Полимеразная цепная реакция при диагностике лептоспироза и изучение органотропности лептоспир у сельскохозяйственных животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат ветеринарных наук Викторова, Елена Владимировна

• Викторова, Елена Владимировна
• кандидат ветеринарных наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Викторова, Елена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 ГЛАВА 1. КРАТКАЯ ИСТОРИЧЕСКАЯ СПРАВКА

ГЛАВА 2. СИСТЕМАТИКА И НОМЕНКЛАТУРА ЛЕПТОСПИР

2.1. Дифференциация патогенных и сапрофитных лептоспир

ГЛАВА 3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛЕПТОСПИР

3.1. Морфология лептоспир 3.2. Физиология лептоспир

3.3. Патогенность лептоспир

ГЛАВА 4. ПАТОГЕНЕЗ ЛЕПТОСПИРОЗА

ГЛАВА 5. КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ

ГЛАВА 6. ПАТОЛОГОАНАТОМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ 28 щ

ГЛАВА 7. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ЛЕПТОСПИР В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ

ГЛАВА 8. ДИАГНОСТИКА ЛЕПТОСПИРОЗА

8.1. Микроскопия

8.2. Выделение культур

8.3. Биопроба 32 ♦ 8.4. Серологический метод

8.5. Молекулярно-генетические методы

ГЛАВА 9. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

9.1. Преимущества метода ПЦР

9.2. Ограничения метода ПЦР

9.3. Применение ПЦР при диагностике инфекционных болезней

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Полимеразная цепная реакция при диагностике лептоспироза и изучение органотропности лептоспир у сельскохозяйственных животных»

Лептоспироз - инфекционная природно-очаговая болезнь животных многих видов и человека, регистрируется в большинстве стран мира.

Возбудители лептоспироза - микроорганизмы рода Leptospira, относящиеся к семейству Leptospiraceae в порядке Spirohaetales. Род Leptospira объединяет два вида - Leptospira interrogans (патогенные лептоспиры) и Leptospira biflexa (сапрофитические). Патогенные лептоспиры по степени антигенного родства объединены в 23 серологические группы.

Лептоспирозом болеют животные различных видов в любом возрасте, наиболее тяжело болезнь протекает у молодняка. Во внешней среде лептоспиры паразитируют в природных очагах на мелких диких млекопитающих; в антропургических - на сельскохозяйственных животных и синантропных грызунах.

В Российской Федерации ежегодно регистрируется от 20 до 60 неблагополучных пунктов, где заболевает в среднем около 3000 животных и погибает от лептоспироза от 20 до 100 животных. Среди людей ежегодно регистрируется до 1500 тыс случаев заболевания лептоспирозом, на долю детей приходится до 20% случаев. Летальность составляет до 10% [7, 12].

В организм человека и животных лептоспиры проникают через незначительные повреждения кожи и неповрежденные слизистые оболочки рта, носа, глаз, желудочно-кишечного и мочеполового трактов.

У крупного рогатого скота в типичных случаях болезнь проявляется кратковременной лихорадкой, реже иктерогемоглобинурией, некрозом слизистых оболочек и кожи, абортами; в ряде случаев атипичными маститами, синдромом потери молочной продуктивности.

Основным симптомом лептоспироза у свиней являются аборты во второй половине супоросности или рождение нежизнеспособных поросят.

У животных лептоспиры паразитируют в корковом слое почек, а возбудители некоторых сероваров (hardjo, bratislava, munchen) - также в слизистой оболочке мочеполового тракта. Выделяясь во внешнюю среду с мочой, они инфицируют почву, воду, пастбища, корма, подстилку, пищевые продукты и другие объекты, которые могут служить факторами передачи возбудителя инфекции. Основной путь передачи инфекции -водный, меньшее значение имеют контактный, пищевой и половой пути.

Клинические и патологоанатомические признаки не служат достаточным основанием для постановки диагноза. Они позволяют только

Щ предположить вероятность инфицирования лептоспирами. Для постановки диагноза необходимо лабораторное подтверждение.

Диагноз на лептоспироз устанавливают следующими методами: 1) бактериологический (включает микроскопию, выделение культуры, биопробу); 2) серологический; 3) гистологический.

За рубежом и в нашей стране наиболее широко применяется серологический метод диагностики с использованием реакции микроагглютинации (РМА). РМА является и чувствительной и специфичной, однако остается весьма трудоемкой в постановке, требует поддержания и использования живых культур лептоспир.

Бактериологический и гистологический методы в нашей стране практически не используются из-за ряда объективных и субъективных причин, в том числе и из-за низкой чувствительности.

Учитывая то, что своевременная постановка диагноза позволяет Ф успешно бороться с заболеванием, необходимо найти методы диагностики, более эффективные по сравнению с используемыми.

Актуальность темы

Лептоспиры, в отличие от большинства микроорганизмов других видов, трудно культивируются на питательных средах. Первичные культуры лептоспир при высеве из патологического материала вырастают в течение 10-90 дней, при этом посевы микроскопируют каждые 5 дней.

