibrillary acidic protein in pituicytes of the neurohypophysis // Brain Res. — 1982. — Vol. 236. — p. 471-476.

103. Schaumburg H. H., Powers J. M., Raine C. S. et al. Adrenoleukodystrophy. A clinical and pathological study of 17 cases. // Arch. Neurol. — 1975. — Vol. 33. — P. 577-591.

104. Schnitzer J., Franke W. W., Schachner M. iMMunocytochemical demonstration of vimentin in astrocytes and ependymal cells of developing and adult mouse nervous system // J. Cell Biol. — 1981. — Vol. 90. — P. 435-447.

105. Segovia J., Vergara P., Brenner M. Astrocyte-specific expression of tyrosine hydroxylase after intracerebral gene transfer induces behavioral recovery in experimental Parkinsonism. // Gene Therapy. — 1995. — Vol. 5. — P. 1650-1655.

106. Shibuki K., Gomi H., Chen L. et al. Deficient cerebellar long-term depression, impaired eye blink conditioning, and normal motor coordination in GFAP mutant mice. // Neuron. — 1996. — Vol. 16. — P. 587-599.

107. Smith J. D., Sikes J., Levin A. J. Human apolipoprotein E allele-specific brain expressing transgenic mice. //Neurobiol. Aging. — 1998. — Vol. 19. — P. 407-413.

108. Sporer B., Missler U., Magerkurth O. et al. Evaluation of CSF glial fibrillary acidic protein (GFAP) as a putative marker for HIV-associated dementia. // Infection. — 2004. — Vol. 32. — P. 20-23.

109. Suenaga T., Hirano A., Llena J. F. et al. Modified iMMunocytochemical studies in cerebellar plaques in Alzheimer's disease. // J. Neuropathol. Exp. Neurol.1990.— Vol. 49.—P. 31-40.

110. Sun Y., Wu S., Bu G. et al. Glial fibrillary acidic protein-apolipoprotein E (apoE) transgenic. // J. Neurosci. — 1998. — Vol. 18. — P. 3261-3272.

111. Tardy M., Fages C., Riol H., et al. Developmental expression of the glial fibrillary acidic protein mRNA in the central nervous system and in cultured astrocytes // J. Neurochem. — 1989. — Vol. 52. — P. 162-167.

112. Trejo F., Vergara P., Brenner M. et al. Gene therapy in a rodent model of Parkinson's disease using differentiated C6 cells expressing a GFAP-tyrosine hydroxylase transgene. // Life Sci. — 1999. — Vol. 65. — P. 483-491.

113. Tsukita S. Ishikawa H., Karokawa M. Isolation of 10 nm filaments from astrocytes in the mouse optic nerve. // J. Cell Biol. — 1981. — Vol. 88. — P. 245250.

114. Van Geel W. J., de Reus H. P., Nijzing H. et al. Measurement of glial fibrillary acidic protein in blood: An analytical method. // Clin. Cliim. Acta. — 2002. — Vol. 326,—P. 151-154.

115. Vijayan V., Geddes J. W., Anderson K. J. et al. Astrocyte hypertrophy in the Alzheimer's disease hippocampal formation. // Exp. Neurol. — 1991. — Vol. 112.P. 72-78.

116. Wallin A., Blennow K., Rosengren L. E. Glial fibrillary acidic protein in the cerebrospinal fluid of patients with dementia. // Dementia. — 1996. — Vol. 7. — P. 267-272.

117. Yu A. C., Lee Y. L., Eng L. F. Inhibition of GFAP synthesis by antisense RNA in astrocytes. // J. Nenrosci. Res. — 1991. — Vol. 30. — P. 72-79.