Микроскопия является недостаточно чувствительным методом. Она позволяет обнаруживать лептоспиры, когда их количество составляет сотни тысяч микробных клеток в см3.

При использовании реакции микроагглютинации (РМА) необходимо повторное исследование сыворотки крови с целью выявления нарастания титра антител. К тому же РМА не позволяет дифференцировать вакцинированных животных от инфицированных и выявлять лептоспироносите-ф лей, в сыворотке крови которых специфические антитела могут отсутствовать.

К числу недостаточно изученных вопросов при лептоспирозе относится органотропность лептоспир, т.е. их локализация, помимо почек, в других органах и тканях, что важно с точки зрения ветсанэкспертизы про-Щ дуктов убоя и оценки эффективности лечебных препаратов. Эти вопросы не представляется возможным решить бактериологическим или серологическим методами. Для совершенствования диагностики необходимы новые более чувствительные методы. Одним из таких методов является полиме-разная цепная реакция (ПЦР), обладающая высокой специфичностью и ^ чувствительностью.

Цели и задачи исследований

Целью работы является создание тест-системы для диагностики ^ лептоспироза животных методом ПЦР, изучение возможности ее использования для выявления животных-лептоспироносителей, изучения патогенеза заболевания.

Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:

1. Создать тест-систему ПЦР для обнаружения патогенных лептоспир.

2. Изучить специфичность тест-системы, ее способность обнаруживать ДНК лептоспир в различном патологическом материале, г полученном от животных (кровь, моча, абортированный плод, кусочки органов и тканей и т.д).

3. Провести сравнительную оценку полимеразной цепной реакции с традиционными методами обнаружения лептоспир.

4. Разработать нормативную документацию на тест-систему.

5. Изучить с помощью ПЦР локализацию и сроки персистирования лептоспир в органах и тканях экспериментально зараженных животных (лабораторных и сельскохозяйственных).

6. Изучить распространенность лептоспир в органах и тканях убойного крупного рогатого скота.

Научная новизна.

Впервые в нашей стране создана тест-система для обнаружения патогенных лептоспир с помощью полимеразной цепной реакции, которая является высокочувствительной и специфичной.

Использование тест-системы позволило изучить локализацию и сроки персистирования лептоспир в органах и тканях экспериментально зараженных животных (золотистых хомячков, крупного рогатого скота и свиней), а также распространенность лептоспир в органах и тканях убойного крупного рогатого скота.

Практическая значимость работы.

Разработана тест-система для обнаружения патогенных лептоспир с помощью полимеразной цепной реакции (совместно с НПО «Нарвак»).

Разработана и утверждена временная, а затем постоянная Нормативная документация:

-ТУ «Тест-система для обнаружения патогенных лептоспир методом ПЦР» 9388-001-42418073-02, утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11 июля 2002 г.;

-Инструкция по применению «Тест-системы для обнаружения патогенных лептоспир методом ПЦР», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 20 марта 2003 г.

Тест-система выпускается для практического применения, используется в ветеринарных диагностических лабораториях для постановки или подтверждения диагноза на лептоспироз. ф Подготовлен к согласованию в Россельхознадзоре проект Инструкции по борьбе с лептоспирозом животных, в которой метод ПЦР предложен, как один из методов диагностики лептоспироза.

Апробация работы.

Результаты исследований по диссертационной работе доложены и положительно оценены на:

1. Всероссийской научной конференции "Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов", посвященной 70-летию ВГНКИ, Москва, 2001 г.

2. X Московском международном ветеринарном конгрессе, Москва, 2002 г.

3. IX Всероссийской конференции по лептоспирозу, Анапа, 2003 г.

4. Межлабораторном совещании по рассмотрению диссертационной работы в ФГУ ВГНКИ, Москва, 2006 г.

5. Всероссийской научной конференции "Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов", посвященной 75-летию ФГУ ВГНКИ, Москва, 2006 г.

Экспериментальные материалы, представленные в диссертации, получены как лично автором, так и в соавторстве с сотрудниками НПО «Нар-вак».

На защиту выносится:

1. Обоснование применения метода полимеразной цепной реакции для диагностики лептоспироза.

2. Результаты изучения сроков обнаружения и органотропности лептоспир в организме экспериментально зараженных лабораторных и сельскохозяйственных животных.

3. Результаты изучения распространенности лептоспир в органах и тканях убойного крупного рогатого скота.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Викторова, Елена Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Создана тест-система и оптимизированы условия для выявления патогенных лептоспир методом ПЦР, определены ее специфичность и чувствительность, которая составляла в нативных культурах и суспензиях органов о

1-10 клеток в пробе, что соответствует примерно 40-400 клеткам/см , в печени - 100-1000 клеток в пробе.

2. Сравнение различных методов диагностики показало, что полимераз-ная цепная реакция (ПЦР) может быть использована для диагностики лептоспироза животных наравне с традиционными методами исследований (бактериологическими и серологическими).

3. «Тест-система для обнаружения патогенных лептоспир методом ПЦР» позволяет поставить диагноз на лептоспироз в течение 4-6 часов.

4. Тест-система ПЦР обеспечивает выявление лептоспир не только в на-тивном, но и в замороженном патологическом материале.

5. ДНК лептоспир обнаруживается в крови, моче и органах животных на 1-4 сутки после заражения, что позволяет диагностировать лептоспироз на ранних стадиях болезни.

6. Полимеразная цепная реакция позволяет дифференцировать вакцинированных животных от инфицированных лептоспирами.

7. У лабораторных животных методом ПЦР лептоспиры обнаружены в большинстве паренхиматозных органов через сутки после заражения, а на 215 сутки - во всех органах и тканях. Через 2 месяца они выявлены только в почках, моче, спинном мозге и лимфатических узлах инфицированных животных.

8. У сельскохозяйственных животных после заражения лептоспиры проникают в кровь в течение первых 3-4 суток и разносятся по всем органам и тканям, а затем постепенно элиминируются в течение 3-6 месяцев. В лимфатических узлах ДНК лептоспир обнаруживалась в течение всего срока исследований (12 месяцев у телят и 14 месяцев у поросят).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для диагностики лептоспироза, наряду с традиционными методами исследований, рекомендуем использовать «Тест-систему для обнаружения патогенных лептоспир методом ПЦР».

2. Для прижизненной диагностики лептоспироза целесообразно использовать мочу, кровь, спинномозговую жидкость; для посмертной диагностики можно использовать любые паренхиматозные органы.

3. «Тест-систему для обнаружения патогенных лептоспир методом ПЦР» следует использовать:

-для ранней диагностики лептоспироза;

-для выявления лептоспироносителей;

-для дифференциации инфицированных и вакцинированных животных;

-для оценки эффективности противолептоспирозных препаратов.

4. Разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация:

-ТУ 9388-001-42418073-02 «Тест-система для обнаружения патогенных лептоспир методом ПЦР», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11 июля 2002 г.;

-Наставление по применению «Тест-системы для обнаружения патогенных лептоспир методом ПЦР», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 20 марта 2003 г.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Правильная и своевременная диагностика лежит в основе борьбы с любой инфекционной болезнью. Постановка диагноза при лептоспирозе -сложный и многосторонний процесс. Клинические признаки и патологоанатомические изменения должны быть в обязательном порядке подтверждены лабораторными методами исследований. Серьезную проблему представляют животные-лептоспироносители, которые не имеют клинических признаков болезни, но активно выделяют лептоспиры в окружающую среду и являются источником возбудителя инфекции .

Классическими лабораторными методами для постановки диагноза на лептоспироз являются реакция микроагглютинации (РМА), микроскопия в темном поле, выделение бактериальной культуры, постановка биопробы на золотистых хомячках или крольчатах.

Микроскопия в темном поле является быстрым, но малочувствительным методом. К тому же, многочисленные представители лептоспир вида Biflexa не отличаются по морфологии от патогенных лептоспир.

Выделение культуры и биопроба на лабораторных животных требуют затрат времени (от 7 суток), что является неприемлемым для быстрой постановки диагноза.

Реакция микроагглютинации (РМА) является эталонной, наиболее широко применяемой при диагностике лептоспироза и оценке других диагностических реакций. РМА позволяет устанавливать диагноз при остром течении лептоспироза по нарастанию титра антител в пробе парных сывороток. Диагноз в этом случае считается бесспорным. Однако как любой метод, РМА имеет свои ограничения, например, не позволяет по титру антител дифференцировать вакцинированных животных от инфицированных, не позволяет выявить инфицированных животных на начальных стадиях заболевания, так как первые антитела, выявляемые в РМА, появляются с 4-7 дня после заражения в достаточно низком титре. Кроме того, для определения нарастания титра антител необходимо повторное исследования сыворотки крови через 10-14 дней после первичного исследования.

Показания РМА нельзя использовать для выявления животных-лептоспироносителей, так как до 20% и более лептоспироносителей дают отрицательный результат РМА.

В последние годы широкое распространение получили молекулярно-генетические методы исследований, позволяющие быстро и эффективно обнаруживать возбудителя в любом материале, проводить его идентификацию.

ПЦР используется для выявления возбудителей многих болезней, в том числе и лептоспироза, и имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами диагностики. Данный метод может быть использован для уточнения или решения ряда актуальных с нашей точки зрения вопросов, таких как изучение локализации и сроков персистирования лептоспир в органах и тканях инфицированных животных, оценка эффективности препаратов, применяемых при лечении животных и многих других.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

ГЛАВА 10. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в период с 1999 по 2005 гг. в лаборатории качества и стандартизации лекарственных средств против зоонозных болезней Федерального государственного учреждения "Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ)" и ЗАО "НПО Нарвак".