118. Bernier, L.; Colman, D. R.; D'Eustachio, P. Chromosomal locations of genes encoding 2-prime,3-prime cyclic nucleotide 3-prime-phosphodiesterase and glial fibrillary acidic protein in the mouse. J. Neurosci. Res. 20: 497-504, 1988. PubMed ID :2903254

119. Yu A. C., Lee Y. L., Eng L. F. Astrogliosis in culture: I. The model and the effect of antisense oligonucleotides on glial fibrillary acidic protein synthesis. // J. Neurosci. Res. — 1993. — Vol. 34. — P. 295-303.

120. Hallpike J. F., Adams C. W. M., Tourtellotte W. W. Multiple Sclerosis. Pathology, diagnosis and management. — Baltimore: Williams & Wilkins, 1983.

121. De Strooper, B. Aph-1, Pen-2, and nicastrin with presenilin generate an active gaMMa-secretase complex. Neuron 38: 9-12, 2003. PubMed ID : 12691659

122. Li, Y.-M.; Xu, M.; Lai, M.-T.; Huang, Q.; Castro, J. L.; DiMuzio-Mower, J.; Harrison, T.; Lellis, C.; Nadin, A.; Neduvelil, J. G.; Register, R. B.; Sardana, M. K.; Shearman, M. S.; Smith, A. L.; Shi, X.-P.; Yin, K.-C.; Shafer, J. A.; Gardell, S. J. :

123. Photoactivated gaMMa-secretase inhibitors directed to the active site cova-lently label presenilin 1. Nature 405: 689-694, 2000. PubMed ID : 10864326

124. Page, K.; Hollister, R.; Tanzi, R. E.; Hyman, B. T. In situ hybridization analysis of presenilin 1 mRNA in Alzheimer disease and in lesioned rat brain. Proc. Nat. Acad. Sci. 93: 14020-14024,1996. PubMedID : 8943053

125. Bernier, L.; Colman, D. R.; DEustachio, P. Chromosomal locations of genes encoding 2-prime,3-prime cyclic nucleotide 3-prime-phosphodiesterase and glial fibrillary acidic protein in the mouse. J. Neurosci. Res. 20: 497-504, 1988. PubMed ID :2903254

126. Brownell, E.; Lee, A. S.; Pekar, S. K.; Pravtcheva, D.; Ruddle, F. H.; Bay-ney, R. M. : Glial fibrillary acid protein, an astrocytic-specific marker, maps to human chromosome 17. Genomics 10: 1087-1089, 1991. PubMedID : 1655631

127. Brenner, M.; Johnson, A. B.; Boespflug-Tanguy, O.; Rodriguez, D.; Goldman, J. E.; Messing, A. Mutations in GFAP, encoding glial fibrillary acidic protein, are associated with Alexander disease. Nature Genet. 27: 117-120, 2001.

128. Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М. и соавт. Моделирование и иммуногистохимический анализ глиомы Сб. // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2007 — №2 — С. 65 — 73.

129. Erlich et al., Recent advances in the PCR. Science, 1991

130. Di Donato et al. A method for synthesizing denes and cDNAs by the PCR. Anal. Biochem. -1993

131. Ornstein L. Disc electrophoresis. I. Background and theory. // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 1964. — Vol. 121. — P. 321-349.

132. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. — 1979. — Vol. 76. — P. 4350-4354.

133. Porath J, Carlsson J, Olsson I, Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.Nature. 1975 Dec 18;258(5536):598-9. No abstract available. РМЮ: 1678 PubMed indexed for MEDLINE.

134. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантаев Б.Б., Гаврилова E.M., Теория и практика иммуноферметного анализа. 1991

135. Albrechtsen М, Bock, Quantification of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in human body fluids by means of ELISA employing a monoclonal anti-body.E.J NeuroiMMunol. 1985 Jun;8(4-6):301-9.

136. Petzold A, Keir G, Green AJ, Giovannoni G, Thompson EJ.J An ELISA for glial fibrillary acidic protein.lMMunol Methods. 2004 Apr;287(l-2): 169-77.

137. Weller Т.Н. и Coons A.H. (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1954, V. 86, p. 787794).