В работе использовали штаммы лептоспир, питательные среды, реактивы, лабораторное оборудование, животных (лабораторных и сельскохозяйственных), бактериологические, серологические, иммунологические и другие методы диагностики лептоспироза. Для исследований методом полимеразной цепной реакции был использован набор для выявления ДНК патогенных лептоспир, разработанный совместно с НПО "Нарвак".

10.1. Материалы

Штаммы.

В работе использованы 33 штамма лептоспир видов Leptospira interrogans и Leptospira biflexa 17 серогрупп (табл.3).

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Викторова, Елена Владимировна, 2006 год

1. АЗАРЯН Р.П. Патогенез лептоспироза у свиней и усовершенствование методов терапии: Автореф. дисс. на соиск. уч. степ. докт. вет. наук / Азарян Р.П.; Казань, 1982. 36 с.

2. АНАНЬИН В.В. Лептоспирозы людей и животных / Ананьин В .В. -М. -1971.

3. АНАНЬИНА Ю.В., ЧЕХОВИЧ А.В., ЧЕРНУХА Ю.Г. / Тез. Докл. I Всесоюзной конф. «Проблемы патологии и экологической взаимосвязи болезней диких теплокровных и сельскохозяйственных животных. М. - 1988. -с. 23-24.

4. АНАНЬИНА Ю.В, ЧЕРНУХА Ю.Г. / Тез. Докл. 12-ой Всесоюзной конф. По природной очаговости болезней. М. - 1989. - с. 8-10.

5. АНАНЬИНА Ю.В. Проблемы экологии патогенных лептоспир: Автореф. дисс. на соиск. уч. степ. докт. мед. наук / Ананьина Ю.В.; М, 1993.

6. АНАНЬИНА Ю.В. Особенности гостальной персистенции патогенных лептоспир / Ананьина Ю.В. // Биомедицинские технологии. М. - 1996. -вып. 4. - с. 8-10.

7. АНАНЬИНА Ю.В. Современные тенденции эпидемического проявления природных и техногенных очагов лептоспирозов / Ананьина Ю.В. // Лептоспироз: материалы 10-й Всерос. науч.-практ. конф. по лептоспирозу, Анапа,- 18-20 сент 2003 г. - с.40-42.

8. АРТЮШИН С.К. Изучение генетического родства лептоспир: Автореф. Дисс. Канд. Биол. Наук / Артюшин С.К.; М, 1980,-15 с.

9. БАЛАШОВ Н.Г. Выделение лептоспир из спермы животных / Балашов Н.Г, Родина В.Н. // Материалы симпозиума по лептоспирозу. М. -1972.-с. 151-152.

10. БЕЛОУСОВ В.И. Методические рекомендации по идентификации производственных штаммов лептоспир и дифференциации L. interrogans от L.biflexa в реакции ДНК-ДНК-гибридизации / Белоусов В.И., Тюрина И.Н., Артюшин С.К. М. - 2001. - 9 с.

11. БЕЛОУСОВ В.И. Лептоспироз животных в Российской Федерации и меры борьбы с ними / Белоусов В.И., Абрамов В.Н., Калмыков М.В. // Лептоспироз: материалы 10-й Всерос. науч.-практ. конф. по лептоспирозу, Анапа.- 18-20 сент,- 2003 г. с.6-10.

12. БЕРНАСОВСКАЯ Е.П. Выявление антигенов лептоспир в биологических жидкостях и окружающей среде / Бернасовская Е.П., Назарова О.Г., Могирева Л.А. // Тезисы докладов VIII Всесоюзной конференции по лептоспирозам. Тбилиси, 1983. - с. 270-271.

13. БЕРНАСОВСКАЯ Е.П. Лептоспироз / Бернасовская Е.П., Угрюмов Б.Л., Вовк А.Д. Киев. - 1989. - 152 с.

14. БОЛОЦКИЙ И.А. Лептоспироз животных в зоне Северного Кавказа. Дисс. на соиск. уч. степени докт. вет. наук. - М., 1998

15. ДРАГУН А.Г. Материалы по патологической морфологии лептоспироза свиней: Автореф. дисс. на соиск. уч. степ. канд. вет. наук / Дрогун А.Г., М, 1970.

16. ЕЖОВ Г.И. Содержание нуклеиновых кислот и нуклеотидный состав РБК у некоторых штаммов лептоспир / Ежов Г.И, Березова Т.Т, Кик-тенко B.C. // ЖМЭИ. 1974. - N9. - с.70-73.

17. ЕЖОВ Г.И. Генотипические и фенотипические критерии систематики лептоспир / Ежов Г.И, Лысенко А.М, Артюшин С.К. // Тезисы докладов VIII Всесоюзной конференции по лептоспирозам. Тбилиси, 1983. - с. 35-37.

18. ИОНОВА О.П. Сравнительный анализ ультраструктуры сапрофитного и паразитического штаммов лептоспир / Ионова О.П, Котылев О.А, Ежкова М.С, Садыков И.И. // Тезисы докладов VIII Всесоюзной конференции по лептоспирозам. Тбилиси, 1983. - с. 41-42.

19. КИКТЕНКО B.C. Лептоспироз / Киктенко B.C., Ежов Г.И, Волина Е.Г. М, издательство Университета дружбы Народов, 1985, -149 с.

20. ЛАВРЕНТЬЕВ Н.И. К вопросу прижизненной диагностики лептос-пирозов сельскохозяйственных животных / Лаврентьев Н.И. // Материалы симпозиума по лептоспирозу. М. - 1972. - с. 94-95.

21. ЛОПУХОВ Л.В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике / Лопухов Л.В, Эйдельштейн М.В. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. - т. 2. - № 3 -Лабораторная диагностика. - с. 96-106.

22. ЛЮ ЧЖУН ФУ Разработка тест-системы на основе полимеразной цепной реакции для диагностики лептоспирозов в очагах тропического пояса: Автореф. дисс. на соиск. уч. степ. канд. мед. наук / Лю Чжун Фу. М. -1976.-22 с.

23. МАВЗЮТОВ А.Р. Ингибиторы полимеразной цепной реакции / Мавзютов А.Р, Бондаренко В.М, Латкин А.Т. // Микробиология, эпидемиология и иммунология. 2003. - № 3. - 93-98.

24. МАККРЕДИ Б.ДЖ, ЧИМЕРА Д.А. Обнаружение и идентификация патогенных микроорганизмов молекулярными методами / Маккреди Б.Дж, Чимера Д.А. // Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М.: Мир. - 1999. -С.496- 506.

25. МАЛАХОВ Ю.А. Лептоспироз животных / Малахов Ю.А. М: Аг-ропромиздат, 1992, -238 с.

26. МАЛАХОВ Ю.А. Лептоспироз животных / Малахов Ю.А., Панин А.Н., Соболева Г.Л. Ярославль, ДИА-пресс, 2001. - 584 с.

27. МАНИАТИС Т. Молекулярное клонирование / Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. // Перевод с англ. М: Мир, 1984, - 479 с.

28. МЕЛЬНИЦКАЯ Е.В. Антигенный эритроцитарный диагностикум для определения инфицированности собак лептоспирами / Мельницкая Е.В., Дремлюга В.И., Кондратенко В.Н. // Ветеринария. 1990. - № 5. - с. 66.

29. МЕЛЬНИЦКАЯ Е.В. Экспресс-методы в диагностике лептоспироза и обнаружении лептоспироносительства у грызунов / Мельницкая Е.В., Бер-насовская Е.П., Кондратенко В.Н. // Биомедицинские технологии. М. -1996.-вып. 4.-с. 22-27.

30. ПОЛЕВОДОВ Н.А. Материалы к обоснованию ветеринарно-санитарной оценки продуктов убоя свиней при лептоспирозе: Автореф. дисс. на соиск. уч. степ. канд. вет. наук / Полеводов Н.А. М. - 1973. - 20 с.

31. ПРУСС О.Г. Реакция диффузионной преципитации в геле (РДП) при лептоспирозе свиней / Прусс О.Г., Карышева А.Ф. // Материалы симпозиума по лептоспирозу. М. - 1972. - с. 75-76.

32. САМСОНОВА А.П. Разработка тест-системы на основе ПЦР для изучения гостальной персистенции лептоспир и диагностики лептоспироза: Автореф. дисс. на соиск. уч. степ. канд. мед. наук / Самсонова А.П. М. -1995.-20 с.

33. САМСОНОВА А.П. Применение методов амплификации ДНК при изучении проблем лептоспирозов / Самсонова А.П, Лю Чжун Фу, Гинцбург А.Л, Ананьина Ю.В. // Биомедицинские технологии. М. - 1996. - вып. 4. -с. 44-48.

34. САМСОНОВА А.П. Новый методический подход к изучению персистенции лептоспир при смешанной лептоспирозной инфекции / Самсонова А.П, Петров Е.М, Вышивкина Н.В, Ананьина Ю.В. // Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2003. - № 4. - с. 37-39.

35. ТРОП И.Е. Промысловые животные Приамурья резервы лептоспир / Троп И.Е. // Тезисы докладов VIII Всесоюзной конференции по лептоспирозам. - Тбилиси, 1983. - с. 161-163

36. ФЕДОРОВА Р.А. Изучение генетического родства лептоспир методами геносистематики / Федорова Р.А, Лысенко A.M., Чернуха Ю.Г. // Тезисы докладов VIII Всесоюзной конференции по лептоспирозам. -Тбилиси, 1983. с. 59-61.

37. ФЕДОРОВА Р.А. Сравнение двух способов изучения гомологий в ДНК лептоспир / Федорова Р.А, Лысенко A.M., Чернуха Ю.Г. // Тезисы докладов VIII Всесоюзной конференции по лептоспирозам. Тбилиси, 1983. -с. 61-63.

38. ШКАРЛАТ П.Е. Латексная тест-система для экспресс диагностики лептоспирозной инфекции у собак: Автореф. дисс. на соиск. уч. степ канд. биол. наук / Шкарлат П.Е. М. - 2003. 20 с.

39. ADLER В. The sensitivity of different immunoassay for detecting lepto-spiral antigen / Adler B, Chappel R.J, Faine S. // Zbl. Bact. I. Abt. Orig. A. -1982. Bd. 252. - № 3. - s. 405-413.

40. ATTIA E.R.H. Dot Enzyme linked immunosorbent assay as a quick reliable diagnostic aid for Leptospirosis / Attia E.R.H, Ibrahim I.G.A, Tawfik M.S. // Assiut. Veter. Med. J. 1996. - vol. 36. - № 71 - p. 167-172.

41. BAL A.E. Detection of leptospires in urine by PCR for early diagnosis of leptospirosis / Bal A.E, Gravekamp C, Hartskeerl R.A, De Meza-Brewster J, Korver H, Terpstra W.J. // J Clin Microbiol 1994 Aug - 32(8) - p. 1894-1898

42. BLOCKER A. Leptospirosis / Blocker A., Baranton G., Saint Girons J. -Moscow. 1990.-p. 54.

43. BRENDLE J.J. Deoxyribonucleic acid hybridization among selected lep-tospiral serotypes / Brendle J.J., Rogul M.A. // Jnt. J of System. Bacterid 1974. -№24-p. 205-214.

44. BROWN P.D. Evaluation of the polymerase chain reaction for early diagnosis of leptospirosis / Brown P.D., Gravekamp C., Carrington D.G., van de Kemp

45. H, Hartskeerl R.A., Edwards C.N., Everard C.O., Terpstra W.J., Levett P.N. //

46. J Med Microbiol 1995 Aug - 43 (2) - p. 110-114

47. BUNNELL J.E. Detection of pathogenic Leptospira spp. Infections among mammals captured in the Peruvian Amazon basin region / Bunnell J.E., Hice C.L., Watts D.M., Montrueil V., Tesh R.B., Vinetz J.M. // Am J Med Hyg 2000 Nov-Dec-63 (5-6)-p. 255-258.

48. CHESKY M. Polymerase chain reaction for the laboratory diagnosis ofaseptic meningitis and encephalitis / Chesky M., Scalco R., Failace L., Read S., Jobim L.F. // Arq Neuropsiquiatr 2000 Sep - 58(3B) - p. 836-842

49. CORNEY B.G. Rapid identification of some Leptospira isolates from cattle by random amplified polymorphic DNA fingerprinting / Corney B.G., Colley J., Djordjevic S.P., Whittington R., Graham G.C. // J Clin Microbiol 1993 Nov31(11)-p. 2927-2932

50. DRAGON A.D. Quality Control of Polymerase Chain Reaction / Dragon A.D., Spadoro J.P., Madej R. // Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications Washington: ASM Press. - 1993.-p.160- 168.

51. ELLIS W.A. Bovine Leptospirosis / Ellis W.A. // Irish. Veter. News. -1983.-p. 12-14.

52. ELLIS W.A. Isolation of leptospires from the genital tracts of Iowa cows / Ellis W.A., Thiemann A.B. // Am. J. veter. Res. 1986. - vol. 47. - № 8. - p. 1694-1696.

53. ELLIS W. A. Leptospirosis / Ellis W.A. // OIE manual of recommended diagnostic techniques and requirements for biological products for List A and В diseases Paris - 1994 - Vol 2 - sect 7 - p. 1

54. FARINA R. Research of Leptospira interrogans serovar harjio in the genital and urinary tracts of sheep / Farina R, Andreani E, Cerri D, Penzoni G, Pedrini A. // Abst. VIII th Meeting of European Leptospira workers. Anzio (Rome).- 1994. p.-10.

55. FREDERICKS D.N. Application of Polymerase Chain Reaction to the Diagnosis of Infectious Diseases / Fredericks D.N, Relman D.A. // Clin Infect Dis. 1999.-29:457-p. 88.

56. GERRITSEN M.A. Random amplified polymorphic DNA fingerprinting for rapid identification of leptospiras of serogroup Sejroe / Gerritsen M.A, Smits M.A, Olyhoek T. // J Med Microbiol 1995 May - 42(5) - p. 336-339

57. GRAVEKAMP C, VAN DE KEMP H, CARRINGTON D. / Leptospirosis Research Conference: Proceedings. 1990.

58. GREGOIRE N. Isolation of leptospires from nephritic kidneys of beef cattle at slaughter / Gregoire N., Higgins R., Robinson Y. // Am. J. vet. Res. 1987. -vol. 48. - № 3. - p. 370-371

59. GREIZEN K. PCR Primers and Probes for the 16S rRNA Gene of Most Species of Pathogenic Bacteria, Including Bacteria Found in Cerebrospinal Fluid / Greizen K., Loeffelholz M., Purohit A., Leong D. // J Clin Microbiol. 1994. -32:335 -p. 51

60. HAAPALA D.K. Deoxyribonucleic acid base composition and homology of Leptospira. / Haapala D.K., Rogul M., Evaus L., Alexander A. // J.Bacteriol -1969-N98-p. 421-428.

61. HERRMANN J.L. Genome conservation in isolates of Leptospira interrogans / Herrmann J.L., Baril C., Bellenger E., Perolat P., Baranton G., Saint Girons I.//J Bacterid-1991 Dec- 173 (23)-p. 7582-7588.

62. HERRMANN J.L. Genomic techniques for identification of Leptospirastrains / Herrmann JL. // J Clin Microbiol 1992 Jul - 30 (7) - p. 1696-1702.

63. HOOKEY J.V. The use of 16S rDNA sequence analysis to investigate the phylogeny of Leptospiraceae and related spirochaetes / Hookey J.V., Bryden J., Gatehouse L. // J Gen Microbiol 1993 Nov - 139 (Pt 11) - p. 2585-2590.

64. HOOKEY JV. The detection of genetic variation in Leptospira interrogans serogroup ICTEROHAEMORRHAGIAE by ribosomal RNA gene restriction fragment patterns / Hookey J.V. // J Gen Microbiol.

65. KATHE J. Leptospiren und Leptospirosen / Kathe J, Mochmann H. -1967.-482.

66. KEE S.H. Detection of leptospiral DNA by PCR / Kee S.H, Kim I.S, Choi M.S., Chang W.H. // J Clin Microbiol 1994 Apr - 32 (4) - p. 1035-1039

67. Leptospirosis / OIE Terrestrial Manual. 2004. - Chapter 2.2.4. - p. 316320.

68. Leptospirosis / ZOONOSES REPORT UNITED KINGDOM 2001 - p. 42-44

69. LIN M. PCR genome walking identifies a genetic locus comprising two heat shock genes (hslV and hslU) from Leptospira borgpetersenii serovar hardjobovis / Lin M, Li Y. // Curr Microbiol 2001 Dec - 43 (6) - p. 452-456

70. MASRI S.A. A polymerase chain reaction assay for the detection of Leptospira spp. in bovine semen / Masri S.A, Nguyen P.T, Gale S.P, Howard C.J, Jung S.C.//Can J Vet Res- 1997 Jan-61(1)-p. 15-20

71. MERIEN F. Polymerase chain reaction for detection of Leptospira spp. in clinical samples / Merien F, Amouriaux P, Perolat P, Baranton G, Saint Girons I. // J Clin Microbiol 1992 Sep - 30 (9) - p.2219-2224.

72. MERIEN F. Comparison of polymerase chain reaction with microaggluti-nation test and culture for diagnosis of leptospirosis / Merien F, Baranton G, Perolat P. // J Infect Dis 1995 Jul - 172 (1) - p. 281-285

73. MERIEN F. In vivo apoptosis of hepatocytes in guinea pigs infected with Leptospira interrogans serovar icterohaemorrhagiae / Merien F, Truccolo J, Rougier Y, Baranton G, Perolat P. // FEMS Microbiol Lett 1998 Dec - 169(1) -p. 95-102

74. MILLAR B.D. Detection of leprospires in biological fluids using DNA restriction / Millar B.D, Chappel R.J, Adler B. // Vet. Microbiol. 1987. - VOL. 15. -№'/2. -P. 71-78.

75. MULLIS K.B. Specific Synthesis of DNA in vitro via a Polymerase-Catalysed Chain Reaction / Mullis K.B., Faloona F.A. // Methods Enzymol 1987 - 155:335 -p. 50

76. MURGIA R. Oligonucleotides specific for pathogenic and saprophytic leptospira occurring in water / Murgia R, Riquelme N, Baranton G, Cinco M. // FEMS Microbiol Lett 1997 Mar - 148 (1) - p. 27-34

77. PALMER M. The chemiluminescent detection of leptospiral antigen / Palmer M, Hookey J. // Zentralbl Bakteriol 1992 Oct - 277 (3) - p. 300-308.

78. PARMA A.E. Differentiation of pathogenic and non-pathogenic leptospires by means of the polymerase chain reaction / Parma A.E., Seijo A., Lucchesi P.M., Deodato B, Sanz M.E. // Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1997 Jul-Aug - 39ft (4)-p. 203-207

79. PEROLAT P. Characterization of Leptospira isolates from serovar hardjo by ribotyping, arbitrarily primed PCR, and mapped restriction site polymorphisms / Perolat P., Merien F., Ellis W.A., Baranton G. // J Clin Microbiol 1994 Aug -32 (8)-p. 1949-1957

80. RAMADASS P. Genetic characterization of pathogenic Leptospira Spell cies by DNA hybridization / Ramadass P., Jarvis B.D.W., Corner R., Penny D.,

81. Marshall R. // Jutern. J of System Bacteriol. 1992, vol 42, N2 - p.215-219.

82. RAMADASS P. Characterization of leptospiral serovars by randomly amplified polymorphic DNA fingerprinting / Ramadass P., Meerarani S., Venkate-sha M.D., Senthilkumar A, Nachimuthu K. // Int J Syst Bacteriol 1997 Apr -47(2)-p. 575-576.

83. RICHTZENHAIN L.J. A multiplex PCR assay for the detection of

84. Brucella spp. and Leptospira spp. DNA from aborted bovine fetuses / Richtzenhain L.J., Cortez A., Heinemann M.B., Soares R.M. // Veterinary Microbiology 2002. -87.-p. 139-147.

85. SAENGJARUK P. Diagnosis of Human Leptospirosis by Monoclonal Antibody-Based Antigen Detection in Urine / Saengjaruk P, Chaicumpa W, Watt • G, Bunyaraksyotin G. // J Clin Microbiol 2001 Feb - 40 (2) - p. 480-489

86. SMITH C.R. A review of laboratory techniques and their use in the diagnosis of Leptospira interrogans serovar hardjo infection in cattle / Smith C.R.,

87. Ketterer P.J, McGowan M.R, Corney B.G. // Austr. Vet. J. 1994 - vol. 71 - № 9-p. 290-293

88. SOUTHERN M. Detection of specific seguinces amond DNA fragments separated by gel electrophoresis. / Southern M. // J.Mol. Biol. 1975 - v.95 - P. 503-517.

89. TAYLOR M.J. Magnetic immuno capture PCR assay (MIPA): detection of Leptospira borgpetersenii serovar hardjo / Taylor M.J, Ellis W.A, Montgomery J.M. , Yan K.-T, McDowell S.W.J, Mackie D.P. // Veterinary Microbiology. -1997 vol 56 - № Уг - p. 135-145

90. TERPSTRA W.J, SCHOONE G.J, SCHEGGET J. Antonie v. Leeu-wenhoek- 1985 (86). vol. 51. - № 5/6. - p. 516-517.

91. TERPSTRA W.J, SCHOONE G.J, LIGTHART G.S, SCHEGGET J. / J. gen. microbial. 1987.-vol. 133. -№4.-p. 911-914.

92. IO.TRUCCOLO J. Following the course of human leptospirosis: evidence of a critical threshold for the vital prognosis using a quantitative PCR assay / Truc-colo J, Serais 0, Merien F, Perolat P. // FEMS Microbiology Letters. 2001. -204.-p. 317-321.

93. VAN EYS G.J. Detection of leptospires in urine by polymerase chain reaction / Van Eys G.J, Gravekamp C, Gerritsen M.J, Quint W, Cornelissen M.T, Schegget J.T, Terpstra W.J. // J Clin Microbiol 1989 Oct - 27 (10) - p. 22582262

94. VANASCO N.B. Development and validation of an ELISA for the detection of leptospire-specific antibodies in rodents / Vanasco N.B, Lottersberger J, Sequeira M.D, Tarabla H.// Vet Microbiol 2001 Oct - 82(4) - p. 321-330

95. WAGENAAR J. A. Rapid and specific detection of pathogenic Leptospira species by amplification of ribosomal sequences / Wagenaar J.A, Segers R.P, Van der Zeijst B.A. // Mol Biotechnol 1994 Aug - 2 (1) - p. 1-14

96. WATSON A.D.J. Leptospirosis in cats and dogs / Watson A.D.J. // Austr. Vet. J. 1994 - vol. 71 - № 2 - p. 59

97. WOO Т.Н. Rapid distinction between Leptonema and Leptospira by PCR amplification of 16S-23S ribosomal DNA spacer / Woo Т.Н., Smythe L.D., Sy-monds M.L., Norris M.A., Dohnt M.F., Patel B.K. // FEMS Microbiol Lett 1996 Aug - 142(1)-p. 85-90

98. WOO Т.Н. Identification of Leptospira inadai by continuous monitoring of fluorescence during rapid cycle PCR / Woo Т.Н., Patel B.K., Smythe L.D., Sy-monds M.L., Norris M.A., Weyant R.S., Dohnt M.F. // Syst Appl Microbiol 1998 Mar-21 (l)-p. 89-96

99. WOO Т.Н. Identification of Leptospira biflexa by real-time homogeneous detection of rapid cycle PCR product / Woo TH, Patel BK, Cinco M, Smythe LD, Norris MA, Symonds ML, Dohnt MF, Piispanen J // J Microbiol Methods -1999 Feb-35(1)-p. 23-30

100. WOODWARD M.J. Nucleotide sequence of a repetitive element isolated from Leptospira interrogans serovar hardjo type hardjo-bovis / Woodward M.J., Sullivan G.J. // J Gen Microbiol 1991 May - 137 (Pt 5) - p. 1101-1109

101. WOODWARD M.J. Leptospira hardjo serodiagnosis: a comparison of MAT, ELISA and Immunocomb / Woodward M.J., Swallow C., Kitching A., Dalley C., Sayers A.R. // The Veterinary Record. 1997. - 141. - p. 603-604.

102. ZUERNER R.L. Differentiation of Leptospira interrogans isolates by IS 1500 hybridization and PCR assays / Zuerner R.L., Bolin C.A. // J Clin Microbiol 1997 Oct-35 (10) -p. 2612-2617